PL225419B1

PL225419B1 - Pochodne 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4] triazyn-4(6H)-onu podstawione fenylem, alkilofenylem, dialkilofenylem, alkoksyfenylem, sposób ich otrzymywania i zastosowanie medyczne

Info

Publication number: PL225419B1
Application number: PL410364A
Authority: PL
Inventors: Małgorzata Sztanke; Krzysztof Sztanke
Original assignee: Univ Medyczny W Lublinie
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2017-04-28
Also published as: PL410364A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są biologicznie aktywne pochodne 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu podstawione fenylem, alkilofenylem, dialkilofenylem, alkoksyfenylem o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza podstawnik, jak: fenyl, 2-metylofenyl, 4-metylofenyl,

2,3-dimetylofenyl lub 2-metoksyfenyl.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania nowych związków i ich zastosowanie medyczne.

Niektóre znane z piśmiennictwa 7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-ony z ugrupowaniem arylowym na N-8 i podstawnikiem fenylowym lub 2-furanylowym na C-3 charakteryzują się znaczącą cytotoksycznością in vitro wobec komórek linii nowotworowych, a jednocześnie niską toksycznością lub jej brakiem wobec komórek prawidłowych (Sztanke K., Pasternak K., Sztanke M., Kandefer-Szerszeń M., Kozioł A., Dybała I.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 5095, 2009; Sztanke K., Sztanke M., Pasternak K.: Patent PL nr 212 442, 2012; Sztanke K., Sztanke M., Pasternak K.: Patent PL nr 212 447, 2012; Sztanke K., Tuzimski T., Sztanke M., Rzymowska J., Pasternak, K.: Bioorg. Med. Chem. 19, 5103, 2011).

Ponadto, niektóre pochodne tego układu zawierające podstawniki arylowe na N-8 oraz rodnik fenylowy na C-3, wykazują właściwości przeciwnowotworowe, antymetastatyczne (Sztanke K., Pasternak K., Sztanke M., Kandefer-Szerszeń M., Kozioł A., Dybała I.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 5095, 2009).

Będące przedmiotem wynalazku biologicznie aktywne pochodne 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu podstawione fenylem, alkilofenylem, dialkilofenylem, alkoksyfenylem stanowią grupę związków nowych, dotychczas nieopisanych w literaturze źródłowej.

Okazało się, że otrzymane związki będące stałymi substancjami krystalicznymi, rozpuszczalnymi w polarnych aprotonowych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak dimetyloformamid. czy dimetylosulfotlenek, charakteryzują się znaczącą aktywnością przeciwnowotworową.

Związki o wzorze ogólnym 1, według wynalazku otrzymuje się przez kondensację odpowiednio podstawionego halogenowodorku 2-hydrazynoimidazoliny, to jest związku o wzorze ogólnym 2, w którym R oznacza podstawnik, taki jak: fenyl, 2-metylofenyl, 4-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyl, 2-metoksyfenyl, a X oznacza halogen, korzystnie jod, chlor lub brom, z estrem etylowym kwasu 4nitrofenyloglioksalowego, to jest związkiem o wzorze ogólnym 3, stosując proporcje molowe substratów 1:1.

Kondensację prowadzi się w środowisku rozpuszczalników organicznych, początkowo w n-butanolu łagodnie ogrzewając aż do wytrącenia się osadu, po czym dodaje się dimetyloformamid w ilości potrzebnej do całkowitego rozpuszczenia się osadu, a powstały klarowny roztwór reakcyjny ogrzewa się w temperaturze wrzenia przez okres 2-5 godzin celem dokończenia reakcji.

Reakcję prowadzi się w obecności substancji zasadowych wiążących wydzielający się halogenowodór, korzystnie w obecności trietyloaminy, pirydyny, alkoholanów metali alkalicznych, węglanu sodu lub potasu.

Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną zatęża się przez oddestylowanie rozpuszczalników do 1/2 objętości pod zmniejszonym ciśnieniem, oziębia się, a wydzielony osad odsącza się, przemywa na sączku kolejno wodą i zimnym metanolem w celu usunięcia soli zawierających chemicznie związany halogenowodór.

Następnie, usuwa się rozpuszczalniki, a wysuszony osad oczyszcza się przez krystalizację z mieszaniny rozpuszczalników polarnych: aprotonowego, korzystnie dimetyloformamidu i protonowego, korzystnie alkoholu metylowego w stosunku objętościowym od 2:1 do 9:1.

Przedmiotem wynalazku są również związki o wzorze ogólnym 1 do zastosowania w leczeniu raka płuc, raka szyjki macicy, raka piersi a także raka jajnika.

Otrzymane sposobem według wynalazku nowe związki o wzorze ogólnym 1 wykazują znaczące działanie przeciwnowotworowe, które potwierdzono w badaniach in vitro na następujących liniach komórkowych:

1. A549 (ECACC 86012804) - komórki ludzkiego raka płuc (referencyjna linia nowotworowa).

2. HeLa (ECACC 93021013) - linia komórek ludzkiego raka szyjki macicy (referencyjna linia nowotworowa).

3. T47D (ECACC 85102201) - linia komórek ludzkiego raka piersi (referencyjna linia nowotworowa).

PL 225 419 B1

4. TOV112D (ATCC CRL -11731) - linia komórek ludzkiego raka jajnika (referencyjna linia nowotworowa).

Aktywność przeciwnowotworową badanych związków określono immunocytochemiczną metodą interkorporacyjną z 5-bromo-2’-deoksyurydyną po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji, a wyniki, wyrażone jako procent hamowania wzrostu komórek prawidłowych i nowotworowych, przedstawiono w tabeli 1.

Wszystkie nowo zsyntetyzowane związki odznaczały się wyraźnie zaznaczoną cytotoksycznością wobec komórek ludzkiego raka płuc linii A549, komórek ludzkiego raka szyjki macicy linii HeLa, komórek ludzkiego raka piersi linii T47D oraz komórek ludzkiego raka jajnika linii TOV112D.

Najwyższą cytotoksycznością wobec komórek linii nowotworowych linii T47D odznaczały się pochodne: 3-chlorofenylowa, 4-chlorofenylowa, 3,4-dichlorofenylowa, które w stężeniu efektywnym 50 pg/ml po 24, 48 i 72-godzinnej inkubacji hamowały wzrost komórek tej linii o 95, 100 i 100%.

Najwyższą aktywność cytotoksyczną wobec komórek linii TOV112D wykazały pochodne: 4-chlorofenylowa oraz 3,4-dichlorofenylowa, które w tym samym stężeniu po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji hamowały wzrost komórek tej linii o 90, 100 i 100%.

Natomiast najwyższą aktywność antyproliferacyjną wobec komórek linii A549 wykazały pochodne: 3-chlorofenylowa i 3,4-dichlorofenylowa, które w stężeniu 50 pg/ml po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji hamowały wzrost komórek tej linii o 80, 100 i 100%.

Natomiast pochodna 2-chlorofenylowa w tym samym stężeniu po 24-godzinej inkubacji charakteryzowała się najniższą toksycznością wobec komórek prawidłowych linii Vero.

P r z y k ł a d 1

Do zawiesiny 0,02 mola (6,08 g) jodowodorku hydrazonu 1-fenylo)imidazolidyno-2hydrazynoimidazoliny w 50 ml n-butanolu dodano 2,8 ml trietyloaminy oraz 0,02 mola (4,46 g) estru etylowego kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego i umieszczono w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml, zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną, mieszadło mechaniczne i wkraplacz.

W czasie mieszania po lekkim ogrzaniu wytrącił się osad. Dodano wówczas 50 ml dimetyloformamidu celem rozpuszczenia osadu, a klarowny roztwór reakcyjny utrzymywano w temperaturze wrzenia przez 5 godzin.

Mieszaninę reakcyjną zatężono do połowy objętości w wyniku oddestylowania pod zmniejszonym ciśnieniem rozpuszczalników organicznych i oziębiono. Wydzielony osad odsączono, przemyto na sączku wodą (3 x 5 ml) i zimnym metanolem (2 x 5 ml).

Wysuszony osad przekrystalizowano z mieszaniny dimetyloformamidu i alkoholu metylowego w stosunku objętościowym 5:1.

Otrzymano 4,63 g (69% wydajności teoretycznej) 3-(4-nitrofenylo)-8-fenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 291-293°C (po krystalizacji z mieszaniny dimetyloformamidu i metanolu w stosunku objętościowym 5:1).

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

4,26 (s, 4H, 2CH2), 7,18-8,46 (m, 9H, ar-H).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

40,5 (C-6, CH2), 45,5 (C-7, CH2), 119,1 (2CH), 123,3 (2CH), 124,0 (CH), 128,5 (2CH), 128, (2CH), 138,4 (C-1”), 139,9 (C-1'), 134,8 (C-1”), 145,5 (C-4”), 145,3 (C-4”), 147,4 (C-3), 151,7 (C-8a),

152.1 (C-4).

Analiza elementarna dla wzoru C₁₇H₁₂CIN₅O₃ (m. cz. 335,32):

Obliczono: %C = 60,89, %H = 3,91, %N = 20,89;

Oznaczono: %C = 61,10, %H = 3,90, %N = 20,81.

P r z y k ł a d 2

Postępując analogicznie jak w przykładzie 1 do reakcji użyto jodowodorek 1-(2-metylofenylo)-2-hydrazynoimidazoliny, trietyloaminę oraz ester etylowy kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego i otrzymano

3,7 g (53% wydajności teoretycznej) osadu 3-(4-nitrofenylo)-8-(2-metylofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 210-211°C (po krystalizacji z mieszaniny dimetyloformamidu i metanolu w stosunku objętościowym 3:1).

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

2,31 (s, 3H, CH3), 4,07-4,36 (m, 4H, 2CH₂), 7,31-8,39 (m, 8H, ar-H).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

(CH3), 41,6 (C-6, CH₂), 48,0 (C-7, CH₂), 123,3 (2CH), 126,9 (CH), 126,9 (CH), 127,1 (CH), 128,3 (2CH), 131,0 (CH), 136,0 (C-2'), 136,1 (C-H), 140,2 (C-1”), (C-4”), 147,1 (C-3), 151,9 (C-8a),

153.2 (C-4).

PL 225 419 B1

Analiza elementarna dla wzoru C₁₈H₁₅N₅O₃ (m. cz. 349,34):

Obliczono: %C = 61,89, %H = 4,33, %N = 20,05;

Oznaczono: %C = 61,67, %H = 4,34, %N = 19,98.

P r z y k ł a d 3

Postępując analogicznie jak w przykładzie 1 do reakcji użyto jodowodorek 1-(4-metylofenylo)-2-hydrazynoimidazoliny, trietyloaminę oraz ester etylowy kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego i otrzymano 5,03 g (72% wydajności teoretycznej) osadu 3-(4-nitrofenylo)-8-(4-metylofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 278-280°C (po krystalizacji z mieszaniny dimetyloformamidu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1).

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

2,33 (s, 3H, CH3), 4,24 (s, 4H, 2CH₃), 7,28 (d, J = 8,4 Hz, 2H, ar: H-2' i H-6'), 7,77 (d, J = 8,5 Hz, 2H, ar: H-3' i H-5'), 8,30-8,45 (m, 4H nitrofenylu).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

20,4 (CH3), 40,5 (C-6, CH2), 45,6 (C-7, CH2), 119,2 (2CH), 123,3 (2CH), 128,5 (2CH), 129,4 (2CH), 133,2 (C-4'), 136,0 (C-1”), 140,0 (C-H), 145,2 (C-4”), 147,3 (C- 3), 151,7 (C-8a), 152,1 (C-4).

Analiza elementarna dla wzoru C₁₈H₁₅N₅O₃ (m. cz. 349,34):

Obliczono: %C = 61,89, %H = 4,33, %N = 20,05;

Oznaczono: %C = 62,11, %H = 4,32, %N = 20,11.

P r z y k ł a d 4

Postępując analogicznie jak w przykładzie 1 do reakcji użyto jodowodorek 1-(2,3-dimetylofenylo)-2-hydrazynoimidazoliny, trietyloaminę oraz ester etylowy kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego i otrzymano 4,0 g (55% wydajności teoretycznej) osadu 3-(4-nitrofenylo)-8-(2,3-dimetylofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1- c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 274-276°C (po krystalizacji z mieszaniny dimetyloformamidu i metanolu w stosunku objętościowym 2:1 ).

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

2,19 (s, 3H, CH3), 2,32 (s, 3H, CH3), 4,06 (t, J = 8,9 Hz, 2H, CH2), 4,31 (t, J = 8,9 Hz, 2H, CH2), 7,19-8,39 (m, 7H: ar-H).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

14,1 (CH3), 19,9 (CH3), 41,5 (C-6, CH2), 48,3 (C-7, CH2), 123,3 (2CH), 124,7 (CH), 126,3 (CH),

128,3 (2CH), 129,6 (CH), 134,8 (C-2'), 136,1 (C-1”), 138,1 (C-3'), 140,3 (C-1'), 144,4 (C-4”), 147,1 (C-3), 151,9 (C-8a), 153,4 (C-4).

Analiza elementarna dla wzoru C₁₉H₁₇N₅O₃ (m. cz. 363,37):

Obliczono: %C = 62,80, %H = 4,72, %N= 19,27;

Oznaczono: %C = 62,58, %H = 4,73, %N= 19,20.

P r z y k ł a d 5

Postępując analogicznie jak w przykładzie 1 do reakcji użyto jodowodorek 1-(2-metoksyfenylo)-2-hydrazynoimidazoliny, trietyloaminę oraz ester etylowy kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego i otrzymano 3,80 g (52% wydajności teoretycznej) osadu 3-(4-nitrofenylo)-8-(2-metoksyfenylo)-7,8dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu o temperaturze topnienia 286-287°C (po krystalizacji z mieszaniny dimetyloformamidu i metanolu w stosunku objętościowym 7:1).

Widmo ¹H NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

3,85 (s, 3H, OCH3), 4,08 (t, J = 9,1 Hz, 2H, CH2), 4,31 (t, 9,1 Hz, 2H, CH2), 7,04-8,40 (m, 8H:

ar-H).

Widmo ¹³C NMR (DMSO-d6, TMS, 300 MHz) δ (ppm):

(C-6, CH2), 47,3 (C-7, CH2), 55,8 (CH3O), 112,7 (CH), 120,6 (CH), 123,3 (2CH), 125,5 (C-1”),

128,3 (2CH), 128,5 (CH), 129,4 (CH), 140,2 (C-1'), 144,7 (C- 4”), 147,2 (C-3), 151,8 (C-8a), 153,6 (C-4), 154,8 (C-2').

Analiza elementarna dla wzoru C₁₈H₁₅N₅O₄ (m. cz. 365,34):

Obliczono: %C = 59,18, %H = 4,14, %N = 19,17;

Oznaczono: %C = 58,98, %H = 4,15, %N = 19,26.

PL 225 419 B1

T a b e l a 1

Cytotoksyczność (wyrażona jako procent hamowania wzrostu komórek) nowych pochodnych 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu podstawionych fenylem, alkilofenylem, dialkilofenylem, alkoksyfenylem w stężeniu efektywnym 50 pg/ml

R	Czas inkubacji	% hamowania wzrostu w liniach komórkowych
Vero	A549	HeLa	T47D	TOV112D
C6H₅	24 h	40	70	80	100	80
48 h	95	90	90	100	100
72 h	100	100	100	100	100
2-CH3C6H4	24 h	50	75	80	60	80
48 h	75	80	90	80	90
72 h	95	100	100	90	100
4-CH3C6H4	24 h	10	25	85	90	80
48 h	80	50	90	100	90
72 h	100	80	100	100	95
2,3-(CH3)2C6H3	24 h	15	25	75	80	50
48 h	50	75	85	95	90
72 h	90	85	90	100	100
2-CH3OC6H4	24 h	10	30	85	80	80
48 h	40	75	90	90	90
72 h	75	80	100	100	100

Vero - (ECACC 88020401) - klon GMK, komórki nerki małpy zielonej - Macaccus rhesus (referencyjna linia prawidłowa).

A-549 (ECACC 86012804) - komórki ludzkiego raka płuc (referencyjna linia nowotworowa). HeLa (ECACC 93021013) - komórki ludzkiego raka szyjki macicy (referencyjna linia nowotworowa).

T47D (ECACC 85102201) - komórki ludzkiego raka piersi (referencyjna linia nowotworowa). TOV112D (ATCC CRL-11731) - komórki ludzkiego raka jajnika (referencyjna linia nowotworowa). Stężenie efektywne 50 pg/ml odpowiada następującym stężeniom molowym: 0,149 mM (pochodna fenylowa), 0,143 mM (pochodna 2-metylofenylowa i 4-metylofenylowa), 0,138 mM (pochodna

2,3-dimetylofenylowa), 0,137 mM (pochodna 3-metoksyfenylowa).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Pochodne 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu podstawione fenylem, alkilofenylem, dialkilofenylem, alkoksyfenylem o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza podstawnik, jak: fenyl, 2-metylofenyl, 4-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyI lub 2-metoksyfenyl.
2. Sposób otrzymywania nowych pochodnych 3-(4-nitrofenyIo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c]-[1,2,4]triazyn-4(6H)-onu podstawionych fenylem, alkilofenylem, dialkilofenylem, alkoksyfenylem o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza podstawnik, taki jak: fenyl, 2-metylofenyl, 4-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyl lub 2-metoksyfenyl, znamienny tym, że związek o wzorze ogólnym 2, w którym R ma wyżej podane znaczenie, a X oznacza halogen, korzystnie jod, chlor lub brom, poddaje się kondensacji z estrem etylowym kwasu 4-nitrofenyloglioksalowego, to jest związkiem o wzorze ogólnym 3, stosując proporcje molowe substratów 1:1, w środowisku rozpuszczalników organicznych, początkowo łagodnie ogrzewając w n-butanolu do czasu wytrącenia się osadu, a następnie po dodaniu dimetyloformamidu w ilości potrzebnej do rozpuszczenia osadu w mieszaninie n-butanolu i dimetyloformamidu, w temperaturze wrzenia przez okres 1-5 godzin, w obecności substancji zasadowych wiążących wydzielający się halogeno wodór, a po zakończeniu reakcji, wydzielony osad po oddzieleniu od rozpus zczalnika przemywa się wodą lub alkoholem, a pozostałość oczyszcza się przez krystalizację z mieszaniny rozpuszczalników polarnych.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako substancje zasadowe wiążące wydzielający się halogenowodór stosuje się trietyloaminę, pirydynę, alkoholany metali alkalicznych, węglan sodu lub potasu.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że krystalizację prowadzi się z użyciem mieszaniny rozpuszczalników: aprotonowego, korzystnie dimetyloformamidu i protonowego, korzystnie alkoholu metylowego, w stosunku objętościowym od 2:1 do 9:1.
5. Pochodne 3-(4-nitrofenylo)-7,8-dihydroimidazo[2,1-c][1,2,4]triazyn-4(6H)-onu podstawione fenylem, alkilofenylem, dialkilofenylem, alkoksyfenylem o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza podstawnik, taki jak: fenyl, 2-metylofenyl, 4-metylofenyl, 2,3-dimetylofenyl lub 2-metoksyfenyl, do zastosowania w leczeniu raka płuc, raka szyjki macicy, raka piersi, a także raka jajnika.