PL217737B1 - Sposób wytwarzania kompozycji lipopolisacharydu - Google Patents

Sposób wytwarzania kompozycji lipopolisacharydu

Info

Publication number
PL217737B1
PL217737B1 PL373657A PL37365702A PL217737B1 PL 217737 B1 PL217737 B1 PL 217737B1 PL 373657 A PL373657 A PL 373657A PL 37365702 A PL37365702 A PL 37365702A PL 217737 B1 PL217737 B1 PL 217737B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
lps
cells
mla
culture
solution
Prior art date
Application number
PL373657A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373657A1 (pl
Inventor
Kent R. Myers
D.Scott Snyder
Original Assignee
Corixa Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Corixa Corp filed Critical Corixa Corp
Publication of PL373657A1 publication Critical patent/PL373657A1/pl
Publication of PL217737B1 publication Critical patent/PL217737B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C07H13/06—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji lipopolisacharydu.
Tło wynalazku
1. Dziedzina wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny biosyntetycznego wytwarzania 3-O-deacylo-4'monofosforylolipidu A (3D-MLA). W szczególności, dotyczy on sposobów podwyższania wydajności w sposobach wytwarzania pożądanych kongenerów 3D-MLA lub minimalizacji kosztu oczyszczania prekursorów lipopolisacharydowych (LPS) 3D-MLA.
2. Opis najbliższego stanu techniki
Dawno temu stwierdzono, że lipopolisacharydy enterobakterii (LPS) są silnymi stymulatorami układu immunologicznego. Submikrogramowe ilości LPS mogą wywoływać rozmaite odpowiedzi, zarówno korzystne, jak i szkodliwe. Fakt, że niektóre odpowiedzi są szkodliwe, a niektóre mogą być śmiertelne, uniemożliwiał zastosowanie kliniczne LPS per se. Stwierdzono, że składnikiem LPS, odpowiedzialnym w największym stopniu za aktywność endotoksyczną, jest lipid A.
W związku z tym włożono wiele wysiłku, by osłabić własności toksyczne LPS lub lipidu A, bez obniżania zdolności stymulowania układu immunologicznego przez te związki. Znamienne pośród tych wysiłków były prace Edgara Ribi i jego współpracowników, które zaowocowały powstaniem pochodnej lipidu A,
3-O-deacylo-4'-monofosforylolipidu A (3D-MLA; kompozycje zawierające 3D-MLA są dostępne na rynku ® pod nazwą handlową MPL® od Corixa Corporation (Seattle, WA) ). Wykazano, że 3D-MLA posiada zasadniczo te same zdolności stymulowania układu immunologicznego, co lipid A, ale niższą endotoksyczność (Myers i wsp., pat. USA nr 4912094). Myers i wsp. donosili również o sposobie wytwarzania 3D-MLA w następujący sposób. Najpierw LPS lub lipid A, uzyskany ze szczepu mutanta głęboko szorstkiego bakterii gram-ujemnych (np. Salmonella minnesota R595) ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w roztworze kwasu mineralnego o umiarkowanej mocy (np. 0,1 N HCl) przez około 30 min. To prowadzi do defosforylacji w pozycji 1 glukozoaminy przy końcu redukującym i usunięcia węglowodanu w pozycji 6' nieredukującej glukozoaminy lipidu A. Następnie defosforylowany i pozbawiony węglowodanu lipid A (nazywany również monofosforylolipidem A lub MLA) poddawany jest hydrolizie zasadowej, na przykład przez rozpuszczenie w rozpuszczalniku organicznym, takim jak chloroform:metanol (CM) 2:1 (obj./obj.), nasycenie roztworu
0,5 M roztworem wodnym Na2CO3 o pH 10,5 i impulsowe odparowanie próżniowe rozpuszczalnika. Prowadzi to do selektywnego usunięcia reszty kwasu β-hydroksymirystynowego w pozycji 3 lipidu A, co daje 3-O-deacylo-4'-monofosforylolipid A (3D-MLA).
Jakość 3D-MLA otrzymanego według powyższego sposobu, w dużym stopniu zależy od czystości i składu LPS, uzyskanego z bakterii gram-ujemnej. Na przykład, lipid A, będący składnikiem LPS, jest mieszaniną blisko spokrewnionych form, które zawierają od około 5-7 reszt kwasu tłuszczowego. Podczas powstawania 3D-MLA, co jasno wynika z powyższego omówienia, jedna reszta kwasu tłuszczowego ulega usunięciu z wytworzeniem 3D-MLA, które zawierają od około 4-6 reszt kwasu tłuszczowego. Zasadniczo uważa się, że 3D-MLA z przynajmniej 6 resztami kwasu tłuszczowego jest korzystny pod względem kombinacji utrzymanych lub podwyższonych zdolności stymulowania układu immunologicznego, obniżonej toksyczności i innych pożądanych właściwości (Qureshi i Takayama w „The Bacteria”, tom XI (Iglewski i Clark, red.), Academic Press, 1990, str. 319-338).
Według innego przykładu, w ekstrakcji na skalę przemysłową LPS z bakterii gram-ujemnych zazwyczaj stosuje się sposób Chena (Chen i wsp., J. Infect. Dis. 128:543 (1973)); mianowicie ekstrakcję za pomocą CM, która prowadzi do bogatej w LPS i fosfolipidy fazy CM, z której można je następnie oczyścić. Jednakże oczyszczanie LPS z fazy CM, wzbogaconej w LPS i fosfolipidy, zazwyczaj wymaga wielokrotnych etapów wytrącania, aby otrzymać LPS o czystości wystarczającej do zastosowania w stymulowaniu układu immunologicznego, takich jak, na przykład, przez zastosowanie jako adiuwant szczepionki.
Byłoby zatem pożądane posiadanie sposobów dogodnego wytwarzania bardzo czystych kompozycji LPS. Byłoby ponadto pożądane posiadanie sposobów tworzenia kompozycji LPS, które to kompozycje mają 3D-MLA ze zwiększonymi poziomami kongenerów heksaacylowych.
Do przygotowania hodowli bakterii gram-ujemnych, zawierających łatwy do oczyszczania LPS, stosowano znane techniki fermentacji. Te znane techniki obejmują zazwyczaj zbieranie hodowli bakterii we wczesnej fazie stacjonarnej, w zgodzie ze standardami praktyki bakteriologicznej. Zauważono jednak, że stopień acylacji LPS, wytwarzanego w znanych warunkach, jest zmienny. Na przykład, zawartość formy heptaacylowej w lipidzie Az S. minnesota R595 może zmieniać się od 20% do 80%, w zależności od partii (Rietschel i wsp., Rev. Infect. Dis. 9:S257 (1987)). Zmienność pod względem zawartości kongenera heptaPL 217 737 B1 acylowego dałaby znaczące różnice zawartości kongenera heksaacylowego w 3D-MLA, otrzymanego z tych partii LPS.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji lipopolisacharydu (LPS) obejmujący:
a) hodowanie w pożywce hodowli szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego z rodzaju
Salmonella lub Escherichia;
b) utrzymywanie hodowli w fazie stacjonarnej przez przynajmniej 5 godzin;
c) zbieranie komórek z hodowli; oraz
d) ekstrakcję LPS z komórek.
Sposób ten pozwala na wytwarzanie LPS, który daje 3D-MLA o względnie dużym udziale (tj. przynajmniej około 20% mol) kongenerów, zawierających 6 reszt kwasu tłuszczowego.
Korzystnie, szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego stosowany w sposobie według wynalazku jest z rodzaju Salmonella, korzystnie z gatunku Salmonella minnesota, a najkorzystniej stanowi szczep Salmonella minnesota R595.
W korzystnej postaci wykonania pożywkę stosowaną w sposobie według wynalazku stanowi M9.
Również korzystnie hodowlę w sposobie według wynalazku utrzymuje się przez pomiędzy 5 a 6 godzin.
W kolejnej korzystnej postaci wykonania sposób według wynalazku obejmuje ponadto poddawanie LPS kolejno hydrolizie kwasowej i zasadowej z wytworzeniem 3-O-deacylo-4'-monofosforylolipidu A (3DMLA) zawierającego co najmniej około 20% molowych heksaacylowej grupy kongenerowej.
Niniejszym opisano również sposób ekstrakcji lipopolisacharydu (LPS) z hodowli komórek szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego, obejmującego:
(a) ekstrakcję komórek za pomocą roztworu, składającego się zasadniczo z przynajmniej około 75% wag. alkoholu alifatycznego, mającego od 1 do 4 atomów węgla, pozostałość stanowi woda (ang. balance water), w wyniku czego otrzymuje się komórki o obniżonej zawartości fosfolipidów;
(b) ekstrakcję komórek o obniżonej zawartości fosfolipidów za pomocą roztworu zawierającego chloroform i metanol, prowadzącą do otrzymania roztworu LPS w chloroformie i metanolu (CM).
Ten sposób dostarcza roztworu LPS w CM, który ma obniżoną zawartość fosfolipidów i jest dlatego odpowiedni do dalszych modyfikacji i oczyszczania z wytworzeniem 3D-MLA. Sposób ten zawiera względnie proste i niedrogie etapy.
Krótki opis rysunków
Następujące rysunki stanowią część niniejszego opisu i są dołączone, aby głębiej wykazać pewne aspekty niniejszego wynalazku. Wynalazek może być lepiej zrozumiany przez odniesienie do jednego lub większej liczby tych rysunków, w połączeniu ze szczegółowym opisem konkretnych wykonań, prezentowanych tutaj.
Na Fig. 1 przedstawiono płytki TLC ekstraktów etanolowych i próbek LPS, otrzymanych przy różnych temperaturach podczas ekstrakcji alkoholem. Na płytce po lewej przedstawiono, idąc od lewej do prawej, ekstrakty etanolowe w temperaturach 22°C, 37°C i 50°C. Ostatnia próbka z prawej strony tej płytki jest oryginalną próbką LPS. Na płytce po prawej przedstawiono LPS, uzyskany z każdego preparatu. Próbki na ścieżkach 3, 4 i 5 odpowiadają odpowiednio LPS z komórek poddanych ekstrakcji wstępnej za pomocą etanolu w 22°C, 37°C i 50°C. Intensywne pasma przy Rf~0,6 odpowiadają zanieczyszczeniom fosfolipidowym i kwasów tłuszczowych. Poziomy tych zanieczyszczeń ulegają obniżeniu przez podniesienie temperatury ekstrakcji etanolowych i są one bardzo niskie w próbkach poddanych ekstrakcji wstępnej w 50°C.
Opis przykładowych postaci wykonania
W jednej z postaci wykonania niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania lipopolisacharydu (LPS), obejmującego:
(a) hodowanie w pożywce hodowli szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego;
(b) utrzymywanie hodowli w fazie stacjonarnej przez przynajmniej około 2 godz.;
(c) zbieranie komórek z hodowli i (d) ekstrakcję LPS z komórek.
Lipopolisacharydy są głównym składnikiem lipidowym zewnętrznej warstwy błony komórkowej bakterii gram-ujemnych. Frakcja lipopolisacharydowa bakterii gram-ujemnej zawiera, oprócz innych składników, lipid A. Jak opisano, lipid A można pozbawić reszty węglowodanowej i częściowo zdefosforylować, by uzyskać monofosforylolipid A (MLA), a MLA można deacylować selektywnie w pozycji 3 otrzymując 3-O-deacylo-4'-monofosforylolipid A (3D-MLA).
PL 217 737 B1
Lipid A, wytwarzany przez bakterie gram-ujemne, zawiera jednak zazwyczaj szereg form, które mają taką samą ogólną strukturę lipidu A, ale różnią się posiadaną liczbą reszt kwasów tłuszczowych. Grupy form lipidu A o takiej samej liczbie reszt kwasów tłuszczowych noszą tutaj nazwę „kongenery”. Kongenery lipidu A, zawierające od 4 do 7 reszt kwasów tłuszczowych są wytwarzane w standardowej hodowli na skalę przemysłową bakterii gram-ujemnych, takich jak S. minnesota R595. W wyniku tego 3D-MLA, wytwarzany np. z lipidu A S. minnesota R595, posiada skład kongenerowy o typowym zakresie 3 do 6 reszt kwasów tłuszczowych (ponieważ 3D-MLA utracił jedną resztę kwasu tłuszczowego).
Heterogenność składu kongenerowego 3D-MLA (ze względu na lipid A i MLA) można przypisać dwóm źródłom: (1) różnorodności biosyntetycznej przy powstawaniu lipidu A i (2) utracie reszt kwasów tłuszczowych ze szkieletu lipidu A podczas przetwarzania go w 3D-MLA. Choć nie jest to oparte o teorię, uważa się, obok innych wyjaśnień, że różnorodność biosyntetyczna wynika z niedoskonałej swoistości substratowej acylotransferaz zaangażowanych w końcowych etapach biosyntezy lipidu A. Utrata reszt kwasów tłuszczowych ze szkieletu lipidu A może również nastąpić podczas hydrolizy zasadowej i kwaśnej, używanych zazwyczaj przy wytwarzaniu 3D- MLA.
Niespodziewanie stwierdzono, że skład kongenerowy 3D-MLA można zmienić, zmieniając parametry procesu hodowli szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego, który wytwarza lipid A. Dokładniej, stwierdzono, że hodowanie szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego w fazie stacjonarnej przez przynajmniej około 5 godz. przed zebraniem wywołuje zmianę proporcji kongenerów wytworzonego w ten sposób lipidu A, tak że przynajmniej około 20% molowych 3D-MLA, otrzymanych później z lipidu A, zawiera 6 kwasów tłuszczowych. Korzystnie przynajmniej około 50% molowych 3D-MLA zawiera 6 kwasów tłuszczowych. Stwierdzono, że utrzymywanie w fazie stacjonarnej przez około 5,5 godz. jest szczególnie skuteczne. Odróżnia się to od znanych w dziedzinie typowych procesów hodowli, gdzie zbieranie następuje prawie natychmiast po wejściu hodowli w fazę stacjonarną; w znanym procesie skład kongenerowy LPS jest wysoce zmienny, co daje 3D-MLA o zmiennej zawartości kongenera heksaacylowego.
Przez „szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego” należy rozumieć szczep bakterii gramujemnej, posiadający fenotyp głęboko szorstki. Fenotyp „głęboko szorstki” oznacza, że reszta polisacharydowa przyłączona do lipidu A składa się z zaledwie 2-3 reszt kwasu 2-keto-3-deoksy-Dmannooktulozonowego (KDO). Korzystnie szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego jest wybrany z rodzaju Salmonella. Korzystniej jeżeli szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego jest z rodzaju Salmonella, to jest on z gatunku Salmonella minnesota, a korzystnej jest to szczep Salmonella minnesota R595. Można zastosować inne szczepy bakteryjne mutanta głęboko szorstkiego, takie jak między innymi szczepy Proteus mirabilis.
Można zastosować każdą technikę odpowiednią dla hodowli szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego. Zazwyczaj wymagać to będzie użycia przynajmniej jednego bioreaktora o skali przemysłowej. W jednej postaci wykonania technika obejmuje zaszczepienie względnie małego bioreaktora (np. 15 I) komórkami szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego, wzrost szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego aż do fazy stacjonarnej, a następnie aseptyczny transfer 15 l pożywki z komórkami do dużego bioreaktora (np. 750 I).
Wzrost można prowadzić na każdej pożywce, o której wiadomo lub stwierdzono, że umożliwia wzrost szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego. W jednej korzystnej postaci wykonania pożywką jest M9, mieszanina soli nieorganicznych uzupełniona o dekstrozę i hydrolizat kazeiny (kazaminokwasy). Skład M9 jest dobrze znany specjaliście w dziedzinie.
Po utrzymywaniu szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego w fazie stacjonarnej przez przynajmniej około 5 godz. można zebrać komórki z hodowli i ekstrahować LPS z tych komórek. Do zbierania komórek z hodowli i ekstrakcji LPS z komórek można zastosować znane techniki, choć korzystna technika ekstrakcji LPS z komórek jest opisana poniżej.
Zbieranie można wykonać za pomocą każdej znanej techniki. W jednej z korzystnych postaci wykonania, po utrzymywaniu w fazie stacjonarnej przez przynajmniej około 5 godz., zawartość bioreaktora pompuje się do urządzenia do sączenia stycznego, by oddzielić zużytą pożywkę od komórek.
