PL232070B1 - Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywania - Google Patents
Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywaniaInfo
- Publication number
- PL232070B1 PL232070B1 PL419483A PL41948316A PL232070B1 PL 232070 B1 PL232070 B1 PL 232070B1 PL 419483 A PL419483 A PL 419483A PL 41948316 A PL41948316 A PL 41948316A PL 232070 B1 PL232070 B1 PL 232070B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- puccinia striiformis
- detecting
- oligonucleotide primers
- fungal pathogen
- dna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 241001123583 Puccinia striiformis Species 0.000 title claims abstract description 20
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract description 13
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241001360088 Zymoseptoria tritici Species 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000736122 Parastagonospora nodorum Species 0.000 description 1
- 241001123569 Puccinia recondita Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 239000004476 plant protection product Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 101150108487 pst2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zgłoszenie dotyczy oligonukleotydów, umożliwiających stwierdzanie obecności materiału genetycznego patogenu grzybowego Puccinia striiformis w badanym materiale biologicznym z wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy lub jej modyfikacji. Przedmiot zgłoszenia stanowi para specyficznych gatunkowo starterów oligonukleotydowych do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy lub jej modyfikacji, o sekwencjach: LidPs11: 5'TTACGACATCTGCTTCCGCA 3' LidPs12: 5' TGCGATGTCAACTCTGGGAC 3' komplementarnych do specyficznych gatunkowo fragmentów sekwencji genomu Puccinia striiformis. Zgłoszenie obejmuje też sposób wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Puccinia striiformis, w którym dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA o długości 230 - 270 par zasad w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów oligonukleotydowych.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego Puccina striiformis z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy, a także sposób wykrywania obecności tego patogena.
Ochrona roślin zbożowych przed patogenami grzybowymi jest szczególnie istotna ze względu na znaczne straty powodowane przez te mikroorganizmy, zarówno pod względem wielkości, jak i jakości pozyskiwanego plonu. Najczęściej w celu ograniczenia populacji grzybów patogennych stosuje się działające nieselektywnie środki ochrony roślin. Z kolei wykorzystywane obecnie metody molekularne, identyfikujące mikroorganizmy jeszcze przed wystąpieniem widocznych objawów chorobowych poprzez wykrycie obecności ich materiału genetycznego, charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Niejednokrotnie, jak stwierdzono w przypadku patogena grzybowego Septoria tritici, okazuje się iż po kilkunastu latach stosowania opublikowanej metody identyfikacji, uzyskiwane produkty amplifikacji są tożsame z DNA innych gatunków grzybów (Guo J.R., Schneider F., Verreet J.A. 2006. Presymptomatic and quantitative detection of Mycosphaerella graminicola development in wheat using a real-time PCR assay. FEMS Microbiology Letters; 262(2): 223-229). Ponadto rzadko po zaprojektowaniu testu dokonuje się oceny przydatności na próbach środowiskowych o pełnym składzie gatunkowym grzybów występujących w danej lokalizacji.
W literaturze dostępnych jest kilka metod umożliwiających identyfikację grzyba Puccinia striiformis. Metody opracowane przez Fraaije i in. (2001) oraz Lihua i in. (2008) bazują na parach oligonukleotydów, celujących w gen kodujący β-tubulinę. Startery YRNT1/YRNT2 generują produkty specyficzne o wielkości 351 par zasad (Fraaije B.A., Lovell D.J., Coelho J.M., Baldwin S., Hollomon D.W. 2001. PCR-based assays to assess wheat varietal resistance to blotch (Septoria tritici and Stagonospora nodorum) and rust (Puccinia striiformis and Puccinia recondita) diseases. European Journal of Plant Pathology; 107, 905-917). Natomiast fragmenty DNA powielane przez pary starterów SCAR YR(f)/(r1) i YR(f)/YR(r2) mają długość odpowiednio 160 i 139 par zasad (Lihua C., Shichang X., Ruiming L., Taiguo L., Wanquan C. 2008. Early molecular diagnosis and detection of Puccinia striiformis f. sp. tritici in China. Letters in Applied Microbiology; 46: 501-506). Identyfikacja gatunkowa grzyba Puccinia striiformis jest możliwa również dzięki amplifikacji fragmentu regionu ITS z wykorzystaniem starterów PSR/PSF, zaprojektowanych przez Zhao i in. (2007). Produkt ma tu wielkość 169 par zasad (Zhao J., Wang X.J., Chen C.Q., Huang L.L., Kang Z.S. 2007. A PCR-based assay for detection of Puccinia striiformis f. sp. tritici in wheat. Plant Disease; 91: 1669-1674). Specyficzny i czuły sposób detekcji we wczesnych stadiach infekcji zaproponował Wang i in. (2008). Oligonukleotydy PST2 f/r powielające według metody fragment długości 470 nukleotydów zostały następnie wykorzystane jako startery zewnętrzne w nested PCR. Para wewnętrzna Nesta/Nests generuje produkt wielkości 230 par zsad (Wang X., Zhao J., Han Q., Huang L., Kang Z. 2008. The development of a PCR-based method for detecting Puccinia striiformis latent infections in wheat leaves. European Journal of Plant Pathology; 120: 241-247); (Wang X., Tang Ch., Chen J., Buchenauer H., Zhao J., Han Q. 2009. Detection of Puccinia striiformis in latently infected wheat leaves by nested polymerase chain reaction. Journal of Phytopathology; 157: 490-493). Z kolei najnowsza dostępna metoda identyfikacji, opracowana przez Gao i in. (2016) zakłada detekcję patogena już kilka godzin po inokulacji poprzez zastosowanie starterów SCAR PSTF117/PSTR363 i TF114/TR323 amplifikujących fragmenty długości odpowiednio 274 i 180 nukleotydów (Gao L., Yu H.X., Shen H.M., Li C., Liu T.G., Liu B. 2016. Development of SCAR markers and an SYBR green assay to detect Puccinia striiformis f. sp. tritici in infected wheat leaves. Plant Disease; 100: 1840-1847).
