CN116554361B - 用于提取脂多糖的抽提液和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于脂多糖的制备领域，具体涉及一种用于提取脂多糖的抽提液和提取方法，所述提取方法包括以下步骤：（1）对培养得到的革兰氏阴性菌进行干燥；（2）将干燥后的革兰氏阴性菌加入抽提液中在20‑30℃进行提取，收集提取液；（3）浓缩所述提取液并加入预冷的有机溶剂，收集析出的沉淀得到脂多糖；其中所述抽提液由甲醇、氯仿和石油醚组成，甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3‑5)：(1‑2)：(5‑7)。本发明的方法可在常温下进行，操作条件简单，适于大规模生产。

Description

用于提取脂多糖的抽提液和方法
技术领域
本发明涉及脂多糖(LPS)的制备领域。具体地，本发明涉及适于大规模生产的从革兰氏阴性菌提取LPS的抽提液和提取方法。
背景技术
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，是由脂质和多糖构成的物质（糖脂质）。脂多糖的结构复杂，在不同细菌类群、甚至菌株之间都有差异。以沙门氏菌为例，其脂多糖由核心多糖、O-多糖侧链、和类脂A组成。脂多糖中的类脂A部分作为脂质双分子层外层的组成部分进入到脂质层中，糖链部分暴露在细胞外面，以这种形式存在于革兰氏阴性细菌的细胞表面。脂多糖是一种内毒素（Endotoxin），当其作用于人类或动物等其他生物细胞时，就会表现出多种的生物活性。脂多糖的生理作用是通过存在于宿主细胞的细胞膜表面的Toll样受体(TLR)4而体现的。
在培养革兰氏阴性菌后，通过对其进行提取获得脂多糖。其中由明尼苏达沙门氏菌R595菌株（Salmonella minnesota, strain R595）获得的脂多糖。在中等强度的无机酸溶液条件下酸水解可产生单磷酰脂质A（MPL）。经进一步的温和碱水解可获得3-O-脱酰基单磷酰脂质A (3D-MPL)，3D-MPL在疫苗佐剂中有着广泛的应用。
现有技术中提取脂多糖的一种方法是用氯仿和甲醇的混合物(CM)对革兰氏阴性菌进行提取，然后是一系列的甲醇沉淀步骤以去除磷脂。该方法的粗提取产物富含脂多糖和磷脂，其通常需要多个沉淀步骤以获得足够纯度的脂多糖，操作比较复杂且提取率较低，另一种方法中使用包含苯酚的溶剂进行提取，由于苯酚具有毒性，不适合大规模生产。因此，需要开发一种适于大规模生产、操作简便的脂多糖提取方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于提取脂多糖的抽提液和提取方法，可以在低温下进行提取，提取过程简单，适于大规模生产，同时还具有较高的提取率。
为了达到上述目的，一方面，本发明提供一种提取脂多糖的方法，包括以下步骤：
（1）对培养得到的革兰氏阴性菌进行干燥；
（2）将干燥后的革兰氏阴性菌加入抽提液中在20-30℃进行提取，收集提取液；
（3）浓缩所述提取液并加入预冷的有机溶剂，收集析出的沉淀得到脂多糖；
其中所述抽提液由甲醇、氯仿和石油醚组成，甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3-5)：(1-2)：(5-7)。
在一些实施方式中，所述石油醚的沸程为30-60℃。
在一些实施方式中，步骤（2）中的革兰氏阴性菌在提取前被研磨成粉状。
在一些实施方式中，步骤（2）中提取温度为23-27℃。
在一些实施方式中，步骤（2）中对革兰氏阴性菌的提取操作重复2-3次，单次提取时间为2-3小时。
在一些实施方式中，步骤（2）中抽提液体积与干燥细菌细胞重量的比例为5-20ml/g。
在一些实施方式中，步骤（2）中通过离心或过滤来收集提取液。
在一些实施方式中，步骤（2）中的提取在底部具有过滤膜的反应釜中进行，提取后通过加压过滤收集提取液。
在一些实施方式中，所述过滤膜为不锈钢过滤膜，孔径1-2μm，优选为1-1.5μm，厚度为1~2mm，优选为1.5mm。
在一些实施方式中，步骤（2）中的提取在50~120rpm的搅拌下进行，优选为80-100rpm。
在一些实施方式中，步骤（1）中在干燥前还包括利用溶剂清洗革兰氏阴性菌并去除所述溶剂的步骤，优选地，清洗次数为1-3次。
在一些实施方式中，清洗革兰氏阴性菌采用的溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种或多种。
在一些实施方式中，采用错流过滤的方式清洗革兰氏阴性菌。
在一些实施方式中，清洗革兰氏阴性菌在包含管式陶瓷膜的过滤单元中进行。
在一些实施方式中，所述管式陶瓷膜包含多个通道，孔径为0.1~0.5μm，优选为0.2μm。
在一些实施方式中，清洗完成后通过离心或过滤去除所述溶剂。
在一些实施方式中，所述预冷的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，预冷的温度为-30℃至-10℃，优选为-25℃至-15℃。
在一些实施方式中，浓缩所述提取液的方法为旋蒸法。
在一些实施方式中，所述革兰氏阴性菌选自明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota) R595、空肠弯曲菌(Compylobacter jejuni)、大肠杆菌(E. coli) K12菌株CS2429、大肠杆菌(E. coli) D31m4、大肠杆菌(E. coli)菌株F515和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株R45中的一种或多种。
另一方面，本发明还提供一种用于从革兰氏阴性菌提取脂多糖的抽提液，所述抽提液由甲醇、氯仿和石油醚组成，甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3-5)：(1-2)：(5-7)。
在一些实施方式中，所述石油醚的沸程为30-60℃。
又一方面，本发明还提供一种制备脂多糖衍生物的方法，包括以下步骤：
（1）利用前述的方法提取脂多糖；
（2）对所述脂多糖进行酸水解和/或碱水解得到脂多糖衍生物。
在一些实施方式中，对所述脂多糖进行酸水解得到磷酰脂质A（MPL）。
在一些实施方式中，对所述脂多糖先后进行酸水解和碱水解得到3-O-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明所述方法中采用的抽提液包含甲醇和乙醇的至少一种醇、选自氯仿和二氯甲烷的至少一种卤代烃和石油醚，相对于现有技术中甲醇和氯仿组成的抽提液，本发明的提取可在常温下进行，操作条件简单，提取的脂多糖纯度较高，适于用作疫苗佐剂，而且可以用于制备单磷酰脂质A（MPL）或3-O-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)；本发明所述方法对革兰氏阴性菌进行干燥后再利用抽提液提取脂多糖，可以显著提高提取率并降低单位产量所需的抽提液体积降低，从而降低成本；在规模化生产中，在利用切向流过滤系统进行提取时，由于其中包含管式陶瓷膜，系统承受压力受限，过滤周期较长，生产效率低，而本发明所述方法可在底部具有过滤膜的反应釜中进行，提取后可通过加压过滤快速收集提取液，生产效率高。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：
图1为本发明对比例1中提取率随温度变化曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供了从革兰氏阴性菌的细菌细胞提取脂多糖(LPS)的方法，所述方法包括下列步骤：
（1）对培养得到的革兰氏阴性菌进行干燥；
（2）将干燥后的革兰氏阴性菌加入抽提液中在20-30℃进行提取，收集提取液；
（3）浓缩所述提取液并加入预冷的有机溶剂，收集析出的沉淀得到脂多糖。
本发明中的抽提液包含低分子醇、卤代烃和石油醚。
本发明中的低分子醇是指含有1-3个碳原子的醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等。在本发明的实施方式中，优选的低分子醇为甲醇或乙醇，更优选为甲醇。
本发明中的卤代烃是指烃分子中的氢原子被卤素原子取代后的化合物。在本发明的实施方式中，卤代烃优选为氯代烃或溴代烃，更优选为氯代烃。本发明中的卤代烃可以为一卤代烃、二卤代烃和多卤代烃，优选为多卤代烃。本发明中的卤代烃的烃基为1-2碳原子数的饱和烃，在优选的实施方式中，本发明中的卤代烃为二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等，优选为氯仿。
本发明中的石油醚是一种轻质石油产品，是低相对分子质量的烃（主要是戊烷及己烷）的混合物，也可以由具有类似组分的烃混合物来代替。在本发明中，石油醚的沸程为30-60℃。
在本发明优选的实施方式中，所述抽提液包含甲醇、氯仿和石油醚，其体积比为(3-5)：(1-2)：(5-7)，例如优选为3：1：5、3：1：6、3：1：7、4：1：5、4：1：6、4：1：7、5：1：5、5：1：6、5：1：7、3：2：5、3：2：6、3：2：7、4：2：5、4：2：6、4：2：7、5：2：5、5：2：6、5：2：7等。
在本发明的实施方式中，步骤（2）中的革兰氏阴性菌在提取前被研磨成粉状，由此可提高提取率。
在本发明的实施方式中，步骤（2）中提取温度为20-30℃，优选的提取温度可以为23-27℃（即室温），例如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃。收集提取液的方法可以为离心或过滤。
在本发明的实施方式中，抽提液体积与干燥细菌细胞重量的比值为5-20ml : 1g，例如6 ml : 1g、7 ml : 1g、8 ml : 1g、9ml : 1g、10ml : 1g、12ml : 1g、15ml : 1g、18ml :1g等。
在本发明的实施方式中，步骤（2）中单次提取时间为2-3小时，每批次的革兰氏阴性菌可重复提取2-3次。例如，在提取后可通过离心或过滤来收集提取液，然后将离心后的沉淀物或过滤后的滤渣再次加入到抽提液中进行提取，如此进行2次或3次，可以提高脂多糖的提取率。
在本发明的实施方式中，步骤（2）中的提取在50~120rpm的搅拌下进行，优选为80-100rpm。
在本发明的实施方式中，步骤（2）中的提取在底部具有过滤膜的反应釜中进行，提取完成后，通过加压过滤收集提取液。
在本发明的实施方式中，过滤膜为不锈钢滤膜，孔径≤2μm，具体可以为1.75μm、1.5μm、1.25μm或1μm，或上述任意两个相邻数值之间的任意值。在本发明的优选实施例中，所述不锈钢滤膜的孔径为1.25μm，该孔径至少对于本发明而言是最佳的尺寸，孔径过大会导致杂质残留过多、影响过滤的效果，孔径过小会增加制作成本、同时影响过滤的效率和产量。
在本发明的实施方式中，不锈钢过滤膜的厚度为1~2mm，具体可以为1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm或2mm，或其中任意两个相邻数值之间的任意值。在本发明的优选实施例中，所述不锈钢滤膜的厚度为1.5mm，该厚度是具有上述规格的滤膜对于本发明而言的最佳尺寸，厚度过大会降低过滤的速度、影响过滤的效率；厚度过小又会过于轻薄，搅拌物料时容易受涡流的影响而移动，从而导致物料渗漏至出料单元的位置、影响产品的纯度。
在本发明的实施方式中，在干燥革兰氏阴性菌之前，还包含清洗革兰氏阴性菌的步骤，清洗次数可以为1-3次。清洗革兰氏阴性菌采用的溶剂为水和醇类中的一种或多种，所述的水优选为纯水，包括通过蒸馏、去离子、离子交换处理或反渗透获得的水，优选的水是无菌水。所述醇类优选为甲醇或乙醇。所述醇类可以为约75%至约95%(v/v)的醇的水溶液。在提取步骤之前用水洗涤能够降低提取的脂多糖中杂质的量，利用醇类洗涤可以降低与脂多糖共同提取的磷脂的量。
在一些实施方式中，可以首先利用水进行洗涤，然后用甲醇进行洗涤。在一些实施方式中，可以首先利用水进行洗涤，然后用乙醇进行洗涤。一些实施方式中，可以首先利用水进行洗涤，然后用甲醇进行洗涤，最后用乙醇进行洗涤。一些实施方式中，可以首先利用水进行洗涤，然后用乙醇进行洗涤，最后用甲醇进行洗涤。在一些实施方式中，可以首先利用乙醇进行洗涤，然后用甲醇进行洗涤。在一些实施方式中，可以首先利用甲醇进行洗涤，然后用乙醇进行洗涤。在以上所有的洗涤步骤中，洗涤可以为一次、两次或更多次。
本发明的实施方式中，可以采用错流过滤（又称切向流过滤）的方式清洗革兰氏阴性菌。在一些实施方式中，清洗革兰氏阴性菌在包含管式陶瓷膜的过滤单元中进行。在本发明的一个实施方式中，利用装有孔径为0.1~0.5μm（优选为0.2μm）的多通道管式陶瓷膜的过滤单元清洗革兰氏阴性菌，所述多通道管式陶瓷膜优选为19通道或7通道，也可以为其他数量的通道。清洗完成后可以通过离心或过滤去除用于清洗革兰氏阴性菌的溶剂，得到的革兰氏阴性菌可通过晾干或烘干的方式进行干燥，得到干燥的革兰氏阴性菌。
在一些实施方式中，步骤（3）中通过蒸发溶剂来浓缩滤液，优选地，通过减压蒸馏（例如旋蒸法）的方式进行蒸发溶剂。
在一些实施方式中，步骤（3）中预冷的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，有机溶剂的体积为滤液浓缩液的1-5倍，优选为2-4倍。有机溶剂预冷的温度为-30℃至-10℃，优选为-25℃至-15℃，例如-20℃。
在一些实施方式中，步骤（3）中通过离心收集析出的沉淀。离心的转速为2000-20000rpm，优选为5000-15000rpm，例如8000rpm、10000rpm或12000rpm，离心时间为5-25min，优选为10-20min，例如15min。优选地，收集的沉淀可以进一步利用预冷的有机溶剂分散，离心后收集沉淀，如此重复2-3次，以提高脂多糖的纯度。
本发明的方法中使用的细菌细胞可以为沙门氏菌属(Salmonella)或埃希杆菌属(Escherichia)的细菌细胞。其中，沙门氏菌属(Salmonella)可以为明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)种，特别是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595菌株。可选的细菌细胞还可以为空肠弯曲菌(Compylobacter jejuni)、大肠杆菌(E. coli)K12菌株CS2429、大肠杆菌(E. coli) D31m4、大肠杆菌(E. coli)菌株F515和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株R45。
本发明还提供了制备脂多糖衍生物的方法，包括利用本发明的方法从革兰氏阴性菌的细菌细胞提取脂多糖(LPS)，对脂多糖进行酸水解和/或碱水解得到脂多糖衍生物。
在一个实施方式中，将脂多糖(LPS)在0.1M HCl中回流大约30分钟，导致在1位脱磷酸(dephosphorylation)以及在6’位脱糖(decarbohydration)，产生单磷酰脂质A（MPL）。在一个实施方式中，通过MPL的温和碱水解获得了3-O-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)，3D-MPL具有进一步降低的毒性。
实施例1、菌体清洗
水洗：
取R595菌发酵后收集的菌体约1kg，加入约4L纯化水重悬，利用分散器重悬混匀，用中空纤维膜组件清洗菌体，加约40L纯化水，直至透过液透明无色无泡沫。在菌体清洗过程中，出液口流速会越来越快，需要保持出液口与进液口流速相当，以控制菌液浓度，粘度维持在恒定水平。
将上述清洗后的菌体液以4000rpm离心40min，收集纯化水清洗后的菌体。
乙醇清洗：
将上述收集到的纯化水清洗后菌体，加入约2L的95%医用酒精重悬，用均质机分散混匀后，在60℃水浴锅内搅拌1小时，以8000rpm离心20min收集菌体，按照上述操作重复一次。
将离心收集到的菌体在通风橱内晾干过夜，碾碎，在烘箱中烘干，研磨成菌干粉，颜色呈淡土黄色，之后密封-20℃以下保存。
实施例2、LPS提取
用天平准确称取50g实施例1中的菌干粉于锥形瓶中，加入配制的CMP（氯仿：甲醇：石油醚=4:1:6）抽提液350ml，置于磁力搅拌器上在25℃搅拌5h，布氏漏斗PTFE膜过滤，获得滤液300ml。
将滤渣再次提取，加入相同体积的CMP抽提液350ml，重复提取2次，磁力搅拌器上室温搅拌5h后用布氏漏斗PTFE膜过滤。
将上述得到的三次滤液合并，共800ml，42℃旋蒸至无冷凝回流。收集剩余的旋蒸液，并用CM（氯仿：甲醇=4:1）溶液溶解蒸馏瓶内壁的附着物，合并后约60ml，加入两倍体积的冷甲醇120ml，析出沉淀，转移至40ml特氟龙离心管中，以10000rpm离心15min，收集沉淀，重复该步骤两次。沉淀室温充分通风干燥得到脂多糖。
在提取过程中，间隔1小时取样，以提取的LPS重量与干燥细菌细胞重量的比值来计算样品的提取率。
结果表明，利用CMP提取时，首次提取2小时后，提取率即达到1.66%，此后即使延长提取时间，但提取率增长缓慢，因此，CMP常温下提取时，优选的提取时间为2-3小时。
将滤渣提取第二次时，2小时后，提取率为0.9%，提取第3次时，提取率降低到0.62%，此后再次提取发现提取率明显降低，可见，利用CMP提取时，通过提取2-3次，可达到较高的总提取率。
在该实施例中，发明人还研究了利用湿菌（即细菌细胞未经干燥）进行提取时，提取率相对于干菌提取的变化情况。发明人意外地发现，利用湿菌提取时，提取率相对于干菌提取要低20%-30%左右，这可能是由于在干燥后，细菌外膜中的脂多糖更容易溶于抽提液中，因而提取率提高，单位产量的脂多糖所需的抽提液体积降低，从而降低成本。另外，发明人还发现，利用将干燥细菌细胞研磨后得到的菌干粉进行提取时，提取率相对于干菌（即仅干燥，未研磨）可进一步提高约8-12%。
实施例3、不同组成的抽提液对提取率的影响
参照实施例2的方法，利用由不同体积比的氯仿：甲醇：石油醚组成的抽提液进行提取，测量提取率，结果如表1所示。
表1
组别 氯仿：甲醇：石油醚体积比 提取率（%）
1 3:1:7 1.23
2 5:2:5 1.15
3 4:2:6 2.03
4 3:2:5 1.59
5 4:2:7 1.62
6 3:2:6 1.36
7 4:1:7 2.37
8 5:2:6 1.33
9 4:2:5 1.75
10 3:2:7 1.41
可见，利用由上述不同体积比的氯仿：甲醇：石油醚组成的抽提液进行提取时，在常温下均可以获得较高的提取率。
另外，发明人还研究了分别利用由二氯甲烷、甲醇：石油醚组成的抽提液、由氯仿、乙醇：石油醚组成的抽提液以及由二氯甲烷、乙醇：石油醚组成的抽提液提取脂多糖时提取率的变化情况。结果表明，在采用上述3种抽提液时，在常温下均可提取脂多糖，但提取率相对于由氯仿、甲醇：石油醚组成的抽提液有所降低。
实施例4、单次提取抽提液使用量的考察
该实施例研究了抽提液使用量对提取率的影响。各组中干燥细菌细胞重量与抽提液体积的比例如表2所示。
表2
组别 固液比（g：ml） 菌体重量（g） 抽提液体积（ml） 提取率（%）
1 1：5 30 150 1.5
2 1：10 30 300 2.85
3 1：20 30 600 4.06
4 1：30 30 900 4.10
5 1：50 30 1500 4.56
6 1：70 30 2100 4.69
7 1：100 30 3000 4.78
从表中可以看出，当提高抽提液的用量时，提取率可显著提高；当抽提液用量进一步提高、固液比继续减小至低于1:20时，提取率随抽提液用量的增加而提高的幅度开始明显放缓。如果继续增加抽提液的用量，不仅不能使提取率得到显著提升，还会大大提高生产成本。因此，综合提取率和生产成本等因素来考虑，抽提液体积与干燥细菌细胞重量的比例以5-20 ml/g为宜。
实施例5、中试规模的LPS提取
取R595菌发酵后收集的菌体约15kg，加入装有孔径为0.2μm的多通道管式陶瓷膜的过滤单元中，在过滤单元中利用约40L甲醇清洗菌体，将系统压力控制在0.5MPa，当固液比达到0.6时清洗完成，得到菌体悬浮液。
将菌体悬浮液以8000rpm离心20min，收集菌体。将收集到的菌体晾干，碾碎，烘干后研磨成菌干粉，颜色呈淡土黄色，之后密封-20℃以下保存。
将4kg菌干粉置于底部设置有不锈钢过滤膜（孔径为1.25μm，厚度为1~2mm）的反应釜中，加入配制的CMP（氯仿：甲醇：石油醚=4:1:6）抽提液30L，在25℃，100rpm搅拌2h，加压过滤10min得到提取液，滤渣被截留在不锈钢过滤膜上，再次加入相同的CMP抽提液30L，在25℃搅拌2h，加压过滤得到提取液。
将得到的提取液引入旋转蒸发仪，42℃旋蒸至无冷凝回流，用1L CM（氯仿：甲醇=4:1）溶液溶解旋转蒸发仪内壁的附着物，加入冷甲醇2L，析出沉淀，在离心机中以10000rpm离心15min，收集沉淀。沉淀室温充分通风干燥得到脂多糖。
对比例1
用天平准确称取50g实施例1中的菌干粉于锥形瓶中，加入配制的CM（氯仿：甲醇=4:1）抽提液350ml，置于磁力搅拌器上25-60℃搅拌10h，布氏漏斗PTFE膜过滤，获得滤液300ml。
将滤渣再次提取，加入相同体积的CM抽提液350ml，重复提取2次，磁力搅拌器上室温搅拌10h后用布氏漏斗PTFE膜过滤。
将上述得到的三次滤液合并，共800ml，42℃旋蒸至无冷凝回流。收集剩余的旋蒸液，并用CM（氯仿：甲醇=4:1）溶液溶解蒸馏瓶内壁的附着物，合并后约60ml，加入两倍体积的冷甲醇120ml，析出沉淀，转移至40ml特氟龙离心管中，10000rpm，离心15min，收集沉淀，重复该步骤两次。沉淀室温充分通风干燥得到脂多糖。
在提取过程中，间隔1小时取样，以提取的LPS重量与干燥细菌细胞重量的比值来计算样品的提取率。
如图1所示，利用CM提取时，提取温度低于35℃时，2小时后测得的提取率均低于1%，当温度达到40℃时，提取率接近2%，当温度达到50℃时，提取率逐渐达到较高的水平，当温度55℃时，抽提液达到沸点，不宜继续升高温度。因此，利用CM提取时，优选的提取温度为50℃左右。
在提取时间方面，随提取时间延长，LPS提取率也呈现一定的增高，但2小时以后增高幅度并不明显，因此，利用CM提取时，优选的提取时间为2-4h左右。
对比例2
用天平准确称取50g实施例1中的菌干粉于锥形瓶中，加入配制的CM（氯仿：甲醇=4:1）抽提液350ml，置于索氏提取器，在65-75℃下回流5小时，布氏漏斗PTFE膜过滤，获得滤液300ml。
将滤渣再次提取，加入相同体积的CM抽提液350ml，利用索氏提取器按照相同的条件重复提取2次，用布氏漏斗PTFE膜过滤。
将上述得到的三次滤液合并，共800ml，42℃旋蒸至无冷凝回流。收集剩余的旋蒸液，并用CM（氯仿：甲醇=4:1）溶液溶解蒸馏瓶内壁的附着物，合并后约60ml，加入两倍体积的冷甲醇120ml，析出沉淀，转移至40ml特氟龙离心管中，10000rpm，离心15min，收集沉淀，重复该步骤两次。沉淀室温充分通风干燥得到脂多糖。
在提取过程中，间隔1小时取样，以提取的LPS重量与干燥细菌细胞重量的比值来计算样品的提取率。
结果表明，尽管该对比例中的抽提液与对比例1相同，但提取率仅为1.6%，明显低于对比例1，这可能是由于在索氏提取器中无法充分搅拌所致，该方法也不适于大规模生产。
对比例3
用天平准确称取50g实施例1中的菌干粉于锥形瓶中，加入配制的CMH（氯仿：甲醇：水=78:22:1）抽提液350ml，置于磁力搅拌器上50℃搅拌10h，布氏漏斗PTFE膜过滤，获得滤液300ml。
将滤渣再次提取，加入相同体积的CMH抽提液350ml，重复提取2次，置于磁力搅拌器上50℃搅拌10h，用布氏漏斗PTFE膜过滤。
将上述得到的三次滤液合并，共800ml，42℃旋蒸至无冷凝回流。收集剩余的旋蒸液，并用CM（氯仿：甲醇=4:1）溶液溶解蒸馏瓶内壁的附着物，合并后约60ml，加入两倍体积的冷甲醇120ml，析出沉淀，转移至40ml特氟龙离心管中，10000rpm，离心15min，收集沉淀，重复该步骤两次。沉淀室温充分通风干燥得到脂多糖。
在提取过程中，间隔1小时取样，以提取的LPS重量与干燥细菌细胞重量的比值来计算样品的提取率。
结果表明，在抽提液中加入少量水提取，提取率与对比例1相当。
由以上实施例和对比例可以看出，采用本发明的CMP抽提液提取脂多糖时，在常温下即可达到较高的提取率，相对于在高温下利用CM抽提液的提取方法，操作的便利性明显提高，通过重复提取2-3次即可达到较高的总提取率，非常适于大规模生产，并且可以大幅降低生产成本。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种提取脂多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对培养得到的革兰氏阴性菌进行干燥；
（2）将干燥后的革兰氏阴性菌加入抽提液中在20-30℃进行提取，收集提取液；
（3）浓缩所述提取液并加入预冷的有机溶剂，收集析出的沉淀得到脂多糖；
其中所述抽提液由甲醇、氯仿和石油醚组成，甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3-5)：(1-2)：(5-7)，所述石油醚的沸程为30-60℃；
步骤（2）中抽提液体积与干燥细菌细胞重量的比例为5-20ml/g。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的革兰氏阴性菌在提取前被研磨成粉状。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中提取温度为23-27℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中提取在50~120rpm的搅拌下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中对革兰氏阴性菌的提取操作重复2-3次，单次提取时间为2-3小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中通过离心或过滤收集提取液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的提取在底部具有过滤膜的反应釜中进行，提取后通过加压过滤收集提取液。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述过滤膜为不锈钢过滤膜，孔径1-2μm，厚度为1~2mm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中在干燥前还包括利用溶剂清洗革兰氏阴性菌并去除所述溶剂的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述溶剂为水、甲醇和乙醇中的一种或多种。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用错流过滤的方式清洗革兰氏阴性菌。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，清洗革兰氏阴性菌在包含管式陶瓷膜的过滤单元中进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述管式陶瓷膜包含多个通道，孔径为0.1~0.5μm。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，清洗完成后通过离心或过滤去除所述溶剂。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预冷的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，预冷的温度为-30℃至-10℃。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌选自明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota) R595、空肠弯曲菌(Compylobacter jejuni)、大肠杆菌(E.coli) K12菌株CS2429、大肠杆菌(E. coli) D31m4、大肠杆菌(E. coli)菌株F515和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株R45中的一种或多种。
17.一种制备脂多糖衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用权利要求1-16中任一项所述的方法提取脂多糖；
（2）对所述脂多糖进行酸水解和/或碱水解得到脂多糖衍生物。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，对所述脂多糖进行酸水解得到磷酰脂质A（MPL），或者对所述脂多糖先后进行酸水解和碱水解得到3-O-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。
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