PL239136B1 - Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania - Google Patents
Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania Download PDFInfo
- Publication number
- PL239136B1 PL239136B1 PL431986A PL43198619A PL239136B1 PL 239136 B1 PL239136 B1 PL 239136B1 PL 431986 A PL431986 A PL 431986A PL 43198619 A PL43198619 A PL 43198619A PL 239136 B1 PL239136 B1 PL 239136B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- colletotrichum
- detection
- molecular probe
- oligonucleotide primers
- detecting
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 title claims description 12
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims description 9
- 241001480643 Colletotrichum sp. Species 0.000 title description 2
- 241000222199 Colletotrichum Species 0.000 claims description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 6
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 2
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 4
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241001120669 Colletotrichum lindemuthianum Species 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 2
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 2
- 241001529387 Colletotrichum gloeosporioides Species 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222201 Colletotrichum capsici Species 0.000 description 1
- 241001123534 Colletotrichum coccodes Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000021278 navy bean Nutrition 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Colletotrichum z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym (qPCR), a także sposób wykrywania obecności tych patogenów.
Grzyby z rodzaju Colletotrichum należą do fitopatogenów powodujących antraknozę, prowadzącą do strat ekonomicznych w uprawach owoców, w tym truskawek. Grzyby z rodzaju Colletotrichum mogą atakować prawie wszystkie części roślin, prowadząc do poważnych strat w plonach i obniżenia jakości wielu upraw, a zwłaszcza owoców. Objawami chorobowymi dojrzałych owoców są brązowe lub czarne jędrne plamy zatopione w owocu, które mogą się powiększać dopóki nie pokryją całego owocu (Chen Y. Y., Conner R. L., Gillard C. L., Boland G. J., Babcock C., Chang K. F., Hwang S. F., Balasubramanian P. M., 2007. A specific and sensitive method for the detection of Colletotrichum lindemuthianum in dry bean tissue. Plant Disease, 91, 1271-6). Antraknoza wywoływana przez grzyby z rodzaju Colletotrichum wpływa nie tylko na owoce, ale także na korony, ogonki, liście, pąki i części kwiatowe, co stanowi poważne zagrożenie dla uprawianych roślin (Howard C. M., Maas J. L., Chandler C. K., Afbregts E. E., 1992. Anthracnose of strawberry caused by the Colletotrichum complex in Florida. Plant Disease, 76, 976-981).
Wykrycie grzybów z rodzaju Colletotrichum na wczesnych etapach zakażenia jest bardzo istotne dla utrzymania wydajności i jakości owoców, a także dla kontroli rozprzestrzeniania się patogenów (Mararczyk D., Panek .J., Frąc M., 2019. Alternative Molecular-Based Diagnostic Methods of Plant Pathogenic Fungi Affecting Berry Crops-A Review. Molecules, 24, 1200, doi: 10.3390/molecules).
Do metod najczęściej wykorzystywanych w detekcji grzybów z rodzaju Colletotrichum należą tradycyjne metody diagnostyczne oparte o izolację patogenu z zakażonej tkanki roślinnej, a następnie na identyfikacji grzyba, co jest długotrwałe i czasochłonne (Xie L., Zhang J., Wan Y., Hu D., 2010. Identification of Colletotrichum spp. isolated from strawberry in Zhejiang Province and Shanghai City, China, Biomed & Biotechnology, 11,1, 61-70). Chociaż rozwijane są również molekularne metody wykrywania i diagnostyki grzybów z rodzaju Colletotrichum, to dotyczą one pojedynczych gatunków, a patogeny z rodzaju Colletotrichum często występują wspólnie, atakując różne części roślin (Gadaga S. J. C., Siqueira C. S., Machado J. C., 2018. Molecular detection of Colletotrichum lindemuthianum in bean seed samples. Journal of Seed Science, 40, 4, 370-377). Wśród metod opracowanych do diagnostyki grzybów z rodzaju Colletotrichum należą te oparte o konwencjonalną łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) (Tapia-Tussell R., Qujano-Ramayo A., Cortes-Velazquez A., Lappe P., Larque-Saavedra A., Perez-Brito D., 2008. PCR-Based Detection and Characterization of the Fungal Pathogens Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum capsici Causing Anthracnose in Papaya (Carica papaya L.) in the Yucatan Peninsula. Molecular Biotechnology, 40, 3, 293-298), ilościową łańcuchową reakcję polimerazy (qPCR) (Chen Y. Y., Conner R. L., Gillard C. L., McLaren D. L., Boland G. J., Balasubramanian P. M., Stasolla C., Zhou Q. X., Hwang S. F., Chang K. F., Babcock C., 2013. A quantitative real-time PCR assay for detection of Colletotrichum lindemuthianum in navy bean seeds. Plant Pathology, 62, 900-907. Yang H. C., Haudenshield J. S., Hartman G. L., 2015. Multiplex Realtime PCR Detection and Differentiation of Colletotrichum Species Infecting Soybean. Plant Diseas, 99, 11, 1559-1568), oraz metody izotermicznej amplifikacji wykorzystującej zapętlenie (LAMP) (Wang S., Ye W., Tian Q., Dong S., Zheng X., 2017. Rapid detection of Colletotrichum gloeosporioides using a loop-mediated isothermal amplification assay. Australasian Plant Pathology, 46, 493-498). Jednakże wymienione dostępne w literaturze metody umożliwiające identyfikację grzybów z rodzaju Colletotrichum oparte są o inne markery lub startery i charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Ponadto, testy detekcji wymienionych grzybów opracowywane są najczęściej dla czystych kultur bez oceny ich przydatności do detekcji na próbkach środowiskowych, w których występują inne grzyby towarzyszące uprawom roślin w danej lokalizacji lub kontaminowanych różnymi patogenami, albo sprawdzane są na pojedynczych specyficznych matrycach środowiskowych.
Startery oraz sonda zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje genu kodującego region D2 dużej podjednostki rybosomalnego RNA, uzyskane z izolatów grzybów należących do rodzaju Colletotrichum pochodzących z części nadziemnych roślin, owoców i korzeni truskawki oraz z gleby spod upraw truskawek.
PL 239 136 B1
Istotę wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Colletotrichum o sekwencjach nr 1, 2 i 3, przedstawionych na liście sekwencji.
Istotą sposobu wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Colletotrichum jest zastosowanie w reakcji qPCR, pary starterów oligonukleotydowych o sekwencjach nr 1 i 2 oraz sondy molekularnej o sekwencji nr 3, przedstawionych na liście sekwencji, w wyniku której dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się specyficznej detekcji otrzymanego produktu amplifikacji poprzez odczyt fluorescencji o długości fali 576 nm, po wzbudzeniu światłem o długości fali 544 nm.
Zastosowanie wymienionych starterów oligonukleotydowych oraz sondy molekularnej do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym, przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku, umożliwia amplifikację produktu o długości 321 par zasad. Podstawową zaletą opracowanego systemu detekcji jest fakt, że został on zwalidowany nie tylko na czystych szczepach grzybów, ale również na próbkach środowiskowych, w szczególności glebie oraz fragmentach roślin, korzeniach i owocach truskawki, w których stwierdzono obecność grzyba patogenicznego z rodzaju Colletotrichum.
Wynalazek jest bliżej pokazany w przykładzie wykonania i zamieszczonym poniżej rysunku, na którym:
- Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji qPCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencjach nr 1 i 2;
- Fig. 2 przedstawia wykres wzrostu fluorescencji w wyniku amplifikacji materiału genetycznego Colletotrichum sp. w obecności starterów o sekwencjach nr 1 i 2 oraz sondy molekularnej o sekwencji nr 3.
Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie detekcji stanowi gleba, korzenie, fragmenty roślin, owoce, fragmenty grzybni lub zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. Reakcję qPCR przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana wolna od nukleaz, master mix do reakcji qPCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA typu HotStart, kofaktor enzymu - jony Mg2+, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę oligonukleotydowych starterów (0,3 μM) o sekwencjach nr 1 i 2, sondę molekularną (0,15 μM) o sekwencji nr 3 i termolabilną uracyl-N-gikozylazę (0,01 U/μl). Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: UNG - 37°C przez 2 minuty, wstępna denaturacja, dezaktywacja UNG i aktywacja polimerazy Taq DNA: 95°C przez 12 minut, następnie 40 cykli: denaturacja - 95°C przez 5 sekund, przyłączanie starterów, elongacja i odczyt fluorescencji - 60°C przez 2 minuty lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA i detekcji z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanego fragmentu DNA przedstawiona jest na Rysunku 1.
Obecność oczekiwanego produktu o długości 321 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnego termocyklera typu real-time PCR umożliwiającego wzbudzenie mieszaniny reakcyjnej światłem o długości fali 544 nm i odczyt fluorescencji o długości fali 576 nm.
Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego patogenów grzybowych należących do rodzaju Colletotrichum w badanej próbce według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.
A. Izolacja DNA z fragmentów roślin, korzeni i owoców truskawki, grzybni oraz gleby
Izolację DNA przeprowadzono w wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji DNA z próbek środowiskowych (FastDNA Spin Kit for Faeces - MP Biomedicals).
250 mg tkanki roślinnej/grzybowej lub 500 mg gleby wprowadzano do probówek o pojemności 2 ml, zawierających matrycę złożoną z kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm, kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm oraz 1 kulki szklanej o średnicy 4 mm. Próby następnie płukano w buforze fosforanowo-sodowym (825 μl) z odczynnikiem PLS (275 μl). Następnie wirowano (5 minut, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Dodano bufor fosforanowo-sodowy (978 μl) i bufor MT (122 μl), po czym próbki homogenizowano w aparacie FastPrep24 w warunkach: 40 s, 6 m/s. Próbki następnie wirowano (15 minut, 14 000 x g), a supernatant przenoszono do nowych probówek zawierających bufor PPS (250 μl). Próbki mieszano poprzez odwracanie i inkubowano (10 minut w temperaturze 4°C). Mieszaninę wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie supernatant przenoszono do nowej probówki o pojemności 5 ml, zawierającej odczynnik Binding Matrix Solution (1 ml). Próbki następnie mieszano na rotatorze (5 minut), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Osad płukano buforem płuczącym (Wash
PL239 136 Β1
Buffer #1, 1 ml). Otrzymaną zawiesinę dwukrotnie przenoszono na kolumnę separacyjną (SPIN Filter), wirowano (1 minutę, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr następnie płukano drugim buforem płuczącym (Wash Buffer #2, 500 μΙ), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr ponownie wirowano (2 minuty, 14 000 x g) a następnie przenoszono filtr do nowej probówki. Na filtr nanoszono bufor elucyjny (TES, 100 μΙ) i wirowano (2 minuty, 14 000 x g). Uzyskany przesącz, zawierający wyekstrahowane DNA, rozcieńczano 10-krotnie wodą dejonizowaną wolną od nukleaz.
B. Przygotowanie próbek do amplifikacji
DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji qPCR. Do probówki o pojemności 0,1 ml dodano 4 μΙ wyizolowanego DNA.
Reakcje przeprowadzono w termocyklerze 7500 FAST (AppliedBiosystems) w objętości 20 μΙ mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną wolną od nukleaz, master mix MP qPCR Master Mix (2x) (EURx), parę oligonukleotydowych starterów (0,3 μΜ) o sekwencjach nr 1 i 2, sondę molekularną o sekwencji nr 3 (0,15 μΜ), termolabilną uracyl-N-gikozylazę (0,1 U/μΙ). Ponadto, ze względu na wykorzystany termocykler, mieszanina reakcyjna zawierała barwnik referencyjny ROX (30 nM). Probówki wprowadzono na blok termocyklera stosując następujący profil termiczny: 37°C przez 2 minuty, 95°C przez 12 minut, następnie 40 cykli: 95°C przez 5 sekund, 60°C przez 2 minuty.
C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą detekcji fluorescencji w trakcie trwania reakcji
W trakcie trwania reakcji, po każdym cyklu aparat zbierał dane dotyczące fluorescencji mieszaniny reakcyjnej. Pozytywny wynik reakcji obserwowano jako wystąpienie wzrostu fluorescencji ponad poziom bazowy i pojawienie się krzywej amplifikacji. Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów, sondy molekularnej i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.
LISTA SEKWENCJI
Sekwencja nr 1
D2LSUF: 5’ AGA CCG ATA GCG MAC AAG 3'
Sekwencja nr 2
D2LSUR: 5’ CTT GGT CCG TGT TTC AAG 3’
Sekwencja nr 3
ColletotrichumTamra: Tamra(R)5’ TGTGACCAGACTTGCGTCCGGTGAA 3’
BHQ-2.
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Colletotrichum o sekwencjach nr 1, 2 i 3, przedstawionych na liście sekwencji.
- 2. Sposób wykrywania fitopatogenicznego grzyba z rodzaju Colletotrichum, w którym w reakcji qPCR z zastosowaniem pary starterów i sondy molekularnej dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, objawiającej się pojawieniem się krzywej amplifikacji, potwierdzając detekcję powstałego produktu, znamienny tym, że parę starterów i sondę stanowią startery oligonukleotydowe i sonda molekularna jak określono w zastrz. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431986A PL239136B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431986A PL239136B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431986A1 PL431986A1 (pl) | 2021-05-31 |
| PL239136B1 true PL239136B1 (pl) | 2021-11-08 |
Family
ID=76133057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431986A PL239136B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL239136B1 (pl) |
-
2019
- 2019-11-28 PL PL431986A patent/PL239136B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL431986A1 (pl) | 2021-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| Osman et al. | Real-time RT-PCR (TaqMan®) assays for the detection of Grapevine Leafroll associated viruses 1–5 and 9 | |
| Almasi et al. | Development of colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of the tomato yellow leaf curl virus | |
| CN111206106B (zh) | 一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法 | |
| KR101624026B1 (ko) | 사과갈색무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| Herath et al. | Detection of elm yellows phytoplasma in elms and insects using real-time PCR | |
| KR20230112858A (ko) | 키위 무름병균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출키트 및 이를 이용한 검출방법 | |
| PL239136B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| KR101424101B1 (ko) | 벼 도열병균 검출용 조성물 및 이를 이용한 벼 도열병균의 정량적 검출방법 | |
| KR100744699B1 (ko) | 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적프라이머 | |
| CN105039331B (zh) | 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法和应用 | |
| PL239138B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania | |
| CN105039560A (zh) | 一种荔枝炭疽菌lamp引物及其快速检测方法和应用 | |
| PL239137B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239135B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| CN113789401B (zh) | 环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法 | |
| PL242988B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania | |
| KR101457275B1 (ko) | 사탕무황화바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 | |
| JP7578608B2 (ja) | ビルベリーの識別のための方法とキット | |
| KR102926935B1 (ko) | 빌베리의 확인을 위한 방법 및 키트 | |
| JP7349149B2 (ja) | サツマイモ基腐病菌を検出するための核酸、プライマーセット、キットおよび方法 | |
| PL248973B1 (pl) | Para starterów oligonukleotydowych do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum acutatum oraz sposób jego wykrywania | |
| KR20200048622A (ko) | 박과 작물 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 박과 작물 바이러스병 진단방법 | |
| PL242987B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora cactorum oraz sposób ich wykrywania | |
| PL239141B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Phytophthora sp. oraz sposób jego wykrywania |