SI20209A

SI20209A - Novi optično aktivni aminopentanski derivati

Info

Publication number: SI20209A
Application number: SI9920013A
Authority: SI
Inventors: Joseph Knoll; Fumio Yoneda; Hironori Ohde; Masatoshi Sakae; Toshiaki Moto; Takashi Ando; Seiichiro Shimazu; Kazue Takahata
Original assignee: Fujimoto Brothers Co., Ltd.
Priority date: 1998-10-29
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2000-10-31
Also published as: CN1287554A; ES2285861T3; DK1052259T3; PT1052259E; CN1131858C; KR20010033756A; HUP0004667A3; DE69935849D1; EP1052259A4; ATE360009T1; AU762995B2; AU6124199A; JP2000136187A; WO2000026204A1; HUP0004667A2; EP1052259A1; CA2317036A1; JP4499208B2; HK1032585A1; CA2317036C

Abstract

Opisan je (-)-1-(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentan, ki v bistvu ne vsebuje (+)-izomera in je prikazan z naslednjo formulo, in njegove farmacevtsko sprejemljive kislinske soli. Te spojine imajo odličen CAE učinek (učinek povečanja kateholaminergične aktivnosti), ki je povečevalni učinek sproščanja nevrotransmiterja kateholamina, in so koristne kot psihotropni sestavki, antidepresivi, sestavki za zdravljenje Parkinsonove bolezni in/ali Alzheimerjeve bolezni.ŕ

Description

Izum se nanaša na nov optično aktiven aminopentanski derivat, (-)-l-(benzofuran-2il)-2-propilaminopentan, ki v bistvu ne vsebuje (+)-izomera, in na farmacevtsko sprejemljive kislinske soli. Le-ti so obetajoči kot aktivne spojine za medicinski sestavek, zlasti psihotropičen sestavek, antidepresiv, sestavek za zdravljenje Parkinsonove bolezni in/ali Alzheimerjeve bolezni.

OZADJE IZUMA

Znano je, da imajo etilaminski derivati različne biološke učinke. Zlasti za aromatske etilaminske derivate mislijo, da so obetajoč psihotropni sestavek, ker imajo učinek sproščanja pri premeščanju kateholaminov z njihovih mest shranjevanja v centralnem živčnem sistemu. Vendar poudarjamo, da imajo ti sestavki stranske učinke, podobne učinkom stimulantov, kot nevrotoksičnost in nenormalno obnašanje, ker zlahka povzročijo prebitek kateholaminskega sproščanja z mest shranjevanja, t.j. sinaptičnih mehurčkov itd. Stalno dajanje teh sestavkov, ki povečajo prebitek kateholaminskega sproščanja, povzroči zmanjšanje kateholaminskih receptorjev. Torej se odziv pacientov na te sestavke postopoma zmanjšuje in ne da se doseči zadostnega terapevtskega učinka.

Po drugi strani so v WO 88/2254 opisali nove fenetilaminske derivate kot psihotropne sestavke itd. Ti fenetilaminski derivati so bili deležni znatne pozornosti, ker so kazali učinek povečanja kateholaminergične aktivnosti (CAE učinek), ki je na novo odkrit učinek za povečanje kateholaminskega sproščanja zaradi pomnoževanja od membranskega potenciala odvisne eksocitoze in ki je različen od gornjega sproščevalnega učinka s premestitvijo kateholamina z njihovega shranjevanja [Life

Sci. 58, 945-952 (1996)]. Vendar te spojine niso umirile povečanja intersignalne reakcije, ki je indikator nenormalnega obnašanja pri kondiciorani izognitveni nalogi. Zato je bil potreben razvoj zelo selektivnega CAE zdravila. Tako smo razvili nove spojine, ki povečajo sproščanje kateholamina s CAE učinkom, in ugotovili, da so uporabne kot psihotropni sestavki, antidepresivi, sestavki za zdravljenje Parkinsonove bolezni in/ali Alzheimerjeve bolezni (patentna prijava št. JP 9/247445).

Organske aminske spojine v patentni prijavi JP 9/247445 so racemne spojine, ki obstoje iz dveh ekvimolskih količin optičnih izomerov (enantiomerov), ker imajo asimetričen ogljik. Kar se tiče racemnih spojin, ki so zmesi optičnih izomerov, je ena od para na splošno pokazala višjo aktivnost kot druga. Zato so poskušali optično ločiti izomere z uporabo metod priprave diastereomernih soli ali derivatov. Vendar se je izkazalo, da se optičnega ločenja racemnih spojin v patentni prijavi JP 9/247445 ni dalo zlahka izvesti zaradi njihovih lastnih fleksibilnih substituentov.

