PT100121A - Compostos 1,2,3,4-oxatriazol-5-imina substituidas na posicao 3, seu processo de preparacao e preparados farmaceuticos compreendendo os referidos compostos - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo Técnico O presente invento refere-se a compostos 1,2,3,4-oxa-triazol-5-imina substituídos na posição 3, até agora desconhecidos, que provaram possuir efeitos biológicos que os tornam adequados ao tratamento de doenças cardiovasculares (coágulos sanguíneos e asma), a um processo para a sua preparação e um preparado farmacêutico que contém os referidos compostos.

Arte Anterior N.G. Finnegan et al., J. Org. Chem. 30, pág. 567-575 (1965) descreve o composto 3-ciclo-hexil-l,2,3,4-oxatriazol-5-imino--hidrocloreto. Não se menciona contudo nenhum efeito biológico do referido composto. K. Masuda et al., Chem. Pharm. Buli. 19 (3) pág. 559-563 (1971) descreve compostos 3-aril-l,2,3,4-oxatriazol-5-imina e seus derivados acílicos onde o grupo acilo pode estar monos-substituído por metilo ou halogéneo. Ainda que estes compostos tivessem sido sintetizados na esperança de obter novos agentes hipotensivos, não se descrevem efeitos biológicos dos compostos. C. Christophersen et al., Acta Chemica Scandinavica 25 pág. 625-630 (1971), descreve compostos l,2,3,4-oxatriazol-5-imino substituídos na posição 3, onde o substituinte em 3- pode ser propilo ou fenilo ou ciclo-hexilo. Não se descrevem contudo efeitos biológicos dos referidos compostos.

Hanley et al., J.C.S. Perkin Trans I, 736-740 (1979) descreve compostos 3-aril-l,2,3,4-oxatriazol-5-imina onde o grupo arilo pode estar monossubstituído por metilo ou halogéneo. Não se descrevem contudo efeitos biológicos dos compostos.

As patentes JP Nfis. 20904/70 e 21102/70 descrevem sais da 1,2,3,4-oxatriazol-5-imina substituídos na posição 3, e seus derivados acílicos, onde o substituinte em 3- pode ser arilo

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62804 HM/MSJ -3- opcionalmente monossubstítuído por cloreto ou metilo. Afirma-se que estes compostos mostram actividade vasodepressora. A descrição publicada, GB Na. 2 015 878, descreve compostos 3-fenil-l,2,3,4-oxatriazol-5-imina, nos quais se encontrou actividade pesticida e/ou pestoocida e/ou herbicida. A descrição da patente US NB. 4 329 355 descreve hidróxidos de anidro-5-imino-l,2,3,4-oxatriazólio com uma estrutura semelhante à estrutura dos compostos do presente invento. Contudo, os compostos revelados na descrição desta patente são apenas mencionados como sendo úteis no tratamento do cancro.

Conhecem-se ainda, de J.C.S. Perkin Trans I, 747-751 (1979), compostos com uma estrutura semelhante à estrutura dos compostos do presente invento. Não se descrevem contudo efeitos biológicos dos referidos compostos.

Divulgação do Invento 0 presente invento refere-se a compostos 1,2,3,4-oxatria-zolo-5-imina substituídos na posição 3, de fórmula geral I até agora desconhecidos e a seus sais de adição de ácidos

onde R1 é grupos alquilo ou alcoxi, iguais ou diferente, tendo 1 a 3 átomos de carbono, halogéneo, grupos trifluorometilo, nitro, ciano, fenilo ou alquilsulfonilo, néla5, eR2é hidrogénio ou um grupo de fórmula II

-X-Y-Q-(Z)m II onde X é -C(0)-, -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)2 ou uma ligação direc-ta, Y é um grupo alquileno com 1 a 4 átomos de carbono ou uma ligação directa, e Q é alquilo, cicloalquilo, alcoxi ou um grupo fenilo, piridilo, furanilo, tienilo ou pirazinilo estando

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62804 HM/MSJ -4- opcionalmente substituído por Z, onde Z é grupos alquilo ou alcoxi, com 1 a 3 átomos de carbono, halogéneo, hidroxi, aciloxi, trifluorometilo, nitro, ciano ou alquilsulfonilo, e m é 1 a 3, e onde Z, quando X for -c(0)- ou -C(0)NH-, Y for uma ligação directa e Q for fenilo substituído, pode também representar a estrutura I, onde R2 tem o mesmo significado que em relação a X, Y e Q, com a condição de R2 não ser hidrogénio, alquilo, benzoílo, trifluoroacetilo ou um grupo fenilo opcionalmente substituído, quando R1 for metilo ou cloro e n for 1, e de R2 não ser hidrogénio ou um grupo fenilo opcionalmente substituído quando R1 for nitro, alcoxi, fluoro ou bromo e n for 1.

Estes compostos diferem dos compostos conhecidos, acima referidos, pela sua constituição química pois que têm uma substituição diferente na posição 3 e/ou na posição 5 do anel de oxatriazol, e diferem dos compostos conhecidos das patentes, acima referidas, pelos seus efeitos biológicos pois que inibem a agregação de plaquetas sanguíneas e apresentam um efeito rela-xante da traqueia.

Assim, o invento refere-se também a uma preparação farmacêutica caracterizada por compreender como ingrediente activo um composto de fórmula I em associação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

De acordo com o invento, os compostos preferidos são os compostos de fórmula geral I onde n é 2 a 4.

Na fórmula geral II, Q significa de preferência grupos alquilo e alcoxi, com 1 a 6 átomos de carbono.

Os compostos do invento podem formar sais de adição de ácidos com ácidos orgânicos ou inorgânicos. São ácidos adequados, por exemplo, o cloreto de hidrogénio, brometo de hidrogénio, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido oxálico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido acético, ácido salicílico, ácido benzóico, ácido fórmico, ácido

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-5-propiónico, ácido piválico, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido málico, ácido sulfâmico, ácido fenilpropiónico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido isonicotínico, ácido metanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido cítrico ou o ácido adípico.

Além disso, o presente invento descreve um processo para a preparação de compostos 1,2,3,4-oxatriazol-5-imina substituídos na posição 3, de fórmula geral I, e os seus sais de adição de ácidos de acordo com o invento, sendo o referido processo carac-terizado:

a) pelo fecho do anel de um derivado 1-ariltio-semicarba zida de fórmula geral III

III

onde R1 tem o mesmo significado que na fórmula I, e R3 é H ou um grupo de fórmula IV

-X-Y-Q-(Z)m IV onde X é uma ligação directa e Y e Q-(Z)m têm o mesmo significado que na fórmula I, por tratamento com um nitrito de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono ou com um nitrito de metal alcalino, em condições acídicas, a cerca de 0 a 10°C, após o que o sal resultante é opcionalmente convertido no composto livre e, se desejado, é submetido a uma acilação. 0 processo que utiliza um nitrito de alquilo, de 1 a 6 átomos de carbono, é novo e é o preferido para a preparação dos compostos de acordo com o invento, pois que dele se obtém um rendimento quantitativo, antes da purificação.

Pelo processo de acordo com o invento, prefere-se usar o nitrito de etilo como nitrito de alquilo de 1 a 6 átomos de

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-6-carbono, e o nitrito de sódio como nitrito de metal alcalino. Já é sabido como ciclizar as tio-semicarbazidas dissubsti-tuídas em 1,4- com ácido nitroso (nitrito de sódio e ácido) para formar 1,2,3,4-oxatriazol-5-iminas substituídas em 3-. Os rendimentos desta reacção situam-se entre 18 e 57%.

Para fazer reagir 1 equivalente do derivado 1-aril--tio-semicarbazida com nitrito de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, prefere-se usar 2 a 2,5 equivalentes de nitrito de alquilo num solvente adequado, como um álcool alquilico de 1 a 6 átomos de carbono, para se obter o sal de 1,2,3,4-oxatriazol-5-imina 3-aril-substituída, com rendimento substancialmente quantitativo. Após filtração do enxofre precipitado e evaporação do solvente, o produto é, se necessário, recristalizado em, por exemplo, álcool alquilico de 1 a 6 átomos de carbono, acetonitrilo ou nitrometano, obtendo-se rendimentos do produto puro usualmente entre 60 e 95%.

Como álcool alquilico de 1 a 6 átomos de carbono, usa-se de preferência o metanol ou o etanol. A preparação dos compostos acilados, de acordo com o invento, realiza-se de preferência dissolvendo um hidrocloreto de 3--aril-l,2,3,4-oxatriazol-5-imina num sistema bifásico compreendendo água e um hidrocarboneto halogenado, de preferência o cloreto de metileno, ao qual se juntam as quantidades de base equivalentes à reacção, por exemplo de hidrogenocarbonato de sódio, e de agente de acilação. O produto resultante pode ser obtido por evaporação da fase orgânica e opcionalmente recrista-lizado em álcool alquilico de 1 a 6 átomos de carbono ou em acetonitrilo. Os rendimentos destes compostos encontram-se usualmente na zona dos 50 a 95%. Os compostos acilados de acordo com o invento podem também ser preparados de modo já conhecido por reacção do hidrocloreto de 3-aril-l,2,3,4-oxatriazol-5-imina com um agente de acilação em piridina. São agentes de acilação adequados, por exemplo: halogenoés- 73 632

62804 HM/MSJ teres do ácido fórmico, cloretos de ácido, anidridos, o-alquil-e O-aril-ésteres, alquil- e aril-isocianatos, alquil- e aril-isotiocianatos.

Os derivados 5-iminoalquilados das 3-aril-l,2,3,4--oxatriazol-5-iminas, de acordo com o invento, são preferivelmente preparados a partir de tio-semicarbazidas l-aril-4-substituídas por meio do processo de acordo com o invento usando como solvente um alquil (em Cj^-Cg)-álcool, de preferência o metanol ou o etanol. Os rendimentos destes compostos situam-se usualmente entre 80 e 90%.

Os sais de adição de ácidos resultam usualmente da síntese dos compostos de fórmula I onde R2 é H, arilo, alquilo ou cicloalquilo. Os compostos livres podem ser obtidos a partir de sais de adição de ácidos de modo conhecido, per se. isto é, por exemplo, por dissolução ou suspensão em água e subsequente reacção com a base até reacção alcalina (de preferência a um valor de pH de 8,0 a 9,5), por exemplo com hidrogenocarbonato de sódio e subsequente isolamento.

Os compostos de partida, de fórmula geral III, que são necessários, podem ser preparados por modo já conhecido. Os compostos de partida, de fórmula III, onde R3 seja H, podem ser preparados, por exemplo, fazendo reagir o hidrocloreto de aril--hidrazina substituída, com um tiocianato alcalino ou com um tiocianato de amónio, num solvente adequado como álcool ou água, ao longo de um refluxo por 6 a 18 horas, como se descreve por exemplo por Houben-Weyl: "Methoden Der Organischen Chemie E4", pág. 513. Os compostos de partida de fórmula geral III onde R3 seja alquilo ou arilo podem igualmente ser preparados por processos já conhecidos, por exemplo, fazendo reagir uma aril-hidrazina com um tiocianato de alquilo ou arilo num solvente adequado, por exemplo éter, metanol, etanol, benzeno ou tolueno, como foi descrito por Houben-Weyl! "Methoden Der Organischen Chemie E4", pág. 506.

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PREPARAÇÃO DOS COMPOSTOS DE PARTIDA

Preparação da l-(3-cloro-2-metilfenil)tio-semicarbazida

Dissolveram-se 19,3 g (0,1 mole) de 3-cloro-2-metilfenil--hidrazina-hidrocloreto em 200 ml de etanol absoluto, juntaram--se 11,64 g (0,12 mole) de tiocianato de potássio à solução e aqueceu-se a mistura sob refluxo durante 16 h. Arrefeceu-se depois a mistura, o que fez precipitar parcialmente o produto, e depois evaporou-se a mistura até à secura por meio de um evaporador rotativo. O produto foi recristalizado em 200 ml de água e 250 ml de metanol, separado por filtração e lavado intensamente com água.

Rendimento: 17,8 g - 82,5% Ponto de fusão: 192-193°C Análise elementar: C8H10C1N3S S: 14,86% S: 14,67%

Calculada C: 44,54% H: 4,67% N: 19,48% obtida C: 44,22% H: 4,58% N: 19,60% 500 MHz XH RMN (dg-DMSO): 6 9,33 (s largo, 1H, NH), δ 7,80 (s largo, 1H, NH), δ 7,72 (s largo, 1H, NH), 6 7,52 (s largo, 1H, NH), δ 6,80 (m, 3H, ArH), δ 2,18 (s, 3H, CH3).

Preparação da 1-f3-cloro-2-metilfenil)-4-(l-metiloropil)tio-se-micarbazida

Juntaram-se 1,44 g (10 mmole) de isotiocianato de sec-butilo a 1,56 g (10 mmole) de 3-cloro-2-metilfenil-hidrazina dissolvida em 120 ml de tolueno, submeteu-se a mistura a refluxo durante 2 h e depois evaporou-se. 0 remanescente foi agitado com uma pequena quantidade de hexano, separado por filtração e seco.

Rendimento: 2,3 g - 96,6%

Ponto de fusão: 145-146°C Análise elementar:

Cale. C: 53,02% H: 6,67% N: 15,46% S: 11,79% Cl: 13,04%

Obtida C: 53,22% H: 6,33% N: 15,52% S: 11,84% Cl: 13,02%

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62804 HM/MSJ -9- -9- 500 MHZ ^ RMN (CDCI3): δ 7,48 (s, 1H, NH), S 6,94 (m, 3H, ArH), S 6,90 (s largo, 1H, NH), S 5,92 (S, 1H, NH), δ 4,40 (m, 1H, CH), 6 2,60 (s, 3H, CH3), δ 1,54 (m, 2H, CH2), δ 1,18 (d, 3H, CH3), 6 0,88 (t, 3H, CH3) .

Exemplo 1

Hidrocloreto de 3-f3-cloro-2-metilfenil)-l.2.3.4-oxatriazol-5--imina

Dissolveram-se 8,6 g (40 mmole) de 1-(3-cloro-2-metilfenil)tio-semicarbazida em 100 ml de metanol e 5 ml e ácido clorídrico a 37% enquanto se agitava à temperatura ambiente. Arrefeceu-se a mistura até 0-5"C, por meio de um banho de gelo, e depois juntaram-se 6,3 g (7 ml) de nitrito de etilo em pequenas quantidades, ao longo de um período de cerca de 5 min. A mistura tornou-se de cor escura por acção dos vapores nitrosos mas clareou após alguns minutos ao mesmo tempo que precipitava enxofre livre. Agitou-se a mistura durante 10 min, juntaram-se mais 0,9 g (l ml) de nitrito de etilo e deixou-se a mistura reagente, durante cerca de 20 min, sob agitação. Separou-se o enxofre por filtração e evaporou-se a mistura num evaporador rotativo, a uma temperatura de banho de 30eC. Se necessário desidrata-se a mistura por evaporação juntamente com tolueno/etanol. Agitaram-se os cristais em éter dietílico, separaram-se por filtração e lavaram-se ainda com pequenas quantidades de éter dietílico.

Rendimento: 9,2 g - 94%

Ponto de fusão: 194-195°C (decompõe-se) IV: 1 700 cm-1

Análise elementar: C8H7C1N, 1°, HC1, hH2 0: Calculada C: 38,19% H: 3, 41% N: 22, , 28% Cl: 28,18% Obtida C: 38,07% H: 3 / 19% N: 22, r30% Cl: 28,58% 500 MHz RMN (D20): 67,52 (m, 3H, ArH), 6 2,38 (s , 3H ch3)

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Exemplos 2 a 28

Os compostos indicados no Quadro 1 foram preparados do modo descrito no Exemplo 1. (segue Quadro 1)

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o X

H

QUADRO

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-13- Λ

Exemplo 29 3-(3-cloro-2-metilfenil)-1.2.3.4-oxatriazol-5-imina 1/23 g (5 mmole) do hidrocloreto de 3-(3-cloro-2-metil-fenil)-lf2,3,4-oxatriazol-5-imina, preparado no Exemplo 1, foram dissolvidos nina sistema bifásico constituído por 30 ml de água e 10 ml de diclorometano. Arrefeceu-se a mistura num banho de gelo até 5°C e depois juntou-se cuidadosamente, em pequenas quantidades 0,84 g (10 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio. Depois de terminar a evolução de dióxido de carbono, agitou-se a mistura vigorosamente durante cerca de 10 min, depois separou-se a fase orgânica e evaporou-se.

Rendimento: 0,89 g - 84,6%

Ponto de fusão: 54-56°C Análise elementar CgH^ClN^O:

Calculada C: 45,62% H: 3,35% N:‘ 26,60% Cl: 16,83%

Obtida C: 45,95% H: 3,35% N: 26,30% Cl: 17,27%

Exemplo 30 3 - (3-trif luorometilf enil )-1.2.3.4-oxatriazol-5-ÍN-3-trifluoro-metil-benzilcarbonil)imina

Dissolveram-se em 45 ml de água 2,66 g (10 mmole) de hidrocloreto de 3-(3-trifluorometilfenil)-1,2,3,4-oxatria-zol-5-imina, preparada no Exemplo 3, e depois juntaram-se cuidadosamente, em pequenas quantidades, 1,68 g (20 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio. Juntaram-se 20 ml de diclorometano à base livre precipitada que nele se dissolveu completamente, e arrefeceu-se a mistura até 5°C num banho de gelo. Juntaram-se então à mistura 2,23 g (10 mmole) de cloreto de ácido 3-trifluorometilbenzilcarboxílico dissolvidos em 10 ml de cloreto de metileno, enquanto se agitava vigorosamente. Agitou-se depois a mistura durante 45 min, separou-se a fase orgânica e lavou-se duas vezes com 30 ml de água. Evaporou-se o cloreto de metileno num evaporador rotativo, a substância resultante foi intensamente agitada com éter dietílico, separada por filtração e seca.

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Rendimento: 2,98 g - 71,6%

Ponto de fusão: 106-108°C IV: 1655 cm"1, 1620-1590 cm"1, 1350-1320 cm"1.

Análise elementar Ci7Hi0F6N4O2:

Calculada C: 49,04% H: 2,42% N: 13,46%

Obtida c: 48,87% H: 2,30% N: 13,59% 500 MHz l-H RMN (d6-DMS0): δ 8,02 (m, 8H, ArH), δ 3,88 (s, 2H, CH2)

Exemplos 31 a 45

Os compostos indicados no Quadro 2 foram preparados como se descreveu no Exemplo 30. (segue Quadro 2)

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QUADRO H 0 ~ CM CM c g θ' θ' (d tf 4-> w CM CM <D s O O O U CM s» H 1 o co o o ro 1 ··. λ co H O H Z — Mm co — in vo 1 tf (D H H tf f- iH «I ϋ tf <D p —— 1 φ H *—- O >->> Q) P m > n n o -PH • Si O co P DlHDOhO in ω o |H-S u IO O (0 '<D w o co co '0) ·> t** tf 1 H tf »õ) H w vo w 1 H -__o vo (D 1 vo 1 Ο Η 1 Η H P z ·*. H -—- “ g “ Η O Z ·»> * CM — m ^—·. — P — u λ CM ·*> Ο 1 -—- H ·*> O '0) o o o u — O O *>(DO Ο Η — co ϋ O O — U w O V U ^ tf U O o p U *»*"S O · H ·— o o ·*- · 1 1 1 1 d) 1 i ο ω i tf i ·* <w 1 1 1 — «w 1 O 1 1 1 O P 1 1 f- '(D 1 m 1 —ri O O 1 1 ro *ri Z CK 1 Z Z 'tf ω z Z H wZ Ζ Z coh co vo z Z A H — 1 Η z 1 1 vo '<D 1 1 1 1 A (d co H 1 1 U (tí O U H 1 U ϋ H w ϋ ϋ ·“ Ο ϋ U ϋ'-’Η H u O w — U Ό s-- w ^—* H > <w<w <w w | V “O • CM M H Q ··. *» “ O 1 o o OOIOH o Ο «Η Η O CÊ O O VO o o o o m Z cm cm ο σι o oo cm σι CO -ri H 1 co o co O H ra cm σ\ ω 1 vocMt^invovoHio IO ri “f·* IZ φ π n ϋ ό in iDCM^nOHHin Η Η H H H (d ^ H Η Η 1 H H Η H tf ·«— H • S — tf 2_/ II -1 1 — 1 — 1 1 d) “1 S Si 1 “ » “ tf s. - d) «. o o o z o roo roo o+>oooooooo <D o CMO ΟΡΙΟ h co ί< iroltfroAovHin^tfov in t'- o tf VO H -P VO O vo ro io t“ I \ r^coAUvouvouvoco^oiiovor^vovovor·' ω vo Z vo σι MD r»· o Η H CM '—'Η '-'H v— Η H CMHHHHHHHHDH H CM *** H + / Ό Ό z=z O «d h σι ω IO o vo co Η O CO tf σι ω h / ω O O tf o vo ro IO CM tf lf> VO θ' ΙΟ Γ“ vo _/ tf VO Η H H Η H Η H Η Η H H Η Η H <w υ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 / \ o CO 00 00 r» CM 00 IO o* σι ω vo CM ro vo o / r\ \ • in oi -í o\ VO CM to CM co ri* vo IO t“ vo A H H Η H Η H Η Η H H Η Η H y / •H| O àp àP áP àP àP àP àP àP àP / — Ό 4J ro in tf vo ω h CM VO 00 / tf tf àP àP PP df> S. Si -dP S, s, s, “ - àp c (D 0) Cl O O O tf H ro o 10 f' 10 ro σι co A g r-> co tf tf in σι > 00 oo ro vo vo IO o» 00 co co E w U ϋ O CM 1 i—1 ϋ o «tf z ϋ Ο Ο ω z z CM 1 "4· 1 1 co co 1 Ί· « M* W CM CM E E co E IO «H tú in tn H 1 1 'tf -tf in 1 in in ΙΛ ffi H VO ϋ K H 'tf oox •M* ϋ E E CM « O 1 CM w X w 1 1 CM E 1 CM CM U vo 1 O ϋ vo vo vo o o o vo o u ϋ CM ϋ CM ϋ CM u ϋ ϋ U U CM ϋ ϋ CM CM O o O 1 O o ο ο 1 1 o o 1 o o U ϋ CQ co u ϋ ϋ ο CM CM O ϋ co U u (tf 1 rH ι—1 ι—1 ι—1 i—1 i—1 Ί* ο υ ο o u u ι—1 rri tf 1 1 1 1 1 1 ϋ ϋ fc V #—s co CO <ο co co co 1 1 1 Pm H co M* "tf 1 Si Si Si ^ co co co co co co CO CO co co co co s, S. Si À À À À À ffi X E E E E H Η H «. O U O o ϋ Q O O O O O o o o Itf 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 co co co co "tf CM CM CM CM CM Ί* CM CM CO CM 1 g <D 0 H CM co ro VO r·* ro σι o h CM CO 'tf in X i—1 ro CO co co co CO co co (Otftf <· 'tf "tf •tf W ft

73 632 62804 HM/MSJ «*-' :JS\

-16-

Exemplo 46 3-( 3-cloro-2-metilfenil)—1.2.3.4-oxatriazol-5-(N-2-pirazinoil)--imina 2,47 g (10 mmole) do hidrocloreto de 3-(3-cloro-2--metilfenil)-1,2,3,4-oxatriazol-5-imina, preparado no Exemplo 1, foram dissolvidos em 30 ml de água à qual depois se juntaram, sob agitação, 2,1 g (25 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio. Depois de terminada a libertação de dióxido de carbono juntaram-se 30 ml de diclorometano, após o que se dissolveu a substância precipitada. Juntaram-se depois 2,21 g (10 mmole) do éster de N-hidroxi-succinimida do ácido pirazina-2-carboxílico. Deixou-se a mistura ficar sob intensa agitação durante 16 horas após o que se separou a fase de cloreto de metileno. Lavou-se esta fase duas vezes com 30 ml de água e evaporou-se. Agitou-se a substância com uma pequena quantidade de éter dietílico e separou-se por filtração.

Rendimento: 2,03 g = 64,3%

Ponto de fusão: 111-112eC Análise elementar C13H9C1N50: N: 26,54% Cl: 11.19% N: 26,37% Cl: 11,40%

Calculada c: 49,30% H: 2,86%

Obtida C: 49,10% H: 2,89% 8,56 (d, 1H, J = 2,5 Hz, = 2,5 HZ, ArH), δ 7,21 (m, 500 MHz % KMN (CDCI3): δ 9,26 (d, 1H, J = 1,5 Hz, ArH), δ ArH), δ 8,39 (dd, 1H, J = 1,5 HZ Θ J 3H, ArH), δ 2,58 (s, 3H, CH3).

Exemplo 47 3-(2-cloro-3-clorofenil^-l.2.3.4-oxatriazol-5-(N-fenilcarba-moill-imina 2,31 g (10 mmole) do hidrocloreto de 3-(2-cloro-3-cloro-fenil)-1,2,3,4-oxatriazol-5-imina, preparado no Exemplo 21, foram dissolvidos em 30 ml de água aos quais se juntaram 0,9 g (10,7 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio. Depois de terminar a libertação de dióxido de carbono, juntaram-se 30 ml de diclorometano e 1,20 g (10 mmole) de isocianato de fenilo em

73 632 62804 HM/MSJ

-17- 5 ml de diclorometano. Depois agitou-se intensamente a mistura durante 30 min à temperatura ambiente, pelo que precipitou parcialmente o produto. Juntaram-se mais 50 ml de diclorometano e 30 ml de água, após o que se separaram as fases. A fase de diclorometano foi lavada com 50 ml de água e evaporada. A recristalização realizou-se em etanol absoluto.

Rendimento: 2,10 g = 60,9%

Ponto de fusão: 149-151'C Análise elementar C14H9C12N502:

Calculada C: 48,02% H: 2,59% N: 20,01% Cl: 20,25% obtida c: 48,06% H: 2,67% N: 19,68% Cl: 20,17% 500 MHz % RMN (CDCI3): δ 6,69 (m, 3H, ArH), S 7,58 (s largo, 1H, NH), δ 7,19 (m, 5H,

ArH).

Exemplo 47a 3-(3-cloro-2-metilfenil)-1.2.3.4-oxatriazol-5-(N-3.4-dimetoxi-fenil-etilcarbamoil)imina 2,47 g (10 mmole) de hidrocloreto de 3-(3-cloro-2-metilfe-nil)-1,2,3,4-oxatriazol-5-imina, preparado no Exemplo 1, foram dissolvidos em 30 ml de água, aos quais se juntaram 0,9 g (10,7 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio. Depois de terminar a libertação de dióxido de carbono, juntaram-se 30 ml de diclorometano e 2,1 g (10 mmole) de isocianato de homoveratrilo em 5 ml de diclorometano. A mistura foi depois intensamente agitada durante 30 min à temperatura ambiente, após o que se separaram as fases. A fase de cloreto de metileno foi lavada com água, filtrada e evaporada. A substância foi então lavada com éter dietílico.

Rendimento: 3,60 g = 86,12%

Ponto de fusão: 148 a 151 °C IV: 1660 cm”1 (N”-C0-NH); 1260, 1030 cm"1 (OCH3)

Análise elementar C19H20C1N504:

Calculada C: 54,61% H: 4,82% N: 16,76%

Obtida C: 54,22% H: 4,67% N: 16,72% Λ*/. 73 632 J'x', .s., 62804 HM/MSJ 'j é'~ -18-

Exemplo 48 3-( 4-cloro~2-metilfenil)-1.2.3.4-oxatriazol-5-(N-4-piridinoil)--imina

Juntaram-se 0f90 g (5 mmole) de cloreto de ácido isonicotí-nico a uma suspensão, arrefecida em gelo, de 1,24 g (5 mmole) de hidrocloreto de 3-(4-cloro-2-metilfenil)-l,2,3,4-oxatriazol-5--imina, preparado no Exemplo 13, em 15 ml de piridina.

Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 hora e depois juntaram-se 20 ml de água (desenvolvimento de calor). Arrefeceu-se a mistura com gelo e separou-se a substância por filtração. Lavou-se depois a substância intensamente com água e éter.

Rendimento: 1,35 g = 85,52%

Ponto de fusão: 180-184°C Análise elementar C14H10C1N5°2:

Calculada C: 53,36% H: 3,20% N: 22,13% Cl: 11,23%

Obtida C: 53,26% H: 3,19% N: 22,18% Cl: % 500 MHz ΧΗ RMN (dg-DMSO): 6 8,77 (dd, 2H, PirH, J = 6 Hz, J = 1,5 Hz), S 7,99 (dd, 2H, PirH, H = 6 Hz, J = 1,5 Hz), δ 7,77 (d, 1H, ArH, J = 9 Hz), δ 7,81 (d, 1H, ArH, J ) 2Hz), δ 7,71 (dd, 1H, ArH, J - 9Hz, J - 2 HZ).

Exemplos 49 a 59

Os compostos indicados no Quadro 3 foram preparados de modo correspondente ao descrito no Exemplo 48. (segue Quadro 3) -19- 73 632

62804 HM/MSJ . f··. S.V~

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QUADRO

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73 632 62804 HM/MSJ

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Exemplo 60

Hidrocloreto de 3-(3-cloro-2-metilfenil)-1.2.3.4-oxa~ triazol-5-(Ν-1-metilpropil)imina

Juntaram-se, gota a gota, 1,5 g (20 mmole) de nitrito de etilo a uma mistura gelada, de 2,16 g (8 mmole) de l-(3-clo-ro-2-metilfenil)-4-(l-metilpropil)tio-semicarbazida e 2 ml de ácido clorídrico a 37% em 80 ml de etanol, ao longo de um período de 5 min. Pouco tempo depois começou a precipitar enxofre. Agitou-se a mistura durante 1 hora, após o que se separou o enxofre por filtração e se evaporou a mistura. Juntou-se éter (cerca de 50 ml) e a substância, lentamente, tornou-se cristalina. Separaram-se os cristais por filtração e secaram-se.

Rendimento: 2,00 g = 93,73%

Ponto de fusão: 151-153°C

Análise elementar C12H15C1N40, HC1, k H2Os

Calculada C: 47,54% H: 5,32% N: 18,48% Cl: 23,48%

Obtida C: 46,91% H: 5,34% N: 18,17% Cl: 23,45% 500 MHz XH RMN (dg-DMSO): δ 7,84 (m, 3H, ArH), δ 3,77 (m, 1H, CH), δ 1,69 (m, 2H, CH2), δ 1,33 (d, 3H, CH3), δ 0,96 (t, 3H, CH3)

Exemplos 62 e 63

Os compostos indicados no Quadro 4 foram preparados pelo processo descrito no Exemplo 60. (segue Quadro 4)

73 632 62804 HM/MSJ -21

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QUADRO

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73 632 62804 HM/MSJ

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Exemplo 64 3-(3-cloro-2-metilfenil)-l.2.3.4-oxatriazol-5-fN-3-metoxÍpro-pilΪ imina-hidrocloreto

Suspenderam-se 1,15 g (4 mmole) de l-(3-cloro-2-metilfe-nil)-4-(3-metoxipropil)tio-semicarbazida em 40 ml de etanol a 96% e l ml de ácido clorídrico concentrado. A mistura foi arrefecida em gelo e juntou-se, gota a gota, uma solução de 0,55 g (8 mmole) de nitrito de sódio em 2 ml de água com o resultado da suspensão se ter dissolvido e, passado um pouco, de começar a precipitação de enxofre. Agitou-se de novo a mistura durante l hora e depois clarificou-se por filtração. Evaporou-se a mistura a um máximo de 30"C e juntaram-se à substância 10 ml de etanol seguidos de 50 ml de éter, resultando a precipitação da substância. Separou-se por filtração o produto resultante e secou-se.

Rendimento: 1,0 g = 78%

Ponto de fusão: 133,1-133,3°c IV (KBr) (cm”1): 3000-2700 (alifático); 1710 (C-N”-C, HCl); 1085 (0CH3).

Exemplo 65

Hidrocloreto de 3-f4-metilsulfonilfenil)-l.2.3.4-oxatriazol-5--imina

Uma solução de 4,66 g (25 mmole) de 4-metilsulfonilfenil--hidrazina em 100 ml de tetra-hidrofurano seco foi adicionada, a 0°C, a uma solução de 1,32 g (12,5 mmole) de brometo de ciano-géneo em 10 ml de éter. Agitou-se a mistura a frio durante 1 h, separou-se por filtração e lavou-se com éter seco. Arrefeceu-se o filtrado até uma temperatura entre -20°C e -40°C, após o que se juntou óxido de azoto durante cerca de 45 min..

Juntou-se então um excesso de etanol/ácido clorídrico à mistura, que foi depois agitada a 5°C durante 4 h. Os cristais resultantes foram separados por filtração e recristalizados em etanol. y* &

y* & :;L 73 632

62804 HM/MSJ -23- &

Rendimento: 1,20 g = 35%

Ponto de fusão: 193-195°C

Os resultados de IV e UV foram iguais aos obtidos pelo produto preparado no Exemplo 10.

Exemplo 66 1.2-bis(3-(3-cloro-2-metilfenil)-1,2.3.4-oxatriazolil-5-carba-moil)benzeno

Em 60 ml de água dissolveram-se 4,94 g (20 mmole) de hidrocloreto de 3-(3-cloro-2-metilfenil)-1,2,3,4-oxatria-zol-5-imina, preparado no Exemplo 1, após o que se juntaram, sob agitação, 3,78 g (45 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio. Depois de terminar a libertação de dióxido de carbono, juntaram-se 60 ml de diclorometano do que resultou a dissolução da substância precipitada. Juntaram-se depois à mistura 2,13 g (10 mmole) de cloreto de ftalilo. Deixou-se a mistura repousar durante 45 min sob agitação à temperatura ambiente e depois separou-se a fase de cloreto de metileno. Esta fase foi lavada duas vezes com 60 ml de água e depois evaporada. Agitou-se a substância com uma pequena quantidade de éter dietílico e separou-se por filtração.

Rendimento: 3,53 g = 64,1%

Ponto de fusão: 176-178°C IV: 1685 cm-1 largo (C-N-CO)

Análise elementar c24h16c-L2n2°4:

Cl: 12,86% Cl: 12,55%

Calculada: C: 52,28% H: 2,93% N: 20,32%

Obtida c: 51,87% H: 3,17% N: 20,02%

Exemplo 67 1,4-bisf 3-(3-cloro-2-metilfenil)-l.2.3.4-oxatriazolil-5-carba-moilamino)benzeno 3,40 g (13,4 mmole) do hidrocloreto de 3-(3-cloro-2-metil-fenil)-1,2,3,4-oxatriazol-5-imina, preparado no Exemplo 1, foram dissolvidos em 50 ml de água, a que se juntaram 2,25 g (26,8 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio, enquanto se agitava a -24- 73 632 62804 HM/MSJ mistura. Depois de terminar a libertação de dióxido de carbono, j untaram-se 50 ml de diclorometano, do que resultou a dissolução da substância precipitada, e juntaram-se em seguida 1,1 g (6,9 mmole) de diisocianato de 1,4-fenileno em 20 ml de cloreto de metileno. Deixou-se a mistura repousar durante 60 min sob agitação à temperatura ambiente,após o que se separou a fase de cloreto de metileno. Lavou-se esta fase por duas vezes com 50 ml de água e evaporou-se. Agitou-se a substância com uma pequena quantidade de éter dietílico e separou-se por filtração.

Rendimento: 3,02 g = 78,5%

Ponto de fusão: 200-201°C dec. IV: 1660 cm-1, (N-CO-NH)

Análise elementar C24H18c-*-2N1004:

Calculada: C: 49,53% H: 3,12% N: 24,10% Cl: 12,20%

Obtida C: 49,52% H: 3,10% N: 23,33% Cl: 12,50%

Exemplo 68

Hidrocloreto de 3-í3-cloro-2-metilfenil)-1.2.3.4-oxatriazol--5-(N-l-adamantil)imina

Dissolveram-se 5,1 g (14,6 mmole) de l-(3-cloro-2-metilfe-nil)-4-(l-adamantil)tio-semicarbazida em 1,5 1 de metanol e 1,5 ml de ácido clorídrico concentrado. A mistura foi arrefecida em gelo e juntou-se-lhe 1,26 ml (30 mmole) de nitrito de etilo, após o que se agitou de novo a mistura durante 2 horas à temperatura ambiente. A solução turva foi depois separada por filtração e evaporada. A substância cristalizou após algumas horas, na presença de éter dietílico misturado com uma pequena quantidade de etanol. Separou-se a substância por filtração e lavou-se com éter.

Rendimento: 2,9 g = 52,1%

Ponto de fusão: 204,3 a 204,8°c

Análise elementar cin4o, HC1: Calculada C: 56,79% H: 5,82% N: 14,69% Obtida C: 55,18% H: 5,80% N: 14,17% 73 632 62804 HM/MSJ IV: 2910 cm”1.

2860 cm”1 (alifático); 1695 cm 1 (C-N-C, HC1).

Exemplo 69 3-(3-cloro-2-metilfenil)-1.2.3.4-oxatriazol-5-(Ν-3-hidroxifenil-carbamoil)imina 2,47 g (10 mmole) de hidrocloreto de 3-(3-cloro-2-metil-fenil)-1,2,3,4-oxatriazol-5-imina, preparado no Exemplo 1, foram dissolvidos em 30 ml de água, aos quais depois se juntaram 0,9 g (10,7 mmole) de hidrogenocarbonato de sódio, sob agitação. Depois de terminar a libertação de dióxido de carbono, juntou-se isocianato de 3-hidroxi-fenilo em 30 ml de tolueno, enquanto se agitava fortemente. Agitou-se depois a mistura durante mais 30 min, do que resultou precipitar uma substância amarela. Separou-se a substância por filtração e lavou-se duas vezes com etanol e uma com éter dietílico.

Rendimento: 1,1 g = 31,8%

Ponto de fusão: 164 a 165 °C Análise elementar C15H12C1N5°35

Calculada c: 52,11% H: 3,50% N: 20,26%

Obtida C: 51,37% H: 3,42% N: 19,36% IV: 1630 cm1 (N-CO-NH), 1320 cm"1, 1210 cm"1 (ar-OH) ENSAIOS FARMACOLÓGICOS 1. Inibição da agregação de plaquetas sanguíneas

Os compostos de acordo com o invento foram ensaiados quanto à capacidade de inibirem a aglutinação de plaquetas do sangue (trombocitos), o que constitui a primeira fase da formação de coágulos sanguíneos (trombos). Tal inibição pode evitar a formação de coágulos sanguíneos e inibir o desenvolvimento de novos trombos após o diagnóstico de um trombo. O método para demonstrar este efeito é a chamada medição por agregómetro, primeiramente descrita por Born (Nature (Lond.) 194, 927-929, 1962). Usa-se sangue venoso, estabilizado por ci-

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trato (0,38% de citrato de sódio, concentração final), de pessoas saudáveis que não tenham tomado medicamentos durante pelo menos 8 dias. Duma ligeira centrifugação (160 x g durante 10 min) resulta PRP (plasma sanguínea rico em plaquetas) que é pipetado. Obtém-se PPP (plasma sanguíneo pobre em plaquetas) por uma centrifugação intensa (3000 x g durante 10 min) do sangue restante. Mede-se a transmissão da luz pelo agregómetro (CHR0N0L0G). o PRP quase não permite a transmissão da luz, enquanto que o PPP permite uma completa transmissão da luz. Coloca-se PRP no agregómetro a 37 °C enquanto se agita com um íman. A adição de uma substância pró-agregadora faz com que o PRP se agregue gradualmente e, ao mesmo tempo, dá-se um aumento da transmissão da luz. Quando a agregação se completa obtém-se uma transmissão de luz correspondente ao PPP. Como substância pró-agregadora usa-se o adenosina-difosfato (ADP), representando esta substância um mecanismo bioquímico básico da agregação de plaquetas sanguíneas. As substâncias a ensaiar são incubadas durante 3 min em PRP colocado no agregómetro a 37 eC durante agitação magnética. Junta-se então uma dosagem predeterminada, positivamente agregadora, de adenosina-difosfato (ADP) (2 a 4 μΜ). Ensaiam-se pelo menos 3 concentrações diferentes das substâncias em ensaio, para demonstrar a inibição, dependente da dosagem, da agregação. 0 chamado valor ICçq (que é a concentração que inibe em 50% a agregação, em relação à agregação do controlo) é calculada para cada substância em ensaio, por análise de regressão linear (o log da concentração μΜ como constante, em abcissas, e a % de inibição como variável, em ordenadas). Usaram-se as seguintes substâncias de referência, já conhecidas: nitroglicerina (GTN), nitrosilpentacianoferrato (III) de sódio (NNP) e SIN-1 (o metabolito activo da molsidomina).

Os resultados para oito compostos de acordo com o invento e para três substâncias de referência, estão indicados no Quadro 5. Nota-se no Quadro 5 que os compostos de acordo com o invento são substancialmente superiores às melhores substâncias de referência. A nitroglicerina mostrou-se inactiva neste ensaio. (segue Quadro 5)

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in

c* O CM o 0\ σ\ o a rH co CM in ω rH o CM a. r» σ\ *. rH K. *. h. V o o O o K o o o o O CM CO o ΙΛ o U rH H 10 rH rH (tí Ή •H d) o o G rH G •H Ή Ή •H H P O +> (0 CM G 0 ω G « H H H H H •H 0 H (tí CS o u u CJ o p •H •H ta tf | a B B B a 0 G +> 0 0 d) ta »» *» V *·» •rH (0 0 tí \φΛ a a a a a G *H (C p d) y p Z---- σ C | \ <tí O H ft K + / N 11 N 0 0) u •C 1 0 \ H 0 \ o «tí \ 1 θ' (tí / U / s, 0 d) \ 0 0 H P H H 0 u , / u u •H 0 •H •H P &> G 0 0 P H p +» 0 (0 «—x. H rH d> 0 $ ω rH H 0 o g 1 g g 0 (0 1 1 0 (Ω 0 0 1 Ό co *r P P P r> 0 0 0 0 * P •H P P **. »(tí o rH rH H rH rH rH o> G •H •H Ή 0 <H <H •H •H (tí +> +> •H +> •H •H +» Λ •H 0) o u d) P ρ d) •H 0 g g P g +> P g c 1 1 1 1 1 1 1 H Cl CM CM o CM o CO CM * α z 0 rH H (0 co O M* O CO H rH H <M O in co 1 g g gj z <2> X U g CQ H

-28- 73 632 62804 HM/MSJ

rf/V J· -v A# 9ΓΤ*» 2. Inibição do inibidor activador do plasminogénio (PAI) das plaquetas sancruíneas - (actividade fibrinolítica)

Os compostos de acordo com o invento foram ensaiados quanto à sua inibição do inibidor activador do plasminogénio (PAI). Um trombo já estabelecido compreende plaquetas agregadas tornadas coesas pela fibrina. O organismo tem um sistema fibrinolítico para manter as condições fisiológicas normais. 0 plasminogénio endógeno é activado em plasmina (fibrinolisina, que é um enzima proteolítico que decompõe a fibrina) por meio de um activador do plasminogénio de tecido (t-PA). As plaquetas incluem o enzima PAI-1 que inibe a activação do plasminogénio em plasmina e portanto também a decomposição da fibrina.

Uma estimulação geral do sistema fibrinolítico pode provocar efeitos secundários hemostáticos graves (hemorragias). Uma inibição específica do PAI-1 induz uma maior fibrinólise em áreas com muitas plaquetas o que é exactamente o caso dos trombos. Em resultado disso obtém-se um efeito trombolítico. O método que demonstra a inibição do PAl-l é descrito por Lidbury et al. (Brit. J. Pharmacol 101. 527-530, 1990). Usa-se PRP humano, preparado por centrifugação ligeira como anteri-ormente se mencionou, mas a uma temperatura baixa (4°C). Por incubação de PRP (1 ml num tubo de plástico) durante uma ligeira agitação a 37“C, liberta-se a actividade do PAI-1, sendo a actividade do referido PAI-1 medida espectrofotometricamente por um procedimento em dois passos, usando conjuntos comerciais (conjunto Spectrolyse™/fibrin da BIOPOOL, Suécia). A actividade do PAI-1 do PRP de controlo e do PRP incubado com cada um dos 6 compostos de acordo com o invento e com a substância de referência nitrosilpentacianoferrato (III) de sódio (NNP) (50 μΜ de cada durante 60 min) está indicada no Quadro 6. 0 mesmo Quadro mostra também a percentagem de inibição da actividade do PAI-1 comparada com a das incubações de controlo.

Nota-se no Quadro 6 que os compostos de acordo com o inven-

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to são todos inibidores eficazes da libertação do PAI-1 das plaquetas . A sua potência é comparável com a potência do nitrosilpentacianoferrato (III) de sódio (NNP).

Quadro 6

Inibição da actividade do PAI-1

Substância Actividade do PAI-1 % de inibição (50 juM) (U/108 plaquetas)

Controlo 3,24 Nitrosilpentacianofer- rato (III) de sódio (NNP) 1,99 39 Exemplo Na. 8 1,83 44 24 2,14 34 20 2,09 35 12 2,04 37 18 1,93 40 1/29 (base) 1,97 39 3. Estimulação da cmanilato-ciclase das plaquetas do sancrue

Os compostos de acordo com o invento foram ensaiados quanto à sua capacidade de estimular a guanilato-ciclase. 0 efeito biológico do NO (óxido nítrico) em diversas células (por exemplo plaquetas e leucócitos nucleares polimorfos) é exercido através de um estímulo do enzima guanilato-ciclase solúvel. Em resultado disso forma-se o guanosina-monofosfato cíclico (c-GMP). Os compostos de acordo com o invento são todos dadores de NO. Um aumento do guanosina-monofosfato cíclico (c-GMP) nas plaquetas resulta, inter alia, numa capacidade de agregação reduzida e numa capacidade reduzida para aderir às paredes dos vasos sanguíneos. 0 método para demonstrar a estimulação da guanilato-ciclase é descrito por Axelsson e Anderson (European J. Pharmacol. 88#

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-30- <r

71-79, 1983). Plaquetas humanas são homogeneizadas e centri-fugadas num meio gelado. A actividade do guanilato-ciclase no sobrenadante após incubação, com e sem a substância a ensaiar, durante 15 min a 37°C, é medida por meio de uma técnica de radioimunoensaio (RIA). o princípio é de que o guanosina-trifosfato (GTP) adicionado ntuna quantidade constante por meio da guanilato-ciclase é convertido em guanosina-monofosfato cíclico (c-GMP) que é determinado por radioimunoensaio.

