PT101140A - Processo para a purificacao de polissacarideos e materiais polissacarideos ultra-puros para utilizacao medica assim obtidos - Google Patents
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Description
FUNDAMENTOS DO INVENTO
Campo do Invento
Este invento relaciona-se com um processo para ultra--purificação de "grau médico" de polissacarídeos de modo a poderem ser colocados internamente com segurança no interior do corpo (organismo). Mais particularmente, este invento relaciona--se com a prevenção da formação de fibrina põs-cirúrgica, que por último leva à formação de aderências entre tecidos corporais internos adjacentes, pela utilização de polissacarídeos altamente purificados.
Descrição de Técnicas Anteriores
Recentemente, os polissacarídeos foram alvo de especial atenção no campo da medicina, particularmente para utilização no campo de pensos para feridas. Materiais tais como celulose, derivados da celulose, alginato de cálcio, quitina e derivados da quitina têm sido encontrados em materiais comercialmente disponíveis como pensos para feridas. Outros materiais tais como ácido hialurónico estão a ser explorados para aplicações como pensos de feridas. A vantagem da utilização de polissacarídeos selecciona-dos em aplicações médicas consiste no facto de serem biodegradáveis/ biocompatíveis, bioreabsorvíveis, de natureza biológica, e de poderem ser fácilmente modificados (por exemplo ligação cruzada) a fim de produzir dispositivos que possam ser colocados internamente mo organismo durante períodos de tempo variáveis. Contudo, sob um ponto de vista de biocompatibilidade, a utilização de um polissacarídeo para uma aplicação externa, tal como um penso para ferida, pode diferir drásticamente do uso interno. 0 ácido hialurónico é um dos poucos polissacarldeos que encontrou êxito comercial como um fluído de substituição intra-ocular durante técnicas oftalmológicas seleccionadas. Mais recentemente, a metil celulose foi também oferecida comercialmente para aplicações semelhantes.
Aplicações internas, tais como estas, requerem processos de purificação prolongados e dispendiosos (Patente dos E.U.A. No. 4.141.973 para Ácido Hialurónico). Verificou-se que os materiais polissacarldeos de "grau médico" tais como o ácido algínico, quitosan, celulose e seus derivados são tão impuros que causam inflamações graves quando implantados internamente em certos sítios. Tem sido sentida a falta desde há muito de um método barato para produzir polissacarldeos altamente purificados para implantação no corpo (organismo). A película ou solução de polissacarldeos altamente purificada produzida pelo processo de purificação do presente invento é principalmente utilizada para a prevenção de depósito fibroso em aplicações ortopédicas, mas é também usada em aplicações tais como fluido de lavagem, lubrificante articular, líquido sinovial artificial, material anti-inflamatório, um adjuvante da terapêutica física e uma matriz veículo para agentes farmacológicamente activos incluindo factores de crescimento e outros factores osteo-indutores. As soluções ou películas podem ainda ser modificadas por vários métodos químicos já reconhecidos na bibliografia.
Uma adesão resulta da organização de exsudado fibrinoso sobre as superfícies dos tecidos devido à inflicção de traumatismo ou processo de inflamação. Tecidos tais como vasos sanguíneos ou orgãos incluindo rim, fígado e intestinos são revestidos com membranas mucosas ou membranas serosas de modo a poderem J t Λ
funcionar independentemente uns dos outros. Èxênipios de membranas mucosas ou serosas são a pleura da parede externa e a pleura orgânica na cavidade torácica, e o peritoneu parietal e o mesen-terio na cavidade abdominal, cada um deles protegendo os orgãos correspondentes. 0 traumatismos cirúrgico ou a inflamação nessas porções do organismo revestidas com membranas serosas podem levar a aderências independentemente do tamanho da parte afectada. Essas aderências entre tecidos podem ser observadas em todos os tecidos do corpo (do organismo), não apenas os atrás mencionados. As aderências entre tecidos podem levar a dor grave, função diminuída, e mesmo a permanente perda da motilidade.
No campo ortopédico, condições tais como artrite aguda ou crónica (por exemplo artrite supurativa, artrite reumatoide, artrite gonorreica, tuberculose), ou lesões traumáticas na articulação (por exemplo fractura ou entorse), poderão resultar em doença aclótica em que a superfície dos ossos, assim como os tecidos moles afectados constituindo a articulação, aderem uns aos outros e desse modo restringem a mobilidade da articulação. Outra situação de aderencia, a sintose radioulnal congénita, em que o rádio e o cúbito aderem entre sí, é difícil de tratar por operação cirúrgica visto que os ossos separados frequentemente voltam a aderir. Enquanto que complicações da articulação rótula--fémur a seguir à substituição total do joelho são raras, verificou-se que a disfunção da articulação rótula-fémur era secundária a faixas fibrosas intra-articulares (Thorpe et al, Journal of Bone and Joint Surgery (JBJS) Vol. 72A, No. 6, p. 811, 1990). A fibrose intra-articular na reconstrução do ligamento cruciforme anterior (ACL) foi também verificada (K. Shelbourne et al, Am. J. Sports Med., Vol. 19, No. 4, p. 332, 1991).
As aderências são também importantes na cirurgia dos tendões. Neste caso, existe uma tendencia generalizada para 5
aderências entre o tendão e a bainha do tendão» e outros tecidos circundantes durante um plríodo de imoboilização a seguir ã operação (P. Matthews et al., JBJS Vol. 58B, No. 2, P. 230, 1976; Matthews, The hand, Vol. 11, No. 3, P. 233, 1979; Gelberman et al., Hand clinics, Vol. 1, No. 1, P. 35, 1985). Mais recentemen-te, tem havido um maior interesse na prevenção da "membrana de laminectomia" formada a seguir a vários processos espinais. Esta membrana é uma massa bem organizada de tecido fibrinoso que substitui o osso que foi removido na laminectomia. Esta massa fibrinosa liga a dura aos músculos sobrejacentes (H. LaRocca and I. McNab, JBJS, Vol. 56B, No. 3, P. 545, 1974). Isto leva a um estreitamento do canal espinal que provoca pressão sobre as raizes nervosas da cauda equina. Esta formação de tecido cicatri-cial pode requerer uma nova operação que é aborrecida e perigosa, levando à possibilidade de rasgaduras durais e a lesões das raizes nervosas emergentes levando a uma fraqueza motora, a alterações sensoriais e a uma parestesia dolorosa.
Foram publicados vários artigos sobre vários tratamentos para evitar a formação de aderências. Tratamentos com parafina líquida, óleo de canfora, sulfato de condroitina e ureia apresentam um efeito insuficiente visto actuarem apenas temporáriamente. Outros tratamentos profiláticos tais como membranas de silicone, guta-percha, ou poli (tetrafluoroetileno) membranas têm sido utilizados para servirem como barreiras à formação de aderências, contudo, estes materiais ficam no corpo e muitas vezes são reconhecidos pelo corpo como corpos estranhos. Assim, pode ser necessária uma segunda operação a fim de remover o material que serve de barreira. O material polissacarídeo altamente purificado do presente invento pode ser utilizado para aplicações ortopédicas tais como prevenção de aderencia intra-articular, de aderências 6
do tendão flexor, cicatrização espinal, ombroí- rígido, lesão do rotador do punho e outras. Além disso, o material altamente purificado pode ser usado como uma matriz para fazer crescer condrocitos ou outras células para re-implantação e regeneração de tecidos naturais tais como cartilagem. Como uma matriz, o material pode também servir como um veículo para factores de crescimento, agentes farmacológicamente activos que possam induzir a regeneração de tecidos seleccionados. O gel, solução ou película de polissacarídeo biodegradável asim altamente purificado do presente invento será colocado entre tecidos para afectar a formação de aderências, localizado em contacto com o(s) tecido(s) afectado(s) para outras aplicações referenciadas, e afixado para cobrir o tecido afectado para regeneração. A aplicação destes materiais pode ocorrer antes, durante ou após a operação. 0 pedido de patente 07/644.758, apresentado em 24 de Janeiro, 1991 e cedido ao cessionário do presente invento, relaciona-se com a utilização de derivados do quitosano para prevenção das aderências.
Foram publicadas várias patentes sobre o tema da utilização de ácido hialurónico para aplicações contra a formação de aderências (Balasz, U.S. Patent 4.141.973 e DeBelder, WO 86/00912). Embora estas patentes incidam sobre a utilização de geles e películas para a prevenção da formação de aderências, elas não se dirigem ao fabrico de películas altamente purificadas que possam ser fácilmente produzidas, manipuladas, e aplicadas em várias aplicações para anti-formação de aderências.
Foram publicados outros artigos e patentes envolvendo a utilização de polissacarldeos como veículos de agentes 7
terapêuticos a fim de evitar a deposição de fibrina (Mohler, WO 89/00049; Sheffield, U.S. Patent 4.889.722 e Dizegra, EP 0.234.887). Ainda outros polissacarídeos tais como goma xantam (Higham, U.S. Patent 4.994.277), celulose regenerada oxidada (Linsky, EP 0.262.890 e EP 0.213.563), e alginato sódio/cãlcio (G. Blaine, Medicai press, August 20, 1947, p. 166).
Embora estas patentes e publicações incidam todas sobre a utilização de polissacarídeos, a questão da purificação e do fabrico tem-se apresentado limitada.
SUMÁRIO DO INVENTO
Um objectivo deste invento consiste em proporcionar um método barato e eficiente para preparar polissacarídeos biodegradáveis altamente purificados para aplicações biomédicas internas.
Um outro objectivo deste invento consiste em proporcionar um processo de filtração para purificação dos polissacarídeos de modo a que possa ser produzida uma película mais manejável e facilmente manipulada composta por material polissacarídeo altamente purificado. O material de escolha deste invento inclui, mas não se limita a, metil celulose e seus derivados, quitina/quitosan e derivados, ácido algínico, goma xantam, e ácido hialurónico de baixo peso molecular (>750.000 daltons). Outros materiais tais como colagénio, ácidos poliamino, e outros podem também ser usados com sucesso utilizando o método de purificação deste invento. V.
Embora tenha havido patentes dirigidas à purificação de ácido hialurõnico ocorrendo naturalmente para aplicações médicas (Balazs, U.S. 4.141.973; Hildesheim, EP 0.239.335; Delia Valle, EP 0.138.572 e Brown, EP 0.144.019), este invento proporciona um processo de filtração simples que pode ser utilizado para todos os polissacarídeos a serem utilizados para aplicações internas. Embora muitos polissacarídeos de "grau médico'* possam ser comprados em vários fornecedores, a maior parte não se apresenta apropriada para implantação interna em vários tecidos originando respostas inflamatórias graves. Os que são referidos como de "grau médico" são, na sua maior parte, materiais aprovados para substitutos alimentares ou para uso externo.
No presente invento, estes materiais são libertados de qualquer excesso de agentes inflamatórios tais como proteína, ácidos nucleicos, agentes pirogénicos, lípidos, impurezas hidro-fóbicas, impurezas de baixo peso molecular e outras. Os produtos resultantes podem proporcionar materiais de elevado peso molecular, se desejado, que se apresentam livres de proteína, peptídeo e agentes pirogénicos e cujas soluções concentradas não provocam uma reacção inflamatória quando implantadas nos espaços do tecido conjuntivo animal ou humano. Esta reacção inflamatória, ou a sua falta, pode ser caracterizada intra-articularmente na articulação da soldra altamente sensível do coelho branco da Nova Zelandia. Métodos comuns para analisar a inflamação desta articulação poderão incluir avaliação a olho nú, avaliação citolôgica, histopatologia, e ensaios normalizados em relação a mediadores inflamatórios no líquido sinovial. Deve também ser notado que estes materiais altamente purificados podem ainda ser modificados (por exemplo submetidos a ligação cruzada ou misturados) a fim de proporcionar produtos finais com tempos de residência i& vivo variáveis.
É importante levar os matérias purificados pelo método do presente invento ã forma física apropriada para que sejam eficazes em cada aplicação. Em duas utilizações afins do presente invento, pode-se usar uma solução de lavagem ou líquido de substituição artroscópico, uma solução diluída purificada de polissacarídeo. Esta solução varia na sua concentração entre 0,l%-2,0% dependendo do peso molecular do polissacarídeo. Noutras aplicações afins tais como prevenção das aderências, líquido sinovial artificial, ou lubrificação articular, pode ser utilizada uma solução mais viscosa ou gel do polissacarídeo altamente purificado. Este tipo de gel pode ter uma concentração entre 0,1% e 10,0% dependendo do peso molecular.
Ainda noutras aplicações, tais como cicatrização espinal, aderências do tendão flexor e aderências intra-articula-res, uma película liofilizada oferece uma excelente forma para utilização. A forma física desta película pode ser manipulada a fim de proporcionar a desejada flexibilidade e espessura que irá proporcionar uma película com melhores qualidades de aplicação assim como quailidades de eficácia.
Os polissacarídeos biodegradáveis a ser utilizados em várias aplicações ortopédicas indicadas poderão eventualmente ser degradados em produtos biocompatíveis mais pequenos que possam ser fácilmente removidos do corpo por vias excretoras naturais.
Estes e outros objectivos e aspectos do presente invento tornar-se-ão aparentes a partir da descrição pormenorizada que se segue, que apresenta vários exemplos do invento.
DESCRIÇÃO DA APRESENTAÇÃO PREFERIDA
No processo do presente invento é preferido utilizar polissacarídeos solúveis na água, contudo, o invento não se limita a um polímero solúvel na água. Exemplos destes materiais solúveis na água incluem, mas não se limitam a: ácido hialurónico de baixo peso molecular (750.000 daltons), carboximetil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxietil celulose, alginato de sódio, quitina, quitosan, lactato de quitosan, glutamato de quitosan, acetato de quitosan, metil quitosan, N-carboximetil quitosan, O-carboximetil quitosan, N,O-carboximetil quitosan, acetato de Ν,Ο-carboximetil quitosan, N-carboxibutil quitosan, O-carboxibu-til quitosan, Ν,Ο-carboxibutil quitosan e goma xantam. Todos estes produtos são preparados a partir de produtos naturais ou podem ser obtidos por meio de métodos de fermentação bem conhecidos e encontram-se na sua maior parte disponíveis comercialmente num grau médico.
Quando se processa o material em bruto de modo a obter-se material purificado apropriado para implantação, é desejável inicialmente utilizar vários passos de filtração de extremidade fechada. Para a filtração de extremidade fechada, é preferível preparar uma solução relativamente diluída inferior a 1% e de preferência 0,25% em água purificada, (esta concentração pode ser variada dependendo do material e do peso molecular) sendo o material com peso molecular mais elevado diluído ainda em água purificada se necessário para facilitar a filtração. É preferível conduzir a filtração seriada de extremidade fechada por meio de filtros de nitrocelulose que possuem uma elevada afinidade em relação a proteínas e a ácidos nucleicos. Esses filtros encontram-se disponíveis comercialmente sendo fornecidos por Schleicher and Schuell. 11 -
A seguir â filtração de extremedidade fechada é desejável submeter a solução resultante a um método modificado de ultra-filtração. Neste método, é utilizada uma membrana de ultra-filtração (UF) derivatizada. Uma membrana deste tipo é fornecida por AlerCHEK (Portland, Maine). A membrana tal como é adquirida é modificada com polipeptídeos que se ligam específicamente a lipopolissacarídeos, e outras impurezas hidrofóbicas. É ainda preferido que a membrana de ultra-filtração modificada tenha um tamanho de poro que permita que o material não só passe sobre a membrana, mas também que passe através da membrana de modo a que as impurezas atrás discutidas sejam removidas de um modo mais eficaz. Isto oferece uma exposição dos matérias a uma maior superfície do filtro modificado. É também desejável, embora não necessário, que o aparelho de ultrafiltração tenha um fluxo tangencial. Isto irá permitir uma circulação contínua de material em vez de uma simples passagem como ocorreria com um fluxo axial. 0 tamanho do poro da membrana modificada pode variar entre 0,2 mícrons e 12 mícrons dependendo do material e do peso molecular. Se se utilizar um fluxo tangencial, será também possível empilhar várias membranas modificadas umas sobre as outras a fim de reduzir o tempo de filtração e ao mesmo tempo aumentar a superfície disponível para o tratamento.
No passo que se segue, é então preferível dialisar a solução resultante por meio de uma técnica de ultra-filtração normalizada utilizando uma membrana selectiva para pesos moleculares mais baixos. Mais uma vez, a selectividade dos pesos moleculares irá depender do peso molecular do material a ser purificado e da estrutura química do material. Neste passo, é desejável usar uma membrana tendo uma para pesos moleculares os mais elevados possíveis mantendo ainda o material com o peso molecular desejado. Este passo irá remover quaisquer materiais de baixo peso molecular que não tenham sido removidos por absorção pela membrana de ultra-filtração no passo anterior. 0 material retido terá então atingido um elevado nível de pureza. A solução de polissacarídeo altamente purificada produzida pelo método do presente invento pode então ser colocada na forma apropriada para várias aplicações ortopédicas e outras aplicações médicas. Por exemplo, um líquido de lavagem ou artros-cópico pode ser preparado tomando o material altamente purificado e dialisando-o contra água, solução salina fisiológica, PBS, Ringer, ou outras soluções fisiológicas a fim de obter o pH desejado e o make-up iónico para a aplicação desejada. A concentração apropriada pode ser obtida diluindo a solução com a solução aquosa apropriada, ou concentrando-a por ultra-filtração contra a solução apropriada. A concentração final deve ser de aproximadamente 0,l%-4,0%, embora este valor possa variar de acordo com o material e com as suas características.
Alternativamente, o material altamente purificado pode ser formado em películas para aplicações tais como anti-formação de aderencia do tendão flexor, aderências intra-articulares, cicatrização espinal, e dores do ombro intra e extra-articulares. Embora existam vários meios para preparar películas, o meio desejado consiste em verter uma solução num recipiente plano de pouca profundidade, tal como uma placa de Petri, e liofilizar a solução. 0 produto resultante é uma película altamente purificada com características de utilização notáveis. As características físicas das películas podem ser manipuladas fazendo variar a concentração da solução a fim de produzir uma película mais forte, menos flexível com uma solução mais concentrada, ou uma película mais fraca, mais fibrosa com melhor flexibilidade com uma solução menos concentrada. De novo, dependendo da aplicação, a película pode ser modificada quanto á sua espessura variando a quantidade de solução inicialmente colocada no recipiente pouco 13
profundo. A outra vantagem de utilizar uma película liofilizada nestas aplicações, para além de facilitar a sua manipulação, consiste no facto da película não necessitar de agentes de plasticidade para produzir flexibilidade, e a película liofilizada terá um tempo de residência mais longo na localização específica devido ao tempo inicial necessário para hidratar o material antes do material entrar no estádio gelatinoso.
Um terceiro exemplo de uma aplicação interna para a película altamente purificada consiste em tomar as películas liofilizadas e modificá-las a fim de aumentar ainda mais o tempo de residência numa aplicação anti-aderencia ou cicatrização espinal. Isto pode ser realizado usando técnicas de modificação bem conhecidas tais como a formação de um complexo de películas de alginato de sódio com cloreto de cálcio, ou tratamento de derivados de carboximetil quitosan com uma solução ácida tal como é discutido no requerimento de patente co-pendente 07/644.758. Existem, evidentemente, outros métodos para modificar os vários outros polissacarídeos mencionados que são bem conhecidos. É também possível neste invento produzir primeiro um gel modificado com a solução altamente purificada, e em seguida liofilizar o gel dando origem a uma forma de película. O invento será agora descrito mais pormenorizadamente sendo feita referencia aos exemplos que se seguem. Deverá, contudo, ser reconhecido que os exemplos são dados a título ilustrativo do presente invento não se pretendendo definir o seu espirito e âmbito. X'
Exemplo 1
Uma solução de dois litros de alginato de sódio a 0,5% com elevado conteúdo de ácido glucorónico (>50%) foi preparada em água livre de agentes pirogénicos (solução salina, PBS, ou Ringer são solventes alternativos). A solução resultante foi feita passar através de um filtro de membrana de nitro-celulose de 12 microns (Schneider and Schuller): Esta solução foi então feita passar através de um filtro de nitro-celulose de 0,45 mícron (pode ser necessário utilizar um tamahno de poro mais elevado, tal como de 8 microns, antes de utilizar o de 0,45, dependendo do grau de impurezas insolúveis nos materiais e do peso molecular). Também, se necessário, pode ser utilizado um filtro até 45 microns como um primeiro passo e um filtro com 1 micron pode ser usado como um passo final.
Uma Membrana de Afinidade para a Endotoxina de 0,5 micron (AlerCHEK, Portland, ME Cat # 4200) foi instalada num aparelho de ultra-filtração com fluxo tangencial (Filtron Part Number FS021K01) e o conjunto resultante foi totalmente deshidro-genado por passagem de uma solução alcalina diluída ou de um detergente dodecilfosfato de sódio diluido. 0 conjunto foi então irrigado com uma solução de metanol diluída (10%) seguindo-se lavagem exaustiva com água livre de agentes pirogénicos. A remoção do detergente vestigial pode ser determinada por análise com UV a 270 nm. A solução de alginato foi então deixada passar sobre e através da membrana, recirculando constantemente durante aproxi-madamente uma hora (este tempo pode ser reduzido se se utilizarem duas ou mais membranas, ou membranas maiores com uma maior superfície). Após esta filtração, a cor amarelo claro na solução inicial desaparece permanecendo uma solução dè'âlginato cristali na.
Em seguida, a solução foi dialisada exaustivamente numa membrana com selectividade para pesos moleculares de 300.000 a fim de remover quaisquer materiais de baixo peso molecular que não tenham sido removidos pela membrana de ultra-filtração modificada. Isto foi feito contra água. Para este exemplo, uma solução final de 1 litro foi dialisada contra 7 litros de água purificada. Tal como foi atrás indicado, o peso molecular cutoff para a membrana pode variar dependendo do peso molecular do material. É muito desejável usar a membrana cutoff com o peso molecular mais elevado a fim de remover tanto material de baixo peso molecular quanto possível sem comprometer a variação do peso molecular desejado para o produto final. A solução pode ser dialisada contra qualquer solução aquosa apropriada dependendo da aplicação.
Finalmente, a solução foi concentrada por meio de técnicas de ultra-filtração até uma concentração de 1%. A solução de alginato altamente purificada resultante foi então submetida aos testes normalizados de biocompatibilidade in vivo (esterilidade, citotoxidade, agentes pirogénicos, hemóli-se). Os resultados foram negativos para cada um destes testes. O material foi então implantado, por meio de injecção, para a articulação da perna com a coxa de um coelho branco da Nova Zelandia SPF durante um período de 2-4 dias. O alginato não produziu uma resposta inflamatória reconhecível a olho nú, ou quaisquer respostas citológicas ou histopatológicas. Isto demonstra que o material tinha sido purificado até um nível apropriado para aplicações ortopédicas internas. - 16 A utilização da articulação da perna com a coxa do coelho para o teste de biocompatibilidade é superior ao teste intramuscular. A implantação intra-muscular padrão de alginato de •'grau médico" indicou em várias ocasiões um material biocompatí-vel. Contudo, quando este material de "grau médico" foi implantado na articulação da perna com a coxa de um coelho, ele produziu uma reacção inflamatória grave. Assim, a articulação da perna com a coxa, sendo altamente vascular, proporciona um sítio preservador para teste de biocompatibilidade. Além disso, a articulação da perna com a coxa é uma área onde esses matérias purificados podem ser usados para várias aplicações ortopédicas.
Exemplo 2
Uma solução de um litro de alginato a 0,5% foi preparada e purificada tal como foi atrás indicado no Exemplo 1. A seguir ao passo de diãlise contra água a fim de remover materiais de baixo peso molecular, a solução foi dialisada contra 7 litros de lactato de Ringer numa membrana de ultra-filtração com um cutoff de peso molecular 30.000. Esta solução foi então concentrada na mesma membrana até metade do seu volume original, dando assim origem a uma solução a 1% de alginato de Ringer. Esta solução resultante foi esterilizada por filtração através de um sistema de esterilização por filtragem descartável de 0,22 micron (Falcon). Esta solução pode então ser utilizada como uma solução de lavagem aplicada não frequentemente.
Exemplo 3
Um lote de nove litros de alginato foi preparado tal
como foi indicado no Exemplo 1 com excepção do meio, em que o Ringer foi substituido ao longo do processo em vez de água. Após esterilização por filtração através de um dispositivo de filtração estéril descartável de 0,22 μιη, a solução apresentava-se pronta para utilização como uma solução artroscópica para distensão da articulação.
Exemplo 4
Foi preparado uma solução tal como é indicado no Exemplo 1. 0 passo de diálise foi realizado contra 7 litros de solução salina I.V. 0 passo final consistiu em concentração numa membrana 30K até 1/4 do volume original dando origem a uma solução final de 2%. Esta solução poderá ser subsequentemente usada para prevenção de aderências intra-articulares, cicatriza-ção espinal, aderência do tendão flexor, injecções intra-articulares para articulações inflamadas, ou como um lubrificante para ombro rígido.
Exemplo 5
Como uma alternativa à concentração da solução purificada por meio de ultra-filtração, uma solução a 0,5% tal como foi preparada no Exemplo 1 foi esterilizada por filtração e subsequentemente seca por congelação assepticamente. Este material seco I por congelação foi então rehidratado com um meio aquoso apropria do até qualquer concentração desejada. Por exemplo, 5,25 g de alginato seco por congelação, estéril, purificado, poderá ser . 3 re-hidratado em 50 cm de solução de Ringer a fim de dar origem a uma solução a 10,5%. Esta poderá ser colocada assepticamente numa seringa e injectada num saco de solução de Ringer I.V. de 1 litro para um processo artroscópico, dando uma concentração final no saco de 0,5%.