Sposób identyfikacji patogena grzybowego Puccinia striiformis w badanej próbie opiera się według wynalazku na amplifikacji sekwencji DNA przy użyciu zaprojektowanej pary specyficznych gatunkowo oligonukleotydów, a następnie detekcji otrzymanego produktu reakcji PCR, w przypadku kiedy w próbce środowiskowej obecne jest DNA niniejszego mikroorganizmu.
Istotę wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis o następujących sekwencjach:
LidPs11: 5'TTACGACATCTGCTTCCGCA 3' LidPs12: 5'TGCGATGTCAACTCTGGGAC 3'
Istotą sposobu wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis jest zastosowanie w reakcji PCR pary starterów oligonukleotydowych o sekwencjach:
LidPs11 : 5'TTACGACATCTGCTTCCGCA 3'
PL 232 070 B1
LidPs12: 5’TGCGATGTCAACTCTGGGAC 3' w wyniku której dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji otrzymanego produktu amplifikacji poprzez rozdział elektroforetyczny.
Zastosowanie wyżej wymienionej pary starterów do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku umożliwia amplifikację fragmentu DNA o długości 230-270 par zasad. Podstawową zaletą opracowanego systemu identyfikacji jest fakt, że został on zwalidowany na wielokrotnie większej liczbie próbek niż metody wyżej opisane. W szczególności na korzyść niniejszej metody przemawia jej walidacja na próbach środowiskowych o stwierdzonej obecności patogena Puccinia striiformis.
Wynalazek ilustruje przykład wykonania oraz zamieszczone poniżej rysunki, na których:
- Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji PCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów LidPs11 i LidPs12;
- Fig. 2 przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji przeprowadzonej w obecności starterów LidPs11 i LidPs12 dla pojedynczych prób izolowanych z liści porażonych patogenem Puccinia striiformis (1-7); M - marker wielkości GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder.
Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie identyfikacji stanowią fragmenty liści pszenicy zwyczajnej lub fragmenty grzybni/zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. PCR przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana, standardowy master mix do reakcji PCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA, kofaktor enzymu - jony Mg2+, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę specyficznych starterów oligonukleotydowych (0,5-0,8 μM): LidPs11 i LidPs12. Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: wstępna denaturacja - 95°C przez 5 minut, następnie 45 cykli: denaturacja - 95°C przez 30 sekund, annealing - 55°C przez 30 sekund, elongacja - 72°C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowi końcowa elongacja w 72°C przez 8 minut lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanego fragmentu DNA przedstawiona jest na Fig. 1.
Obecność oczekiwanego produktu o długości około 230-270 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnej metody rozdziału i identyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych.
Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego grzyba Puccinia striiformis w badanej próbie według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.