LPS ekstrahuje się następnie z komórek za pomocą dowolnej odpowiedniej techniki. Do znanych technik należą sposób Galanosa, który obejmuje ekstrakcję LPS mieszaniną fenolu, chloroformu i eteru naftowego (PCP), następnie odparowanie chloroformu i eteru naftowego, dodanie acetonu i wody, aby wytrącić LPS i odzyskanie LPS za pomocą wirowania lub sączenia (Galanos i wsp., Eur. J. Biochem. 9:245 (1969)) i sposób Chena, cytowany powyżej, który obejmuje ekstrakcję LPS mieszaniną chloroformu i metanolu (CM), a następnie szereg etapów wytrącania metanolem.
PL 217 737 B1
Poniżej opisano udoskonalenie sposobu Chena, które jest korzystne w wytwarzaniu LPS i jego pochodnych dla zastosowań komercyjnych.
Niezależnie od techniki ekstrakcji, jej wynikiem jest zasadniczo czysty, suchy LPS, który można przetwarzać dalej przez kolejne hydrolizy kwasowe i hydrolizy zasadowe z wytworzeniem 3D-MLA, jak naucza Ribi, pat. USA nr 4436727 i Myers i wsp., pat. USA nr 4912094. By podsumować ujawnienia tych odnośników literaturowych, w korzystnej postaci wytwarzania 3D-MLA, LPS poddaje się reakcji z kwasem organicznym lub nieorganicznym, a następnie liofilizuje z wytworzeniem MLA. Kwasem nieorganicznym jest w korzystnej postaci wykonania kwas chlorowodorowy, kwas siarkowy lub kwas fosforowy. Kwasem organicznym jest w korzystnej postaci wykonania kwas toluenosulfonowy lub kwas trichlorooctowy. Reakcję można przeprowadzić w temperaturze pomiędzy około 90°C a około 130°C, w czasie dostatecznym do dokończenia hydrolizy, zazwyczaj pomiędzy około 15 min. i około 60 min. MLA można traktować rozpuszczalnikiem, korzystnie acetonem, aby rozpuścić kwasy tłuszczowe i inne zanieczyszczenia, po czym usuwa się wzbogacony w zanieczyszczenia rozpuszczalnik dla kwasów tłuszczowych.
Następnie MLA poddaje się działaniu łagodnej zasady, aby selektywnie usunąć kwas β-hydroksymirystynowy z pozycji 3 MLA (w środowisku łagodnie zasadowym tylko kwas β-hydroksymirystynowy w pozycji 3 jest labilny). Reakcję z łagodną zasadą można przeprowadzić w środowisku wodnym lub organicznym. Do odpowiednich rozpuszczalników organicznych należą między innymi metanol i inne alkohole, dimetylosulfotlenek (DMSO), dimetyloformamid (DMF), chloroform, dichlorometan lub ich mieszaniny. Można również wykorzystać kombinacje wody i mieszalnych z wodą rozpuszczalników organicznych.
Zasadę zastosowaną do przeprowadzenia hydrolizy, wybiera się korzystnie spośród wodorotlenków, węglanów, fosforanów lub amin. Do przykładowych zasad nieorganicznych należą między innymi wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, węglan sodu, wodorowęglan potasu, wodorowęglan sodu i wodorowęglan potasu. Do przykładowych zasad organicznych należą między innymi alkiloaminy (takie jak, między innymi, dietyloamina i trietyloamina).
W środowiskach wodnych pH wynosi zazwyczaj pomiędzy około 10 i około 14, korzystnie pomiędzy około 10 i około 12. Reakcję hydrolizy przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze pomiędzy około 20°C i około 80°C, w korzystnym wykonaniu pomiędzy około 50°C i około 60°C, w czasie około 10 min. do około 48 godz.
Jeden z korzystnych sposobów hydrolizy zasadowej obejmuje rozpuszczenie MLA w CM 2:1 (obj./obj.), nasycenie roztworu wodnym buforem 0,5 M Na2CO3 o pH 10,5, a następnie impulsowe odparowanie próżniowe rozpuszczalnika przy 45-50°C pod aspiratorem próżniowym (w przybliżeniu
100 mm Hg).
Niniejszym ujawniono również sposób ekstrakcji lipopolisacharydu (LPS) z hodowli komórek szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego, obejmującego:
(a) ekstrakcję komórek za pomocą roztworu, składającego się zasadniczo z przynajmniej około 75% wag. alkoholu alifatycznego, posiadającego od 1 do 4 atomów węgla, pozostałość stanowi woda, w wyniku czego otrzymuje się komórki o obniżonej zawartości fosfolipidów;
(b) ekstrakcję komórek o obniżonej zawartości fosfolipidów za pomocą roztworu zawierającego chloroform i metanol z wytworzeniem roztworu LPS w chloroformie i metanolu (CM).
Komórki szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego, ich hodowlę i sposoby przygotowywania hodowli opisano powyżej. Korzystnie szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego jest wybrany z rodzajów Salmonella lub Escherichia. Korzystniej, jeżeli szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego jest z rodzaju Salmonella, to jest on z gatunku Salmonella minnesota, a bardziej korzystnie stanowi szczep Salmonella minnesota R595. Jeśli szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego jest wybrany z rodzaju Escherichia, to korzystniej jest on z gatunku Escherichia coli i bardziej korzystne stanowi szczep Escherichia coli D31m4.
Pierwszy etap ekstrakcji można przeprowadzić za pomocą każdego alkoholu alifatycznego o krótkim łańcuchu. Alkohol alifatyczny może być liniowy, rozgałęziony lub cykliczny. Korzystnie alkohol alifatyczny ma od 2 do 4 atomów węgla i miesza się z wodą. Korzystniej alkoholem alifatycznym jest etanol.
Roztwór zawierający alkohol alifatyczny może zawierać dowolną część alkoholu alifatycznego od 75% wag. wzwyż. W przypadku korzystnym roztwór zawiera pomiędzy około 85% wag. i około 95% wag. alkoholu alifatycznego. Dopełnieniem roztworu jest zasadniczo woda. Mogą być obecne ślady innych związków, w wyniku niepełnego oczyszczenia lub innego zanieczyszczenia alkoholu alifatycznego lub wody, jako składników roztworu.
PL 217 737 B1
Temperaturą, w której prowadzi się pierwszy etap ekstrakcji, może być każda temperatura, która zapewnia dostateczną ekstrakcję fosfolipidu z hodowli komórek. Korzystnie temperatura wynosi pomiędzy około 35°C a około 65°C. Korzystniej temperatura wynosi pomiędzy około 45°C a około 55°C.
Inne parametry pierwszego etapu ekstrakcji, takie jak między innymi szybkość dodawania roztworu alkoholu alifatycznego, czas trwania kontaktu roztworu i komórek i wstrząsanie lub jego brak, mogą być rutynowo zmieniane przez specjalistę w dziedzinie.
W wyniku pierwszego etapu ekstrakcji powstaje (i) faza roztworu alkoholu alifatycznego, bogata w fosfolipidy i (ii) komórki o obniżonej zawartości fosfolipidów. Składnik LPS błon komórkowych oddziela się w zasadzie całkowicie od komórek o obniżonej zawartości fosfolipidów.
Drugi etap ekstrakcji obejmuje ekstrakcję komórek o obniżonej zawartości fosfolipidów roztworem chloroform:metanol (CM).
W drugim etapie ekstrakcji można zastosować dowolny stosunek chloroformu do metanolu, o którym wiadomo, że będzie odpowiedni do zastosowania do ekstrakcji LPS z błon komórkowych (tak jak w sposobie Chena). Stosunek chloroformu do metanolu wynosi typowo od około 2:1 do około 9:1. Do otrzymywania LPS z komórek o obniżonej zawartości fosfolipidów można również zastosować mieszaniny rozpuszczalników o właściwościach równoważnych właściwościom CM.
Przewaga tego sposobu nad sposobem Chena polega na usunięciu fosfolipidów w pierwszym etapie ekstrakcji. Podczas gdy ekstrakcja CM w sposobie Chena daje roztwór LPS, który zawiera znaczące ilości fosfolipidów, to drugi etap ekstrakcji tu opisanej, przeprowadzany na komórkach o obniżonej zawartości fosfolipidów, daje roztwór wzbogacony w LPS, który jest zasadniczo pozbawiony fosfolipidów. Alternatywne sposoby wytwarzania preparatów LPS, które są względnie wolne od fosfolipidów, takie jak sposób Galanosa (patrz powyżej), są mniej pożądane, ponieważ nie nadają się do wytwarzania na dużą skalę, stosują mieszaniny rozpuszczalników, które stanowią zagrożenie dla zdrowia i bezpieczeństwa (np. fenol:chloroform:eter naftowy) lub mają obydwie te cechy.
Z uwagi na zasadniczą nieobecność fosfolipidów w roztworze LPS, dalsze oczyszczanie LPS według tego sposobu jest ogólnie prostsze i mniej kosztowne, niż w sposobie Chena. Stwierdzono, że można utworzyć suchą pozostałość LPS o wystarczającej czystości przez odparowanie z roztworu LPS chloroformu i metanolu.
Ewentualnie można prowadzić dalszą obróbkę LPS, taką jak w etapach hydrolizy kwasowej i hydrolizy zasadowej, opisanych powyżej, by wytworzyć MLA lub 3D-MLA.
3D-MLA, wytwarzany przez wykonywanie sposobów opisanych powyżej, można zastosować do rozlicznych celów. Jednym z korzystnych zastosowań jest zastosowanie jako immunostymulatora lub adiuwanta w kompozycjach farmaceutycznych zawierających immunogenny polinukleotyd, polipeptyd, przeciwciało, komórkę T lub komórkę prezentującą antygen (APC). Immunostymulator lub adiuwant odnosi się do zasadniczo dowolnej substancji, która podnosi lub wzmaga odpowiedź immunologiczną (w której pośredniczą przeciwciała i/lub komórki) na antygen zewnętrzny.
Jedna z odpowiedzi immunologicznych, którą może stymulować MLA lub 3D-MLA, wytworzone według niniejszego wynalazku, jest typ Th1. Zaobserwowano, że kombinacja monofosforylolipidu A (MLA), korzystnie 3-de-O-acylowanego-4'-monofosforylolipidu A wraz z solą glinu jest skuteczna jako adiuwant do wywoływania przede wszystkim odpowiedzi typu Th1. Wysokie poziomy cytokin typu Th1 (np. IFN-γ, TNFa, IL-2 i IL-12) faworyzują raczej indukcję odpowiedzi immunologicznej na podawany antygen, w której pośredniczą komórki. Przeciwnie, wysokie poziomy cytokin typu Th2 (np. IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10) faworyzują raczej indukcję humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Po podaniu kompozycji farmaceutycznej zawierającej MLA lub 3D-MLA, pacjent wykaże odpowiedź immunologiczną, która obejmuje odpowiedzi typu Th1 i Th2. Gdy odpowiedź jest przede wszystkim typu Th1, to poziom cytokin typu Th1 wzrośnie w większym stopniu, niż poziom cytokin typu Th2. Poziomy tych cytokin można łatwo określić za pomocą standardowych testów. Rodziny cytokin omówiono w pracy przeglądowej Mosmann i Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989.
W jednej korzystnej postaci wykonania układ adiuwanta zawiera kombinację monofosforylolipidu A (MLA), korzystnie 3D-MLA, z pochodną saponiny (taką jak Quil A lub jego pochodne, w tym QS21 i QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); escyna; digitonina lub saponiny Gypsophila albo Chenopodium quinoa), taką jak kombinacja QS21 i adiuwanta 3D-MLA, jak opisano w WO 94/00153 lub mniej reaktogenna kompozycja, w której SQ21 jest hamowany przez cholesterol, jak opisano w WO 96/33739. Inne korzystne kompozycje zawierają emulsję oleju w wodzie oraz tokoferol. Inną szczególnie korzystną kompozycję adiuwanta, wykorzystującą QS21, 3D-MLA i tokoferol w emulsji oleju w wodzie opisano w WO 95/17210.
PL 217 737 B1
Aby wyjaśnić korzystne wykonania wynalazku, dołączono następujące przykłady. Specjaliści w dziedzinie powinni docenić fakt, że techniki ujawnione w przykładach poniżej reprezentują techniki, co do których twórca stwierdził, że działają dobrze przy wykonywaniu wynalazku i zatem można je uważać za stanowiące korzystne postaci jego wykonywania.
P r z y k ł a d 1 - Sposoby ogólne
A. Przygotowanie pożywek
Wzrost komórek odbywał się w pożywce M9, którą sporządza się mieszając jałowe roztwory soli nieorganicznych, hydrolizatu kazeiny i dekstrozy. Roztwór soli M9 sporządza się zazwyczaj w fermentorze, zawiera on następujące sole: 2,0 g/l NaCl, 0,2 g/l MgSO47H2O, 3,0 g/l KH2PO4, 6,0 g/l Na2HPO4 i 1,0 g/l dekstrozy. Następnie do fermentora dodaje się, w sposób aseptyczny, jałowe roztwory 20% (wag./obj.) hydrolizatu kazeiny (20 ml/l) i 50% (wag./obj.) dekstrozy (32 ml/l), aby otrzymać kompletną pożywkę.
B. Zaszczepianie
Typowo do jałowej 250 ml kolby Erlenmeyera nalewano 50 ml jałowej pożywki M9. Porcję Salmonella minnesota R595 do zaszczepienia (ok. 108 cfu) rozmrażano i wlewano do kolby, którą zamykano korkiem z gazy. Hodowlę inkubowano w 37°C przez 6-8 godz., aż uzyskano stały wzrost.
C. Wzrost komórek
Hodowle Salmonella minnesota R595 hodowano w fermentorze BioFlo III (New Brunswick Scientific, Inc.), wyposażonym w naczynie szklane 2,5 I. W typowym przebiegu do naczynia nalewano 2,0 I roztworu soli M9, autoklawowano, a następnie w sposób aseptyczny dodano jałowe roztwory hydrolizatu kazeiny i dekstrozy. Fermentor był wyposażony w linie do dostarczania środka przeciwpieniącego (0,1% SAG-471, Witco Corp.) i NH4OH (30%) oraz sondy pH, dO2 i piany. pH pożywki doprowadzono do 6,9 dostarczając NH4OH. Fermentor inokulowano następnie całą hodowlą zaszczepiającą i inkubowano w 37°C, przedmuchując tlenem (zazwyczaj 2,0 l/min.) i mieszając (zazwyczaj 50 obr./min.). Fazę wzrostu hodowli monitorowano mierząc gęstość optyczną przy 590 nm. Komórki zbierano albo przez wirowanie albo sączenie z przepływem stycznym, przemywano wodą i liofilizowano.
D. Ekstrakcja lipopolisacharydu (LPS)
LPS wyizolowano zgodnie z procedurą Qureshiego i wsp. (1986) z małymi modyfikacjami. W typowym przebiegu najpierw mieszano wysuszone komórki w stężeniu 20 mg/ml w etanolu 90% (obj./obj.) w temperaturze pokojowej przez 1 godz., a następnie odzyskano przez sączenie próżniowe. Komórki poddano drugiej ekstrakcji etanolem, a następnie kolejnym ekstrakcjom acetonem i eterem dietylowym (każda 15 min., obydwa 40 mg/ml, według wagi początkowej), a powstały proszek eterowy wysuszono na powietrzu przez noc. W międzyczasie sporządzono roztwór fenol (89%) : chloroform : eter naftowy 19:45:72 (obj./obj./obj.; skrót PCP), który odstawiono na noc. Proszek eterowy zawieszono w PCP, z którego zdekantowano nadmiar wody, w stężeniu 70 mg/ml. Roztwór mieszano przez 30 min., a następnie odwirowano (3000 x g, 15 min. 0-5°C). Frakcję supernatanta zdekantowano do kolby okrągłodennej, a osad komórek wyekstrahowano po raz drugi za pomocą PCP. Frakcje supernatantów połączono i odparowano na wyparce w 40°C, aż do usunięcia w dużym stopniu lotnych rozpuszczalników. Zmierzono wtedy pozostałą objętość. Dodano kroplami wodę, aż do pojawienia się widocznego zmętnienia, a następnie do roztworu fenolowego, przy szybkim mieszaniu dodano 5 objętości acetonu, a następnie 1 objętość eteru dietylowego (obydwie substancje ochłodzone w łaźni lodowej). Roztwór umieszczono na 30 min. w łaźni lodowej, a następnie odzyskano wytrącony LPS przez wirowanie (5000 x g, 15 min. 0-5°C). Na ogół konieczne było odsączenie grawitacyjne frakcji supernatantu, by odzyskać ten LPS, który nie pozostał w osadzie. LPS przemyto raz minimalną objętością zimnego acetonu, odzyskano przez wirowanie/sączenie i wysuszono pod próżnią. Typowa wydajność wynosi 4-5%, w oparciu o początkową suchą masę komórek.
E. Sporządzenie 4'-monofosforylolipidu A (MLA)
LPS zawieszono w wodzie przy stężeniu 10 mg/ml, stosując rozbijanie ultradźwiękami w temp. 4555°C w celu ułatwienia dyspergowania ciała stałego. Otrzymany roztwór powinien być nieco mętny, ale bez widocznego gołym okiem osadu. Do tego roztworu dodano 1 objętość 0,2 N HCl, po czym umieszczono go w łaźni z wrzącą wodą na 15 minut. Reakcję zatrzymano w łaźni lodowej, a następnie ekstrahowano 5 objętościami (w stosunku do wyjściowego roztworu LPS) mieszaniny chloroform:metanol 2:1 (obj./obj.). Roztwór dwufazowy zmieszano, a fazy rozdzielono przez wirowanie przy niskiej prędkości (500-1000 x g). Fazę dolną odzyskano i odparowano pod azotem, co dało surowy MLA.
F. Sporządzenie 3-O-deacylowanego-4'-monofosforylolipidu A (3D-MLA)
Surowy MLA rozpuszczono w mieszaninie chloroform:metanol 2:1 (obj./obj.) w stężeniu pomiędzy około 1-5 mg/ml, a 3,0 ml tego roztworu przeniesiono do probówki 16x100 mm. Do probówki do8
PL 217 737 B1 datkowo dodano 0,4 ml metanolu, po czym umieszczono ją w łaźni wodnej w 50°C na 10 min. Reakcję zainicjowano przez dodanie 40 μΐ 0,5 M KHCO3, pH 10,5, a roztwór inkubowano w 50°C przez 20 min.
Przy końcu tego czasu probówkę wyjęto z łaźni wodnej, a reakcję zatrzymano przez dodanie 2,0 ml
0,1 N HCl (lodowatego), a następnie mieszanie. 3D-MLA odzyskano przez dodanie 1,0 ml metanolu, mieszanie, wirowanie (500-1000 x g) i odparowanie dolnej fazy do sucha pod azotem.
P r z y k ł a d 2 - Sposoby analityczne
A. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) MLA i związanych próbek
Wszystkie analizy TLC przeprowadzono z użyciem płytek 5 x 10 cm, pokrytych Silica Gel 60 (E Merck). Próbki nakładano na płytki TLC zasadniczo jako roztwory 10 mg/ml w mieszaninie chloroform:metanol 4:1 (obj./obj.), z 3 μΐ roztworu (próbka 30 pg), nakładanych w małych plamkach na linii 5 mm, za pomocą kapilary). Płytki wywoływano w układzie rozpuszczalników, zawierającym chloroform, metanol, wodę, wodorotlenek amonu 50:31:6:2 (obj./obj.). Pasma na wywołanych płytkach uwidoczniono przez rozpylenie na nie roztworu 10% (wag./obj.) kwasu fosfomolibdenowego w etanolu, a następnie zwęglenie w 150-160°C. W pewnych przypadkach zbadano ilościowo względne intensywności plamek za pomocą densytometrii skanującej na Shimadzu CS9000U Dual Wavelength Flying Spot Scanner (Shimadzu Corp.), stosując długość fali skanowania 520 nm.
B. Analiza MLA/3D-MLA za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
Próbki do analizy przekształcono najpierw do postaci wolnego kwasu, przez przemywanie roztworu
3-5 mg próbki w 5 ml mieszaniny chloroform:metanol 2:1 (obj./obj.) za pomocą 2 ml 0,1 N HCl. Układ dwufazowy mieszano, odwirowano, a fazę dolną (organiczną) przeniesiono do probówki i odparowano w strumieniu azotu. Następnie pozostałość metylowano w reakcji z diazometanem. W skrócie, roztwór eterowy diazometanu sporządzono przez umieszczenie 60-100 mg 1-metylo-3-nitro-1-nitrozoguanidyny (MNNG; Aldrich) w niewielkiej fiolce (2 dram), dodając 60 μl eteru dietylowego na każdy mg MNNG, a następnie dodając 9 μl 5 N NaOH na mg MNNG, w trakcie mieszania roztworu poniżej -10°C. Po zakończeniu reakcji cytrynową warstwę eterową wysuszono przez przeniesienie jej do innego naczynia, które zawierało kilka ziaren NaOH i wirowanie, cały czas poniżej -10°C. Próbkę, przemytą kwasem, rozpuszczono w 1 ml mieszaniny chloroform:metanol 4:1 (obj./obj.), umieszczonej w łaźni poniżej -10°C i wkroplono roztwór diazometanu, mieszając, aż do pojawienia się trwałego bladożółtego zabarwienia. Roztwór odparowano następnie w temperaturze pokojowej w strumieniu azotu, a potem suszono pod próżnią przez co najmniej 30 min.
Analizy chromatograficzne przeprowadzono na kolumnie z odwróconym układzie faz C18 (Nova-Pak, wielkość ziarna 4 μm, 8 mm x 10 cm Waters]). Metylowane próbki rozpuszczono w mieszaninie chloroform:metanol 4:1 (obj./obj.) w stężeniu 100 μg/ml i przepuszczono przez filtr strzykawkowy PTFE 0,45 μm. Zazwyczaj stosowano nastrzyk o objętości 20-25 pi, a następnie elucję prowadzono w gradiencie liniowym 20 do 80% izopropanolu w acetonitrylu w ciągu 60 min, przy prędkości przepływu 2 ml/min., monitorowaną przy 210 nm.
C. Analiza zawartości kongenerów za pomocą HPLC
LPS jest substancją wysoce heterogenną, z powodu zmienności 1) liczby pierścieni cukrowych w obszarach antygenu O i rdzenia, 2) podstawień polarnych w obszarze rdzenia i na fosforanach lipidu A i 3) liczby i położenia kwasów tłuszczowych, przyczepionych do szkieletu lipidu A. To ostatnie źródło zmienności jest interesujące w związku ze składem kongenerowym 3D-MLA (MPL®). Hydroliza LPS do MLA i 3D-MLA usuwa zmienność w obszarach antygenu O i rdzenia, wprowadza jednak również dodatkową heterogenność, z powodu niekontrolowanej utraty kwasów tłuszczowych, związanych do O. To uniemożliwia dokładne poznanie wzoru acylacji w wyjściowym LPS. Aby to obejść opracowano sposób, według którego fosforany i obszar rdzenia usuwane są w łagodnych warunkach, które nie wywołują rozkładu kwasów tłuszczowych, związanych z O. Otrzymany zdefosforylowany lipid A (zerowy fosforylolipid A lub ZPL) można następnie analizować za pomocą HPLC, co daje dokładne odzwierciedlenie schematu acylowania w wyjściowym LPS.
Sposób wykonywano zazwyczaj tak, jak opisano poniżej.
0,5 do 5,0 mg próbki LPS hydrolizowano w 200 pl stężonego kwasu fluorowodorowego przez 3-4 godz. w 27°C. Reakcję tę należy wykonywać w szczelnie zamkniętych probówkach teflonowych i pod dobrze działającym wyciągiem. HF usuwano przez odparowanie w strumieniu azotu w temperaturze pokojowej, a następnie hydrolizat rozpuszczano w mieszaninie chloroform:metanol (4:1) (obj./obj.), przenoszono do probówki szklanej 16x100 mm i odparowywano rozpuszczalnik w strumieniu azotu. Pozostałość zawieszano w 1,0 ml 0,1% trietyloaminy z użyciem łaźni ultradźwiękowej, dodawano 1,0 ml 40 mM NaOAc, po czym zawieszano probówkę we wrzącej łaźni wodnej przez 30 - 45 min. Reakcję zatrzymywano przez
PL 217 737 B1 ochłodzenie w łaźni lodowej, po czym odzyskiwano ZPL przez ekstrakcję 5 ml mieszaniny chloroform:metanol (2:1) (obj./obj.). Fazę organiczną przenoszono do małej fiolki z nakrętką i odparowywano rozpuszczalnik pod azotem. ZPL derywatyzowano przez dodanie 200 μΐ 10 mg/ml O-(3,5-dinitrobenzylo)hydroksyloaminy HCl (Regis Technologies, Inc.) w pirydynie, szczelne zamknięcie fiolki i inkubację w 60°C przez 3 godz. Odparowywano pirydynę pod azotem, a pozostałość suszono dalej pod próżnią przez >30 min. Następnie pozostałość zawieszano w 500 μΐ mieszaniny chloroform:metanol (2:1) (obj./obj.) i nakładano na 0,5-1,0 ml złoża Accell-QMA (forma octanowa; Waters), które uprzednio wstępnie zrównoważono w tym samym rozpuszczalniku. Kolumnę przemywano łącznie 5,0 ml mieszaniny chloroform:metanol (2:1) (obj./obj.) w kilku małych porcjach, a eluat zbierano do probówki 16x100 mm. Do eluatu dodawano 2,0 ml 0,1 N HCl, układ dwufazowy mieszano, wirowano krótko przy 500-1000 x g, a fazę dolną (organiczną) przenoszono do innej probówki i odparowywano pod azotem. Pozostałość rozpuszczono w 100-300 μl mieszaniny chloroform:metanol (4:1) (obj./obj.) i przesączano przez filtr strzykawkowy PTFE 0,45 μm. Filtr przemywano dwa razy mieszaniną chloroform:metanol (4:1) (obj./obj.), a przesącz odparowywano pod azotem. Przesącz rozprowadzano ostatecznie w 50-150 μl mieszaniny chloroform:metanol (4:1) (obj./obj.) i przenoszono do naczynka automatycznego iniektora w celu analizy HPLC. Warunki HPLC były następujące: kolumna z odwróconym układem faz C18 (np. Waters), objętość nastrzyku 10 pi, gradient liniowy od 20 do 80% izopropanolu w acetonitrylu w ciągu 60 min., przy szybkości przepływu 2 ml/min., monitorowanie przy 254 nm.
P r z y k ł a d 3 - Porównanie składu kongenerowego MLA/3D-MLA z hodowli zbieranych w różnych czasach
Przeprowadzono szereg przebiegów fermentora przy następujących parametrach: 2,0 I pożywki M9 (pH początkowe 6,84-6,87), przepływ powietrza 2 l/min., mieszanie przy 50 obr./min., 37°C, brak kontroli pH. Hodowle monitorowano, mierząc gęstość optyczną przy 590 nm i zatrzymywano po osiągnięciu pożądanego stadium wzrostu. Komórki przerabiano i ekstrahowano według powyższego opisu, uzyskując próbki LPS, które hydrolizowano następnie do MLA i 3D-MLA i analizowano za pomocą HPLC (patrz Przykłady 1 i 2). Wyniki podsumowano w Tabeli 1.
T a b e l a 1
Skład kongenerowy MLA i 3D-MLA z komórek zbieranych w różnych stadiach
Przebieg Opis Wiek hodowli przy zbiorze Czas w fazie stacjonarnej MLA 3D-MLA
3-O- deacylowany heksaacyl heptaacyl 3-O- deacylowany heksaacyl
A Późna wykładnicza 6, 75 h Nie dotyczy 12, 4% 12, 2% 9, 9%
B Wczesna faza stacjonarna 9, 5 h ~5 godz. 9, 2% 6,8% 9,2%
C Późna faza stacjonarna 15 h ~6 godz. 19, 5% 13, 2% 21, 5%
Dane wykazują, że hodowle S. minnesota R595 zmieniają schemat acylacji LPS podczas fazy stacjonarnej, czego efektem jest wzrost całkowitej zawartości heksaacylowych plus heptaacylowych 3O-deacylowanych form w MLA otrzymanym z tego LPS, co z kolei wywołuje podwyższenie zawartości heksaacylowej 3-O-deacylowanej formy w 3D-MLA otrzymanym z tego MLA.
P r z y k ł a d 4 - Porównanie składu kongenerowego LPS z hodowli zbieranych w różnych czasach
Przeprowadzono szereg przebiegów fermentora przy następujących parametrach: 2,0 I pożywki M9 (pH początkowe 6,84-6,87), przepływ powietrza 2 l/min., mieszanie przy 225 obr./min., 37°C, brak kontroli pH. Stadium wzrostu hodowli monitorowano, mierząc gęstość optyczną przy 590 nm. Komórki poddawano obróbce i ekstrahowano według opisu w Przykładzie 1, uzyskując próbki LPS. Próbki LPS hydrolizowano do ZPL i analizowano za pomocą HPLC, jak opisano w Przykładzie 2. Wyniki podsumowano w Tabeli 2.
PL 217 737 B1
T a b e l a 2
Skład kongenerowy LPS z komórek zbieranych w różnych stadiach
Przebieg Opis Wiek hodowli przy zbiorze Czas w fazie stacjonarnej MLA 3D-MLA
3-O- acylowany heksaacyl 3-O- deacylowany heksaacyl heptaacyl
A Wczesna faza stacjonarna 9 h ~ 0,5 h 76% 0% 24%
B Późna faza stacjonarna 15 h ~ 6 h 48% 17% 19%
W LPS z komórek z wczesnej fazy stacjonarnej nie wykryto żadnego składnika heksaacylowego 3-O-deacylowanego (przebieg A). Jedynym źródłem kongenerów heksaacylowanych w 3D-MLA, otrzymanym z tego LPS byłby zatem jedynie materiał heptaacylowany (24%). W przeciwieństwie do tego, LPS z komórek zbieranych w późnej fazie stacjonarnej zawierał zarówno formy heptaacylową i heksaacylową 3-O-deacylowaną (odpowiednio 19% i 17%). Te obie formy złożyły się na zawartość formy heksaacylowej w 3D-MLA (MPL®), otrzymanym z tego LPS. Ujawnienie, że komórki w pewnych warunkach wytwarzają 3-O-deacylowaną formę heksaacylową LPS, było nieoczekiwane.
P r z y k ł a d 5 - Efekt temperatury ekstrakcji wstępnej na czystość LPS S. minnesota R595
Komórki S. minnesota R595 hodowano w fermentorze 80 I (New Brunswick Scientific), stosując warunki zasadniczo tożsame z podanymi w Przykładzie 1. Komórki zatężono przez sączenie z przepływem stycznym, ale nie wirowano ich, osad zawierał 51,5 mg suchej masy komórek na ml. Sporządzono trzy roztwory, w których porcje zawiesiny komórek po 150 μΐ połączono z 600 ml etanolu. Roztwory etanolowe mieszano przez 1 godz. w 22°C, 37°C i 50°C i przesączono. Komórki poddano drugiej ekstrakcji etanolem w warunkach tych samych, poza użyciem etanolu 95%. Komórki odzyskano przez sączenie próżniowe, a następnie ekstrahowano przez noc w mieszaninie chloroform:metanol (4:1) (obj./obj.) w 50°C. Roztwór przesączono, a przesącz odparowano na wyparce próżniowej do sucha, uzyskując preparaty LPS. Próbki przesączów pierwszej i drugiej ekstrakcji etanolowej, uzyskane w każdej z temperatur, a także LPS otrzymany z komórek poddanych ekstrakcji wstępnej, zanalizowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, według sposobu z Przykładu 2. Obrazy płytek TLC przedstawiono na Fig. 1.
Fig. 1 przedstawia płytki TLC ekstraktów etanolowych i próbki LPS, uzyskane w różnych temperaturach podczas ekstrakcji etanolowych. Płytka po lewej przedstawia, idąc od lewej do prawej, ekstrakty etanolowe w temperaturach 22°C, 37°C i 50°C. Ostatnia próbka z prawej strony tej płytki jest oryginalną próbką LPS. Płytka po prawej przedstawia LPS, otrzymany ze wszystkich preparatów. Próbki na ścieżkach 3, 4 i 5 odpowiadają LPS z komórek, poddanych ekstrakcji wstępnej etanolem, odpowiednio w 22°C, 37°C i 50°C. Intensywne pasma przy Rf~0,6 odpowiadają zanieczyszczeniom fosfolipidami i kwasami tłuszczowymi. Poziom tych zanieczyszczeń ulega obniżeniu przy podniesieniu temperatury ekstrakcji etanolowej i jest bardzo niski w próbce, którą poddano ekstrakcji wstępnej w 50°C. Na płytkach TLC na Fig. 1 widać, że ekstrakcja wstępna etanolem przy podwyższonej temperaturze skutecznie usuwa zanieczyszczenia, które w innym przypadku ulegają współekstrakcji mieszaniną chloroform:metanol (4:1) (obj./obj.). Ekstrakcja wstępna w 50°C daje LPS, który jest w dużej mierze wolny od tych zanieczyszczeń.
P r z y k ł a d 6 - Porównanie LPS otrzymanego z oraz bez ekstrakcji wstępnej etanolem (przykład porównawczy)
W fermentorze 750 I (B. Braun) przeprowadzono trzy hodowle komórek S. minnesota R595, stosując warunki zasadniczo tożsame z podanymi w Przykładzie 1. Komórki zebrano przez sączenie z przepływem stycznym, a z każdej fermentacji pobrano próbkę zawiesiny komórek, którą zliofilizowano. Resztę komórek poddano dwóm ekstrakcjom wstępnym 90% etanolem w 50°C przez 1 godz. Komórki odzyskiwano pomiędzy ekstrakcjami za pomocą sączenia z przepływem stycznym. Następnie komórki ekstrahowano przez noc mieszaniną chloroform:metanol (4:1) (obj./obj.) pod chłodnicą zwrotną. Ekstrakt odzyskano za pomocą sączenia z przepływem stycznym i odparowano do sucha. Próbki komórek zliofilizowanych ekstrahowano przez noc, pod chłodnicą zwrotną, mieszaniną chloroform:metanol (4:1) (obj./obj.), roztwory przesączono, a przesącz odparowano do sucha. Próbki LPS otrzymane z oraz bez ekstrakcji wstępnej etanolem analizowano za pomocą TLC, zasadniczo zgodnie
PL 217 737 B1 z opisem w Przykładzie 2. Płytki TLC skanowano od około Rf=0,01 do 0,90 i dla każdej próbki obliczono stosunek intensywności w obszarze LPS (Rf=0,01 do 0,20) do intensywności całkowitej. Wyniki przedstawiono w Tabeli 3.
T a b e l a 3
Czystość LPS z komórek z oraz bez wstępnej ekstrakcji etanolem
Przebieg Numer serii Procent intensywności całkowitej w obszarze LPS1
bez ekstrakcji wstępnej etanolem z ekstrakcją wstępną etanolem
A 48020-B2698C 7 86
B 48020-C0598A 11 83
C 48020-C0598B 14 88
1 Procent intensywności całkowitej w obszarze LPS = [(intensywność w Rf=0,01 do 0,20)/(intensywność w Rf=0,01 do 0,90)] x 100
Wyniki w Tabeli 3 wykazują, że LPS otrzymany po ekstrakcji wstępnej komórek S. minnesota R595 90% etanolem w 50°C jest znacznie czystszy, niż materiał z komórek bez ekstrakcji wstępnej.
W świetle niniejszego ujawnienia wszystkie sposoby, ujawnione i zastrzegane tutaj, mogą zostać wykonane i przeprowadzone bez nadmiernej pracy eksperymentalnej.

Claims (7)

1. Sposób wytwarzania kompozycji lipopolisacharydu (LPS), znamienny tym, że obejmuje:
a) hodowanie w pożywce hodowli szczepu bakteryjnego mutanta głęboko szorstkiego z rodzaju Salmonella lub Escherichia;
b) utrzymywanie hodowli w fazie stacjonarnej przez przynajmniej 5 godzin;
c) zbieranie komórek z hodowli; oraz
d) ekstrakcję LPS z komórek.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego jest z rodzaju Salmonella.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że szczep bakteryjny mutanta głęboko szorstkiego z rodzaju Salmonella jest z gatunku Salmonella minnesota.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że szczepem bakteryjnym mutanta głęboko szorstkiego z gatunku Salmonella minnesota jest szczep Salmonella Minnesota R595.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywkę stanowi M9.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę utrzymuje się przez pomiędzy 5 godzin a 6 godzin.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto poddawanie LPS kolejno hydrolizie kwasowej i hydrolizie zasadowej z wytworzeniem 3-O-deacylo-4'-monofosforylolipidu A (3DMLA) zawierającego co najmniej około 20% molowych heksaacylowej grupy kongenerowej.
PL373657A 2001-03-30 2002-03-28 Sposób wytwarzania kompozycji lipopolisacharydu PL217737B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28008901P 2001-03-30 2001-03-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373657A1 PL373657A1 (pl) 2005-09-05
PL217737B1 true PL217737B1 (pl) 2014-08-29

Family

ID=23071615

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL402939A PL402939A1 (pl) 2001-03-30 2002-03-28 Kompozycja 3-0-deacylo-4'-monofosforylolipidu A
PL373657A PL217737B1 (pl) 2001-03-30 2002-03-28 Sposób wytwarzania kompozycji lipopolisacharydu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL402939A PL402939A1 (pl) 2001-03-30 2002-03-28 Kompozycja 3-0-deacylo-4'-monofosforylolipidu A

Country Status (21)

Country Link
US (3) US20030031684A1 (pl)
EP (3) EP2465937B1 (pl)
JP (3) JP4233327B2 (pl)
KR (2) KR100927099B1 (pl)
CN (2) CN1928107B (pl)
AU (1) AU2002306962B2 (pl)
BR (2) BRPI0208535B8 (pl)
CA (1) CA2440249C (pl)
CZ (2) CZ305601B6 (pl)
DK (2) DK1461418T3 (pl)
ES (2) ES2415769T3 (pl)
HU (1) HU228688B1 (pl)
IL (3) IL157867A0 (pl)
MX (1) MXPA03008856A (pl)
NZ (2) NZ548595A (pl)
PL (2) PL402939A1 (pl)
PT (2) PT2465937E (pl)
RU (2) RU2302463C2 (pl)
SI (2) SI1461418T1 (pl)
WO (1) WO2002078637A2 (pl)
ZA (1) ZA200307238B (pl)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
FR2848223B1 (fr) * 2002-12-09 2005-02-25 Centre Nat Rech Scient Nouveau procede d'isolement des endotoxines.
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
KR101515078B1 (ko) 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2008134830A1 (en) * 2007-03-22 2008-11-13 Fundação Butantan Method to obtain monophosphoryl lipid a from bordetella pertussis as a by-product of the cellular pertussis vaccine production
JP5331105B2 (ja) 2007-05-24 2013-10-30 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 凍結乾燥抗原組成物
US20130066064A1 (en) * 2010-05-20 2013-03-14 Glaxosmithkline Biologicals S.A, Novel process
CN103533953A (zh) 2011-05-17 2014-01-22 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 针对肺炎链球菌的疫苗
GB201113570D0 (en) 2011-08-05 2011-09-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US9241988B2 (en) * 2012-04-12 2016-01-26 Avanti Polar Lipids, Inc. Disaccharide synthetic lipid compounds and uses thereof
CN102746414B (zh) * 2012-07-20 2014-04-16 成都生物制品研究所有限责任公司 一种细菌脂多糖的沉降方法
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US11186652B2 (en) 2015-12-22 2021-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa LPS extraction process
KR101761348B1 (ko) * 2016-01-06 2017-07-26 한국과학기술연구원 헥사 아실화된 모노포스포릴 지질 a를 생산하는 세균, 및 이를 이용한 헥사 아실화된 모노포스포릴 지질 a 생산 방법
KR102019331B1 (ko) * 2017-07-05 2019-09-09 한국과학기술연구원 모노포스포릴 지질 ａ를 구성적으로 생산하는 세균, 및 이를 이용한 모노포스포릴 지질 ａ 생산 방법
EP3777884A1 (en) 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
KR102748233B1 (ko) * 2019-08-29 2024-12-31 주식회사 유바이오로직스 모노포스포릴 지질 ａ를 생산하는 방법
WO2021040414A1 (ko) * 2019-08-29 2021-03-04 주식회사 유바이오로직스 모노포스포릴 지질 ａ를 생산하는 방법
WO2021122551A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa S. aureus antigens and compositions thereof
CN113652455B (zh) * 2021-08-09 2022-04-26 北京华诺泰生物医药科技有限公司 六酰基3d-mla的发酵方法
CN116554361B (zh) * 2023-07-11 2023-11-03 江苏瑞科生物技术股份有限公司 用于提取脂多糖的抽提液和方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5A (en) * 1836-08-10 Thomas Blanchard Machine for mortising solid wooden shells of ships' tackle-blocks
JPS5758889A (en) * 1980-08-19 1982-04-08 Shell Int Research Preparation of microbiological polysaccharide
US4436728A (en) * 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US5057598A (en) * 1983-05-06 1991-10-15 Centocor, Inc. Monoclonal antibodies reactive with endotoxin core
US4612304A (en) * 1985-06-11 1986-09-16 Ss Pharmaceutical Co., Ltd. Antitumor formulation containing lipopolysaccharide with trehalose derivatives
US5554372A (en) * 1986-09-22 1996-09-10 Emory University Methods and vaccines comprising surface-active copolymers
US4912094B1 (en) * 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5068191A (en) * 1989-08-31 1991-11-26 The Biomembrane Institute Purified histo-blood group a glycosyltransferase and antibodies thereto
US5552141A (en) * 1991-10-30 1996-09-03 Ribi; Hans O. Polymeric immunological adjuvants
CA2138997C (en) 1992-06-25 2003-06-03 Jean-Paul Prieels Vaccine composition containing adjuvants
RU2051969C1 (ru) * 1992-07-31 1996-01-10 Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Способ получения бактериальных липополисахаридов
US5776468A (en) 1993-03-23 1998-07-07 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid A
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5648343A (en) * 1994-02-28 1997-07-15 The University Of Georgia Research Foundation Method for treating LPS-mediated disorders
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5762943A (en) * 1996-05-14 1998-06-09 Ribi Immunochem Research, Inc. Methods of treating type I hypersensitivity using monophosphoryl lipid A
US5985309A (en) * 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) * 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5846789A (en) * 1996-12-10 1998-12-08 Council Of Scientific And Industrial Research Process for preparing nontoxic lipopolysaccharides from acidiphilium species
JP3595966B2 (ja) * 1996-12-25 2004-12-02 カウンシィル オブ サイアンティフィック アンド インダストリアル リサーチ 内毒血症または敗血症の予防に有効な新規の効力のある非毒性リポ多糖体の調製方法
US6491919B2 (en) * 1997-04-01 2002-12-10 Corixa Corporation Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A
CN1326564C (zh) 1997-04-01 2007-07-18 科里克萨有限公司 单磷酰基脂质a的水性免疫佐剂组合物
NZ508013A (en) * 1998-05-07 2003-08-29 Corixa Corp Adjuvant composition for use with an antigen in a vaccine composition
DE10013539B4 (de) * 2000-03-20 2006-07-13 Pharma-Zentrale Gmbh Lipopolysaccharide aus Escherichia coli, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendungen
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)

Also Published As

Publication number Publication date
NZ548595A (en) 2008-04-30
WO2002078637A2 (en) 2002-10-10
US20070212758A1 (en) 2007-09-13
BR122015016711B1 (pt) 2016-08-02
NZ528204A (en) 2006-12-22
JP4233327B2 (ja) 2009-03-04
IL157867A0 (en) 2004-03-28
US9512159B2 (en) 2016-12-06
WO2002078637A9 (en) 2004-01-15
EP2479280A1 (en) 2012-07-25
CZ305601B6 (cs) 2015-12-30
IL157867A (en) 2011-07-31
ES2517391T3 (es) 2014-11-03
JP2012057170A (ja) 2012-03-22
SI1461418T1 (sl) 2013-08-30
RU2006140606A (ru) 2008-05-27
HU228688B1 (en) 2013-05-28
PL402939A1 (pl) 2013-08-19
DK1461418T3 (da) 2013-07-08
EP1461418A2 (en) 2004-09-29
EP1461418A4 (en) 2006-05-17
HK1104319A1 (en) 2008-01-11
HUP0304091A2 (hu) 2004-03-29
EP1461418B1 (en) 2013-04-24
PT2465937E (pt) 2014-11-03
KR20080088666A (ko) 2008-10-02
US20030031684A1 (en) 2003-02-13
CN100577790C (zh) 2010-01-06
AU2002306962B2 (en) 2008-04-24
AU2002306962A2 (en) 2002-10-15
BR0208535A (pt) 2006-02-21
CZ305565B6 (cs) 2015-12-16
CN1928107A (zh) 2007-03-14
BRPI0208535B1 (pt) 2016-03-29
JP2004535477A (ja) 2004-11-25
RU2427378C2 (ru) 2011-08-27
CN1928107B (zh) 2010-12-22
SI2465937T1 (sl) 2014-11-28
US20140243513A1 (en) 2014-08-28
EP2465937B1 (en) 2014-08-13
JP2008255335A (ja) 2008-10-23
CZ20032895A3 (cs) 2004-02-18
PL373657A1 (pl) 2005-09-05
CA2440249A1 (en) 2002-10-10
WO2002078637A3 (en) 2004-07-22
KR100927099B1 (ko) 2009-11-13
EP2465937A1 (en) 2012-06-20
ZA200307238B (en) 2005-08-31
HUP0304091A3 (en) 2011-04-28
BRPI0208535B8 (pt) 2021-05-25
RU2003131677A (ru) 2005-04-20
IL189651A (en) 2011-02-28
RU2302463C2 (ru) 2007-07-10
CA2440249C (en) 2013-07-09
BR122015016711B8 (pt) 2021-07-27
KR20060015704A (ko) 2006-02-20
MXPA03008856A (es) 2003-12-04
KR100884462B1 (ko) 2009-02-20
CN1608127A (zh) 2005-04-20
JP5730178B2 (ja) 2015-06-03
PT1461418E (pt) 2013-07-09
HK1075913A1 (zh) 2005-12-30
ES2415769T3 (es) 2013-07-26
DK2465937T3 (da) 2014-11-10
IL189651A0 (en) 2008-06-05
HK1165494A1 (en) 2012-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9512159B2 (en) Methods for the production of 3-O-deactivated-4′-monophosphoryl lipid A (3D-MLA)
AU2002306962A1 (en) Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid A (3D-MLA)
HK1165494B (en) Methods for the production of 3-o-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3d-mla)
HK1075913B (en) Methods for the production of 3-o-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3d-mla)
HK1104319B (en) Methods for the production of 3-o-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3d-mla)

Legal Events

Date Code Title Description
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 402939

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1