PL248973B1 - Para starterów oligonukleotydowych do wykrywania fitopatogenicznego grzyba Colletotrichum acutatum oraz sposób jego wykrywania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest para starterów oligonukleotydowych do wykrywania patogenów grzybowych należących do gatunku Colletotrichum acutatum z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub reakcji łańcuchowej polimerazy z detekcją w czasie rzeczywistym (qPCR), a także sposób wykrywania obecności tych patogenów.

Grzyby należące do gatunku Colletotrichum acutatum powodują antraknozę, należącą do chorób atakujących rośliny w czasie wegetacji, ale również powodujących psucie owoców po zbiorze, co sprawia, że producenci owoców narażeni są na straty ekonomiczne, związane z obniżeniem plonów i jakości owoców (Malarczyk D., Panek J., Frąc M., 2019. Alternative Molecular-Based Diagnostic Methods of Plant Pathogenic Fungi Affecting Berry Crops - A Review. Molecules 2019, 24, 1200; doi:10.3390/molecules24071200; Braganęa C.A.D., Damm U., Baroncelli R, et al., 2016. Species of the Colletotrichum acutatum complex associated with anthracnose diseases of fruit in Brazil. Fungal Biology 120:547-561). Stosowane metody identyfikacji grzybów należących do gatunku Colletotrichum acutatum opierają się głównie na analizie cech morfologicznych, stwarzając wiele problemów, ze względu na plastyczność tych grzybów i podobieństwo ich cech morfologicznych i fenotypu z innymi gatunkami i rodzajami grzybów, co sprawia, że metody te, oprócz tego, że są czasochłonne, to nie są dokładne i obarczone są dużym błędem (Cai L., Hyde K.D., Taylor P.W.J., et al., 2009. A polyphasic approach for studying Colletotrichum. Fungal Divers 39:183-204; Martinez-Culebras P.V., Barrio E., Garcia M.D., Querol A., 2000. Identification of Colletotrichum species responsible for anthracnose of strawberry based on the internal transcribed spacers of the ribosomal region. FEMS Microbiology Letters, 189, 97-101). Dlatego też do diagnostyki grzybów z rodzaju Colletotrichum bardzo często wprowadzane są metody biologii molekularnej oparte o różnorodne markery genetyczne, takie jak: ITS, HIS, GAPDH, CHS-1, TUB2, ACT, CAL, Gs (Braganęa C.A.D., Damm U., Baroncelli R., et al., 2016. Species of the Colletotrichum acutatum complex associated with anthracnose diseases of fruit in Brazil. Fungal Biology 120:547-561; Prihastuti H., Cai L., Chen H., et al, 2009. Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand. Fungal Diversity, 39, 89-109). W literaturze opisane są metody umożliwiające identyfikację gatunku C. acutatum z wykorzystaniem specyficznych starterów i sondy molekularnej na podstawie sekwencji ITS1 i β-tubuliny (Debode Van Hemelrjck W., Baeyen S., et al., 2009. Quantitative detection and monitoring of Colletotrichum acutatum in strawberry leaves using realtime PCR. Plant Pathology Journal, 58, 504-514). Z literatury wynika, że sekwencje genów funkcjonalnych takich jak BTUB i GAPDH mogą być przydatne w identyfikacji grzybów z rodzaju Colletotrichum na poziomie gatunku (Diao Y.Z., Zhang C., Liu F., et al., 2017. Colletotrichum species causing anthracnose disease of chili in China. Persoonia - Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi, 38, 20-37; Dela Cueva F.M., Mendoza J.S., Balendres M.A., 2018. A new Colletotrichum species causing anthracnose of chilli in the Philippines and its pathogenicity to chilli cultivar Django. Crop Protection, 112, 264-268). Z kolei Talhinhas i in. (2005) opracowali metodę szybkiego wykrywania grzybów C. acutatum na podstawie genu β-tubuliny (Talhinhas P., Sreenivasaprasad S., Neves-Martins Oliveira H., 2005. Molecular andphenotypic analyses reveala Association of diverse Colletrotrichum acutatum groups and a low level of C. gloeosporioides with olive anthracnose. Applied and Environmental Microbioloy, 71, 2987-2998). Jednakże wymienione dostępne w literaturze metody umożliwiające identyfikację grzybów z gatunku Colletotrichum acutatum oparte są o różne markery lub startery i charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Ponadto, testy detekcji wymienionych grzybów opracowywane są najczęściej dla czystych kultur bez oceny ich przydatności do detekcji na szerokiej gamie próbek środowiskowych, w których występują inne grzyby towarzyszące uprawom roślin w danej lokalizacji lub kontaminowanych różnymi patogenami, albo sprawdzane są na pojedynczych rodzajach próbek środowiskowych.

Celem wynalazku jest zatem opracowanie starterów oligonukleotydowych do wykrywania patogenów grzybowych należących do gatunku Colletotrichum acutatum, jak również opracowanie sposobu ich wykrywania, który eliminowałby ww. problemy, tj. charakteryzowałby się stałą czułością i przydatnością do stosowania na szerokiej gamie próbek środowiskowych, w których występują również inne grzyby towarzyszące lub uprawy kontaminowane są różnymi innymi patogenami. Cel ten realizuje niniejszy wynalazek.

Istotę wynalazku stanowi para starterów oligonukleotydowych do wykrywania patogenów grzybowych należących do gatunku Colletotrichum acutatum o sekwencjach nr 1 i 2, jak przedstawiono na liście sekwencji.

Istotą sposobu wykrywania fitopatogenicznych grzybów z gatunku Colletotrichum acutatum, w którym w reakcji PCR lub qPCR z zastosowaniem pary starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji powstałego produktu, jest to, że parę starterów stanowią startery oligonukleotydowe o sekwencjach nr 1 i 2, jak przedstawiono na liście sekwencji.

Sposób identyfikacji patogenów grzybowych Colletotrichum acutatum w badanej próbce opiera się według wynalazku na amplifikacji sekwencji DNA przy użyciu zaprojektowanej pary specyficzn ych oligonukleotydów, a następnie detekcji otrzymanego produktu reakcji PCR lub qPCR poprzez rozdział elektroforetyczny (dla reakcji PCR) lub odczyt fluorescencji (dla reakcji qPCR), w przypadku kiedy w próbce środowiskowej obecne jest DNA tych mikroorganizmów. Startery zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje genu kodującego dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH).

Zastosowanie wymienionych starterów oligonukleotydowych do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy, przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku, umożliwia amplifikację produktu o długości 149 par zasad. Podstawową zaletą opracowanego systemu detekcji jest fakt, że został on zwalidowany nie tylko na czystych kulturach grzybów, ale również na próbkach środowiskowych, w szczególności glebie oraz fragmentach roślin, korzeniach i owocach truskawki, w których stwierdzono obecność grzyba patogenicznego z należącego do gatunku Colletotrichum acutatum.

Wynalazek ilustruje przykład wykonania oraz zamieszczony poniżej rysunek, na którym:

- Fig. 1 przedstawia sekwencję nr 3 - sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji PCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencjach nr 1 i 2;

- Fig. 2 przedstawia wyniki analizy specyficzności zaprojektowanych oligonukleotydów w rozdziale elektroforetycznym produktów amplifikacji przeprowadzonej w obecności starterów o sekwencjach nr 1 i 2 dla pojedynczych izolatów grzybów Colletotrichum acutatum (ścieżka 2-11, 15, 17-18, 20 - widoczny prążek), Colletotrichum sp. (ścieżka 12-14, 16, 19, 21-24 brak widocznego prążka), kontrola negatywna (ścieżka 25 - brak widocznego prążka), Marker wielkości DNA, 100-10000 pz (ścieżka 1 i 26).

Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie detekcji stanowi gleba, fragmenty roślin, korzenie, owoce, fragmenty grzybni lub zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. Reakcję PCR przeprowadza się w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana wolna od nukleaz, master mix do reakcji PCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA, kofaktor enzymu - jony Mg²⁺, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę oligonukleotydowych starterów (1 μM) o sekwencjach nr 1 i 2. W reakcji qPCR dodatkowo stosuje się SYBR Green. Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego: wstępna denaturacja: 94°C przez 3 minuty, następnie 5 cykli: denaturacja - 94°C przez 15 sekund, przyłączanie starterów - 63,5°C (touchdown -1 °C) przez 15 sekund, elongacja - 72°C przez 15 sekund, następnie 40 cykli: denaturacja: 94°C przez 15 sekund, przyłączanie starterów 58,5°C przez 15 sekund, elongacja - 72°C przez 15 sekund oraz ostatni etap reakcji - końcowa elongacja - 72°C przez 7 minut lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA i detekcji z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanego fragmentu DNA przedstawiona jest na Fig. 1 i stanowi sekwencję nr 3 na liście sekwencji.

Obecność oczekiwanego produktu o długości 122 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnej metody rozdziału i identyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych.

Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego grzyba Colletotrichum acutatum w badanej próbce według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.

A. Izolacja DNA z fragmentów roślin, korzeni i owoców truskawki, grzybni oraz gleby

Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji DNA z próbek środowiskowych (FastDNA Spin Kit for Faeces - MP Biomedicals).

250 mg tkanki roślinnej/grzybowej lub 500 mg gleby wprowadzano do probówek o pojemności 2 ml, zawierających matrycę złożoną z kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm, kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm oraz 1 kulki szklanej o średnicy 4 mm. Próbki następnie płukano w buforze fosforanowo-sodowym (825 μl) z odczynnikiem PLS (275 μl). Następnie wirowano (5 minut, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Dodano bufor fosforanowo-sodowy (978 μl) i bufor MT (122 μl), po czym próbki homogenizowano w aparacie FastPrep24 w warunkach: 40 s, 6 m/s. Próbki następnie wirowano (15 minut, 14 000 x g), a supernatant przenoszono do nowych probówek zawierających bufor PPS (250 μl). Próbki mieszano poprzez odwracanie i inkubowano (10 minut w temperaturze 4°C). Mieszaninę wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie supernatant przenoszono do nowej probówki o pojemności 5 ml, zawierającej odczynnik Binding Matrix Solution (1 ml). Próbki następnie mieszano na rotatorze (5 minut), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i zlewano supernatant. Osad płukano buforem płuczącym (Wash Buffer #1, 1 ml). Otrzymaną zawiesinę dwukrotnie przenoszono na kolumnę separacyjną (SPIN Filter), wirowano (1 minutę, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr następnie płukano drugim buforem płuczącym (Wash Buffer #2, 500 μl), wirowano (2 minuty, 14 000 x g) i wylewano przesącz. Filtr ponownie wirowano (2 minuty, 14 000 x g), a następnie przenoszono filtr do nowej probówki. Na filtr nanoszono bufor elucyjny (TES, 100 μl) i wirowano (2 minuty, 14 000 x g). Uzyskany przesącz, zawierający wyekstrahowane DNA, rozcieńczano 10-krotnie wodą dejonizowaną wolną od nukleaz.

B. Przygotowanie próbek do amplifikacji

DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR. Do probówki o pojemności 0,1 ml dodano 2 μl DNA wyizolowanego z czystych szczepów (grzybni lub zarodników) lub 4 μl DNA wyizolowanego z próbek środowiskowych. Reakcje przeprowadzono w termocyklerze 9901 Veriti 96 well Fast Thermal Cycler (AppliedBiosystems) w objętości 10 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną wolną od nukleaz, master mix REDTaq mix (X2) (Sigma -Aldrich), parę oligonukleotydowych starterów (1 μM) o sekwencjach nr 1 i 2. Probówki wprowadzono na blok termocyklera stosując następujące profile termiczne dla DNA matrycowego wyizolowanego z czystych szczepów: 94°C przez 3 minuty, następnie 5 cykli: 94°C przez 15 sekund, 63,5°C (touchdown -1°C) przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 40 cykli: 94°C przez 15 sekund, 58,5°C przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 72°C przez 7 minut, dla DNA matrycowego wyizolowanego z próbek środowiskowych: 94°C przez 3 minuty, następnie 5 cykli: 94°C przez 15 sekund, 63,5°C (touchdown -1°C) przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 45 cykli: 94°C przez 15 sekund, 58,5°C przez 15 sekund, 72°C przez 15 sekund, następnie 72°C przez 7 minut.

C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą elektroforezy agarozowej

Produkty reakcji PCR rozdzielano na 2% żelu agarozowym w obecności 0,01% barwnika do wizualizacji DNA SimplySafe (EURx) w buforze TAE, przy napięciu 120 V, w czasie 60 minut. Otrzymane wzory rozdziałów obserwowano w świetle UV w systemie do wizualizacji i archiwizacji żeli.

Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.

PL 248973 BI

LISTA SEKWENCJI <110> INSTYTUT AGROFIZYKI IM. BOHDANA DOBRZAŃSKIEGO POLSKIE] AKADEMII NAUK <120> PARA STARTERÓW OLIGONUKLEOTYDOWYCH DO WYKRYWANIA FITOPATOGENICZNEGO GRZYBA COLLETOTRICHUM ACUTATUM ORAZ SPOSÓB JEGO WYKRYWANIA <130> MT-76ia/2023 <160> 3 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Colletotrichum acutatum <400> 1 acgataacac cagcttcgtc gat 23 <210> 2 <211> 22 < 212> DNA < 213> Colletotrichum acutatum < 400> 2 tctgcatgay tgkgtcacgt cg 22

<210> 3	acutatum
<211> 122
<212> DNA
<213> Colletotrichum
<400> 3 tacgataaca ccagcttcgt	cgatatcgac gggaaaagag tcggagacta gcactctcaa 60
ctcttttgcc ccaaggtttc	gattgggctt gttgtaacga cacgacgtga cccaatcatg 120
ca	122

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenów grzybowych z gatunku Colletotrichum acutatum o sekwencjach nr 1 i 2, jak przedstawiono na liście sekwencji.
2. 2. Sposób wykrywania fitopatogenicznych grzybów z gatunku Colletotrichum acutatum, w którym w reakcji PCR lub qPCR z zastosowaniem pary starterów dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji powstałego produktu, znamienny tym, że parę starterów stanowią startery oligonukleotydowe określone w zastrzeżeniu 1.