PT1052259E

PT1052259E - Novo derivado de aminopentano opticamente activo

Info

Publication number: PT1052259E
Application number: PT99947940T
Authority: PT
Inventors: Joseph Knoll; Masatoshi Sakae; Toshiaki Moto; Seiichiro Shimazu; Kazue Takahata; Fumio Yoneda; Hironori Ohde; Takashi Ando
Original assignee: Fujimoto Brothers Co Ltd
Priority date: 1998-10-29
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2007-07-20
Also published as: CN1287554A; ES2285861T3; DK1052259T3; CN1131858C; KR20010033756A; HUP0004667A3; DE69935849D1; EP1052259A4; ATE360009T1; AU762995B2; AU6124199A; JP2000136187A; WO2000026204A1; SI20209A; HUP0004667A2; EP1052259A1; CA2317036A1; JP4499208B2; HK1032585A1; CA2317036C

Description

ΡΕ1052259 1 DESCRIÇÃO "NOVO DERIVADO DE AMINOPENTANO OPTICAMENTE ACTIVO"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção diz respeito a um novo derivado de aminopentano opticamente activo, (-)-1-(benzofuran-2-il)-2-propilaminapentano que não contêm substancialmente o isóme-ro (+) e aos sais de ácido farmacologicamente aceitáveis. Estes são promissores como compostos activos de uma composição medicinal, especialmente composição psicotrópica, composição anti-depressiva para o tratamento da doença de Parkinson e/ou doença de Alzheimer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os derivados da etilamina são conhecidos por terem várias acções biológicas. Em particular, pensa-se que os derivados aromáticos da etilamina sejam composições psicotrópicas esperançosas, porque têm a acção de libertação por deslocamento de catecolaminas dos seus locais de armazenamento no sistema nervoso central. No entanto, é referido que estas composições têm efeitos secundários do tipo estimulante, como sejam neurotoxicidade e comportamento anormal, porque elas podem facilmente causar liber- 2 ΡΕ1052259 tação excessiva de catecolamina dos locais de armazenamento, í.e., vesículas sinápticas e etc. A administração contínua destas composições, que aumenta a libertação excessiva de catecolamina, induz a diminuição dos recepto-res de catecolamina. Em consequência, a resposta dos doentes a estas composições é gradualmente reduzida e não se consegue um efeito terapêutico suficiente. JP-A-8 059 578 apresenta derivados da fenetil-amina substituída tendo efeito anti-psicótico sem causar distúrbios no sistema extrapiramidal. composições para o

Por outro lado, têm sido apresentados novos derivados da fenetilamina na WO 88/2254 como composições psicotrópicas e etc. Tem sido dada considerável atenção a estes derivados da fenetilamina, porque estes mostraram o efeito de aumento de actividade (efeito CAE), o qual é uma nova acção descoberta para aumentar a libertação de catecolamina devido à amplificação da exocitose dependente do potencial de membrana e a qual é diferente da anterior acção de libertação pelo deslocamento da catecolamina do seu armazenamento [Life Sei., 5_8, 945-952 (1996)]. No entanto, estes compostos não assentaram o aumento da reacção intersinal que é um indicador de comportamento anormal na tarefa de evitação condicionada. Portanto, tem sido requerido o desenvolvimento de fármaco com CAE altamente selectivo. Em seguida, desenvolvemos novos compostos que aumentam a libertação de catecolamina por efeito CAE e verificámos serem úteis como composições psicotrópicas, anti-depressivas, 3 ΡΕ1052259 tratamento da doença de Parkinson e/ou Alzheimer (EP.A-957080) .