Exemplo 6
Colocaram-se aproximadamente 50 cc da solução preparada no Exemplo 1 numa placa de petri normal de 90 mm. A placa de petri foi então colocada num secador de tabuleiros a 50°C durante 3 dias (até o material se encontrar completamente desidratado). 2 A película resultante foi cortada em fragmentos de 2,5 cm e esterilizada por exposição a 0,5 mRad de radiações gama. A película resultante é muito flexíval e pode ser aplicada para evitar aderências no tendão flector, aderências intra-articulares de cicatrizes espinais, ombro rígido e reparações no rotador do punho.
Exemplo 7
Foi preparada uma película de um modo idêntico ao ilustrado no Exemplo 6, exceptuando o facto da solução ser esterilizada por filtração a seguir ao passo de dialise e a liofilização da película ser feita assepticamente. (Preparação por este método irá levar a um material com caracteristicas mais aproximadas do material em bruto visto a degradação criada pela irradiação gama não se tornar evidente, tal como pode acontecer no Exemplo 6).
Exemplo 8
Foi preparada uma solução tal como foi indicado no 19
Exemplo l. A seguir à diálise contra os 7 litros de água purificada, a solução foi concentrada até 1/4 do volume original produzindo uma solução de 2%. Uma amostra de 50 cc desta solução foi colocada numa placa de Petri e colocada num tabuleiro de secagem durante três dias a -50°C. A película resultante era menos fibrosa e menos flexível, mas reteve maior integridade do que a película preparada no Exemplo 6. Este tipo de película poderá ser utilizado com eficácia numa aplicação a cicatrização espinal onde o defeito por laminectomia é relativamente mais substancial.
Exemplo 9
Uma película preparada tal como foi indicado no Exemplo 6. A pelicula de alginato estéril foi subsequentemente submersa numa solução estéril de 2% de cloreto de cálcio durante 30 minutos. A pelicula resultante foi tornada insolúvel na água. A película foi exaustivamente lavada em água estéril a fim de remover o excesso de cloreto de cálcio. A película foi testada quanto à sua esterilidade, citotoxicidade, e hemólise. Todos os testes foram negativos. A película pode ser aplicada em zonas onde seja requerido um tempo de residência in vivo mais longo da película. Isto inclui cicatrização espinal, aderências do tendão flexor, e aderências intra-articulares.
Exemplo 10
Uma solução de alginato de sódio foi preparada tal como foi descrito no Exemplo 1. Aproximadamente 100 cc foram esterilizados por filtração através de um aparelho de membrana esteril de 0,22 micron (Falcon). Sob uma cobertura de fluxo laminar, 35 cc 20- -
da solução foram colocados num recipiente estéril. Aproximadamen-te 0,158 gramas de carbonato de cálcio (esterilizado por autocla-ve de vapor) foi adicionado à solução e foi agitado. Apôs cerca de 30 minutos para permitir que o carbonato de cálcio se dispersasse totalmente, uma solução recente de D-glucono-delta-lactona (GDL) (0,187 g em 10 cc de água) foi esterilizada por filtração para a solução. Esta foi deixada a agitar durante cerca de 20 minutos e nessa altura uma amostra de 30 cc foi vertida para uma placa de 90 mm. Apôs 24 horas foi obtido um gel transparente ópticamente regular. 0 gel foi então extensivamente lavado contra água e testado quanto à sua esterilidade, citotoxicidade (directa e extracção), e hemólise (directa e extracção). Todos os testes foram negativos. Este material pode ser usado a fim de evitar a formação de cicatriz espinal, aderências intra-articulares, e pode ter algum potencial como uma cartilagem artificial.
Exemplo 11
Foi preparado um gel tal como foi indicado no Exemplo 10. O gel foi deixado deshidratar-se sob fluxo laminar durante 24 horas. 0 gel foi então rehidratado numa solução a 0,1% de hepari-na. Foi então possível usar este gel como um método para' administrar material trombogénico para auxiliar a reduzir o exsudado fibrinoso que aparece no processo de formação de aderências. Este exemplo também indica a possibilidade de administrar enzimas tais como a estreptoquinase para destruir as aderências em zonas onde já se tenham formado, ou administração de Activador Plasminogénio Tissular (APT) também conhecido por destruir o tecido fibrinoso.
Exemplo 12
Foi preparada uma soluçaõ tal como foi indicado no Exemplo 1. Além disso, heparina (de Sigma) foi adicionada à solução para dar origem a uma solução de alginato a 0,1% em heparina. Esta foi então levada a uma forma de película tal como foi indicado no Exemplo 6.
Exemplo 13
Uma solução a 0,5% de Ν,Ο-CM Quitosan (NOVA Chem) foi preparada dissolvendo o material em água livre de agentes pirogé-nicos purificada. A solução foi inicialraente filtrada através de um filtro de nitro-celulose de 12 microns, seguindo-se filtração através de um filtro de nitro-celulose de 8 microns, e um filtro de nitro-celulose de 0,45 microns. O material resultante foi feito passar sobre e através de uma membrana de ultra-filtração modificada de 0,5 micron (AlerCHEK) durante 8 horas por meio de um dispositivo de ultrafiltração de fluxo tangencial (Filtron). A solução resultante foi então dialisada contra 7 litros de água numa membrana cut off de peso molecular 30 K utilizando o mesmo dispositivo de ultra-filtração sem o filtro de 0,5 micron modificado. Esta solução foi então esterilizada por filtração através de um filtro para esterilização de 0,45 micron /Falcon). 0,5 cc desta solução foi colocada articularmente num coelho branco da Nova zelandia. Após 2 dias o coelho foi sacrificado e a articulação foi avaliada. Não houve achados anormais na necropsia, nem na avaliação citológica do líquido sinovial, nem no exame histológico de vários tecidos, incluindo a cartilagem articular, e a membrana sinovial. 22
Exemplo 14
Uma amostra de NOCC preparado no exemplo 13 foi retirada e processada exactamente como o alginato no Exemplo 6. A película resultante era extremamente flexível e foi possível utilizá-la em todas as aplicações indicadas para as películas de alginato.
Exemplo 15
Uma amostra de 30 cc da solução preparada no Exemplo 13 foi moldada numa placa de Petri de 90 mm e foi deixada evaporar durante 24 horas. A película delgada resultante foi fácilmente removida da placa e foi possível utilizá-la tal como foi atrás descrito.
Embora tenham sido descritos vários exemplos do presente invento, é óbvio gue se lhe podem introduzir muitas alterações e modificações, sem afastamento do espírito e âmbito do invento.
Lisboa, 18 de Dezembro de 1992
Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON. 10-A 3« 1200 LISBOA
Claims (2)
- REIVINDICAÇÕES Ia. - Processo para a purificação de polissacarídeos, caracterizado por compreender: a filtração de uma solução de polissacarídeo tendo uma concentração de menos de 1% através de um primeiro filtro de nitrocelulose tendo um tamanho de poros inferior a 45 mícrons; a filtração da solução resultante através de um segundo filtro de nitrocelulose tendo um tamanho de poros inferior a 12 mícrons; a filtração da solução resultante através de uma membrana tendo um tamanho de poros inferior a 12 mícrons, sendo a referida membrana modificada com polipeptídeos a fim de se ligar a impurezas hidrofóbicas; e a diálise da solução resultante com uma membrana tendo uma selectividade de pesos moleculares inferior ao da primeira membrana de ultra-filtração.
- 2 -. - Processo para a purificação de polissacarídeos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido primeiro filtro ter um tamanho de poros de 8 a 12 mícrons e o referido segundo filtro ter um tamanho de poros de 22 a 45 mícrons. 23â. - Material polissacarídeo para aplicação biomédica, caracterizado por ter sido produzido pelo processo de acordo com a reivindicação 1. 4S. - Processo para a purificação de polissacarldeos, caracterizado por compreender os passos de: formação de uma solução aquosa de polissacarldeos inferior a 1% em peso; passagem desta solução através de pelo menos um passo de filtração com um filtro de nitrocelulose tendo um tamanho de poros inferior a um mícron; filtração da solução resultante com uma membrana tendo um tamanho de poros inferior a 12 mlcrons, sendo a referida membrana modificada com polipeptídeos a fim de se ligar a impurezas hidrofóbicas; e diãlise da segunda solução resultante contra uma solução aquosa. 5a. - Material polissacarídeo para aplicações biomédi-cas, caracterizado por ter sido produzido pelo processo de acordo com a reivindicação 4. Lisboa, 18 de Dezembro de 1992J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR COROON, 10-A 3« 1200 LISBOA
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19930721 |
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| FC3A | Refusal |
Effective date: 19990617 |