PL239135B1 - Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania - Google Patents
Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania Download PDFInfo
- Publication number
- PL239135B1 PL239135B1 PL431985A PL43198519A PL239135B1 PL 239135 B1 PL239135 B1 PL 239135B1 PL 431985 A PL431985 A PL 431985A PL 43198519 A PL43198519 A PL 43198519A PL 239135 B1 PL239135 B1 PL 239135B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- detection
- botrytis
- molecular probe
- oligonucleotide primers
- detecting
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 title claims description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims description 9
- 241000740945 Botrytis sp. Species 0.000 title description 2
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 6
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 claims description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 7
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 6
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 5
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000010244 detection of fungus Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Botrytis z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym (qPCR), a także sposób wykrywania obecności tych patogenów.
Grzyby z rodzaju Botrytis należą do fitopatogenów o zasięgu światowym i mogą infekować co najmniej 200 gatunków roślin, w tym wiele ważnych rolniczo i cennych ekonomicznie upraw, do których zaliczyć należy również plantacje owoców miękkich, w tym truskawek. Grzyby z rodzaju Botrytis niszczą roślinę, prowadząc do poważnych strat w plonach i powodują obniżenie jakości wielu upraw, a zwłaszcza owoców (Williamson B., Tudzynski B., Tudzynski P., Van Kan J., 2007. Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology, 8, 561-580). Wykrycie grzybów z rodzaju Botrytis na wczesnych etapach zakażenia jest bardzo istotne dla utrzymania wydajności i jakości owoców, a także dla kontroli rozprzestrzeniania się patogenów (Mararczyk D., Panek J., Frąc M., 2019. Alternative Molecular-Based Diagnostic Methods of Plant Pathogenic Fungi Affecting Berry Crops-A Review. Molecules, 24, 1200, doi: 10.3390/molecules).
Do metod najczęściej wykorzystywanych w detekcji grzybów z rodzaju Botrytis należą metody oparte o konwencjonalną łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) (Rigotti S., Gindro K., Richter H., Viret O., 2002. Characterizarion of molecular markers for specific and sensitive detection of Botrytis cinerea Pers.: Fr. in strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) using PCR. FEMS Microbiology Letters, 209, 169-174), ilościową łańcuchową reakcję polimerazy (qPCR) (Suarez M. B., Walsh K., Boonham N., ONeil T., Pearson S., Barker I., 2005. Development of realtime PCR (TaqMan) assays for the detection and quantification of Botrytis cinerea in planta. Plant Physiology and Biochemistry, 43, 890-899), metody oparte o immunodetekcję (Obanor F. O., Walter M., Waipara N. W., Cernusko R., 2002, Rapid method for the detection and quantification of Botrytis cinerea in plant tissues. New Zealand Plant Protection 55, 150-153) oraz metody izotermicznej amplifikacji wykorzystującej zapętlenie (LAMP) (Duan Y. B., Ge C. Y., Zhang X. K., Wang J. X., Zhou M. G., 2014. Development and Evaluation of a Novel and Rapid Detection Assay for Botrytis cinerea Based on Loop-Mediated Isothermal Amplification. PlosONE, 9, 10, e11109). Jednakże wymienione dostępne w literaturze metody umożliwiające identyfikację grzybów z rodzaju Botrytis oparte są o inne markery lub startery i charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Ponadto, testy detekcji wymienionych grzybów opracowywane są najczęściej dla czystych kultur bez oceny ich przydatności do detekcji na próbkach środowiskowych, w których występują inne grzyby towarzyszące uprawom roślin w danej lokalizacji lub kontaminowanych różnymi patogenami, albo sprawdzane są na pojedynczych specyficznych matrycach środowiskowych.
Startery oraz sonda molekularna zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje genu kodującego region D2 dużej podjednostki rybosomalnego RNA, uzyskane z izolatów grzybów należących do rodzaju Botrytis pochodzących z roślin, owoców i korzeni truskawki oraz z gleby spod upraw truskawek.
Istotę wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Botrytis o sekwencjach nr 1,2 i 3, jak przedstawiono na liście sekwencji.
Istotą sposobu wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Botrytis jest zastosowanie w reakcji qPCR, pary starterów oligonukleotydowych o sekwencjach nr 1 i 2 oraz sondy molekularnej o sekwencji nr 3, sekwencje przedstawione na liście sekwencji, w wyniku której dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się specyficznej detekcji otrzymanego produktu amplifikacji poprzez odczyt fluorescencji o długości fali 520 nm, po wzbudzeniu światłem o długości fali 495 nm.
Zastosowanie wymienionych starterów oligonukleotydowych oraz sondy molekularnej do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym, przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku, umożliwia amplifikację produktu o długości 320 par zasad. Podstawową zaletą opracowanego systemu detekcji jest fakt, że został on zwalidowany nie tylko na czystych szczepach grzybów, ale również na próbkach środowiskowych, w szczególności glebie oraz fragmentach roślin, korzeniach i owocach truskawki, w których stwierdzono obecność grzyba patogenicznego z rodzaju Botrytis.
Wynalazek jest bliżej pokazany w przykładzie wykonania i rysunku, na którym:
- Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji qPCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencjach nr 1 i 2;
PL 239 135 B1
- Fig. 2 przedstawia wykres wzrostu fluorescencji w wyniku amplifikacji materiału genetycznego Botrytis sp. w obecności starterów o sekwencjach nr 1 i 2 oraz sondy molekularnej o sekwencji nr 3.
Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie detekcji stanowi gleba, korzenie, fragmenty roślin, owoce, fragmenty grzybni lub zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. Reakcję qPCR przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana wolna od nukleaz, master mix do reakcji qPCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA typu HotStart, kofaktor enzymu - jony Mg2+, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę oligonukleotydowych starterów (0,3 μM) o sekwencjach nr 1 i 2, sondę molekularną (0,15 μM) o sekwencji nr 3 i termolabilną uracyl-N-gikozylazę (0,01 U/μl). Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: UNG - 37°C przez 2 minuty, wstępna denaturacja, dezaktywacja UNG i aktywacja polimerazy Taq DNA: 95°C przez 12 minut, następnie 40 cykli: denaturacja - 95°C przez 5 sekund, przyłączanie starterów, elongacja i odczyt fluorescencji - 60°C przez 2 minuty lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA i detekcji z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanego fragmentu DNA przedstawiona jest na Fig. 1.
Obecność oczekiwanego produktu o długości 320 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnego termocyklera typu real-time PCR umożliwiającego wzbudzenie mieszaniny reakcyjnej światłem o długości fali 495 nm i odczyt fluorescencji o długości fali 520 nm.
Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego patogenów grzybowych należących do rodzaju Botrytis w badanej próbce według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.
A. Izolacja DNA z fragmentów roślin, korzeni i owoców truskawki, grzybni oraz gleby
Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji DNA z próbek środowiskowych (FastDNA Spin Kit for Faeces - MP Biomedicals).
250 mg tkanki roślinnej/grzybowej lub 500 mg gleby wprowadzano do probówek o pojemności 2 ml, zawierających matrycę złożoną z kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm, kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm oraz 1 kulki szklanej o średnicy 4 mm. Próbki następnie płukano w buforze fosforanowo-sodowym (825 μl) z odczynnikiem PLS (275 μl). Następnie wirowano (5 minut, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Dodano bufor fosforanowo-sodowy (978 μl) i bufor MT (122 μl), po czym próbki homogenizowano w aparacie FastPrep24 w warunkach: 40 s, 6 m/s. Próbki następnie wirowano (15 minut, 14 000 x g), a supernatant przenoszono do nowych probówek zawierających bufor PPS (250 μl). Próbki mieszano poprzez odwracanie i inkubowano (10 minut w temperaturze 4°C). Mieszaninę wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie supernatant przenoszono do nowej probówki o pojemności 5 ml, zawierającej odczynnik Binding Matrix Solution (1 ml). Próbki następnie mieszano na rotatorze (5 minut), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Osad płukano buforem płuczącym (Wash Buffer #1, 1 ml). Otrzymaną zawiesinę dwukrotnie przenoszono na kolumnę separacyjną (SPIN Filter), wirowano (1 minutę, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr następnie płukano drugim buforem płuczącym (Wash Buffer #2, 500 μl), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr ponownie wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie przenoszono filtr do nowej probówki. Na filtr nanoszono bufor elucyjny (TES, 100 μl) i wirowano (2 minuty, 14 000 x g). Uzyskany przesącz, zawierający wyekstrahowane DNA, rozcieńczano 10-krotnie wodą dejonizowaną wolną od nukleaz.
B. Przygotowanie próbek do amplifikacji
DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji qPCR. Do probówki o pojemności 0,1 ml dodano 4 μl wyizolowanego DNA. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze 7500 FAST (AppliedBiosystems) w objętości 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną wolną od nukleaz, master mix MP qPCR Master Mix (2x) (EURx), parę oligonukleotydowych starterów (0,3 μM) o sekwencjach nr 1 i 2, sondę molekularną o sekwencji nr 3, termolabilną uracyl-N-gikozylazę (0,1 U/μl). Ponadto, ze względu na wykorzystany termocykler, mieszanina reakcyjna zawierała barwnik referencyjny ROX (30 nM). Probówki wprowadzono na blok termocyklera stosując następujący profil termiczny: 37°C przez 2 minuty, 95°C przez 12 minut, następnie 40 cykli: 95°C przez 5 sekund, 60°C przez 2 minuty.
PL239 135 Β1
C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą detekcji fluorescencji w trakcie trwania reakcji
W trakcie trwania reakcji, po każdym cyklu aparat zbierał dane dotyczące fluorescencji mieszaniny reakcyjnej. Pozytywny wynik reakcji obserwowano jako wystąpienie wzrostu fluorescencji ponad poziom bazowy i pojawienie się krzywej amplifikacji. Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów, sondy molekularnej i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.
LISTA SEKWENCJI
Sekwencja nr 1
D2LSU_F: 5’ AGA CCG ATA GCG MAC AAG 3'
Sekwencja nr 2
D2LSU R: 5’ CTT GGT CCG TGT TTC AAG 3’
Sekwencja nr 3
BotrytisóFAM: 6FAM 5’ TCAGGGTCTCGTACCCTGTGTACTT 3’ BHQ-l
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Botrytis o sekwencjach nr 1,2 i 3, przedstawionych na liście sekwencji.
- 2. Sposób wykrywania fitopatogenicznego grzyba z rodzaju Botrytis, w którym w reakcji qPCR z zastosowaniem pary starterów i sondy molekularnej dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, objawiającej się pojawieniem się krzywej amplifikacji, potwierdzając detekcję powstałego produktu, znamienny tym, że parę starterów i sondę stanowią startery oligonukleotydowe i sonda molekularna jak określono w zastrz. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431985A PL239135B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431985A PL239135B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431985A1 PL431985A1 (pl) | 2021-05-31 |
| PL239135B1 true PL239135B1 (pl) | 2021-11-08 |
Family
ID=76133048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431985A PL239135B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL239135B1 (pl) |
-
2019
- 2019-11-28 PL PL431985A patent/PL239135B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL431985A1 (pl) | 2021-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| US10415096B2 (en) | Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by PCR, primers as well as bacteria and fungi detection kit | |
| PL239135B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| KR102212379B1 (ko) | 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 | |
| KR100744699B1 (ko) | 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적프라이머 | |
| PL238698B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Cyp51 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239138B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania | |
| US20150292039A1 (en) | Method to amplify nucleic acids of fungi to generate fluorescence labeled fragments of conserved and arbitrary products | |
| PL248973B1 (pl) | Para starterów oligonukleotydowych do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum acutatum oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239137B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239141B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Phytophthora sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL242988B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania | |
| PL239142B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239136B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239139B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis cinerea oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239140B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| EP3956455B1 (en) | Method and kit for the identification of vaccinium myrtillus | |
| KR102926935B1 (ko) | 빌베리의 확인을 위한 방법 및 키트 | |
| PL238696B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Rpb2 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| RU2814814C2 (ru) | Способ и набор для идентификации Vaccinium myrtillus | |
| PL238697B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu SdhB do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| PL242987B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora cactorum oraz sposób ich wykrywania | |
| HK40060728A (en) | Method and kit for the identification of vaccinium myrtillus | |
| PL232070B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywania | |
| KR101823301B1 (ko) | 배 검은별무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 |