Compostos aminas orgânicas na EP-A-957080 são compostos racémicos consistindo em duas quantidades equi-molares de isómeros ópticos (enantiómeros) porque têm um carbono assimétrico. Como no caso dos compostos racémicos que são misturas de isómeros ópticos (enantiómeros), um do par apresenta geralmente uma actividade superior à do outro. Portanto, tentaram-se resoluções ópticas do isómeros por utilização dos métodos de preparação de sais ou derivados diasteriómeros. No entanto, verificou-se não ser fácil realizar a resolução óptica dos compostos racémicos na EP.A.957080 devido aos seus próprios substituintes flexíveis. O propósito da invenção é obter os respectivos isómeros ópticos dos compostos aminas orgânicas na EP-A-957080 por meio de resolução óptica e encontrar remédios úteis a partir dos isómeros ópticos por varrimento farmacológico. Além disso, são também propósitos da invenção a oferta de uma composição médica como seja uma composição psicotrópica, anti-depressivos, composição para tratamento da doença de Parkinson e/ou Alzheimer.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Seguindo a invenção, o objectivo anterior da invenção é conseguido pelo novo (-)-1-(benzofuran-2-il)-2- 4 ΡΕ1052259 propilaminapentano opticamente puro apresentado pela seguinte fórmula ou os sais farmacologicamente aceitáveis.

Nós, estes inventores, examinámos a resolução óptica para obter isómeros opticamente puros a partir e compostos racémicos que eram composições psicotrópicas, anti-depressivos, composições para tratamento da doença de Parkinson e/ou Alzheimer. Ensaiaram-se vários métodos para se obter o composto opticamente puro a partir dos compostos na EP-A-957080 e, por fim, conseguiu-se a resolução óptica pelo método de cromatografia liquida de alta precisão, utilizando coluna quiral descrita no exemplo 1. Verificou-se que este novo composto opticamente puro ou os sais ácidos apresentavam acções psicotrópica e anti-depressiva pelos excelentes efeitos CAE. Em particular, verificou-se que o (-)-1-(benzofuran-2-il)-2-propilamina-pentano ou os sais farmacologicamente aceitáveis apresentam alta acti-vidade e a invenção completou-se.

Ninguém esperava se entre estes compostos (-)-l-(benzofuran-2-il)-2-propilaminapentano não incluindo substancialmente a forma (+) apresentavam ou não efeito CAE excelente. Porque muitos dos compostos apresentados em EP-A-957080, incluindo (-)-1-(benzofuran-2-il)-2-propil-amino-pentano, não eram conhecidos do público e o método de 5 ΡΕ1052259 resolução óptica para estes compostos aminas orgânicas e acções farmacológicas do isómero óptico também eram desconhecidos.

MELHOR MODO PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO O composto na invenção é o enantiómero (-)de um certo composto apresentado em JP 9/247445 e nesta memória descritiva a frase "o que essencialmente não incluía o isómero (+)" significa que a sua pureza óptica era mais do que 80 % ee, e desejavelmente 90 % ee. Acções farmacológicas de (-)-1-(benzofuran-2-il)-2-propilamina-pentano, que não incluem substancialmente o isómero (+), são melhores do que os compostos racémicos apresentados em EP-A-957080. Nós proporcionamos concretamente os sais com ácido inorgânico, aceitáveis farmacologicamente, que eram desejáveis, como sejam, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido bromídrico, ácido nítrico, ácido metanossulfónico e etc, ou ácido orgânicos como sejam o ácido glucónico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido málico, ácido mandélico e etc. O composto na invenção e os sais de ácido apresentam acção farmacológica como seja acção psicotrópica para ser devido ao efeito de aumento da actividade catecol-aminérgica (efeito CAE). Adicionalmente, fomos capazes de utilizá-los como uma composição para o tratamento de doença de Parkinson, anti-depressivos e composição psicotrópica. 6 ΡΕ1052259

Quando medidas as catecolaminas libertadas do tronco encefálico de ratazana submerso em solução de Krebs durante períodos de descanso ou de electroestimulação, a libertação de catecolaminas aumenta significativamente com este composto só durante o período de electroestimulação, mas não no de descanso. Esta acção do composto da invenção é muito superior à dos compostos racémicos apresentados em ep-a-957080. O isómero (+) apresenta actividade bem como o composto racémico. Além disso, apesar da administração com um depletor de catecolamina, tetrabenazina, reduziu a capacidade de aprendizagem das ratazans, o composto da invenção apresenta melhorar significativamente a capacidade de aprendizagem que é avaliada como os reflexos de evitação condicionados, em doses menores do que o isómero ( + ) ou o composto racémico.

Estas experiências tornaram claro que o composto da invenção tem o efeito de aumentar a actividade catecolaminérgica, que aumenta a exocitose devida a estimulação relacionada com libertação activa potencial e emissora, í.e., um aumento de concentração intracelular de Ca2+ nos neurónios. Além disso, esta acção fisiológica, sem comportamento anormal e depleção de amina no terminal nervoso catecolaminérgico, é diferente da acção de libertação da composição conhecida por deslocar a catecolamina.

Quando se utiliza os compostos da invenção ou os sais de ácido farmacologicamente aceitáveis como na medicina anterior, estes são administrados oralmente ou de 7 ΡΕ1052259 forma parentérica como comprimidos, pós, grânulos, cápsulas, xaropes, injecções ou semelhante. Apesar das doses utilizadas variarem e dependendo de cada sintoma, idade, peso corporal e etc., a dose oral de adulto para estes compostos é geralmente entre 0,1 e 100 mg/dia. Adicionalmente, eles são administrados uma vez ou várias vezes ao dia. O composto da invenção é explicado concretamente como se segue.

Exemplo 1

Preparação do cloridrato de (-)-l-(benzofuran-2-il)-2-propilaminapentano

Realizou-se a resolução óptica pelo método de HPLC sob as seguintes condições. Injectaram-se directamente cento e cinquenta μη de cloridrato de (±)-1-(benzofuran-2-il)-2-propilaminapentano 8 mg/mL (composto racémico) no HPLC. HPLC: LC-6AD, Shimadzu, Kyoto, Japão Coluna: CHIRALPACKAD 20 mm 0 x 250 mm (DAICEL)

Fase móvel: hexano:isopropanol:ácido trifluoracético 100:2:0,1

Velocidade de fluxo: 12,0 mL/min

Detector: SPD-10A tipo detector UV/VIS (280 nm), Shimadzu, Kyoto, Japão

Temperatura: temperatura ambiente ΡΕ1052259

Dissolveu-se óleo de (-)-1-(benzofuran-2-il)-2-propilaminapentano em éter anidro e adicionou-se para a solução etérea solução saturada com ácido clorídrico para converter ao sal cloridrato.

Ponto de fusão: 165,0-166,0°C IV: 3425, 2970, 2870, 2780, 2735, 2690, 2520, 2430, 1605, 1590, 1472, 1455, 1255, 1167, 942, 805, 770, 760 cm-1 .

Análise elementar: como Ci6H23NO.HC1 Calculada: C: 68,19; H: 8,58; N: 4,97 (%)

Experimental: C: 68,07; H: 8,48; N: 4,98 (%)

Pureza óptica: 93 % ee

Rotação especifica [α]2% = -4,08 (c=4,0, metanol)

Exemplo de referência

Preparação do cloridrato de (+)-1-(benzofuran-2-il)-2-propilaminapentano [forma-(+)]

Dissolveu-se óleo de (+)-1-(benzofuran-2-il)-2-propilaminapentano obtido no exemplo 1 em éter anidro e adicionou-se para a solução etérea solução saturada com ácido cloridrico para converter ao sal cloridrato.

Ponto de fusão: 170,0-171,0°C IV: 3425, 2970, 2870, 2790, 2735, 2700, 2515, 2425, 1607, 1590, 1472, 1455, 1250, 1175, 945, 802, 770, 760 cnT1. 9 ΡΕ1052259

Análise elementar: como C16H23NO.HCI Calculada: C: 68,19; H: 8,58; N: 4,97 (%)

Experimental: C: 67,90; H: 8,44; N: 4,98 (%)

Pureza óptica: 100 % ee

Rotação específica [α]2% = +4,01 (c=4,0, metanol)

Os resultados dos estudos farmacológicos são apresentados em seguida.

Exemplo 2

Medição de aminas biogénicas libertadas do tronco encefálico de ratazana por electroestimulação

Utilizou-se o método descrito em Life Sei., 58, 2101-2114 (1996). Atordoaram-se ratazanas macho pesando 280-350 g com um golpe na nuca, isolou-se o tronco encefálico e embebeu-se em solução de Krebs oxigenada (95 % O2 e 5 % CO2) à temperatura de 37 °C durante 30 min. Em seguida, adicionou-se 20 pL de solução de 3H-noradrenalina (actividade específica de 1-[7,8-8H]-noradrenalina: 30-50

Ci/mmole; Amersham) à preparação e aguardou-se 45 minutos para absorção. A composição da solução de Krebs era a seguinte em mmole/L: Na+ 137,4; K+ 5,9; Ca2+ 2,5; Mg2+ 1,2; Cl“ 12 0,2; HzPOr 1,2; HC03~ 25,0; SO 1,2 e glucose 11,5; ácido ascórbico 0,3 e EDTA-2 Na 0,03. Durante o período para absorção esteve presente na solução de Krebs o 10 ΡΕ1052259 transmissor marcado pargilina (12 mmole) para inibir a actividade mao.

Depois de absorção de 3H-noradrenalina, fixou-se o tronco encefálico em banho de órgãos contendo 5 mL de solução de Krebs (37 °C) . Em seguida lavou-se o cérebro à velocidade de 8 mL/min com solução de krebs saturada com oxigénio contendo 0,03 mmole/L de cocaina. Depois de 100 min, reduziu-se a velocidade de perfusão por 4 mL/min e modificou-se a solução de Krebs para conter também 0,05 mmole/L de corticosterona. Realizou-se a experiência na presença de cocaina e corticosterona (nestas condições, 86 % de 3H-noradrenalina não são metabolizadas e absorvidas tanto nos neurónios como noutras células). Realizou-se a cada 3 min a fraccionação da solução de perfusão.

Adicionou-se 1 mL de solução de perfusão a 5 mL Aquasafe 300 P (Zinsser) e determinou-se a quantidade de 3H-noradrenalina libertada durante cada período de 3 min utilizando-se um contador de cintilações (Beckman LS-900). Também se determinaram as quantidades de serotonina e dopamina da mesma forma. Estimulou-se tronco encefálico com impulsos rectangulares (3 Hz, 1 ms 60 V) durante 3 min. No inicio da experiência, procederam-se os três períodos de fracção de repouso antes da primeira estimulação. Em seguida permitiram-se sete períodos de fracção de repouso entre cada estimulação. Resolveram-se os compostos da invenção em tampão perfundido e prepararam-se soluções de 0,5; 1; 2,5 e 5 μρ/πΛ. Perfundiu-se o tampão contendo os compostos da invenção durante 3 min antes da electro-estimulação. Apresentam-se os resultados na Fig. 1. 11 ΡΕ1052259

Como se verifica na Fig. 1, confirmou-se que o composto da invenção aumentou a libertação de noradrenalina, serotonina e dopamina pelo aumento da exoci-tose, quando de deu a electro-estimulação às células neuró-nias. Além disso, verificaram-se os efeitos do composto da invenção em doses mais baixas do que a forma ( + ) e o composto racémico, como se mostra na Tabela 1.

Tabela 1. Dose minima (pg/mL) do composto da invenção que causa a libertação de noradrenalina, serotonina e dopamina do tronco encefálico electroestimulado.

Composto da invenção Isómero ( + ) Composto racémico Noradrenalina 1 x 10~2 5 x 10'1 5 Serotonina 5 x 10~2 5 ND. Dopamina 5 x 10~4 10 1

Exemplo 3

Os efeitos no desafio de evitação condicionada na caixa de lançadeiras

Utilizou-se o método descrito na Life Sei., 58, 817-827 (1996). Analisaram-se os efeitos no reflexo de evitação condicionada (CARs) na caixa de lançadeiras utilizando ratazanas machos e fêmeas (pesando 200-220 g) cujas capacidades de aprendizagem foram reduzidas pela administração de tetrabenazina. Construiu-se o instrumento 12 ΡΕ1052259 de acordo com o aparelho descrito em Psychopharmacologia 10, 1-5 (1966). Treinaram-se as ratazanas macho e fêmea (pesando 200-220 g) para atravessar a barreira sob um estimulo condicionado (CS, "flash" de luz e sons de buzina) . Se falhavam em fazê-lo, eram castigados com um choque na pata (1 mA) que era um estimulo não condicionado (US). Se as ratazanas falhavam na resposta a US dentro de 5 seg, era registado como uma falha de fuga (EF) . Adicionalmente, registou-se o desempenho despreocupado a esta condição como uma reacção (IR). Treinaram-se as ratazanas com 100 ensaios ao longo do dia durante 5 dias. Realizou-se cada ensaio com intervalo entre ensaio de 15 seg. Administrou-se de forma subcutânea a solução salina de tetrabenazina numa dose de 1 mg/kg 1 hora antes do teste. Em seguida, administrou-se a solução dos compostos da invenção em doses de 1; 2; 2,5 e 5 mg/kg, s.c., em simultâneo com tetrabenazina. Contaram-se automaticamente os números de CARs, EFs e IRs e analisaram-se utilizando análises de uma via de variância (ANOVA). Apresentam-se os resultados na Fig. 2.

Como se apresenta na Fig. 2, o composto da invenção melhorou significativamente a função de aprendizagem reduzida das ratazanas administradas com tetrabenazina. Observou-se o feito do composto da invenção numa dose muito inferior à do isómero (+) ou composto racémico, como se apresenta na Tabela 2. Considerou-se que estes compostos podem ter efeitos anti-depressivos, porque o EF diminuiu consideravelmente. Além disso, o composto da 13 ΡΕ1052259 invenção não modificou consideravelmente os IRs o que significa excitação sob nenhum estimulo condicionante e relacionado com comportamento anormal, portanto, o composto não tem excitação do tipo estimulante.

Tabela 2. Dose minima ^g/mL) do composto da invenção, forma (+) ou composto racémico que causa reflexos de evitação condicionada (CARs) em ratazanas tratadas com tetrabenazina numa caixa de lançadeiras.

Composto da invenção Isómero (+) Composto racémico 5 x 1CT2_2,5 mg_1 mg_

Exemplo 4

Medição de aminas biogénicas libertadas do tecido de cérebro

Utilizou-se o método descrito na Life Sei., 56, 611-620 (1995). Depois de se decapitarem as ratazanas Wistar, isolaram-se rapidamente tecidos de cérebro (estriado, substância negra, tubérculo olfactório, locus coeruleus e rafe) e embeberam-se em solução de Krebs oxigenada (95 % O2 e 5 % CO2) à temperatura de 37°C. A composição da solução de Krebs era a seguinte em mole/L: NaCl 111; KC1 4,7; CaCl2 2,5; MgS04 1, 64; NaHC03 25; KH2P04 1,2; glucose 12 mg/L; ácido ascórbico e EDTA-2Na 20 mg/L. As preparações submergidas num banho de órgão eram as seguintes: 1) quatro pedaços de estriado (cada uma em metade), 2) quatro pedaços de substância negra, 3) quatro 14 ΡΕ1052259 pedaços de tubérculo olfactório, 4) oito pedaços de locus coeruleus, 5) oito pedaços de rafe. Depois de incubação do tecido durante 20 min, trocou-se a solução de Krebs. Depois do tecido estar submergido durante 20 min na solução de Krebs contendo os compostos da invenção, quantificou-se a libertação da amina biogénica durante este periodo. Dissolveram-se os compostos da invenção, o isómero (+), o composto racémico e de controlo respectivamente em soro fisiológico e administraram-se por via subcutânea 30 min antes da dissecação das amostras de cérebro. No caso das noradrenalina e dopamina, purificaram-se as amostras em micro colunas (BDH Chemicals Ltd). Encheram-se com 60 mg de alumina de acordo com o método descrito em J. Pharmacol. Exp. Ther, 138, 360-372 (1962). No caso da serotonina, purificaram-se as amostras em micro colunas com 15 mg de Sephadex G-10 (Pharmacia). Quantificaram-se a dopamina, noradrenalina e a serotonina por cromatografia líquida de alta precisão (módulo de dados Waters 746) com detecção electroquímica (detector electroquímico Waters 460). Utilizou-se uma coluna Waters Resolve 5 μ Spherical Ci8 3,9x150 mm como coluna de separação e utilizou-se como fase móvel tampão trietilamina-fosfato (pH 5,2), contendo 200 mg/L de octano sulfonato de sódio e 18 mg/L EDTA-2Na com 6 % de acetonitrilo. Registou-se a quantidade de amina apropriada libertada durante 20 min como nmole/g de tecido. Testaram-se as diferenças entre as médias utilizando o teste de Students. Colocou-se o nível significativo a P<0,05. Os resultados apresentam-se na Tabela 3. 15 ΡΕ1052259

Apesar dos compostos da invenção, respectivamente o composto isómero e racémico aumentarem a libertação de amina biogénica, os compostos da invenção apresentaram a eficácia em concentrações inferiores às do composto na forma (+) e racémica, como se apresenta na Tabela 3.

Tabela 3. Quantidade de aminas biogénicas libertadas de tecidos de cérebro (nmole/g-tecido, 20 min)

Dose mg/kg Dopamina Noradrenalina Serotonina Estriado Sbstância Negra Tubérculo Olfactório Locus coeruleus Rafe Soro - 4,5±0,15 6,8±0,18 4,9±0,15 4,7+0,10 0,391+0,02 fisiológico 0 composto 0, 0001 4,7+0,14 14,8+0,364 7,2+0,234 6,6+0,103 1, 040+0, 033 da invenção 0, 0005 4,8+0,16 13,8+0,234 6,7+0,084 15,4+0,554 0,914+0,033 0, 0025 5,7±0,193 13,1±0,214 6,9±0,314 3,9+0,052 0,421+0,03 0, 0500 6,5+0,094 10,9+0,114 7,7+0,194 4,3+0,25 0,457+0,01 Isómero-( + ) 0, 0005 4,4+0,13 13,8+0,254 6,7+0,064 10,3+0,353 1, 785+0,014 0, 0025 4,4±0,10 8, 4±0,144 4,8±0,25 7,4+0,153 1, 138+0,053 0, 0500 4,4+0,17 7,1+0,24 4,8+0,18 4,4+0,10 0, 642+0,022 0,1000 5,8+0,213 15,9+0,254 7,3+0,204 5,6+0,25 0,381+0,014 Composto 0,0100 5,3±0,143 6, 6±0,043 6,5±0,203 4,3+0,20 0,457+0,04 racémico 2P<0,02 3P<0, .01 4P<0, 001

Exemplo 5

Efeito na monoamina oxidase tipo B (MAO-B)

Depois de se decapitarem ratinhos macho C57B1/6, isolou-se imediatamente o cérebro inteiro. Pesaram-se as 16 ΡΕ1052259 amostras de cérebro e homogeneizaram-se em tampão fosfato de potássio 0,2 mole/L (pH 7,5) contendo EDTA-2Na 1,0 % por homogeneizador. Depois de se centrifugar o homogenato a 2.000 RPM durante 20 min, centrifugou-se o sobrenadante a 18.000 RPM (40.000 g) durante 30 min. Voltou-se a sus+pender o sedimento, e ainda se centrifugou da mesma maneira. Em seguida, voltou-se a suspender o sedimento no tampão anterior para ser solução de enzima. Realizou-se todo o procedimento à temperatura de 4°C.

Misturaram-se substrato marcado com 14C (14C- feniletilamina) e solução de enzima dos ratinhos em tubos de ensaio, incubaram-se durante 30 min à temperatura de 37°C e parou-se a reacção com 20 μι de HC1 6 mole/L. Extraiu-se o produto de reacção com tolueno-acetato de etilo (1:1) e mediu-se a radioactividade utilizando um contador de cintilação. Em seguida calculou-se a actividade inibidora na MAO-B. Apresentam-se os resultados na Tabela 4. A actividade inibidora de cada composto em 10”5 mole/L era inferior a 50 %, como se apresenta na Tabela 4. Isto sugeriu que o composto da invenção não tinha acção inibidora na MAO-B.

Tabela 4. Efeitos inibidores na MAO-B de cérebro de ratinhos na concentração de 10~5 mole/L

Actividade inibidora 0 composto da invenção 4,7 % Isómero-(+) 1,7 % Composto racémico 22,9 % 17 ΡΕ1052259

Exemplo 6

As afinidades para os receptores de <Xi, a2, <Xi, a2, 5-HTi e 5-HT2

Preparou-se a solução do receptor da seguinte maneira. Depois de se decapitarem as ratazanas, isolou-se imediatamente e pesou-se o cérebro. Em seguida, homogeneizaram-se as amostras de cérebro em dez vezes de volumes de sucrose gelado 0,35 mL/L (pH 7,4) utilizando um homogeneizador de vidro com pilão de Teflon, que se revolteou por motor. Centrifugou-se o homogenato à temperatura de 4°C a 900 x g durante 10 min e voltou-se ainda a centrifugar o sobrenadante à temperatura de 4°C a 22.000 x g durante 20 min. Suspendeu-se o precipitado com adição de solução de tampão fosfato 5 mmole/L (pH 7,4). Depois de se incubar a suspensão à temperatura de 37°C durante 30 min, voltou-se a centrifugar à temperatura de 4°C a 20.000 x g durante 20 min. Voltou-se a suspender o precipitado em 10 mL de solução de tampão fosfato 5 mmole/L (pH 8,0) para ser solução de receptor.

Utilizou-se 3H-prazocina como um ligando. Colo-caram-se num tubo 3H-prazocina 0,25 nmole/L, os compostos da invenção e a solução de receptor, que se prepararam respectivamente em tampão fosfato (pH 8) 5 mmole/L e incubou-se a mistura à temperatura de 25°C durante 90 min. Adicionalmente, avaliou-se a ligação não específica com valor de ligação de 3H-prazocina na presença de prazocina 18 ΡΕ1052259 0,1 pmole/L. Realizou-se ο ensaio de ligação como se segue. Depois de 3H-prazocina se ligar ao receptor (tipo de ligação : B), só se recolheu o tipo de ligação de 3H-prazocina utilizando separador B/F (Brandel, USA) com filtro de fibra de vidro (tamanho de poro: 0,5 μιη, Whatman GF/C) e removeu-se prazocina de tipo livre (tipo livre : F). Lavou-se o filtro de fibra de vidro que absorveu o tipo de ligação de 3H-prazocina com solução gelada de soro fisiológico e transferiu-se para um frasquinho. Depois de se colocar 10 mL de cocktail de cintilação, mediu-se a radioactividade. Avaliou-se a afinidade dos compostos da invenção para o receptor ax a partir da velocidade de inibição de ligação entre o receptor ax e o ligando.

Determinaram-se especificamente as afinidades dos compostos da invenção para os receptores ou, a2, Dx, D2, 5-ΗΤχ e 5-HT2 respectivamente da mesma maneira, enquanto se utilizou 3H-rauvolscina 0,7 nmole/L, 3H-SCH-23390 1,4 nmole/L, spiperona 2,0 nmole/L, 3H-5-HT 2 nmole/L e 3H-Cetanserina 0,5 nmole/L, como cada um dos ligandos. Adicionalmente, utilizaram-se iohimbina 1 μπιοΐβ/ί, ( + )-butaclamol 10 pmole/L, haloperidol 10 μιηοΐΘ/L, 5-HT 10 μιηοΐβ^ e cetanserina 1 μιηοΐβ^ respectivamente como seus substituintes. Se a afinidade de certo composto para certo receptor é elevada, a ligação entre o radio ligando e o receptor é inibida. Se a concentração de um certo composto, que é necessária para 50 % de inibição de ligação entre ligando e receptores, é superior a 10~6 mole/L, é geralmente considerado que o composto não tem a actividade 19 ΡΕ1052259 suficiente para apresentar actividade fisiológica. Apresenta-se o teste na Tabela 5.

Os compostos da invenção, isómero (+) e composto racémico mostram não terem afinidade que era necessária para apresentar acção fisiológica, como se apresenta na Tabela 5.

Tabela 5. Afinidade para os receptores* (Xi a2 Di d2 5-HTj 5-HT2 0 composto da invenção > ΚΓ5 3,1 x 10~6 > 10'5 > 10'5 > 10-5 1,0 x 10~5 Isómero-(+) > ΚΓ5 2,6 x ΚΓ6 > 10-5 > 10-5 > 10-5 > 10~5 Composto racémico > 1CT5 1,0 x 10~6 > IO-5 > IO-5 > IO-5 2,0 x 10~5 *Concentração (mole/L) apresentando 50 % de inibição entre cada ligandos e receptor

Os resultados dos testes de segurança apresentam-se em seguida.

Exemplo 7

Avaliação de toxicidade utilizando hepatócito de cultura primária

Prepararam-se os hepatócitos a partir de figado de ratazana utilizando o método de perfusão de colagenase e preparou-se a suspensão de células contendo 5 x 105 células/mL. Depois da cultura durante 24 h, mudou-se o meio para o William's Médium E (GIBCO ERL) contendo 10 ou 100 μιηοΙθ/Έ dos compostos da invenção. Depois da cultura durante 24 h, mediu-se a actividade da lactatedehidrogenase (LDH) libertada para o meio. 20 ΡΕ1052259

Nos resultados, 100 μπιοΐβ/ΐ do composto da invenção aumentaram ligeiramente a libertação de LDH, mas 10 pmole/L não aumentaram, como se mostra na Tabela 6.

Tabela 6. Controlo de percentagem de libertação de LDH a partir de hepatócito de cultura primária o composto da invenção, a forma (+) ou composto racémico 100 pmole/L 10 pmole/L 0 composto da invenção 126,42 ± 8,04* 104,94 ± 4,96 Isómero (+) 116,72 ± 6,91 124,41 ± 12,54 Composto racémico 112,10 ± 36,98 90,28 ± 2,85

Exemplo 8

Teste de toxicidade em ratinhos numa administração única

Observaram-se os sintomas gerais dos ratinhos todos os dias durante duas semanas depois da administração do composto da invenção numa dose de 100 mg/kg.p.o. Nos resultados, cada três números de ratinhos sobreviveram.

REFERENCIA AOS DESENHOS

Fig. 1 Esta figura mostra que os compostos da invenção aumentam a libertação de noradrenalina, dopamina e serotonina a partir do tronco encefálico de ratazana por electro-estimulação. "I_I" significa o tratamento deste composto e "·" Significa electroestimulação. 21 ΡΕ1052259

Fig. 2 Esta figura mostra a eficácia do composto da invenção na reduzida capacidade de aprendizagem de ratazanas administradas com tetrabenazina, quando se utilizou o desafio da caixa de lançadeiras.

Lisboa, 9 de Julho de 2007

Claims

ΡΕ1052259 1 REIVINDICAÇÕES 1. (-)-1-(Benzofuran-2-il)-2-propilaminapentano opticamente puro apresentado pela seguinte fórmula e os sais farmacologicamente aceitáveis.
2. Uma composição medicinal incluindo um composto da reivindicação 1 como um composto activo, em que é utilizado para melhorar a libertação de catecolamina no sistema nervoso central.
3. Uma composição medicinal incluindo o composto da reivindicação 1 como um composto activo, em que é utilizado para composição psicotrópica
4. Uma composição medicinal incluindo o composto da reivindicação 1 como um composto activo, em que é utilizado para anti-depressivos.
5. Uma composição medicinal incluindo o composto da reivindicação 1 como um composto activo, em que é utilizado para o tratamento da doença de Parkinson.
6. Uma composição medicinal incluindo o compos- 2 ΡΕ1052259 to da reivindicação 1 como um composto activo, em que é utilizado para o tratamento da doença de Alzheimer.
7. Uma composição medicinal incluindo o composto da reivindicação 1, caracterizada por a pureza óptica de (-)-1-(Benzofuran-2-il)-2-propilamina-pentano ser especialmente mais do que 80 % ee.
8. A composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser utilizada para melhorar a libertação de catecolaminas no sistema nervoso central.
9. A composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser utilizada para composição psico-trópica.
10. A composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser utilizada para anti-depressivos.
11. A composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser utilizada para tratamento de doença de Parkinson
12. A composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser utilizada para tratamento de doença de Alzheimer. Lisboa, 9 de Julho de 2007