Namen izuma je, da dobimo zadevne optične izomere iz organskih aminskih spojin v patentni prijavi JP 9/247445 s pomočjo optičnega ločenja in da najdemo koristna zdravila iz optičnih izomerov s farmakološkim skriningom. Nadalje je namen izuma tudi ponuditi medicinske sestavke, kot psihotropne sestavke, antidepresive, sestavke za zdravljenje Parkinsonove bolezni in/ali Alzheimerjeve bolezni.

KRATEK OPIS IZUMA

V smislu izuma dosežemo gornji namen izuma z novim optično čistim (-)-l(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentanom z naslednjo formulo ali s farmacevtsko sprejemljivimi kislinskimi solmi.

Avtorji smo raziskovali optično ločenje, da bi dobili optično čiste izomere iz racemnih spojin, ki so psihotropski sestavki, antidepresivi, sestavki za zdravljenje Parkinsonove bolezni in/ali Alzheimerjeve bolezni. Z različnimi metodami smo poskušali dobiti optično aktivno spojino iz spojin v patentni prijavi JP 9/247445 in končno dosegli optično ločenje z metodo visoko zmogljivostne tekočinske kromatografije ob uporabi kiralne kolone, opisane v primeru 1. Ugotovili smo, da ta nova optično aktivna spojina ali kislinske soli kažejo psihotropne in antidepresivne učinke z izvrstnimi CAE učinki. Ugotovili smo, da ima zlasti (-)-l-(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentan ali farmacevtsko sprejemljive kislinske soli visoko aktivnost, in dokončali izum.

Nihče ni pričakoval, če izmed teh spojin (-)-l-(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentan, ki v bistvu ne vključuje (+)-oblike, kaže odličen CAE učinek ali ne. Številne spojine, opisane v patentni prijavi JP 9/247445, vključno l-(benzofuran-2-il)-2propilaminopentan, sedaj namreč niso dostopne javnosti in tudi metoda optičnega ločenja za te racemne organske aminske spojine in farmakološki učinki optičnega izomera niso bili znani.

NAJBOLJŠI NAČIN ZA IZVEDBO IZUMA

Spojina v smislu izuma je (-)-enantiomer določene spojine, opisane v patentni prijavi JP 9/247445, in v tem opisu fraza ki v bistvu ne vsebujejo (+)-izomera pomeni, daje njegova optična čistota nad 80 % ee, zaželeno 90 % ee. Farmakološki učinki (-)-l(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentana, ki v bistvu ne vsebuje (+)-izomera, so boljši kot učinki racemnih spojin, opisanih v patentni prijavi JP 9/247445.

Konkretno navajamo zaželene farmacevtsko sprejemljive soli z anorgansko kislino, kot je klorovodikova, žveplova, bromovodikova, dušikova, metansulfonska kislina itd., ali z organsko kislino, kot je glukonska, vinska, maleinska, fumama, jantarna, jabolčna, mandljeva kislina itd.

Spojino v smislu izuma in kislinske soli kažejo farmakološki učinek, kot psihotropni učinek, ki ga pripisujemo povečevalnemu učinku kateholaminergične aktivnosti (CAE učinek). Poleg tega jih lahko uporabimo kot sestavek za zdravljenje Parkinsonove bolezni, antidepresante in psihotropne sestavke.

Pri merjenju kateholaminov, sproščenih iz možganskega debla podgane, potopljenih v Krebsovi raztopini med časi mirovanja ali elektrostimulacije, se kateholaminsko sproščanje znatno poveča s to spojino le med časom elektrostimulacije, ne pa mirovanja. Ta učinek spojine v smislu izuma je mnogo večji kot racemnih spojin, opisanih v patentni prijavi JP 9/247445. (+)-izomer kaže aktivnost kot tudi racemna spojina. Nadalje, čeprav je dajanje s kateholaminskim depletorjem, tetrabenazinom, zmanjšalo sposobnost učenja podgan, spojino v smislu izuma znatno izboljša sposobnost učenja, ki jo ocenimo kot kondicionirane izognitvene reflekse, v nižji dozi kot (+)-izomer ali racemna spojina.

Iz teh eksperimentov je jasno, da ima spojina v smislu izuma učinek povečanja kateholaminergične aktivnosti, ki poveča eksocitozo zaradi stimulacije, ki se nanaša na aktiven potencial in transmitersko sproščanje, t.j. povečanje intracelulame Ca²⁺koncentracije v nevronu. Nadalje je ta fiziološki učinek, brez nenormalnega obnašanja in aminske deplecije v kateholaminergičnem živčnem terminalu, različen od sproščevalnega učinka znanega sestavka za premestitev kateholamina.

Ob uporabi spojin v smislu izuma ali farmacevtsko sprejemljivih kislinskih soli kot gornja zdravila jih dajemo oralno ali parenteralno kot tablete, praške, granule, kapsule, sirupe, injekcije ipd. Čeprav so uporabljene doze različne in so odvisne vsakokrat od simptomov, starosti, telesne teže itd., je oralna doza za odraslega za te spojine običajno med 0,1 in 100 mg/dan. Poleg tega jih dajemo enkrat ali večkrat dnevno.

Spojine v smislu izuma so konkretno razložene v nadaljevanju.

PRIMER 1

Priprava (-)-l-(benzofuran-2-iI)-2-propilaminopentan hidroklorida

Optično ločenje izvedemo s HPLC metodo ob naslednjih pogojih. 115 μΐ 8 mg/ml (±)l-(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentan hidroklorida (racemna spojina) smo direktno injicirali v HPLC.

HPLC: LC-6AD, Shimadzu, Kyoto, Japonska

Kolona. CHIRALPACK AD 20 mm φ x 250 mm (DAICEL)

Mobilna faza: heksan:izopropanol:trifluoroocetna kislina = 100:2:0,1

Pretočna hitrost: 12 ml/min

Detektor. SPD-10A tip UV/VIS detektor (280 nm), Shimadzu, Kyoto, Japonska Temperatura: sobna temperatura

Olje (-)-l-(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentana raztopimo v brezvodnem etru in dodamo k etrski raztopini, nasičeni s hidrokloridom, da ga pretvorimo v hidrokloridno sol.

Tal.: 165,0-166,0 °C

IR: 3425, 2970, 2870, 2780, 2735, 2690, 2520, 2430, 1605,

1590, 1472, 1455, 1255, 1167, 942, 805, 770, 760 cm'¹

Elementna analiza: kot Ci₆H₂₃NO . HCI izrač.: C: 68,19, H: 8,58. N: 4,97 (%) ugot.: C: 68,07, H:8.48. N: 4,98 (%)

Optična čistota: 93 % ee

Specifična rotacija: [α]^2θ0 = -4,08 (c=4,0, metanol)

Referenčni primer

Priprava (+)-l-(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentan hidroklorida [ (+) -oblika]

Olje (+)-l-(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentana, dobljeno v primeru 1, raztopimo v brezvodnem etru in dodamo k etrski raztopini, nasičeni s hidrokloridom, da dobimo hidrokloridno sol.

Tal.: 170,0-171,0 °C

IT: 3425, 2970, 2870, 2790, 2735, 2700, 2515, 2425, 1607,

1590, 1472, 1455, 1250, 1175, 945, 802, 770, 760 cm'¹

Elementna analiza: kot Ci₆H₂₃NO . HCI izrač: C: 68,19, H: 8,58, N: 4,97 (%)

Ugot.: C: 67,90, H: 8,44, N= 4,98 (%)

Optična čistota: 100 % ee

Specifična rotacija: [α]²% = +4,01 (c - 4,0, metanol)

Rezultati farmakoloških študij so prikazani, kot sledi.

PRIMER 2

Merjenje biogenskih aminov, sproščenih iz možganskega debla podgane z elektrostimulacijo:

Uporabili smo metodo, opisano v Life Sci., 58, 2101-2114 (1996). Samce podgan s težo 280-350 g smo omamili z udarcem na tilnik, izolirali možgansko deblo (povprečna teža okoli 800 mg) ter namakali v oksigenirani (95 % O₂ in 5 % CO₂) Krebsovi raztopini 30 min pri 37 °C. Nato smo dali k preparaciji 20 μΐ raztopine Ήnoradrenalina (l-[7,8-^JH]-noradrenalin; specifična aktivnost: 30-50 Ci/mmol; Amersham) in za navzem dodelili 45 minut. Sestava Krebsove raztopine je bila v mmol/1, kot sledi: Na⁺ 137,4; K⁺ 5,9; Ca²⁺ 2,5; Mg²⁺ 1,2; Cl' 120,2; H₂PO₄' 1,2; HCO₃’ 25,0; SO 1,2 in glukoza 11,5; askorbinska kislina 0,3 in EDTA-2Na 0,03. Med časom navzema markiranega transmiterja je bil v Krebsovi raztopini prisoten pargilin (12 mmol) za blokiranje MAO aktivnosti.

Po navzemu Ή-noradrenalina smo možgansko deblo fiksirali v organski kopeli, ki je vsebovala 5 ml Krebsove raztopine (37 °C). Možgane smo nato spirali s hitrostjo 8 ml/min s Krebsovo raztopino, nasičeno s kisikom, ki je vsebovala 0,03 mmol/1 kokaina. Na koncu 100 minut smo perfuzijsko hitrost zmanjšali za 4 ml/min in modificirali Krebsovo raztopino, da je vsebovala tudi 0,05 mmol/1 kortikosterona. Poskus smo izvedli v prisotnosti kokaina in kortikosterona, (pri teh pogojih se 86 % ³H-noradrenalina ni metaboliziralo in se ni navzel niti nevronalno niti v drugih celicah). Frakcionacija perfuzata se je izvajala vsake 3 minute. Količino Ήnoradrenalina, sproščeno med vsakim 3 minutnim obdobjem, smo določili z 1 ml perfuzata v 5 ml Aquasafe 300 P (Zinsser) s scintilacijskim števcem (Beckman LS900). Na enak način je bila določena količina serotonina in dopamina. Možgansko deblo smo stimulirali s pravokotnimi pulzi (3 Hz, 1 ms, 60 V) 3 minute. Na začetku poskusa so bila pred prvo stimulacijo 3 mirujoča obdobja frakcije. Nato smo med stimulacijami dodelili 7 mirujočih obdobij frakcije. Spojine v smislu predloženega izuma smo raztopili v perfuzatnem pufru in pripravili raztopine 0,5, 1, 2,5 in 5 pg/ml. Pufer, kije vseboval spojine v smislu predloženega izuma, smo perfundirali 3 minute pred elektrostimulacijo.

Rezultati so prikazani na sl. 1. Kot je prikazano na sl. 1, smo potrdili, da spojina v smislu predloženega izuma poveča sproščanje noradrenalina, serotonina in dopamina s povečanjem eksocitoze, kadar damo živčnim celicam elektrostimulacijo.

Ugotovili smo, da so učinki spojine v smislu izuma v manjši dozi kot pri (+)-obliki in racemni spojini, kot je prikazano v tabeli 1.

Tabela 1: Minimalna doza (pg/ml) spojine v smislu izuma, ki povzroči sproščanje noradrenalina, dopamina in serotonina iz električno stimuliranega možganskega debla.

	Spojina v smislu izuma	(+)-izomer	Racemna spojina
Noradrenalin	1 χ IO'²	5 χ 10’¹	5
Dopamin	5 χ IO'²	5	N.D.
Serotonin	5 χ IO'⁴	10	1

PRIMER 3

Učinki na kondicionirano izognitveno nalogo v nihalni škatli (shuttle box)

Uporabili smo metodo, opisano v Life Sci., 58, 817-827 (1996). Učinke na kondicioniran izognitveni refleks (CAR) smo analizirali v nihalni škatli ob uporabi samcev in samic podgan (s težo 200-220 g), katerih sposobnosti za učenje smo zmanjšali z obdelavo s tetrabenzazinom. Instrument smo skonstruirali v skladu z napravo, opisano v Psychopharmacologia 10, 1-5 (1966). Samce in samice podgan (s težo 200-220 g) smo trenirali za prečkanje ovire pod vplivom kondicioniranega stimulusa (CS) (blisk svetlobe in brneči glasovi). Če tega niso storili, so bili kaznovani z nožnim šokom (1 mA), t.j. nekondicioniranim stimulusom (US). Če se podgane niso odzvale v 5 sekund na US, smo to označili kot odpoved pobega (EF). Obnašanje, ki pa ni bilo v zvezi s tem stanjem, pa smo označili kot intersignalno reakcijo (IR). Podgane smo trenirali 5 dni s 100 poskusi dnevno. En poskus je obstajal iz 15 sekund medposkusnega intervala. Raztopino tetrabenazina v fiziološki raztopini kuhinjske soli smo dali pri dozi 1 mg/kg subkutano eno uro pred testom, nato pa smo raztopino spojin v smislu predloženega izuma dali pri dozah 1, 2, 2,5 in 5 mg/kg subkutano istočasno s tetrabenazinom. Število CAR, EF in IR smo avtomatsko šteli in analizirali z večstransko analizo variance (ANOVA). Rezultati so prikazani na sl. 2.

Kot je prikazano na sl. 2, je spojina v smislu izuma znatno izboljšala zmanjšano funkcijo učenja podgan, ki smo jim dajali tetrabenazin. Učinek spojine v smislu izuma smo opazili v mnogo manjši dozi kot pri (+)-izomeru ali racemni spojini, kot je prikazano na tabeli 2. Smatramo, da imajo lahko te spojine antidepresivne učinke, ker seje EF znatno zmanjšal. Nadalje spojino v smislu izuma ni znatno spremenila IR, ki pomenijo vzburjenje brezkondicionime stimulacije in je v zvezi z nenormalnim obnašanjem, zato spojina ne kaže stimulantom podobnega vzburjenja.

Tabela 2: Minimalna doza (mg/kg) spojine v smislu izuma, (+)-oblike ali racemne spojine za povzročitev kondiciranih izognitvenih refleksov (CAR) pri podganah, obdelanih s tetrabenazinom, v nihalni škatli.

Spojina v smislu izuma	(+)-izomer	Racemna spojina
5 χ 10'² mg	2,5 mg	1 mg

PRIMER 4

Merjenje biogenskih aminov, sproščenih iz možganskega tkiva

Uporabili smo metodo, opisano v Life Sci., 56, 611-620 (1995). Po obglavljenju podgan Wistar smo hitro izolirali primerna možganska tkiva (striatum, substantia nigra, tuberculum olfactorium, locus coeruleus in raphe) in namočili v oksigenirani (95 % O₂ in 5 % CO2) Krebsovi raztopini pri 37 °C. Sestava Krebsove raztopine v mol/1 je bila kot sledi: NaCl 111, KCI 4,7, CaCl₂ 2,5, MgSO₄ 1,64, NaHCO₃ 25, KH₂PO₄ 1,2, glukoza 12, 50 mg/1 askorbinske kisline in 20 mg/1 EDTA-2Na. Preparati, namočeni v eni organski kopeli, so bili, kot sledi: 1) štirje koščki striatuma (vsak razpolovljen), 2) štirje koščki substantia nigra, 3) štirje koščki tuberculum olfactorium; 4) osem koščkov locus coeruleus; 5) osem koščkov raphe. Po inkubaciji tkiva 20 minut smo Krebsovo raztopino nadomestili. Po namakanju tkiva 20 minut v Krebsovi raztopini, kije vsebovala spojine v smislu predloženega izuma, smo določili količino biogenskega amina, sproščenega med tem časom. Spojine v smislu predloženega izuma, (+)-izomer, racemno spojino oz. kontrolno spojino smo raztopili v fiziološki raztopini kuhinjske soli in dajali subkutano 30 minut pred seciranjem možganskih vzorcev. V primeru noradrenalina in dopamina smo čistili vzorce na mikro kolonah (BDH Chemicals Ltd.), polnjenih s 60 mg glinice, po metodi, opisani v J. Pharmacol. Exp. Ther., 138, 360-372 (1962).

V primeru serotonina smo vzorce čistili na 15 mg Sephadex G-10 mikrokolonah (Pharmacia). Dopamin, noradrenalin in serotonin smo kvantificirali z visoko zmogljivostno tekočinsko kromatografijo (Waters 746 podatkovni modul) z elektrokemično detekcijo (Waters 460 elektrokemični detektor). Uporabili smo Waters Resolve 5 μ Spherical Cig 3,9 x 150 mm kolono kot ločilno kolono in kot mobilno fazo uporabili trietilaminfosfatni pufer (pH 5,2), ki vsebuje 200 mg/l oktan sulfonat natrija in 18 mg/l EDTA-2Na s 6 % acetonitrila. Sproščeno količino primernega amina smo označili kot nmol/g tkiva, sproščenega v 20 minutah. Razlike med povprečji smo testirali s Študentovim t-testom. Signifikantni nivo je bil postavljen pri P<0,05. Rezultati so prikazani v tabeli 3.

Čeprav so spojine v smislu izuma, (+)-izomer oz. racemna spojina povečale sproščanje biogenskih aminov, so pokazale spojine v smislu izuma učinkovitost v nižji koncentraciji kot (+)-oblika in racemna oblika, kot je prikazano na tabeli 3.

Tabela 3: Količina biogenskih aminov, sproščenih iz možganskih tkiv

							*
			*	*			*	*
			*	*			*	*	*
			*	*			*	*	*
		CM	cc	rc	rc	P—	—4	»r,	CM	f—ra	ra-
s		O	O	o	o	o	O	o	O	o	o
c		O	o	o	o	o	o	c	O	<d	o
o	O	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1
M—»		t	o	ra-	F-ra	c-	VC	00	CM	F—1	r-
o		CZ		t	CM	vc	00	rc	ra-	OO	vc
δ	rt	m	o	CZ	ra-	ra-	r-		o	cc	Tt
CZ	&,	θ'	—1	o	o	o	—4	—	o	o	o
	ζΛ
	□
	o			*
				*			*
c	3		*	*			*	*
rt	<υ D		*	*	*		*	*
	*	m	*		VC	*
c o U	U	o	o	vc	ic	m	rc	ir,	o	VC	o
		θ'	o	CM	o’	—_r		CM #K	CM
rt u		o	o	+1	o	θ'	+1	d	O	o	O
	+1	+1	ra-	+1	+1	rc	+1	+1	+1	+1
o	o		MO	c	<z	rc	d	ra;	rt;	M?	rc
Z	J	Tf	o		rc	ra⁵	—¹		rt	ir?
			-X-	*	*	*	*			*
	E E		* *	* *	* *	* *	* *			* *	* *
	3 3		*	*	*	*	*			*	*
		IT»	rc	oo		σκ	KO	m	oo	o	o
	o ®	—*	CM	o	rc		O	CM	—	CM	CM
	>-» Τί <D S< -3 -g	d	O	o	o	o	O	O	o	O	O
	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1	4-1	+1	+1
	rt —-	cz	CM	r-	CZ	r-	r-	00	00	rc	ir»
	H 0	r> Tt		r· KO	MO	r» r-	r> KO	ra-’	rt	C-	ko
			*	*	*	*	*			*
			*	*	*	*	*	*		*
			*	*	*	*	*	*		*	*
	rt		*	*	*	*	*	*		*	*
		o>	cc	,—1	T—4	IT)	*		m	*
C	4—»	00	rc	CM	CM	F—4	CM	rt*	ra-	CM	ra-
g	S .2		θ'	r\ o	θ’	θ'	o”		CM	θ	o
rt	ubsti ligra	o	+1	+1	+1	+1	+1	o	d	+1	o
O. o	+1 00	oo n ra-	00 r rc	rc	<z o	oo n rc	+1 -ra	+1	<z c ir»	+1 KO
Q	CZ) A.	o		-^-				oo	r-~		KO
						*
					*	*				*	*
					*	*				*	*
					*	*				*	*
	S	IT»	ra-	KO	<z	<z	rc	o	Γ~~-	»—1	ra·
	c		f—4			o	f—4	—	—«	CM	F-ra
		θ'	θ'	o’	d	θ'	O	d	d	o	<d
	rt	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1	+1
	Ui	m	Γ-	00	r-	ir»	rt	rt-	ra-	00	cc
	CZ!	ra-	rt·	rt	ir»	KO	rt-	rt	rt	C	ir»

'Sč

E o

CZ3

O ώί t/5

M	ir»	ir»	o	ir»	ir»		o	o
O	O	CM	o	o	CM		o	o
o	O	O	ir»	o	o	vc	o	—4
O	O	O	o.	O	c?		>—<	O_r
o	o	o	o	d	o	c?	o	d

J3 c/3 'g >

C3 • E ^ra•o' g & .a s_

O

P o

N ra

O

C.

C3

O u

ra

C4 o

<3 <d

V

0-4 *

* *

*

O θ' v

CL, *

* *

(N <O o

v ou

PRIMER 5

Učinek na monoamin oksidazo tipa B (MAO-B)

Po obglavljenju samcev miši C57B1/6 smo takoj izolirali celotne možgane. Možganske vzorce smo stehtali in homogenizirali v 0,2 mol/1 kalijevega fosfatnega pufra (pH 7,5), ki je vseboval 1,0 % EDTA-2Na, s homogenizatorjem. Po centrifugiranju homogenata pri 2000 obr/min 20 minut smo supernatant centrifugirali pri 18000 obr/min (40000 g) 30 minut. Palet smo resuspendirali in nadalje centrifugirali na isti način. Nato smo pelet resuspendirali v gornjem pufru, da je nastala encimska raztopina. Ves postopek smo izvajali pri 4 °C.