Testaram-se onze compostos de acordo com o invento e as substâncias de referência nitrosilpentacianoferrato (III) de sódio (NNP) e SIN-1, em concentrações de 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, 1,0 μΜ e 10 μΜ. Verificou-se uma estimulação dependente da dose, da actividade da guanilato-ciclase para todos os compostos. 0 Quadro 7 mostra a estimulação após 0,01 μΜ e 10 μΜ. Os compostos de acordo com o invento estimulam a actividade da guanilato-ciclase mesmo na concentração mais fraca o que não é o caso do nitrosilpentacianoferrato (III) de sódio (NNP) e SIN-1. (segue Quadro 7)

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Quadro 7

Estimulação da auanilato-ciclase em plaquetas

Substância Actividade da guanilato-ciclase (pmole c-GMP/mg prot. x 15 min)

Concentração 0,01 μΜ 10 μΜ Nitrosilpentacianofer- rato (III) de sódio (NNP) 0 3399 SIN-1 0 59733 Exemplo 2 411 37920 Exemplo 8 897 64192 Exemplo 24 2374 59716 Exemplo 20 2225 47298 Exemplo 3 2499 47529 Exemplo 23 383 76915 Exemplo 1/29 4407 61900 (base) Exemplo 54 8139 18693 Exemplo 38 1024 82100 Exemplo 13 7642 48126 Exemplo 63 1761 72730 4. Efeito relaxante sobre a traqueia

Os compostos de acordo com o invento foram ensaiados quanto à sua capacidade de relaxar uma traqueia pré-contraída. Uma contracção das vias respiratórias em combinação com um engrossamento da membrana mucosa constitui um factor vital no estado asmático. 0 relaxamento ou dilatação das vias respiratórias contraídas melhorará o estado asmático. O método para demonstrar o relaxamento de uma traqueia pré-contraída é descrito por Emmerson & Mackay (J. Pharm. Pharmacol 31, 798, 1979). Usa-se uma traqueia isolada de uma i 73 632

62804 HM/MSJ -32-cobaia. Após preparação de uma tira que mantenha a musculatura circular, o órgão é dividido em duas partes de igual tamanho. As duas tiras de traqueia são suspensas no seu respectivo banho de órgãos e são ligadas a um transdutor que regista a contracção e o relaxamento do órgão por meio de um registador. As duas tiras da traqueia são continuamente banhadas num tampão de Krebs a 37'C, em que se faz borbulhar constantemente carbogénio (95% 02 e 5% C02). Após um tempo de equilíbrio de cerca de 3 horas, os órgãos são ensaiados quanto à sua sensibilidade (contractibilidade) a carbamilcolina, adicionada na forma de bólus directamente ao banho (0,3 μΜ). Se a contracção for satisfatória, os órgãos são transferidos para o tampão de Krebs contendo a mesma concentração de carbamilcolina. Os órgãos estão agora expostos constantemente à carbamilcolina e, lentamente, desenvolvem uma contracção permanente ("asma"). As substâncias em ensaio são adicionadas na forma de bólus directamente ao banho de órgãos. Depois de obtido o efeito máximo (relaxamento) as substâncias são removidas por lavagem e a tira de traqueia regressa ao seu estado de contracção permanente. Ensaiam-se pelo menos 3 concentrações diferentes das substâncias em ensaio para demonstrar um relaxamento do orgão dependente da dose. Calcula-se o valor EC50 (isto é, a concentração que relaxa o órgão em 50% em relação ao relaxamento máximo) para cada substância em ensaio, por meio de uma análise de regressão linear (log da concentração (μΜ) como constante, em abcissas, e a % de relaxamento como variável, em ordenadas). Usam-se como substâncias de referência o nitrosilpentacianoferrato (III) de sódio (NNP) e SIN-1.

Os resultados para oito compostos de acordo com o invento e para duas substâncias de referência estão indicados no Quadro 8.

Verifica-se, pelo Quadro 8, que os compostos de acordo com o invento são equipotentes ao NNP no relaxamento de tiras de traqueia pré-contraídas e são mais potentes do que o SIN-1. Sublinhe-se que os compostos de acordo com o invento têm um efeito muito mais duradouro quando comparado com o das substâncias de referência. /5- -33- 73 632

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Quadro 8

Relaxamento da traqueia

Substância ec50 nitrosilpentacianoferrato (III) de sódio (NNP) 2,5 SIN-1 18,3 Exemplo 53 0,7 20 2,7 12 4,9 1/29 (base) 0,8 54 0,6 38 3,2 13 1/1 47a 5,2 5. Inibição da função dos leucócitos

Os compostos de acordo com o invento foram ensaiados quanto à sua capacidade de aumentar o teor em guanosina-monofosfato cíclico (c-GMP) para inibir a síntese do leucotrieno B4 (LTB4) e para inibir o movimento quimiotáctico dos leucócitos nucleares polimorfos (PMN). Os leucócitos nucleares polimorfos desempenham um papel vital na parte celular dos processos de inflamação. Em doenças como a asma, a membrana mucosa das vias respiratórias incham em resultado de uma inflamação com uma infiltração significativa em particular dos leucócitos nucleares polimorfos (PMN). São substâncias particularmente eficazes no tratamento da asma as que, além de relaxarem a musculatura nas vias respiratórias, têm também um efeito anti-inflamatório sobre a fase celular do processo inflamatório, isto é, as aue inibem a função dos leucócitos. O método para demonstrar a inibição da função dos leucócitos é descrito por Moilanen et al. (Abstracts, 2nd International Symposium on Endothelium Derived Vasoactive Factors, Basel, . .'aSafH* -34- 73 632 f.i

62804 HM/MSJ 1992). Incubam-se a 37°C por 10 min PMN humanos isolados, após o que se mede o teor em guanosina-monofosfato cíclico (c-GMP). Depois determina-se a síntese do LTB4 após estimulação pelo ionóforo Ca (A23187) e determina-se a quimiotaxia (movimento controlado) para a FMLP (uma substância que atrai os leucócitos nucleares polimorfos PMN).

Ensaiaram-se três compostos de acordo com o invento e a substância de referência SIN-1 quanto à sua capacidade de estimular o teor em guanosina-monofosfato cíclico (c-GMP). 0 Quadro 9 mostra um aumento, dependente da dose, do teor de c-GMP nos PMN. Os compostos de acordo com o invento são todos mais potentes do que a SIN-1.

Os compostos de acordo com o invento inibem ainda a síntese do leucotriano B4 nos PMN e a quimiotaxia dos PMN para a FMLP. A SIN-1 foi também capaz de inibir estas funções dos leucócitos mas apenas quando usada em concentrações mais elevadas.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 ilustra a inibição da quimiotaxia para dois compostos de acordo com o invento. A Figura 2 ilustra a inibição da síntese do leucotrieno B4 comparada com o aumento do teor de c-GMP nos leucócitos nucleares polimorfos (PMN) para um composto de acordo com o invento.

Verifica-se que se pode estabelecer um paralelismo entre o aumento no guanosina-monofosfato cíclico (c-GMP) e o decréscimo na síntese de LTB4 e o movimento quimiotáctico dos PMN.

73 632 62804 HM/MSJ - -35- guadro 9

Estimulação do c-GMP nos PMN

Substância Concentração μΜ c-GMP (fmole*/lo6 células) SIN-1 0 14 1 32 10 220 100 473 Exemplo 24 0 13 1 391 10 965 100 1078 Exemplo 20 0 13 1 175 10 492 100 866 Exemplo 1/29 (base) 0 . 14 1 209 10 859 100 1044 * f = 10“15

ENSAIOS DE TOXICIDADE

Realizaram-se dois ensaios em ratazanas macho, nomeadamente uma determinação da "dose máxima tolerável" (MTD) e um ensaio usando doses múltiplas per os. Realizou-se além disto um ensaio de LD5q por via endovenosa em ratinhos. 1. Determinação da dose máxima tolerável

Num ensaio MTD, administrou-se a 10 animais uma dose da 73 632

62804 HM/MSJ -36-substância, uma vez por dia durante uma semana, período durante o qual se registaram os parâmetros clínicos e hematológicos. Quando não se verificaram sinais de efeitos secundários, aumentou-se a dose nas semanas seguintes até aparecerem efeitos secundários. Os parâmetros hematológicos medidos foram os seguintes: o número de glóbulos vermelhos e brancos, o número de plaquetas sanguíneas, a percentagem de hemoglobina, os hematócritos e, para os glóbulos vermelhos, também o volume médio da célula, o teor médio de hemoglobina das células e a concentração média da hemoglobina das células. Além disso, faz-se uma contagem diferencial dos glóbulos brancos.

Os resultados do ensaio estão indicados no Quadro 10.

Quadro 10

Aumento de & peso

Dose Exemplo mg/kg

Observações Parâmetros X x clínicas hematológicos

Estudo MTD i.n. 10 N.R. N.R. N.R. 20 efeito CNS granulócitos neutrof ílicos aumentados com granulação tóxica reduzido Estudo MTD p.o. 10 N.R. N.R. N.R. 20 N.R. N.R. N.R. 40 N.R. RBC reduzido1 2 HGB reduzido3 WBC aumentado4 N.R. 1 avaliado em relação ao grupo de controlo N.R.: nada notável 2 : glóbulos vermelhos 3 : percentagem de hemoglobina 4 : glóbulos brancos

73 632

62804 HM/MSJ -37- O composto preparado pelo processo do Exemplo lf administrado intraperitonealmente a ratazanas, foi tolerado apenas com efeitos secundários pequenos, até 20 mg/kg (-MTD). Os efeitos secundários mais significativos a 20 mg/kg consistiram num efeito CNS passageiro, onde os animais, alguns minutos após a administração pareceram nervosos e hiperactivos e onde se verificaram sinais de uma reacção tóxica no quadro dos glóbulos brancos (número aumentado de granulócitos neutrofílicos e uma granulação tóxica nalgumas células). O valor correspondente (MTD), usando o mesmo composto em administração per os. foi de 40 mg/kg. Após administração desta dose apareceram, depois de uma semana, sinais de anemia e um teor aumentado de glóbulos brancos. 2. Administração de doses múltiplas per os

Neste ensaio administraram-se per os substâncias numa dose de 20 mg por kg, como soluções ou suspensões, uma vez por dia durante 5 dias, a grupos de 5 animais. Realizaram-se observações clínicas todos os dias e mediram-se os parâmetros hematológicos acima citados no terceiro dia do ensaio. Os resultados estão indicados no Quadro 11.

Quadro 11

Exemplo Dose mg/kg Observações clínicas1 Parâmetros hematológicos1 Aumento de peso1 5 dias de administração oer os 21 20 N.R. N.R. N.R. 26 20 N.R. N.R. N.R. 43 20 N.R. N.R. N.R. 38 20 N.R. N.R. N.R. 50 20 N.R. N.R. N.R. 1 avaliado em relação ao grupo de controlo N.R.: nada notável

Em doses de 20 mg/kg, os compostos preparados nos Exemplos

73 632 62804 HM/MSJ -38-

21, 26, 43, 38 e 50 não provocaram efeitos secundários em ratazanas após administração durante 5 dias.

3. Ensaio LD^Q (Segundo Litchfield e Wilcoxon, J. Pharmacol. Exp. Therap. 96, 99-113, 1949). O valor LD50 endovenoso foi determinado após uma única injecção de diferentes doses do composto preparado no Exemplo 4.

Os resultados estão indicados no Quadro 12.

Quadro 12 LD50 mg/kg com limites de confiança a 95% com Exemplo ratinhos macho ratinhos fêmea 81 (75-88) 4 89 (82-97) 4. Conclusão Farmacológica

Os compostos do invento possuem propriedades farmacológicas que os tornam adequados para o tratamento da trombose e asma.

Trombose A inibição da agregação das plaquetas sanguíneas juntamente com a inibição de PAI e estimulação de c-GMP em plaquetas torna os compostos interessantes para evitar a trombose bem como para a dissolução de trombos já estabelecidos..

Asma O relaxamento das vias respiratórias juntamente com a inibição da função dos leucócitos torna os compostos interessantes para o tratamento de asma, inibindo, pela última propriedade, o inchaço inflamatório da membrana mucosa nas vias respiratórias .

Para além das propriedades farmacológicas já mencionadas, 73 632

62804 HM/MSJ

-39- os compostos do invento têm também um efeito relaxante sobre outras células do músculo liso, por exemplo, em artérias, veias e tecido cavernoso. Reduzem ainda a pressão sanguínea em ratazanas. 0 invento foi descrito referindo as concretizações preferidas. Podem contudo realizar-se muitas modificações sem desvio do âmbito do invento.

Claims (4)

73 632 62804 HM/MSJ -40- REIVINDICACÕES

1 - Compostos l,2,3,4-oxatriazol-5-imina substituídos na posição 3 e seus sais de adição de ácido, caracterizados por terem a fórmula geral I,

onde R·*· são grupos alquilo ou alcoxi, iguais ou diferentes, tendo 1 a 3 átomos de carbono, halogéneo, grupos trifluorometilo, nitro, ciano, fenilo ou alquilsulfonilo, néla5eR2é hidrogénio ou um grupo de fórmula II -X-Y-Q-(Z)m onde X é -C(0)-, -C(0)0-, -C(0)NH-, -S(0)2 ou uma ligação directa, Y é um grupo alquileno com 1 a 4 átomos de carbono ou uma ligação directa, e Q é alquilo, cicloalquilo, alcoxi ou um grupo fenilo, piridilo, furanilo, tienilo ou pirazinilo que está opcionalmente substituído por Z, onde Z são grupos alquilo ou alcoxi, com 1 a 3 átomos de carbono, halogéneo, hidroxi, aciloxi, trifluorometilo, nitro, ciano ou alquilsulfonilo, e m é 1 a 3, pelo que Z, também pode significar, quando X for -C(0)- ou —C(O)NH—, Y for uma ligação directa e Q for fenilo substituído, a estrutura I, onde R2 tem os mesmos significados que em relação a X/ ϊ e Q, com a condição de R2 não ser hidrogénio, alquilo, benzoílo, trifluoroacetilo ou um grupo fenilo opcionalmente substituído, quando R1 for metilo ou cloro e n for 1, e de R2 não ser hidrogénio ou um grupo fenilo opcionalmente substituído quando R1 -41- 73 632 62804 HM/MSJ for nitro, alcoxi, flúor ou bromo e n for 1.

2 - Compostos l,2,3,4-oxatriazol-5-imina substituídos na posição 3 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por n ser 2 a 4 na fórmula geral I.

3 - Preparado farmacêutico, caracterizado por o referido preparado compreender, como um ingrediente activo, um composto de fórmula geral I de acordo com a reivindicação 1 associado a um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

4 - Processo de preparação de compostos 1,2,3,4-oxatria-zol-5-imina substituídos na posição 3 de fórmula geral I, de acordo com a reivindicação 1, e dos seus sais de adição de ácido, caracterizado por compreender fechar o anel de um derivado da 1-ariltio-semicarbazida, de fórmula geral III (Rx)n

onde R1 tem o mesmo significado que na fórmula I e R3 é H ou um grupo de fórmula IV -X-Y-Q-(Z)m onde X é uma ligação directa e Y e Q~(Z)m têm o mesmo significado que na fórmula I, por tratamento com um nitrito de alquilo tendo 1 a 6 átomos de carbono ou nitrito de metal alcalino, sob condições acídicas, a aproximadamente 0 a 10°C, sendo, em seguida, o sal resultante opcionalmente convertido no composto livre e, se desejado, acilado.

Por A/S GEA FARMACEUTISK FABRIK =0 AGENTE 0FICIAL=