PL230741B1 - Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Blumeria graminis oraz sposób jego wykrywania - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy oligonukleotydów, umożliwiających stwierdzanie obecności materiału genetycznego patogenu grzybowego Blumeria graminis w badanym materiale biologicznym z wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy lub jej modyfikacji. Przedmiot zgłoszenia stanowi para specyficznych gatunkowo starterów oligonukleotydowych do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy lub jej modyfikacji, o sekwencjach: LidBgl3: 5'-CGAGGTATCCGCAAYCATCA-3' LidBgl4: 5'-GACGAGAACAGCACGAGGAA-3' komplementarnych do specyficznych gatunkowo fragmentów sekwencji genomu. Przedmiotem zgłoszenia jest też Blumeria graminis sposób wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Blumeria graminis, w którym dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA o długości 160 - 200 par zasad w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów oligonukleotydowych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego Blumeńa graminis z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy, a także sposób wykrywania obecności tego patogena.

Ochrona roślin zbożowych przed patogenami grzybowymi jest szczególnie istotna ze względu na znaczne straty powodowane przez te mikroorganizmy, zarówno pod względem wielkości, jak i jakości pozyskiwanego plonu. Najczęściej w celu ograniczenia populacji grzybów patogennych stosuje się działające nieselektywnie środki ochrony roślin. Z kolei wykorzystywane obecnie metody molekularne, identyfikujące mikroorganizmy jeszcze przed wystąpieniem widocznych objawów chorobowych poprzez wykrycie obecności ich materiału genetycznego, charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Niejednokrotnie, jak stwierdzono w przypadku patogena grzybowego Blumeńa graminis, okazuje się iż po kilkunastu latach stosowania opublikowanej metody identyfikacji, uzyskiwane produkty amplifikacji są tożsame z DNA innych gatunków grzybów (Guo, J.R., Schneider, F., Verreet J.A., 2006. Presymptomatic and quantitative detection of Mycosphaerella graminicola development in wheat using a real-time PCR assay. FEMS Microbiology Letters 262(2): 223-229). Ponadto rzadko po zaprojektowaniu testu dokonuje się oceny przydatności na próbach środowiskowych o pełnym składzie gatunkowym grzybów występujących w danej lokalizacji.

Obecnie znane są dwie metody identyfikacji grzyba Blumeńa graminis, których autorami są Zeng i in. (2008) oraz Chen i in. (2015) (Zeng X.W., Luo Y„ Zhou Y.L., Duan Χ.Υ. 2008. PCR detection of Blumeńa graminis f. sp. tritici based on the sequences of rDNA ITS. Acta Phytopathologica Sinica 38, 211-214); (Chen S., Cao Y.Y., Li T.Y. 2015. Development of a specific SCAR marker to race 21C3CTH of Puccinia graminis f. sp. tritici in China. International Journal of Agricultural and Biological Engineering 17, 1200-1206).

Para oligonukleotydów BF-F1/R opracowana przez Zeng'a i in. (2008) umożliwia amplifikację fragmentu DNA o długości 464 nukleotydów. Chen i in. (2015) wykorzystał tą samą parę oligonukleotydów w reakcji multipleks PCR umożliwiającej wykrycie 3 patogenów jednocześnie.

Sposób identyfikacji patogena grzybowego Blumeńa graminis w badanej próbie opiera się według wynalazku na amplifikacji sekwencji DNA przy użyciu zaprojektowanej pary specyficznych gatunkowo oligonukleotydów, a następnie detekcji otrzymanego produktu reakcji PCR, w przypadku kiedy w próbce środowiskowej obecne jest DNA niniejszego mikroorganizmu.

Istotę wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Blumeńa graminis o następujących sekwencjach:

LidBg13: 5’-CGAGGTATCCGCAAYCATCA-3’

LidBg14: 5'-GACGAGAACAGCACGAGGAA-3'

Istotą sposobu wykrywania patogena grzybowego pszenicy Blumeńa graminis jest zastosowanie w reakcji PCR pary starterów oligonukleotydowych o sekwencjach:

LidBg 13: 5’-CGAGGTATCCGCAAYCATCA-3’

LidBg 14: 5'-GACGAGAACAGCACGAGGAA-3' w wyniku której dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji otrzymanego produktu amplifikacji poprzez rozdział elektroforetyczny.

Zastosowanie wyżej wymienionej pary starterów do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku umożliwia amplifikację fragmentu DNA o długości 160-200 par zasad. Podstawową zaletą opracowanego systemu identyfikacji jest fakt, że został on zwalidowany na wielokrotnie większej liczbie próbek niż metody wyżej opisane. W szczególności na korzyść niniejszej metody przemawia jej walidacja na próbach środowiskowych o stwierdzonej obecności patogena Blumeńa graminis.

Wynalazek jest bliżej pokazany w przykładzie wykonania i na rysunku, na którym:

- Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji PCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów LidBg 13 i LidBg14;

- Fig. 2 przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji przeprowadzonej w obecności starterów LidBg13 i LidBgl4 dla pojedynczych prób izolowanych z liści porażonych patogenem Blumeńa graminis (1-11); M - marker wielkości GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder.

Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie identyfikacji stanowią fragmenty liści pszenicy zwyczajnej lub fragmenty grzybni/zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. PCR przeprowadza się w mieszaninie

PL 230 741 Β1 reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana, standardowy master mix do reakcji PCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA, kofaktor enzymu - jony Mg²⁺, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę specyficznych starterów oligonukleotydowych (0,5-0,8 μΜ): LidBgl3 i LidBg14. Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: wstępna denaturacja 95°C przez 5 minut, następnie 45 cykli: denaturacja - 95°C przez 30 sekund, annealing - 55°C przez 30 sekund, elongacja - 72°C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowi końcowa elongacja w 72°C przez 8 minut lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanego fragmentu DNA przedstawiona jest na Fig. 1.

Obecność oczekiwanego produktu o długości około 160-200 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnej metody rozdziału i identyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych.

Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego grzyba Blumeria graminis w badanej próbie według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.

A. Izolacja DNA z fragmentów liści pszenicy zwyczajnej.

Izolację DNA przeprowadzono w wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji kolumienkowej, przeznaczonego dla roślin i grzybów (Plant and Fungi DNA Purification Kit - ELJRx). Fragmenty tkanki zamrażano w ciekłym azocie i homogenizowano mechanicznie poprzez rozcieranie w moździerzu. Otrzymane w ten sposób homogenaty przenoszono do probówek 2 ml typu Eppendorf i dodawano 400 μΙ buforu ekstrakcyjnego, a następnie 3 μΙ RNazy i 10 μΙ proteinazy K. Mieszaniny po dokładnym zworteksowaniu inkubowano w temperaturze 65°C przez 30 minut. W kolejnych etapach dokonano ekstrakcji przy użyciu 130 μΙ buforu AC oraz precypitacji (350 μΙ buforu Sol P, 250 μΙ etanolu 96%). Uzyskany po wirowaniu (1 min., 14 000 x g) supernatant nanoszono dwukrotnie na minikolumny umieszczone w probówkach odbierających, każdorazowo wylewając przesącz po żwirowaniu (1 min., 14 000 x g). Złoże minikolumny płukano dwukrotnie buforem płuczącym (Wash PX, 500 μΙ). Minikolumny umieszczono w nowych probówkach 2 ml typu Eppendorf i dokonano elucji DNA ze złoża z zastosowaniem 100 μΙ ogrzanego do 70°C buforu Elution. Dla określenia stężenia i jakości wyizolowanego DNA przeprowadzono pomiar spektrofotometryczny przy użyciu spektrofotometru NanoDrop2000 (Thermo Scientific).

B. Przygotowanie prób do amplifikacji.

DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR. Do każdej probówki o pojemności 0,2 ml dodano po 20 ng DNA. PCR przeprowadzono w objętości 25 μΙ mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną, standardowy master mix 2xPCR Master Mix (Thermo Scientific, Litwa), parę specyficznych starterów oligonukleotydowych (0,5-0,8 μΜ). Próby nałożono na blok termocyklera stosując następujący profil termiczny: wstępna denaturacja - 95°C przez 5 minut, następnie 45 cykli: denaturacja - 95°C przez 30 sekund, annealing - 55°C przez 30 sekund, elongacja - 72°C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowiła końcowa elongacja w 72°C przez 8 minut.

C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą elektroforezy agarozowej.

Produkty reakcji PCR po zmieszaniu z 3 μΙ buforu obciążającego 6xLoading Dye (Thermo Scientific) rozdzielano na 2% żelu agarozowym w obecności 0,01% barwnika do wizualizacji DNA SimplySafe (EURx) w buforze TAE, przy napięciu 120 V, natężeniu 200 mA, w czasie 1 godziny. Otrzymane wzory rozdziałów obserwowano w świetle UV w archiwizatorze żeli.

Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogena grzybowego pszenicy Blumeria graminis o sekwencjach:

   LidBgl3: 5’-CGAGGTATCCGCAAYCATCA-3’

   LidBgl4: 5'-GACGAGAACAGCACGAGGAA-3'
2. 2. Sposób wykrywania patogena grzybowego pszenicy Blumeria graminis, w którym w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji powstałego produktu, znamienny tym, że parę starterów stanowią startery oligonukleotydowe jak określono w zastrz. 1.