PL239138B1 - Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania - Google Patents
Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania Download PDFInfo
- Publication number
- PL239138B1 PL239138B1 PL431988A PL43198819A PL239138B1 PL 239138 B1 PL239138 B1 PL 239138B1 PL 431988 A PL431988 A PL 431988A PL 43198819 A PL43198819 A PL 43198819A PL 239138 B1 PL239138 B1 PL 239138B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- detection
- fungus
- verticillium
- colletotrichum
- botrytis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 22
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 title claims description 12
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims description 9
- 241000740945 Botrytis sp. Species 0.000 title description 3
- 241001480643 Colletotrichum sp. Species 0.000 title description 3
- 241000221841 Verticillium sp. (in: Hypocreales) Species 0.000 title description 3
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 claims description 16
- 241000222199 Colletotrichum Species 0.000 claims description 14
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 claims description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 11
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 8
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 7
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 4
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 4
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 4
- 241001123668 Verticillium dahliae Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 2
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000010244 detection of fungus Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000222201 Colletotrichum capsici Species 0.000 description 1
- 241001123534 Colletotrichum coccodes Species 0.000 description 1
- 241001529387 Colletotrichum gloeosporioides Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001447693 Verticillium longisporum Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzajów Botrytis, Colletotrichum i Verticillium z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym (qPCR), a także sposób wykrywania obecności tych patogenów.
Grzyby z rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium należą do fitopatogenów o zasięgu światowym i mogą infekować wiele gatunków roślin, w tym wiele ważnych rolniczo i cennych ekonomicznie upraw, do których zaliczyć należy również plantacje owoców miękkich, w tym truskawek. Grzyby te niszczą roślinę, prowadząc do poważnych strat w plonach i powodują obniżenie jakości wielu upraw, a zwłaszcza owoców (Williamson B., Tudzynski B., Tudzynski P., Van Kan J., 2007. Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology, 8, 561-580; Howard C. M., Maas J. L., Chandler C. K., Afbregts E. E., 1992. Anthracnose of strawberry caused by the Colletotrichum complex in Florida. Plant Disease, 76, 976-981; Klosterman S. J., Atallah Z. K., Vallad G. E., Subbarao K. V., 2009. Diver sity, pathogenicity, and management of Verticillium species. Annual Review Phytopathology, 47, 39-62).
Opisano wiele metod detekcji grzybów z rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium, jednakże pomimo ogromnych wysiłków nie istnieje niezawodna metoda pozwalająca na wykrycie tych patogenów w próbkach środowiskowych, a ponadto nie opracowano dotychczas metody jednoczesnej detekcji tych patogenów w próbkach środowiskowych, dlatego opracowana nowa metoda, zwalidowana na wielu rodzajach próbek środowiskowych jest odpowiedzią na zapotrzebowanie rolników, przetwórców i laboratoriów diagnostycznych. Wykrycie grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp. i Verticillium sp. na wczesnych etapach zakażenia oraz w glebie lub w materiale roślinnym przed założeniem plantacji jest bardzo istotne dla utrzymania wydajności i jakości owoców, a także dla kontroli rozprzestrzeniania się patogenów (Mararczyk D., Panek J., Frąc M., 2019. Alternative Molecular-Based Diagnostic Methods of Plant Pathogenic Fungi Affecting Berry Crops-A Review. Molecules, 24, 1200, doi: 10.3390/molecules).
Do metod najczęściej wykorzystywanych w detekcji grzybów z rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium należą tradycyjne metody diagnostyczne oparte o metody płytkowe, które są długotrwałe i czasochłonne (Termorshuizen A. J., Davis J. R., Gort G., Harris D. C., Huisman O. C., Lazarovits G., Locke T., Melero Vara J. M., Mol L., Paplomatas E. J., Platt H. W., Powelson M., Rouse D. I., Rowe R. C., Tsror L., 1998. Interlaboratory comparison of methods to quantify microsclerotia of Verticillium dahliae in soil. Applied and Environmental Microbiology 64, 3846-3853), oraz metody oparte na immunodetekcji (Heppner C., Heitefuss R., 1997. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Verticillium dahliae detection in soil. In: Dehne HW, Adam G., Diekmann M., Frahm J., Mauler-Machnik A. and van Halteren P (eds) Diagnosis and Identification of Plant Pathogens. Proceedings of the 4th International Symposium of the European Foundation for Plant Pathology, Bonn, Germany, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 9-12 September 1996, 105-108; Obanor F. O., Walter M., Waipara N. W., Cernusko R., 2002, Rapid method for the detection and quantification of Botrytis cinerea in plant tissues. New Zealand Plant Protection 55, 150-153). Wśród metod molekularnych opracowanych do diagnostyki grzybów z wymienionych rodzajów należą te oparte o konwencjonalną łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) (Inderbitzin P., Davis R. M., Bostock R. M., Subbarao K. V., 2013. Identification and Differentiation of Verticillium Species and V. longisporum Lineages by Simplex and Multiplex PCR Assays. PLoS ONE 8, 6, e65990. doi: 10.1371/journal.pone. 0065990), ilościową łańcuchową reakcję polimerazy (qPCR) (Maurer K. A., Radisek S., Berg G., Seefelder S., 2013. Real-time PCR assay to detect Verticillium albo-atrum and V. dahliae in hops: development and comparison with a standard PCR method. Journal of Plant Diseases and Protection, 120, 3, 105-114; Tapia-Tussell R, QuijanoRamayo A., Cortes-Velazquez A., Lappe P., Lar que-Saavedra A., Perez-Brito D., 2008. PCR-Based Detection and Characterization of the Fungal Pathogens Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum capsici Causing Anthracnose in Papaya (Carica papaya L.) in the Yucatan Peninsula. Molecular Biotechnology, 40, 3, 293-298), oraz metody izotermicznej amplifikacji wykorzystującej zapętlenie (LAMP) (Aslani S., Garoosi G., Jafary H., 2017. Using a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay and Direct DNA Extraction Method from Wood for Rapid Detection of Verticillium dahliae in Olive Trees. Biosciences Biotechnology Research Asia, 14, 2, DOI: http://dx.doi.org/10.13005/hhra/2501; Duan Y. B., Ge C. Y., Zhang X. K., Wang J. X., Zhou M. G., 2014. Development and Evaluation of a Novel and Rapid Detection Assay for Botrytis cinerea Based on Loop-Mediated Isothermal Amplification. PlosONE, 9, 10, el 1109). Jednakże wymienione dostępne w literaturze metody umożliwiające
PL 239 138 B1 identyfikację grzybów z rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium oparte są o inne markery lub startery i charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Ponadto, testy detekcji wymienionych grzybów opracowywane są najczęściej dla czystych kultur bez oceny ich przydatności do detekcji na próbkach środowiskowych, w których występują inne grzyby towarzyszące uprawom roślin w danej lokalizacji lub kontaminowanych różnymi patogenami, albo sprawdzane są na pojedynczych specyficznych matrycach środowiskowych. Należy również dodać, że dostępne w literaturze metody nie umożliwiają jednoczesnej detekcji tych patogenów w jednej reakcji, podczas tego samego badania.
Startery oraz sondy zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje genu kodującego region D2 dużej podjednostki rybosomalnego RNA, uzyskane z izolatów grzybów należących do rodzajów Botrytis, Colletotrichum i Verticillium pochodzących z części nadziemnych roślin, owoców i korzeni truskawki oraz z gleby spod upraw truskawek.
Istotę wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium o sekwencjach od nr 1 do nr 5, jak przedstawiono na liście sekwencji.
Istotą sposobu wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium jest zastosowanie w reakcji qPCR pary starterów oligonukleotydowych o sekwencjach nr 1, 2 oraz sond molekularnych o sekwencjach od nr 3 do nr 5 Jak przedstawiono na liście sekwencji, w wyniku której dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się specyficznej detekcji otrzymanego produktu amplifikacji poprzez odczyt fluorescencji o długości fali 520 nm, 576 nm i 667 nm, po wzbudzeniu światłem o długości fali 495 nm, 544 nm i 643 nm.
Zastosowanie wymienionych starterów oligonukleotydowych oraz sond molekularnych do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym, przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku, umożliwia amplifikację produktu o długości 320, 321 i 322 par zasad, odpowiednio dla detekcji grzybów z rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium. Podstawową zaletą opracowanego systemu detekcji jest możliwość jednoczesnej detekcji trzech różnych, często występujących wspólnie patogenów lub wykrycia jednego z tych patogenów, jeśli inne nie występują w danej próbce. Przewagą jednoczesnej detekcji różnych patogenów jest również znaczna oszczędność kosztów związanych z odczynnikami, które byłyby wykorzystywane w trzech oddzielnych reakcjach. Korzyścią opracowanej metody jest również fakt, że została ona zwalidowana nie tylko na czystych kulturach grzybów, ale również na próbkach środowiskowych, w szczególności glebie oraz fragmentach roślin, korzeniach i owocach truskawki, w których stwierdzono obecność grzybów patogenicznych z rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium.
Wynalazek jest bliżej pokazany w przykładzie wykonania i zamieszczonym poniżej rysunku, na którym:
- Fig. 1 przedstawia sekwencje nukleotydowe fragmentów DNA amplifikowanych w reakcji qPCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencjach nr 1 i 2;
- Fig. 2 przedstawia wykresy wzrostu fluorescencji w wyniku amplifikacji materiału genetycznego Botrytis sp., Colletotrichum sp. i Verticillium sp. w obecności starterów o sekwencjach nr 1 i 2 oraz sond molekularnych o sekwencjach od nr 3 do nr 5.
Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie detekcji stanowi gleba, korzenie, fragmenty roślin, owoce, fragmenty grzybni lub zarodniki mikroorganizmów. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. Reakcję qPCR przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana wolna od nukleaz, master mix do reakcji qPCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA typu HotStart, kofaktor enzymu - jony Mg2+, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę oligonukleotydowych starterów (0,3 μM) o sekwencjach nr 1 i 2, sondy molekularne o sekwencji nr 3 (0,15 μM), o sekwencji nr 4 (0,15 μM) oraz o sekwencji nr 5 (0,15 μΜ) i termolabilną uracyl-N-gikozylazę (0,01 U/μl). Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: UNG - 37°C przez 2 minuty, wstępna denaturacja, dezaktywacja UNG i aktywacja polimerazy Taq DNA: 95°C przez 12 minut, następnie 40 cykli: denaturacja - 95°C przez 5 sekund, przyłączanie starterów, elongacja i odczyt fluorescencji - 60°C przez 2 minuty lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA i detekcji z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanych fragmentów DNA przedstawiona jest na Fig. 1.
Obecność oczekiwanych produktów o długości 320, 321 i 322 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnego termocyklera typu real-time PCR umożliwiającego wzbudzenie mieszaniny
PL 239 138 B1 reakcyjnej światłem o długości fali 495 nm, 544 nm i 643 nm i odczyt fluorescencji o długości fali 520 nm, 576 nm i 667 nm.
Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego patogenów grzybowych należących do rodzajów Botrytis, Colletotrichum i Verticillium w badanej próbce według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.
A. Izolacja DNA z fragmentów roślin, korzeni i owoców truskawki, grzybni oraz gleby
Izolację DNA przeprowadzono w wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji DNA z próbek środowiskowych (FastDNA Spin Kit for Faeces - MP Biomedicals).
250 mg tkanki roślinnej/grzybowej lub 500 mg gleby wprowadzano do probówek o pojemności 2 ml, zawierających matrycę złożoną z kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm, kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm oraz 1 kulki szklanej o średnicy 4 mm. Próby następnie płukano w buforze fosforanowo-sodowym (825 μl) z odczynnikiem PLS (275 μl). Następnie wirowano (5 minut, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Dodano bufor fosforanowo-sodowy (978 μl) i bufor MT (122 μl), po czym próbki homogenizowano w aparacie FastPrep24 w warunkach: 40 s, 6 m/s. Próbki następnie wirowano (15 minut, 14 000 x g), a supernatant przenoszono do nowych probówek zawierających bufor PPS (250 μl). Próbki mieszano poprzez odwracanie i inkubowano (10 minut w temperaturze 4°C). Mieszaninę wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie supernatant przenoszono do nowej probówki o pojemności 5 ml, zawierającej odczynnik Binding Matrix Solution (1 ml). Próbki następnie mieszano na rotatorze (5 minut), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Osad płukano buforem płuczącym (Wash Buffer #1, 1 ml). Otrzymaną zawiesinę dwukrotnie przenoszono na kolumnę separacyjną (SPIN Filter), wirowano (1 minutę, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr następnie płukano drugim buforem płuczącym (Wash Buffer #2, 500 μl), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr ponownie wirowano (2 minuty, 14 000 x g) a następnie przenoszono filtr do nowej probówki. Na filtr nanoszono bufor elucyjny (TES, 100 μl) i wirowano (2 minuty, 14 000 x g). Uzyskany przesącz, zawierający wyekstrahowane DNA, rozcieńczano 10-krotnie wodą dejonizowaną wolną od nukleaz.
B. Przygotowanie próbek do amplifikacji
DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji qPCR. Do probówki o pojemności 0,1 ml dodano 4 μl wyizolowanego DNA.
Reakcje przeprowadzono w termocyklerze 7500 FAST (AppliedBiosystems) w objętości 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną wolną od nukleaz, master mix MP qPCR Master Mix (2x) (EURx), parę oligonukleotydowych starterów (0,3 μM) o sekwencji nr 1 i 2, sondy molekularne o sekwencji nr 3 (0,15 μM), o sekwencji nr 4 (0,15 μM) oraz o sekwencji nr 5 (0,15 μM), termolabilną uracyl-N-gikozylazę (0,1 U/μl). Ponadto, ze względu na wykorzystany termocykler, mieszanina reakcyjna zawierała barwnik referencyjny ROX (30 nM). Probówki wprowadzono na blok termocyklera stosując następujący profil termiczny: 37°C przez 2 minuty, 95°C przez 12 minut, następnie 40 cykli: 95°C przez 5 sekund, 60°C przez 2 minuty.
C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą detekcji fluorescencji w trakcie trwania reakcji
W trakcie trwania reakcji, po każdym cyklu aparat zbierał dane dotyczące fluorescencji mieszaniny reakcyjnej. Pozytywny wynik reakcji obserwowano jako wystąpienie wzrostu fluorescencji ponad poziom bazowy i pojawienie się krzywej amplifikacji. Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów, sond molekularnych i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.
PL239 138 Β1
LISTA SEKWENCJI
Sekwencja nr 1
D2LSUF: 5’ AGA CCG ATA GCG MAC AAG 3'
Sekwencja nr 2
D2LSU R: 5’ CTT GGT CCG TGT TTC AAG 3’
Sekwencja nr 3
BotrytisóFAM: 6FAM 5’ TCAGGGTCTCGTACCCTGTGTACTT 3’ BIIQ-1
Sekwencja nr 4
ColletotrichumTamra: Tamra(R)5’ TGTGACCAGACTTGCGTCCGGTGAA 3’
BHQ-2
Sekwencja nr 5
VerticilliumCy5: Cy5 5’ TGGTTCAACCAGGTCCATGACCT 3’ BHQ-2
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium o sekwencjach od nr 1 do nr 5, jak przedstawiono na liście sekwencji.
- 2. Sposób wykrywania fitopatogenicznych grzybów z rodzaju Botrytis, Colletotrichum i Verticillium, w którym w reakcji qPCR z zastosowaniem pary starterów i sond molekularnych dochodzi do amplifikacji określonych fragmentów DNA, objawiającej się pojawieniem się krzywych amplifikacji, potwierdzając detekcję powstałych produktów, znamienny tym, że parę starterów i sondy stanowią startery oligonukleotydowe i sondy molekularne jak określono w zastrz. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431988A PL239138B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431988A PL239138B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431988A1 PL431988A1 (pl) | 2021-05-31 |
| PL239138B1 true PL239138B1 (pl) | 2021-11-08 |
Family
ID=76133064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431988A PL239138B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL239138B1 (pl) |
-
2019
- 2019-11-28 PL PL431988A patent/PL239138B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL431988A1 (pl) | 2021-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| Pieczul et al. | Detection of Tilletia caries, Tilletia laevis and Tilletia controversa wheat grain contamination using loop-mediated isothermal DNA amplification (LAMP) | |
| Elbeaino et al. | Development of an FTP-LAMP assay based on TaqMan real-time PCR and LAMP for the specific detection of Xylella fastidiosa De Donno and mulberry strains in both plants and insect vectors | |
| Madihah et al. | Comparison of DNA extraction and detection of Ganoderma, causal of basal stem rot disease in oil palm using loop-mediated isothermal amplification | |
| US10415096B2 (en) | Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by PCR, primers as well as bacteria and fungi detection kit | |
| CN104946760A (zh) | 一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒 | |
| PL239138B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania | |
| KR102212379B1 (ko) | 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 | |
| KR101424101B1 (ko) | 벼 도열병균 검출용 조성물 및 이를 이용한 벼 도열병균의 정량적 검출방법 | |
| KR100744699B1 (ko) | 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적프라이머 | |
| CN107683338A (zh) | 微生物的检查方法、微生物的检查试剂盒、微生物检查用微阵列、霉菌检测用载体、霉菌的检测方法、以及霉菌检测用试剂盒 | |
| PL239137B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239135B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239136B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| Zhang et al. | Rapid detection of cactus virus X in pitaya by efficient reverse transcription loop-mediated isothermal amplification | |
| US20150292039A1 (en) | Method to amplify nucleic acids of fungi to generate fluorescence labeled fragments of conserved and arbitrary products | |
| PL238698B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Cyp51 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239141B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Phytophthora sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239142B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL248973B1 (pl) | Para starterów oligonukleotydowych do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum acutatum oraz sposób jego wykrywania | |
| PL242988B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania | |
| CN105039331A (zh) | 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法和应用 | |
| PL239140B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| RU2795019C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:P681R SARS-CoV-2 | |
| CN105039560A (zh) | 一种荔枝炭疽菌lamp引物及其快速检测方法和应用 |