A. Izolacja DNA z fragmentów liści pszenicy zwyczajnej
Izolację DNA przeprowadzono w wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji kolumienkowej, przeznaczonego dla roślin i grzybów (Plant and Fungi DNA Purification Kit - EURx). Fragmenty tkanki zamrażano w ciekłym azocie i homogenizowano mechanicznie poprzez rozcieranie w moździerzu. Otrzymane w ten sposób homogenaty przenoszono do probówek 2 ml typu Eppendorf i dodawano 400 μl buforu ekstrakcyjnego, a następnie 3 μl RNazy i 10 μl proteinazy K. Mieszaniny po dokładnym zworteksowaniu inkubowano w temperaturze 65°C przez 30 minut. W kolejnych etapach dokonano ekstrakcji przy użyciu 130 μl buforu AC oraz precypitacji (350 μl buforu Sol P, 250 μl etanolu 96%). Uzyskany po wirowaniu (1 min, 14 000 x g) supernatant nanoszono dwukrotnie na minikolumny umieszczone w probówkach odbierających, każdorazowo wylewając przesącz po żwirowaniu (1 min, 14 000 x g). Złoże minikolumny płukano dwukrotnie buforem płuczącym (Wash PX, 500 μ^. Minikolumny umieszczono w nowych probówkach 2 ml typu Eppendorf i dokonano elucji DNA ze złoża z zastosowaniem 100 μl ogrzanego do 70°C buforu Elution. Dla określenia stężenia i jakości wyizolowanego DNA przeprowadzono pomiar spektrofotometryczny przy użyciu spektrofotometru NanoDrop2000 (Thermo Scientific).
B. Przygotowanie prób do amplifikacji
DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR. Do każdej probówki o pojemności 0,2 ml dodano po 20 ng DNA. PCR przeprowadzono w objętości 25 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną, standardowy master mix 2 x PCR Master Mix (Thermo Scientific, Litwa), parę specyficznych starterów oligonukleotydowych (0,5-0,8 μM). Próby nałożono na blok termocyklera stosując następujący profil termiczny: wstępna denaturacja - 95°C przez 5 minut, następnie 45 cykli: denaturacja - 95°C przez 30 sekund, annealing - 55°C przez 30 sekund, elongacja - 72°C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowiła końcowa elongacja w 72°C przez 8 minut.
PL 232 070 Β1
C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą elektroforezy agarozowej
Produkty reakcji PCR po zmieszaniu z 3 μΙ buforu obciążającego 6 x Loading Dye (Thermo Scientific) rozdzielano na 2% żelu agarozowym w obecności 0,01 % barwnika do wizualizacji DNA SimplySafe (EURx) w buforze TAE, przy napięciu 120 V, natężeniu 200 mA, w czasie 1 godziny. Otrzymane wzory rozdziałów obserwowano w świetle UV w archiwizatorze żeli.
Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis o sekwencjach:LidPs11: 5’ TTACGACATCTGCTTCCGCA 3’LidPs12: 5’ TGCGATGTCAACTCTGGGAC 3’
- 2. Sposób wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis, w którym w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji powstałego produktu, znamienny tym, że parę starterów stanowią startery oligonukleotydowe wg zastrz. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL419483A PL232070B1 (pl) | 2016-11-17 | 2016-11-17 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL419483A PL232070B1 (pl) | 2016-11-17 | 2016-11-17 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL419483A1 PL419483A1 (pl) | 2018-05-21 |
| PL232070B1 true PL232070B1 (pl) | 2019-05-31 |
Family
ID=62142450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL419483A PL232070B1 (pl) | 2016-11-17 | 2016-11-17 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL232070B1 (pl) |
-
2016
- 2016-11-17 PL PL419483A patent/PL232070B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL419483A1 (pl) | 2018-05-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10465236B2 (en) | Nucleic acid detection method and kit | |
| US20150159207A1 (en) | Use of markers including nucleotide sequence based codes to monitor methods of detection and identification of genetic material | |
| US9102987B2 (en) | Method of detecting paecilomyces variotii | |
| Almasi et al. | Loop mediated isothermal amplification (LAMP) for embryo sex determination in pregnant women at eight weeks of pregnancy | |
| PL238698B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Cyp51 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| PL232070B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywania | |
| PL232090B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywania | |
| PL232094B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia striiformis oraz sposób jego wykrywania | |
| US20160138119A1 (en) | Sex-determination method for date palm | |
| JP5315519B2 (ja) | コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出方法 | |
| PL232091B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia recondita oraz sposób jego wykrywania | |
| PL232093B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia recondita oraz sposób jego wykrywania | |
| PL232092B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Puccinia recondita oraz sposób jego wykrywania | |
| US20100055703A1 (en) | Organism-Specific Hybridizable Nucleic Acid Molecule | |
| PL238696B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Rpb2 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| PL238697B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu SdhB do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| PL230743B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Blumeria graminis oraz sposób jego wykrywania | |
| PL230742B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Blumeria graminis oraz sposób jego wykrywania | |
| PL230741B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Blumeria graminis oraz sposób jego wykrywania | |
| CN102399903A (zh) | 一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒及其引物 | |
| IL143638A (en) | Method for diagnosing the presence of an organism, a development of a disease or an infection and/or of a cell, in a biological sample | |
| KR101603728B1 (ko) | 벼 흰잎마름병 진단용 조성물 | |
| Lee et al. | Development of in-field-diagnosis of Aspergillus flavus by Loop-Mediated Isothermal Amplification in Honeybee | |
| PL239135B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL242988B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania |