PL227314B1

PL227314B1 - 1-Weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina oraz sposób jej otrzymywania

Info

Publication number: PL227314B1
Application number: PL415745A
Authority: PL
Inventors: Marta Czarnecka; Anna Gliszczyńska; Anna Gliszczynska; Marta Świtalska; Marta Switalska; Joanna Wietrzyk
Original assignee: Univ Przyrodniczy We Wrocławiu
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2017-11-30
Also published as: PL415745A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 1-weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina, o wzorze 1, przedstawionym na rysunku oraz sposób jej otrzymywania.

Związek ten posiada aktywność antyproliferacyjną względem komórek nowotworowych białaczki linii MV4-11.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym oraz jako środek w terapii chorób nowotworowych.

Kwas weratrowy (kwas 3,4-dimetoksybenzoesowy) należy do grupy polifenoli. Jest to związek naturalny, występujący między innymi w pełniku chińskim (Trollius chinensis) (Wang i in., Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 2014, 27, s. 285) i grzybach z gatunku Sparassis crispa (Ferreira i in., Current Medicinal Chemistry, 2009, 16, s. 1543).

Jedną z głównych właściwości kwasu weratrowego jest jego aktywność przeciwutleniająca (Szwajgier i in., Acta Scientiarum Polonorum, Technologia Alimentaria, 2005, 4, s. 129). Ponadto udowodniono, że związek ten jest skuteczny w ochronie przeciwsłonecznej. W badaniach in vitro na linii komórkowej keratynocytów człowieka (HaCat), kwas weratrowy chroni DNA komórek naskórka przed szkodliwym działaniem promieniowania ultrafioletowego (UVB) poprzez hamowanie tworzenia się cyklobutylowych dimerów pirymidynowych (CPDs), które prowadzą do powstawania wysoce specyficznych mutacji (Shin i in., Molecules, 2013, 18, s. 5405). Warto również zwrócić uwagę na wyniki pracy Raja i in., którzy w swoich badaniach na szczurach, u których została zaindukowana miażdżyca, udowodnili wpływ omawianego kwasu na redukcję hiperlipidemii poprzez zapobieganie przez kwas weratrowy nadmiernej peroksydacji lipidów w organizmie (Raja i in., Molecular and cellular biochemistry, 2012, 366, s. 21). Kwas ten ma również działanie przeciwbakteryjne (Malarczyk i in., Cell Biology International, 2000, 8, s. 515). Malarczyk i in. udowodnili bójcze właściwości tego związku względem komórek bakterii Rhodococcus erythropolis. W badaniach na szczurach przeprowadzonych przez Saravanakumar i in. wykazano, że kwas weratrowy hamuje również nadprodukcję tlenku azotu (NO) w komórkach śródbłonka, który w zwiększonym stężeniu prowadzi do powstawania stanów zapalnych lub oddziałuje negatywnie na mięśnie gładkie, prowadząc do wzrostu ciśnienia krwi w organizmie (Saravanakumar i in., European Journal of Pharmacology, 2011,671, s. 87).

Celem wynalazku było opracowanie metody otrzymywania nowej lizofosfatydylocholiny zawierającej cząsteczkę kwasu weratrowego w pozycji sn-1 fosfatydylocholiny, która pełni w tym wypadku rolę nośnika aktywnego biologicznie kwasu polifenolowego ułatwiając jego wnikanie do komórek żywych.

Nie jest znana lizofosfatydylocholina zawierająca kwas weratrowy w pozycji sn-1. Dotychczas w opisie zgłoszenia patentowego P. 414526 ujawniono 1,2-diweratroilo-sn-glicero-3-fosfocholinę oraz w opisie zgłoszenia patentowego P. 414880 1-palmitoilo-2-weratroilo-sn-glicero-3-fosfocholinę.

Istotą wynalazku jest 1-weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina przedstawiona na rysunku oraz sposób jej otrzymywania.

Istotą sposobu otrzymywania lizofosfatydylocholiny z cząsteczką kwasu weratrowego, jakim jest 1-weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina, jest to, że mieszaninę sn-glicero-3-fosfocholiny (GPC) i tlenku dibutylocyny (DBTO) rozpuszczonych w bezwodnym 2-propanolu poddaje się reakcji z chlorkiem kwasu 3,4-dimetoksybenzoesowego, również rozpuszczonym w propan-2-olu, w obecności trietyloaminy (TEA). Całość miesza się przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika, a następnie wydziela powstały produkt i oczyszcza go za pomocą chromatografii kolumnowej.

1-Weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina, o wzorze 1, posiada aktywność antyproliferacyjną względem komórek nowotworowych białaczki linii MV4-11 (IC50= 9.52 μg/ml). Testy aktywności biologicznej związku, o wzorze 1, przeprowadzono według metody SRB opisanej przez Świtalska M. i wsp.; Nutrition and Cancer, 2013, vol. 65(6), s. 874-884.

Sposób, według wynalazku, objaśniony jest bliżej na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d 1

Do kolby okrągłodennej zawierającej 8 cm³ 2-propanol dodaje się 257 mg (1 mmol) osuszonej sn-glicero-3-fosfocholiny (GPC) oraz 249 mg (1 mmol) tlenku dibutylocyny (DBTO) i całość ogrzewa się w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 1 godzinę. Po tym czasie mieszaninę reakcyjną ochładza się i dodaje trietyloaminę (TEA) (243 mg, 335 μΐ, 2,4 mmol) oraz 481 mg (2,4 mmol) chlorku kwasu 3,4-dimetoksybenzoesowego rozpuszczonego w 4 cm³ bezwodnego 2-propanolu. Zawiesinę miesza się intensywnie w temperaturze pokojowej w atmosferze N2 przez 1 godzinę. Po tym czasie mieszaninę poreakcyjną odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejku Shotta przez warstwę

PL 227 314 B1 celitu, a następnie odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując jako eluent mieszaninę rozpuszczalników CHCI3:MeOH:H2O, 65:25:4 (v/v/v). Otrzymuje się 290 mg (0.69 mmol) 1-weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholiny z wydajnością 66% w postaci mazistej substancji.

Współczynnik podziału (Rf) w cienkowarstwowej chromatografii cieczowej wyniósł 0.14 (CHCI3::MeOH:H2O, 65:25:4 (v/v/v)).

Czystość potwierdzona przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wynosiła >99%.

Warunki analizy: kolumna Betasil Diol-100; eluent: bufor z 1% trietyloaminy (A), heksan (B), propan-2-ol (C) o przepływie 1,5 mL/min; temperatura 303 K; program (0 min - 0/43/57 (%A/%B/%C), 5 min - 3/40/57, 8 min 10/40/50, 13 min - 10/40/50, 13,1 min - 0/43/57, 22 min - 0/43/57).

Dane spektroskopowe otrzymanego związku, którym jest 1-weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina, są następujące:

¹H NMR (600 MHz, CDCI3/CD3OD 2:1 (v/v)), δ: 3.02 (s, 9H, -N(CH3)3), 3.49 (m, 2H, CH2-P), 3.68, 3.70 (dwa s, 6H, 2 x -OCH3), 3.72-3.81 (dwa m, 3H, CH2-2' i CH2-3'), 3.92 (m, 1H, -OH), 4.07-4.17 (dwa m, 4H, CH2-a, CH2-1’), 6.70 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-5”), 7.31 (s, 1H, H-2”), 7.46 (dwa d, J = 8.5 Hz, 1H, H-6”) ¹³C NMR (150 MHz, CDCI3/CD3OD 2:1 (v/v)) δ: 53.48 ((-N(CH3)3), 54.34 (-OCH3), 59.07 (C-a), 65.00 (C-1'), 65.73 (C-β), 66.60 (C-3'), 68.09 (C-2'), 110.02 (C-5”), 111.70 (C-2”), 121.62 (C-6”), 123.46 (C-1”), 148.21 (C-3”), 152.96 (C-4”), 166.26 (C-1) ³¹P NMR (121 MHz, CDCI3/CD3OD 2:1 (v/v)) δ: -4.00 (a, β) - oznacza sygnały pochodzące od choliny

Claims

1. 1 -Weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina, o wzorze 1 przedstawionym na rysunku.

2. Sposób otrzymywania 1-weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholiny, znamienny tym, że chlorek kwasu 3,4-dimetoksy-benzoesowego poddaje się reakcji z sn-glicero-3-fosfocholiną (GPC) i tlenkiem dibutylocyny (DBTO) w obecności trietyloaminy (TEA), przy czym reakcję prowadzi się w środowisku bezwodnego 2-propanolu, a zawiesinę miesza się przez co najmniej jedną godzinę, następnie wydziela się powstałą 1 -weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholinę.