PL239140B1 - Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania - Google Patents
Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania Download PDFInfo
- Publication number
- PL239140B1 PL239140B1 PL431991A PL43199119A PL239140B1 PL 239140 B1 PL239140 B1 PL 239140B1 PL 431991 A PL431991 A PL 431991A PL 43199119 A PL43199119 A PL 43199119A PL 239140 B1 PL239140 B1 PL 239140B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- colletotrichum
- detection
- oligonucleotide primers
- seconds
- dna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims description 9
- 241001480643 Colletotrichum sp. Species 0.000 title description 4
- 241000222199 Colletotrichum Species 0.000 claims description 15
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 6
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 claims description 4
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 7
- 241001123536 Colletotrichum acutatum Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 3
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 3
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- -1 ACT Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 1
- 101150026868 CHS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000002568 Capsicum frutescens Nutrition 0.000 description 1
- 241001133184 Colletotrichum agaves Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100098899 Epichloe typhina TUBB gene Proteins 0.000 description 1
- 241001284615 Frangula californica Species 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 241000534579 Persoonia Species 0.000 description 1
- 241000031556 Phytophthora sp. Species 0.000 description 1
- 235000004433 Simmondsia californica Nutrition 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101150083762 TUBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 101150048667 tub-2 gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Colletotrichum z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym (qPCR), a także sposób wykrywania obecności tych patogenów.
Grzyby z rodzaju Colletotrichum powodują antraknozę, która należy od chorób atakujących rośliny w czasie wegetacji, ale również powodujących psucie owoców po zbiorze, powodując straty ekonomiczne, związane z obniżeniem plonów i jakości owoców (Braganęa C.A.D., Damm U., Baroncelli R., et al., 2016. Species of the Colletotrichum acutatum complex associated with anthracnose diseases of fruit in Brazil. Fungal Biology 120:547-561). Stosowane metody identyfikacji grzybów z rodzaju Colletotrichum na podstawie cech morfologicznych, stwarzają wiele problemów, ze względu na plastyczność tych grzybów i podobieństwa cech morfologicznych i fenotypu z innymi rodzajami grzybów, co sprawia, że metody te, oprócz tego, że są czasochłonne, to nie są dokładne i obarczone są dużym błędem (Cai L., Hyde K.D., Taylor P.W.J., et al., 2009. A polyphasic approach for studying Colletotrichum. Fungal Divers 39:183-204; Martinez-Culebras P.V., Barrio E., Garcia M.D., Querol A., 2000. Identification of Colletotrichum species responsible for anthracnose of strawberry based on the internal transcribed spacers of the ribosomal region. FEMS Microbiology Letters, 189, 97-101). Dlatego też do diagnostyki grzybów z rodzaju Colletotrichum bardzo często wprowadzane są metody biologii molekularnej oparte o różnorodne markery genetyczne, takie jak: ITS, HIS, GAPDH, CHS-1, TUB2, ACT, CAL, GS (Braganęa C.A.D., Damm U., Baroncelli R, et al., 2016. Species of the Colletotrichum acutatum complex associated with anthracnose diseases of fruit in Brazil. Fungal Biology 120:547-561; Prihastuti H., Cai L., Chen H., et al., 2009. Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand. Fungal Diversity, 39, 89-109). W literaturze opisane są metody umożliwiające identyfikację gatunku C. acutatum z wykorzystaniem specyficznych starterów i sondy molekularnej na podstawie sekwencji ITS1 i β-tubuliny (Debode Van Hemelrjck W., Baeyen S., et al., 2009. Quantitative detection and monitoring of Colletotrichum acutatum in strawberry leaves using real-time PCR. Plant Pathology Journal, 58, 504-514). Z literatury wynika, że sekwencje genów funkcjonalnych takich jak BTUB i GAPDH mogą być przydatne w identyfikacji grzybów z rodzaju Colletotrichum na poziomie gatunku (Diao Y.Z., Zhang C., Liu F., et al, 2017. Colletotrichum species causing anthracnose disease of chili in China. Persoonia - Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi, 38, 20-37; Dela Cueva F.M., Mendoza J.S., Balendres M.A., 2018. A new Colletotrichum species causing anthracnose of chilli in the Philippines andits pathogenicity to chilli cultivar Django. Crop Protection, 112, 264-268). Z kolei Talhinhas i in. (2005) opracowali metodę szybkiego wykrywania grzybów C. acutatum na podstawie genu β-tubuliny (Talhinhas P., Sreenivasaprasad S., Neves-Martins Oliveira H., 2005. Molecular and phenotypic analyses reveala Association of diverse Colletrotrichum acutatum groups and a low level of C. gloeosporioides with olive anthracnose. Applied and Environmental Microbioloy, 71, 2987-2998). Jednakże wymienione dostępne w literaturze metody umożliwiające identyfikację grzybów z rodzaju Colletotrichum oparte są o różne markery lub startery i charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Ponadto, testy detekcji wymienionych grzybów opracowywane są najczęściej dla czystych kultur bez oceny ich przydatności do detekcji na szerokiej gamie próbek środowiskowych, w których występują inne grzyby towarzyszące uprawom roślin w danej lokalizacji lub kontaminowanych różnymi patogenami, albo sprawdzane są na pojedynczych rodzajach próbek środowiskowych.
Sposób identyfikacji patogenów grzybowych Colletotrichum sp. w badanej próbce opiera się według wynalazku na amplifikacji sekwencji DNA przy użyciu zaprojektowanej pary specyficznych oligonukleotydów, a następnie detekcji otrzymanego produktu reakcji PCR lub qPCR, w przypadku kiedy w próbce środowiskowej obecne jest DNA tych mikroorganizmów. Startery zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje genu kodującego dehydrogenazę aldehydu 3-fosfo-glicerynowego (GAPDH).
Istotę wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Colletotrichum o sekwencjach nr 1 i 2, jak przedstawiono na liście sekwencji.
Istotą sposobu wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Colletotrichum jest zastosowanie w reakcji PCR lub qPCR, pary starterów oligonukleotydowych o sekwencjach nr 1 i 2, jak przedstawiono na liście sekwencji, w wyniku której dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się specyficznej detekcji otrzymanego produktu amplifikacji poprzez rozdział elektroforetyczny (dla reakcji PCR) lub odczyt fluorescencji (dla reakcji qPCR).
PL 239 140 B1
Zastosowanie wymienionych starterów oligonukleotydowych do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy, przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku, umożliwia amplifikację produktu o długości 250 par zasad. Podstawową zaletą opracowanego systemu detekcji jest fakt, że został on zwalidowany nie tylko na czystych kulturach grzybów, ale również na próbkach środowiskowych, w szczególności glebie oraz fragmentach roślin, korzeniach i owocach truskawki, w których stwierdzono obecność grzyba patogenicznego z rodzaju Colletotrichum.
Wynalazek ilustruje przykład wykonania oraz zamieszczony poniżej rysunek, na którym:
- Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji PCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencjach nr 1 i 2;
- Fig. 2 przedstawia wyniki analizy specyficzności zaprojektowanych oligonukleotydów w rozdziale elektroforetycznym produktów amplifikacji przeprowadzonej w obecności starterów o sekwencjach nr 1 i 2 dla pojedynczych próbek DNA izolowanych z grzybni patogenów Colletotrichum sp. (ścieżka 2 - widoczny prążek), Botrytis cinerea (ścieżka 3 i 6), Verticillim sp. (ścieżka 4),
- Phytophthora sp. (ścieżka 5), kontrola negatywna (ścieżka 7), Marker wielkości DNA, 100-1000 pz (ścieżka 1).
Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie detekcji stanowi gleba, fragmenty roślin, korzenie, owoce, fragmenty grzybni lub zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. Reakcję PCR przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana wolna od nukleaz, master mix do reakcji PCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA, kofaktor enzymu - jony Mg2+, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę oligonukleotydowych starterów (1 μM) o sekwencjach nr 1 i 2. W reakcji qPCR dodatkowo stosuje się SYBR Green. Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: wstępna denaturacja: 94°C przez 3 minuty, następnie 5 cykli: denaturacja - 94°C przez 15 sekund, przyłączanie starterów - 56°C (touchdown - 1°C) przez 15 sekund, elongacja - 72°C przez 15 sekund, następnie 25 cykli: denaturacja: 94°C przez 15 sekund, przyłączanie starterów - 50°C przez 15 sekund, elongacja - 72°C przez 15 sekund oraz ostatni etap reakcji - końcowa elongacja - 72°C przez 7 minut lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA i detekcji z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanego fragmentu DNA przedstawiona jest na Fig. 1.
Obecność oczekiwanego produktu o długości 250 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnej metody rozdziału i identyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych.
Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego grzyba Colletotrichum sp. w badanej próbce według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.
A. Izolacja DNA z fragmentów roślin, korzeni i owoców truskawki, grzybni oraz gleby
Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji DNA z próbek środowiskowych (FastDNA Spin Kit for Faeces - MP Biomedicals).
250 mg tkanki roślinnej/grzybowej lub 500 mg gleby wprowadzano do probówek o pojemności 2 ml, zawierających matrycę złożoną z kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm, kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm oraz 1 kulki szklanej o średnicy 4 mm. Próbki następnie płukano w buforze fosforanowo-sodowym (825 μl) z odczynnikiem PLS (275 μl). Następnie wirowano (5 minut, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Dodano bufor fosforanowo-sodowy (978 μl) i bufor MT (122 μl), po czym próbki homogenizowano w aparacie FastPrep24 w warunkach: 40 s, 6 m/s. Próbki następnie wirowano (15 minut, 14 000 x g), a supernatant przenoszono do nowych probówek zawierających bufor PPS (250 μl). Próbki mieszano poprzez odwracanie i inkubowano (10 minut w temperaturze 4°C). Mieszaninę wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie supernatant przenoszono do nowej probówki o pojemności 5 ml, zawierającej odczynnik Binding Matrix Solution (1 ml). Próbki następnie mieszano na rotatorze (5 minut), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Osad płukano buforem płuczącym (Wash Buffer #1, 1 ml). Otrzymaną zawiesinę dwukrotnie przenoszono na kolumnę separacyjną (SPIN Filter), wirowano (1 minutę, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr następnie płukano drugim buforem płuczącym (Wash Buffer #2, 500 μl), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr ponownie wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie przenoszono filtr do nowej probówki. Na filtr nanoszono bufor elucyjny (TES, 100 μl) i wirowano (2 minuty, 14 000 x g). Uzyskany przesącz, zawierający wyekstrahowane DNA, rozcieńczano 10-krotnie wodą dejonizowaną wolną od nukleaz.
PL239 140 Β1
Β. Przygotowanie próbek do amplifikacji
DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR. Do probówki o pojemności 0,1 ml dodano 2 μΙ DNA wyizolowanego z czystych szczepów (grzybni lub zarodników) lub 4 μΙ DNA wyizolowanego z próbek środowiskowych. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze 9901 Veriti 96 well Fast Thermal Cycler (AppliedBiosystems) w objętości 10 μΙ mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną wolną od nukleaz, master mix REDTaq mix (X2) (SigmaAldrich), parę oligonukleotydowych starterów (1 μΜ) o sekwencjach nr 1 i 2. Probówki wprowadzono na blok termocyklera stosując następujące profile termiczne dla DNA matrycowego wyizolowanego z czystych szczepów: 94°C przez 3 minuty, następnie 5 cykli: 94°C przez 15 sekund, 56°C (touchdown 1°C) przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 25 cykli: 94°C przez 15 sekund, 50°C przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 72°C przez 7 minut, dla DNA matrycowego wyizolowanego z próbek środowiskowych: 94°C przez 3 minuty, następnie 5 cykli: 94°C przez 15 sekund, 54°C (touchdown - 1°C) przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 35 cykli: 94°C przez 15 sekund, 48°C przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 72°C przez 7 minut.
C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą elektroforezy agarozowej
Produkty reakcji PCR rozdzielano na 2% żelu agarozowym w obecności 0,01% barwnika do wizualizacji DNA SimplySafe (EURx) w buforze TAE, przy napięciu 120 V, w czasie 60 minut. Otrzymane wzory rozdziałów obserwowano w świetle UV w systemie do wizualizacji i archiwizacji żeli.
Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.
LISTA SEKWENCJI
Sekwencja nr 1
Cli GAPDH F: 5' TCATTCCACCTTACCCCTCC '3
Sekwencja nr 2
Cli GAPDH R: 5' GTGGAGTCGTACTTGAGCATG 3
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów grzybowych z rodzaju Colletotrichum o sekwencjach nr 1 i 2, jak przedstawiono na liście sekwencji.
- 2. Sposób wykrywania fitopatogenicznych grzybów z rodzaju Colletotrichum, w którym w reakcji PCR lub qPCR z zastosowaniem pary starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji powstałego produktu, znamienny tym, że parę starterów stanowią startery oligonukleotydowe jak określono w zastrzeżeniu 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431991A PL239140B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431991A PL239140B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431991A1 PL431991A1 (pl) | 2021-05-31 |
| PL239140B1 true PL239140B1 (pl) | 2021-11-08 |
Family
ID=76133093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431991A PL239140B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL239140B1 (pl) |
-
2019
- 2019-11-28 PL PL431991A patent/PL239140B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL431991A1 (pl) | 2021-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106868138A (zh) | 用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物及试剂盒 | |
| Goud et al. | Novel extraction of high quality genomic DNA from frozen bovine blood samples by using detergent method | |
| Foley et al. | Comparative analyses of the quality and yield of genomic DNA from invasive and noninvasive, automated and manual extraction methods | |
| JP2016140289A (ja) | ウナギの種の同定補助方法 | |
| US20170101689A1 (en) | HMG1 Gene and Uses Thereof in Microsporidium Molecular Detection | |
| PL239140B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| SanJuan-Badillo et al. | Assessment of DNA extraction methods from various maize (Zea mays L.) tissues for environmental GMO monitoring in Mexico: Part I: detection by end-point PCR | |
| PL248973B1 (pl) | Para starterów oligonukleotydowych do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum acutatum oraz sposób jego wykrywania | |
| CN106967802A (zh) | 鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对 | |
| JP2005245257A (ja) | フザリウム属菌検出用プライマー | |
| KR101595016B1 (ko) | 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법 | |
| PL239141B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Phytophthora sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| Leão et al. | Morphological and molecular characterization of powdery mildew on watermelon plants in São Paulo state | |
| KR20070048098A (ko) | 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적프라이머 | |
| PL239142B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239139B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis cinerea oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239135B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239138B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania | |
| PL242988B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania | |
| KR101113974B1 (ko) | 유포자 호기성 세포의 판정에 사용되는올리고뉴클레오티드, 이를 이용한 유포자 호기성 세균의판정방법 및 판정 키트 | |
| EP3956455B1 (en) | Method and kit for the identification of vaccinium myrtillus | |
| PL238698B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Cyp51 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| RU2751248C2 (ru) | Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena | |
| CN116334297A (zh) | Lamp扩增引物及其在苹果树褐斑病检测中的应用 | |
| PL239137B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania |