PL225418B1

PL225418B1 - 3-(4-Nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)- ony podstawione mono-lub dichlorofenylem, sposób ich otrzymywania i zastosowanie medyczne

Info

Publication number: PL225418B1
Application number: PL410363A
Authority: PL
Inventors: Małgorzata Sztanke; Krzysztof Sztanke
Original assignee: Univ Medyczny W Lublinie
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2017-04-28
Also published as: PL410363A1

Description

Przedmiotem wynalazku są 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-ony podstawione mono- lub dichlorofenylem o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza podstawnik aromatyczny mono- lub dichloropodstawiony fenyl, jak zwłaszcza 2-chlorofenyl, 3-chlorofenyl, 4-chlorofenyl, 3,4-dichlorofenyl. Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania nowych związków oraz ich zastosowanie medyczne.

Niektóre znane z piśmiennictwa 7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-ony z ugrupowaniem arylowym na N-8 i podstawnikiem fenylowym lub 2-furanylowym na C-3 charakteryzują się znaczącą cytotoksycznością in vitro wobec komórek linii nowotworowych, a jednocześnie niską toksycznością lub jej brakiem wobec komórek prawidłowych (Sztanke K., Pasternak K., Sztanke M., Kandefer-Szerszeń M., Kozioł A., Dybała I.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 5095, 2009; Sztanke K., Sztanke M., Pasternak K.: Patent PL nr 212 442, 2012; Sztanke K., Sztanke M., Pasternak K.: Patent PL nr 212 447, 2012; Sztanke K., Tuzimski T., Sztanke M., Rzymowska J., Pasternak, K.: Bioorg. Med. Chem. 19, 5103, 2011). Ponadto, niektóre pochodne tego układu zawierające podstawniki arylowe na N-8 oraz rodnik fenylowy na C-3, wykazują właściwości przeciwnowotworowe, antymetastatyczne (Sztanke K., Pasternak K., Sztanke M., Kandefer-Szerszeń M., Kozioł A., Dybała I.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 5095, 2009) lub aktywność antynocyceptywną (Sztanke K.: Patent PL nr 199 750, 2008).

Będące przedmiotem wynalazku 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)ony podstawione mono- lub dichlorofenylem stanowią grupę związków nowych dotychczas nieopisanych w literaturze źródłowej.

Okazało się, że otrzymane według wynalazku związki heterocykliczne będące stałymi substa ncjami krystalicznymi, rozpuszczalnymi w polarnych aprotonowych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak: dimetyloformamid czy dimetylosulfotlenek, charakteryzują się znaczącą aktywnością przeciwnowotworową.

Związki o wzorze ogólnym 1, sposobem według wynalazku otrzymuje się przez kondensację odpowiednio podstawionego halogenowodorku hydrazonu imidazolidyno-2-onu, to jest związku o wzorze ogólnym 2, w którym R oznacza podstawnik aromatyczny mono- lub dichloropodstawiony analog fenylu, jak 2-chlorofenyl, 3-chlorofenyl, 4-chlorofenyl, 3,4-dichlorofenyl, a X oznacza halogen, korzystnie jod, chlor lub brom, z estrem etylowym kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego, to jest związkiem o wzorze ogólnym 3, stosując proporcje molowe substratów 1:1. Kondensację prowadzi się w środowisku rozpuszczalników organicznych, początkowo łagodnie ogrzewając w n-butanolu aż do wytrącenia się osadu, po czym dodaje się dimetyloformamid w ilości potrzebnej do całkowitego rozpuszczenia się osadu, a powstały klarowny roztwór reakcyjny ogrzewa się w temperaturze wrzenia przez okres 1-5 godzin celem dokończenia reakcji. Reakcję prowadzi się w obecności substancji zasadowych wiążących wydzielający się halogenowodór, korzystnie w obecności trietyloaminy, pirydyny, alkoholanów metali alkalicznych, węglanu sodu lub potasu. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną zatęża się przez oddestylowanie rozpuszczalników do 1/2 objętości pod zmniejszonym ciśnieniem, oziębia się, a wydzielony osad odsącza się, przemywa na sączku kolejno wodą i zimnym alkoholem w celu usunięcia soli zawierających chemicznie związany halogenowodór. Następnie, usuwa się rozpuszczalniki, a pozostałość oczyszcza się przez krystalizację z mieszaniny rozpuszczalników polarnych: aprotonowego, korzystnie dimetyloformamidu i protonowego, korzystnie alkoholu metylowego w stosunku objętościowym 4:1 do 8:1.

Przedmiotem wynalazku są również związki o wzorze ogólnym 1 do zastosowania w leczeniu raka płuc, raka szyjki macicy, raka piersi, a także raka jajnika.

Otrzymane według wynalazku nowe związki wykazują działanie przeciwnowotworowe. Działanie to potwierdzono w badaniach in vitro na następujących liniach komórkowych:

1. A549 (ECACC 86012804) - komórki ludzkiego raka płuc (referencyjna linia nowotworowa).

2. HeLa (ECACC 93021013) - linia komórek ludzkiego raka szyjki macicy (referencyjna linia nowotworowa).

3. T47D (ECACC 85102201) - linia komórek ludzkiego raka piersi (referencyjna linia nowotworowa).

4. TOV112D (ATCC CRL -11731) - linia komórek ludzkiego raka jajnika (referencyjna linia nowotworowa).

PL 225 418 B1

Aktywność przeciwnowotworową badanych związków określono immunocytochemiczną metodą interkorporacyjną z 5-bromo-2’-deoksyurydyną po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji, a wyniki, wyrażone jako procent hamowania wzrostu komórek prawidłowych i nowotworowych, przedstawiono w tabeli 1.

Wszystkie nowo zsyntetyzowane związki odznaczały się wyraźnie zaznaczoną cytotoksycznością wobec komórek ludzkiego raka płuc linii A549, komórek ludzkiego raka szyjki macicy linii HeLa, komórek ludzkiego raka piersi linii T47D oraz komórek ludzkiego raka jajnika linii TOV112D. Najwyższą cytotoksycznością wobec komórek linii nowotworowych linii T47D odznaczały się pochodne:

3- chlorofenylowa, 4-chlorofenylowa, 3,4-dichlorofenylowa, które w stężeniu efektywnym 50 pg/ml po 24, 48 i 72-godzinnej inkubacji hamowały wzrost komórek tej linii o 95, 100 i 100%. Najwyższą aktywność cytotoksyczną wobec komórek linii TOV112D wykazały pochodne: 4-chlorofenylowa oraz 3,4-dichlorofenylowa, które w tym samym stężeniu po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji hamowały wzrost komórek tej linii o 90, 100 i 100%. Natomiast najwyższą aktywność antyproliferacyjną wobec komórek linii A549 wykazały pochodne: 3-chlorofenylowa i 3,4-dichlorofenylowa, które w stężeniu 50 pg/ml po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji hamowały wzrost komórek tej linii o 80, 100 i 100%. Natomiast pochodna 2-chlorofenylowa w tym samym stężeniu po 24-godzinej inkubacji charakteryzowała się najniższą toksycznością wobec komórek prawidłowych linii Vero.

P r z y k ł a d 1

Do zawiesiny 0,02 mola (6,8 g) jodowodorku hydrazonu 1-(2-chlorofenylo)imidazolidyno-2-onu w 10 ml n-butanolu dodano 2,8 ml trietyloaminy oraz 0,02 mola (4,46 g) estru etylowego kwasu

4- nitrofenyloglioksalowego i umieszczono w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml, zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną, mieszadło mechaniczne i wkraplacz. W czasie mieszania po lekkim ogrzaniu wytrącił się osad. Następnie, dodano 25 ml dimetyloformamidu celem rozpuszczenia osadu, a klarowny roztwór reakcyjny utrzymywano w temperaturze wrzenia przez 5 godzin. Mieszaninę reakcyjną zatężono do połowy objętości w wyniku oddestylowania pod zmniejszonym ciśnieniem rozpuszczalników organicznych i oziębiono. Wydzielony osad odsączono, przemyto na sączku wodą (3 x 5 ml) i zimnym metanolem (5 ml). Wysuszony osad przekrystalizowano z mieszaniny dimetyloformamidu i alkoholu metylowego w stosunku objętościowym 6:1. Otrzymano 4,51 g (61% wydajności teoretycznej) osadu 3-(4-nitrofenylo)-8-(2-chlorofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 272-274°C.

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

4,15 (t, J = 8,9 Hz, 2H, CH2), 4,36 (t, J = 8,9 Hz, 2H, CH2), 7,46-8,39 (m, 8H, arH).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

41,7 (C-6), 47,7 (C-7), 123,3 (2CH), 128,4 (2CH), 128,5 (CH), 129,9 (CH), 130,1 (CH), 130,3 (CH), 131,5 (C-2'), 134,8 (C-1”), 140,0 (C-H), 145,3 (C-4”), 147,3 (C-3), 151,7 (C-8a), 153,5 (C-4).

Analiza elementarna dla wzoru C₁₇H₁₂CIN₅O₃ (m. cz. 369,76):

Obliczono: %C = 55,22, %H = 3,27, %Cl = 9,59, %N = 18,94;

Oznaczono: %C = 55,01, %H = 3,26, %Cl = 9,56, %N = 19,01.

P r z y k ł a d 2

Postępując analogicznie jak w przykładzie 1 do reakcji użyto jodowodorek hydrazonu 1-(3-chlorofenylo)imidazolidyno-2-onu, trietyloaminę oraz ester etylowy kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego i otrzymano 4,59 g (62% wydajności teoretycznej) osadu 3-(4-nitrofenylo)-8-(3-chlorofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 260-261°C (po krystalizacji z mieszaniny dimetyloformamidu i metanolu w stosunku objętościowym 4:1).

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

4,26 (s, 4H, 2CH2), 7,24-8,46 (m, 8H, ar-H).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

(C-6, CH2), 45,4 (C-7, CH2), 117,1 (CH), 118,6 (CH), 123,3 (2CH), 123,5 (CH), 128,7 (2CH),

130,6 (CH), 133,4 (C-1”), 139,6 (C-3'), 139,8 (C-H), 146,0 (C-4”), 147,5 (C-3), 151,6 (C-8a), 152,0 (C-4).

Analiza elementarna dla wzoru C17H12CIN5O3 (m. cz. 369,76):

Obliczono: %C = 55,22, %H = 3,27, %Cl = 9,59, %N = 18,94;

Oznaczono: %C = 55,43, %H = 3,26, %Cl = 9,57, %N = 18,87.

P r z y k ł a d 3

Postępując analogicznie jak w przykładzie 1 do reakcji użyto jodowodorek hydrazonu 1-(4-chlorofenylo)imidazolidyno-2-onu, trietyloaminę oraz ester etylowy kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego i otrzymano 4,73 g (64% wydajności teoretycznej) osadu 3-(4-nitrofenylo)-8-(4-chlorofenylo)-7,8-dihy4

PL 225 418 B1 droimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 301-302°C (po krystalizacji z mieszaniny dimetyloformamidu i metanolu w stosunku objętościowym 7:1).

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

4,25 (s, 4H, 2CH2), 7,52-8,45 (m, 8H, ar-H).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

(C-6, CH2), 45,4 (C-7, CH2), 120,6 (2CH), 123,3 (2CH), 127,7 (C-4'), 128,6 (2CH), 128,8 (2CH),

137,4 (C-1”), 139,7 (C-1'), 145,8 (C-4”), 147,5 (C-3), 151,6 (C-8a), 152,0 (C-4).

Analiza elementarna dla wzoru C₁₇H₁₂CIN₅O₃ (m. cz. 369,76):

Obliczono: %C = 55,22, %H = 3,27, %Cl = 9,59, %N = 18,94;

Oznaczono: %C = 55,39, %H = 3,28, %Cl = 9,59, %N = 18,89.

P r z y k ł a d 4

Postępując analogicznie jak w przykładzie 1 do reakcji użyto jodowodorek hydrazonu 1-(3,4-dichlorofenylo)imidazolidyno-2-onu, trietyloaminę oraz ester etylowy kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego i otrzymano 4,77 g (59% wydajności teoretycznej) osadu 3-(4-nitrofenylo)-8-(3,4-dichlorofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 340-342°C (po krystalizacji z mieszaniny dimetyloformamidu i metanolu w stosunku objętościowym 8:1).

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

4,5 (s, 4H, 2CH2), 7,71-8,45 (m, 7H, ar-H).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

(C-6, CH2), 45,4 (C-7, CH2), 118,7 (CH), 120,2 (CH), 123,3 (2CH), 125,4 (C- 4'), 128,7 (2CH),

130,7 (CH), 131,3 (C-3'), 138,5 (C-1”), 139,5 (C-1'), 146,2 (C-4”), 147,5 (C-3), 151,5 (C-8a), 151,9 (C-4).

Analiza elementarna dla wzoru C₁₇H₁₂CIN₅O₃ (m. cz. 404,21):

Obliczono: %C = 50,51, %H = 2,74, %Cl = 17,54, %N = 17,33;

Oznaczono: %C = 50,32, %H = 2,73, %Cl = 17,48, %N = 17,27.

T a b e l a 1

Cytotoksyczność (wyrażona jako procent hamowania wzrostu komórek) nowych 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu podstawionych mono- lub dichlorofenylem w stężeniu efektywnym 50 pg/ml

R	Czas inkubacji	% hamowania wzrostu w liniach komórkowych
Prawidłowej	Nowotworowych
Vero	A549	HeLa	T47D	TOV112D
2-ClC6H4	24 h	15	50	65	90	80
48 h	50	90	80	100	100
72 h	80	100	100	100	100
3-ClC6H4	24 h	75	80	85	95	80
48 h	85	100	95	100	100
72 h	100	100	100	90	100
4-ClC6H4	24 h	50	75	85	95	90
48 h	100	100	90	100	100
72 h	100	100	100	100	100
3,4-Cl2C6H3	24 h	30	80	90	95	90
48 h	70	100	100	100	100
72 h	100	100	100	100	100

PL 225 418 B1

Vero - (ECACC 88020401) - klon GMK, komórki nerki małpy zielonej - Macaccus rhesus (referencyjna linia prawidłowa).

A-549 (ECACC 86012804) - komórki ludzkiego raka płuc (referencyjna linia nowotworowa). HeLa (ECACC 93021013) - komórki ludzkiego raka szyjki macicy (referencyjna linia nowotworowa).

T47D (ECACC 85102201) - komórki ludzkiego raka piersi (referencyjna linia nowotworowa). TOV112D (ATCC CRL-11731) - komórki ludzkiego raka jajnika (referencyjna linia nowotworowa). Stężenie efektywne 50 pg/ml odpowiada następującym stężeniom molowym: 0,135 mM (pochodna 2-chloro-, 3-chloro- i 4-chlorofenylowa), 0,124 mM (pochodna 3,4-dichlorofenylowa).

Claims

1.3-(4-Nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-ony podstawione mono- lub dichlorofenylem o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza podstawnik aromatyczny taki jak: mono- lub dichloropodstawiony analog fenylu jak 2-chlorofenyl, 3-chlorofenyl, 4-chlorofenyl, 3,4-dichlorofenyl.

2. Sposób otrzymywania nowych 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onów podstawionych mono- lub dichlorofenylem o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza podstawnik aromatyczny taki jak: mono- lub dichloropodstawiony analog fenylu jak 2-chlorofenyl, 3-chlorofenyl, 4-chlorofenyl, 3,4-dichlorofenyl, znamienny tym, że związek o wzorze ogólnym 2, w którym R ma wyżej podane znaczenie, a X oznacza halogen, korzystnie jod, chlor lub brom, poddaje się kondensacji z estrem etylowym kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego, to jest związkiem o wzorze ogólnym 3, stosując proporcje molowe substratów 1:1 w środowisku rozpuszczalników organicznych, początkowo łagodnie ogrzewając w n-butanolu do czasu wytrącenia się osadu, a następnie po dodaniu dimetyloformamidu w ilości potrzebnej do rozpuszczenia osadu, w mieszaninie n-butanolu i dimetyloformamidu we wrzeniu przez okres 1 -5 godzin, w obecności substancji zasadowych wiążących wydzielający się halogenowodór, a po zakończeniu reakcji, wydzielony osad po oddzieleniu od rozpuszczalnika przemywa się wodą lub alkoholem i oczyszcza przez krystalizację z mieszaniny rozpuszczalników polarnych.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako substancje zasadowe wiążące wydzielający się halogenowodór stosuje się trietyloaminę, pirydynę, alkoholany metali alkalicznych, węglan sodu lub potasu.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że krystalizację prowadzi się z użyciem mieszaniny rozpuszczalników: aprotonowego, korzystnie dimetyloformamidu i protonowego, korzystnie alkoholu metylowego w stosunku objętościowym 4:1 do 8:1

5. 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-ony podstawione mono- lub dichlorofenylem o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza podstawnik aromatyczny taki jak: mono- lub dichloropodstawiony analog fenylu jak 2-chlorofenyl, 3-chlorofenyl, 4-chlorofenyl, 3,4-dichlorofenyl, do zastosowania w leczeniu raka płuc, raka szyjki macicy, raka piersi, a także raka jajnika.