¹⁴C-markiran substrat (¹⁴C-feniletilamin) in encimsko raztopino iz miši smo pomešali v epruveti, inkubirali 30 min pri 37 °C in reakcijo ustavili z 20 μΐ 6 mol/1 HCI. Reakcijski produkt smo ekstrahirali s toluenom-etilacetatom (1:1) in radioaktivnost merili ob uporabi scintilacijskega števca. Nato smo izračunali učinkovitost inhibiranja MAO-B. Rezultati so prikazani na tabeli 4. Inhibitomo aktivnost vsake spojine v 10’^Jmol/1 je bila pod 50 %, kot je prikazano na tabeli 4. To sugerira, da spojina v smislu izuma nima učinka inhibiranja MAO-B.

Tabela 4: Učinki inhibiranja MAO-B na možgane miši v koncentraciji 10'⁵ mol/1

	Inhibitoma aktivnost
Spojina v smislu izuma	4,7%
(+)-izomer	1,7%
Racemna spojina	22,9%

PRIMER 6

Afinitete na receptorje od a₍, a₂, D_b D₂, 5-HT! in 5-HT₂

Raztopino receptorja smo pripravili, kot sledi. Takoj po obglavljenju podgan smo izolirali možgane in stehtali. Možganske vzorce smo nato homogenizirali v 10-kratnih volumnih ledeno mrzle 0,35 mol/1 saharoze (pH 7,4) s steklenim homogenizatorjem s teflonskim batom, ki so ga vrteli motorji. Homogenat smo centrifugirali pri 4 °C pri 900xg 10 minut in supematant smo nadalje recentrifugirali pri 4 °C pri 22000xg 20 minut. Oborino smo suspendirali z dodatkom 5 mmol/1 fosfatne pufrske raztopine (pH 7,4). Po inkubiranju suspenzije pri 37 °C 30 minut smo suspenzijo recentrifugirali pri 4°C pri 2000xg 20 minut. Oborino smo resuspendirali z dodatkom 10 ml 5 mmol/1 fosfatne pufrske raztopine (pH 8,0), kije raztopina receptorja.

H-prazocin smo uporabili kot ligand. 0,25 nmol/1 Ή-prazocina, spojine v smislu predloženega izuma oz. raztopino receptorja v 5 mmol/1 fosfatnem pufru (pH 8,0) smo dodali v cevko in zmes inkubirali pri 25 °C 90 minut. Poleg tega se je pokazala nespecifična vezava z vezavno vrednostjo ³H-prazocina v prisotnosti 0,1 pmol/l prazocina. Vezavni test smo izvedli, kot sledi. Po ločenju ³H-prazocina (vezavni tip: B), vezanega na receptor, smo zbrali le vezavni tip ³H-prazocina ob uporabi B/F separatorja (Brandel, ZDA) s filtrom iz steklenih vlaken (velikost por: 0,5 pm, Whatman GF/C) in prost tip prazocina (prost tip: F) odstranili. Filter iz steklenih

I vlaken, ki je absorbiral vezavni tip Ή-prazocina, smo izprali z ledenomrzlo fiziološko raztopino kuhinjske soli in prenesli v fiolo. Po dodatku 10 ml scintilacijskega koktejla smo izmerili radioaktivnost. Afiniteto spojin v smislu izuma do cti receptorja smo ocenili iz vezavne inhibicijske stopnje med cti receptorjem in ligandom.

Na isti način smo določili afinitete spojin v smislu predloženega izuma do receptorjev od a₂, D[, D₂, 5-HT[ oz. 5-HT₂ ob uporabi 0,7 nmol Ή-rauvolscina, 1,4 nmol/1 ³HSCH-23390, 2,0 nmol/1 spiperona, 2 nmol/1 Ή-5-ΗΤ oz. 0,5 nmol/1³H-ketanserina kot njihovih zadevnih ligandov. Poleg tega smo uporabili 1 pmol/l johimbina, 10 pmol/l (+)-butaklamola, 10 pmol/l haloperidola, 10 pmol/l 5-HT in 1 pmol/l ketanserina kot njihovih sredstev za premeščanje.

Če je afiniteta določene spojine do določenega receptorja visoka, je vezava med radioligandom in receptorjem inhibirana. Če je koncentracija določene spojine, ki je potrebna za 50 % inhibiranje vezave med ligandom in receptorji, večja kot 10'⁶ mol/1, se na splošno smatra, da spojina nima zadostne aktivnosti, da pokaže fiziološko aktivnost. Rezultati so prikazani na tabeli 5.

Pokazalo se je, da spojine v smislu izuma, (+)-izomer in racemna spojina nimajo afinitete, kije potrebna za prikaz fiziološkega učinka, kot je prikazano na tabeli 5.

Tabela 5: Afiniteta do receptorjev *

	ai	a₂	D,	d₂	5-HTi	5-HT₂
Spojma v smislu izuma	>10'⁵	3,lxl0'⁶	>10'⁵	>10'⁵	>10'⁵	1,0x10'⁵
(+)- izomer	>10'⁵	2,6x10'⁶	>10‘⁵	>10'⁵	>10'⁵	>10’⁵
racemna spojina	>10’⁵	1,0x10'⁶	>10'⁵	>10’⁵	>10'⁵	2,0x10’⁵

*Koncentracija (mol/1), ki kaže 50 % inhbicijo med vsakokratnim ligandom in receptorjem

Rezultati varnostnih testov so prikazani, kot sledi.

PRIMER 7

Skrining toksičnosti ob uporabi primarnih gojenih hepatocitov

Hepatocite smo pripravili iz podganjih jeter s kolagenazno perfuzijsko metodo in pripravili celične suspenzije, ki vsebujejo 5x10⁵ celic/ml. Po gojenju 24 ur smo medij izmenjali z William's Medium E (GIBCO ERL), ki je vseboval 10 ali 100 pmol/l spojin v smislu predloženega izuma. Po gojenju 24 ur smo merili aktivnost laktatdehidrogenaze (LDH), sproščene v medij.

Kot rezultat je 100 pmol/l spojine v smislu izuma rahlo povečalo sproščanje LDH, vendar pri 10 pmol/l ni bilo povečanja, kot je prikazano na tabeli 6.

Tabela 6: Odstotna kontrola LDH sproščanja iz primarno gojenih hepatocitov spojina v smislu izuma, (+)-oblika ali racemna spojina

	100 pmol/l	10 pmol/l
Spojina v smislu izuma	126,42±8,04*	104,94±4,96
(+)-izomer	116,72±6,91	124,41±12,54
Racemna spojina	112,10±36,98	90,28±2,85

PRIMER 8

Tekst toksičnosti pri miših pri enem dajanju

Po dajanju spojin v smislu izuma pri dozi 100 mg/kg p.o. smo vsak dan 2 tedna opazovali splošne simptome pri miših. Preživela je vsaka tretja miš.

OPIS RISB

Sl. 1. Ta slika kaže, da spojina v smislu izuma poveča sproščanje noradrenalina, dopamina in serotonina iz izoliranega možganskega debla podgan z elektrostimulacijo. *-* pomeni obdelavo te spojine in · pomeni elektrostimulacijo.

Sl. 2 ta slika prikazuje učinkovitost spojine v smislu izuma na zmanjšano sposobnost učenja podgan, če jo dajemo s tetrabenazinom ob uporabi naloge v nihalni škatli.

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. (-)-l-(benzo furan-2-il)-2-propilaminopentan z naslednjo formulo in farmacevtsko sprejemljive kislinske soli.
2. Medicinski sestavek, ki vključuje spojino po zahtevku 1 kot aktivno spojino, za uporabo za povečanje kateholaminskega sproščanja v centralnem živčnem sistemu.
3. Medicinski sestavek, ki vključuje spojino po zahtevku uporabo za psihotropni sestavek.
4. Medicinski sestavek, ki vključuje spojino po zahtevku uporabo kot antidepresiv.
5. Medicinski sestavek, ki vključuje spojino po zahtevku uporabo za zdravljenje Parkinsonove bolezni.
6. Medicinski sestavek, ki vključuje spojino po zahtevku uporabo za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni.

kot aktivno spojino, za kot aktivno spojino, za kot aktivno spojino, za kot aktivno spojino, za
7. Medicinski sestavek, ki vključuje spojino po zahtevku 1, označen s tem, da je optična čistota (-)-l -(benzofuran-2-il)-2-propilaminopentana zlasti več kot 80 % ee.
8. Sestavek po zahtevku 7, za uporabo za povečanje kateholaminskega sproščanja v centralnem živčnem sistemu.
9. Sestavek po zahtevku 7 za uporabo kot psihotropni sestavek.
10. Sestavek po zahtevku 7 za uporabo kot antidepresiv.
11. Sestavek po zahtevku 7 za uporabo za zdravljenje Parkinsonove bolezni.
12. Sestavek po zahtevku 7 za uporabo za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni.