PL239142B1 - Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania - Google Patents
Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania Download PDFInfo
- Publication number
- PL239142B1 PL239142B1 PL431993A PL43199319A PL239142B1 PL 239142 B1 PL239142 B1 PL 239142B1 PL 431993 A PL431993 A PL 431993A PL 43199319 A PL43199319 A PL 43199319A PL 239142 B1 PL239142 B1 PL 239142B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- verticillium
- detection
- oligonucleotide primers
- seconds
- dna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 14
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims description 9
- 241000221841 Verticillium sp. (in: Hypocreales) Species 0.000 title description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 title description 2
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 claims description 6
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 3
- 241001123668 Verticillium dahliae Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001149503 Verticillium tricorpus Species 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 108020004565 5.8S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 1
- 241001480643 Colletotrichum sp. Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000031556 Phytophthora sp. Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 241001447693 Verticillium longisporum Species 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Verticillium z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym (qPCR), a także sposób wykrywania obecności tych patogenów.
Grzyby z rodzaju Verticillium są ważnymi rolniczo organizmami fitopatogenicznymi, które powodują więdnięcie roślin, przyczyniając się do strat ekonomicznych wielu upraw, w tym truskawek, w Europie i na świecie. Grzyby te wytwarzają struktury spoczynkowe (mikroskleroty), które mogą przetrwać w glebie nawet kilkanaście lat, powodując infekcję roślin w momencie pojawienia się gospodarza i sprzyjających warunków do rozwoju choroby. W efekcie grzyby te są istotnym czynnikiem wpływającym na obniżenie jakości i straty plonów (Klosterman S.J., Atallah Z.K., Vallad G.E., Subbarao K.V., 2009. Diversity, pathogenicity, and management of Verticillium species. Annual Review Phytopathology, 47, 39-62).
W literaturze można znaleźć wiele metod detekcji grzybów z rodzaju Verticillium, jednakże pomimo ogromnych wysiłków nie istnieje niezawodna metoda pozwalająca na wykrycie tego patogenu w próbkach środowiskowych i istnieje konieczność opracowywania nowych metod zwalidowanych na wielu rodzajach próbek środowiskowych, dostosowanych do próbek danego regionu czy typu gleby (Aslam S., TahirA., Aslam M.F., Alam M.W., Shedayi A.A., Sadia S., 2017. Recent advances in molecular techniques for the identification of phytopathogenic fungi - a mini review. Journal of Plant Interactions, 12, 1, 493-504). Wśród metod molekularnych opracowanych do diagnostyki grzybów z rodzaju Verticillium należą te oparte o konwencjonalną łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) (Inderbitzin P., Davis PM., Bostock R.M., Subbarao K.V., 2013. Identification and Differentiation of Verticillium Species and V. longisporum Lineages by Simplex and Multiplex PCR Assays. PLoS ONE 8, 6, e65990. doi:. 10.1371 journal.pone.0065990), ilościową łańcuchową reakcję polimerazy (qPCR) (Maurer K.A., Radisek S., Berg G., Seefelder S., 2013. Real-time PCR assay to detect Verticillium albo-atrum and V dahliae in hops: development and comparison with a standard PCR method. Journal of Plant Diseases and Protection, 120, 3, 105-114), oraz metody izotermicznej amplifikacji wykorzystującej zapętlenie (LAMP) (Aslani S., Garoosi G., Jafary H., 2017. Using a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay and Direct DNA Extraction Method from Wood for Rapid Detection of Verticillium dahliae in Olive Trees. Biosciences Biotechnology Research Asia, 14, 2, DOI: http://dx.doi.org/10.13005/bbra/2501). W przypadku identyfikacji Verticillum sp. wykorzystywana jest sekwencja rRNA 5.8S, dlatego Moukhamedov i in. (1994) zaprojektowali specyficzne gatunkowo (V. tricorpus) startery w obrębie sekwencji ITS (Moukhamedov P, Hu X., Nazar PN, Robb 1994. Use of Polymerase Chain Reaction-amplified ribosomal intergenic sequences for the diagnosis of Verticillium tricorpus. Phytopathology, 84, 256-259). Z kolei Atallah i in. (2007) jako pierwsi wykorzystali gen funkcjonalny - β-tubulinę do zaprojektowania specyficznych gatunkowo starterów i sondy molekularnej do detekcji V. dahliae (Atallah Z.K., Bae J., Jansky S.H., et al., 2007. Multiplex Real-time quantitative PCR to detect and quantify Verticillium dahliae colonization in potato lines that differ in response to Verticillium wilt. Phytopathology, 97, 865-872). Jednakże wymienione dostępne w literaturze metody umożliwiające identyfikację grzybów z rodzaju Verticillium oparte są o inne markery lub startery i charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Ponadto, testy detekcji wymienionych grzybów opracowywane są najczęściej dla czystych kultur bez oceny ich przydatności do detekcji na próbkach środowiskowych, w których występują inne grzyby towarzyszące uprawom roślin w danej lokalizacji lub kontaminowanych różnymi patogenami, albo sprawdzane są na pojedynczych specyficznych matrycach środowiskowych.
Sposób identyfikacji patogenów grzybowych Verticillium sp. w badanej próbce opiera się według wynalazku na amplifikacji sekwencji DNA przy użyciu zaprojektowanej pary specyficznych oligonukleotydów, a następnie detekcji otrzymanego produktu reakcji PCR lub qPCR, w przypadku kiedy w próbce środowiskowej obecne jest DNA tych mikroorganizmów. Startery zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje genu kodującego aktynę (ACT).
Istotę wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Verticillium o sekwencjach nr 1 i 2, jak przedstawiono na liście sekwencji.
Istotą sposobu wykrywania patogenów grzybowych należących do rodzaju Verticillium jest zastosowanie w reakcji PCR lub qPCR, pary starterów oligonukleotydowych o sekwencjach nr 1 i 2,jak przedstawiono na liście sekwencji, w wyniku której dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu D NA, po
PL 239 142 B1 czym dokonuje się specyficznej detekcji otrzymanego produktu amplifikacji poprzez rozdział elektrofor etyczny (dla reakcji PCR) lub odczyt fluorescencji (dla reakcji qPCR).
Zastosowanie wymienionych starterów oligonukleotydowych do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy, przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku, umożliwia amplifikację produktu o długości 236 par zasad. Podstawową zaletą opracowanego systemu detekcji jest fakt, że został on zwalidowany nie tylko na czystych kulturach grzybów, ale również na próbkach środowiskowych, w szczególności glebie oraz fragmentach roślin, korzeniach i owocach truskawki, w których stwierdzono obecność grzyba patogenicznego z rodzaju Verticillium.
Wynalazek ilustruje przykład wykonania oraz zamieszczony poniżej rysunek, na którym:
• Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji PCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencjach nr 1 i 2;
• Fig. 2 przedstawia wyniki analizy specyficzności zaprojektowanych oligonukleotydów w rozdziale elektroforetycznym produktów amplifikacji przeprowadzonej w obecności starterów o sekwencjach nr 1 i 2 dla pojedynczych próbek DNA izolowanych z grzybni patogenów Verticillium sp. (ścieżka 4 - widoczny prążek), Botrytis cinerea (ścieżka 3 i 6), Phytophthora sp. (ścieżka 5), Colletotrichum sp. (ścieżka 2), kontrola negatywna (ścieżka 7), Marker wielkości DNA, 100-1000 pz (ścieżka 1 i 8).
Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie detekcji stanowi gleba, fragmenty roślin, korzenie, owoce, fragmenty grzybni lub zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. Reakcję PCR przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana wolna od nukleaz, master mix do reakcji PCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA, kofaktor enzymu - jony Mg2+, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę oligonukleotydowych starterów (1 μM) o sekwencjach nr 1 i 2. W reakcji qPCR dodatkowo stosuje się SYBR Green. Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: wstępna denaturacja: 94°C przez 3 minuty, następnie 5 cykli: denat uracja - 94°C przez 15 sekund, przyłączanie starterów - 65°C (touchdown - 1°C) przez 15 sekund, elongacja - 72°C przez 15 sekund, następnie 25 cykli: denaturacja - 94°C przez 15 sekund, przyłączanie starterów - 60°C przez 15 sekund, elongacja - 72°C przez 15 sekund, oraz ostatni etap reakcji końcowa elongacja - 72°C przez 7 minut lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA i detekcji z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanego fragmentu DNA przedstawiona jest na Fig. 1.
Obecność oczekiwanego produktu o długości 236 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnej metody rozdziału i identyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych.
Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego grzyba Verticillium sp. w badanej próbce według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.
A. Izolacja DNA z fragmentów roślin, korzeni i owoców truskawki, grzybni oraz gleby
Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji DNA z próbek środowiskowych (FastDNA Spin Kit for Faeces - MP Biomedicals). 250 mg tkanki roślinnej/grzybowej lub 500 mg gleby wprowadzano do probówek o pojemności 2 ml, zawierających matrycę złożoną z kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm, kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm oraz 1 kulki szklanej o średnicy 4 mm. Próbki następnie płukano w buforze fosforanowo-sodowym (825 μl) z odczynnikiem PLS (275 μl). Następnie wirowano (5 minut, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Dodano bufor fosforanowo-sodowy (978 μl) i bufor MT (122 μl), po czym próbki homogenizowano w aparacie FastPrep24 w warunkach: 40 s, 6 m/s. Próbki następnie wirowano (15 minut, 14 000 x g), a supernatant przenoszono do nowych probówek zawierających bufor PPS (250 μl). Próbki mieszano poprzez odwracanie i inkubowano (10 minut w temperaturze 4°C). Mieszaninę wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie supernatant przenoszono do nowej probówki o pojemności 5 ml, zawierającej odczynnik Binding Matrix Solution (1 ml). Próbki następnie mieszano na rotatorze (5 minut), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Osad płukano buforem płuczącym (Wash Buffer #1, 1 ml). Otrzymaną zawiesinę dwukrotnie przenoszono na kolumnę separacyjną (SPIN Filter), wirowano (1 minutę, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr następnie płukano drugim buforem płuczącym (Wash Buffer #2, 500 μl), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr ponownie wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie przenoszono filtr do nowej probówki. Na filtr nanoszono bufor elucyjny (TES, 100 μl) i wirowano (2 minuty, 14 000 x g). Uzyskany przesącz, zawierający wyekstrahowane DNA, rozcieńczano 10-krotnie wodą dejonizowaną wolną od nukleaz.
PL239 142 Β1
Β. Przygotowanie próbek do amplifikacji
DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR. Do probówki o pojemności 0,1 ml dodano 2 μΙ DNA wyizolowanego z czystych szczepów (grzybni lub zarodników) lub 4 μΙ DNA wyizolowanego z próbek środowiskowych. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze 9901 Veriti 96 well Fast Thermal Cycler (AppliedBiosystems) w objętości 10 μΙ mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną wolną od nukleaz, master mix REDTaq mix (X2) (Sigma-Aldrich), parę oligonukleotydowych starterów (1 μΜ) o sekwencjach nr 1 i 2. Probówki wprowadzono na blok termocyklera stosując następujące profile termiczne dla DNA matrycowego wyizolowanego z czystych szczepów: 94°C przez 3 minuty, następnie 5 cykli: 94°C przez 15 sekund, 65°C (touchdown - 1°C) przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 25 cykli: 94°C przez 15 sekund, 60°C przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, oraz 72°C przez 7 minut, dla DNA matrycowego wyizolowanego z próbek środowiskowych: 94°C przez 15 sekund, 51 °C (touchdown - 1 °C) przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 40 cykli: 94°C przez 15 sekund, 46°C przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, oraz 72°C przez 7 minut.
C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą elektroforezy agarozowej
Produkty reakcji PCR rozdzielano na 2% żelu agarozowym w obecności 0,01% barwnika do wizualizacji DNA SimplySafe (EURx) w buforze TAE, przy napięciu 120 V, w czasie 60 minut. Otrzymane wzory rozdziałów obserwowano w świetle UV w systemie do wizualizacji i archiwizacji żeli.
Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.
LISTA SEKWENCJI
Sekwencja nr 1
Vrt ACT F: 5' TAYAGAAGAAGTYGCYGCCCTC '3
Sekwencja nr 2
Vrt ACT R: 5' CCTTGCACATACCCGAACTAC '3
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów grzybowych z rodzaju Verticillium o sekwencjach nr 1 i 2, jak przedstawiono na liście sekwencji.
- 2. Sposób wykrywania fitopatogenicznych grzybów z rodzaju Verticillium, w którym w reakcji PCR lub qPCR z zastosowaniem pary starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji powstałego produktu, znamienny tym, że parę starterów stanowią startery oligonukleotydowe jak określono w zastrzeżeniu 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431993A PL239142B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL431993A PL239142B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL431993A1 PL431993A1 (pl) | 2021-05-31 |
| PL239142B1 true PL239142B1 (pl) | 2021-11-08 |
Family
ID=76133111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL431993A PL239142B1 (pl) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL239142B1 (pl) |
-
2019
- 2019-11-28 PL PL431993A patent/PL239142B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL431993A1 (pl) | 2021-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Böhm et al. | Real‐time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants | |
| IE81145B1 (en) | Generation of specific probes for target nucleotide sequences | |
| CN101608236A (zh) | 梨火疫病菌和亚洲梨火疫病菌的padlock探针及多重检测方法 | |
| KR102212379B1 (ko) | 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 | |
| PL239142B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| KR20190026403A (ko) | 돼지 유행성 설사 바이러스의 유전자형 분석용 프라이머 및 이의 용도 | |
| KR102679936B1 (ko) | 에르위니아 아밀로보라와 에르위니아 피리폴리에 동시 검출용 프라이머 세트 | |
| KR100744699B1 (ko) | 인삼점무늬병균 알타나리아 파낙스 동정 및 검출용 특이적프라이머 | |
| JP2005245257A (ja) | フザリウム属菌検出用プライマー | |
| PL239137B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Verticillium sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239141B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Phytophthora sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239139B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis cinerea oraz sposób jego wykrywania | |
| PL248973B1 (pl) | Para starterów oligonukleotydowych do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum acutatum oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239140B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL239135B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sonda molekularna do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Botrytis sp. oraz sposób jego wykrywania | |
| PL242988B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora SPP. oraz sposób ich wykrywania | |
| PL239138B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe oraz sondy molekularne do jednoczesnego wykrywania fitopatogenicznych grzybów Botrytis sp., Colletotrichum sp., Verticillium sp. oraz sposób ich wykrywania | |
| CN105039560A (zh) | 一种荔枝炭疽菌lamp引物及其快速检测方法和应用 | |
| CN105039331A (zh) | 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法和应用 | |
| EP3956455B1 (en) | Method and kit for the identification of vaccinium myrtillus | |
| PL238698B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu Cyp51 do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymoseptoria tritici powodującego septoriozę paskowaną liści oraz sposób jego wykrywania | |
| KR101457275B1 (ko) | 사탕무황화바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 | |
| CN113789401B (zh) | 环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法 | |
| PL242987B1 (pl) | Startery oligonukleotydowe do wykrywania fitopatogenicznych mikroorganizmów Phytophthora cactorum oraz sposób ich wykrywania | |
| KR20160120594A (ko) | 스테노트로포모나스 애시다미니필라 동정 방법 |