CN116585747B - 一种脂多糖提取装置及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脂多糖提取装置，属于生物医药工程领域，包括洗菌系统、干燥系统和提取系统三大部分，使用时先通过洗菌系统对革兰氏阴性菌培养物进行清洗，去除其中的磷脂等杂质，之后直接将清洗过的菌液转移至干燥系统去除溶剂并干燥、制成菌干粉，再转移至提取系统进行提取，相比于直接在原反应体系中进行提取，可以显著提高提取率、同时大大节约洗菌溶剂和抽提液的用量，降低生产成本。提取过程将陶瓷膜换为不锈钢滤膜，能有效提高系统的承压能力，可缩短过滤周期、提高生产效率，既可以用于高温高压条件提取，也可以用于常温常压条件提取，有效降低了硬件损耗和安全风险，对于实验室的小规模提取和中试规模甚至更大规模的生产操作均能适用。

Description

一种脂多糖提取装置及提取方法

技术领域

本申请属于生物医药工程领域，特别涉及一种适用于中大规模的脂多糖提取装置及提取方法。

背景技术

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，是由脂质和多糖构成的物质（糖脂质）。脂多糖的结构复杂，在不同细菌类群、甚至菌株之间都有差异。以沙门氏菌为例，其脂多糖由核心多糖、O-多糖侧链、和类脂A组成。脂多糖中的类脂A部分作为脂质双分子层外层的组成部分进入到脂质层中，糖链部分暴露在细胞外面，以这种形式存在于革兰氏阴性菌的细胞表面。脂多糖是一种内毒素（Endotoxin），当其作用于人类或动物等其他生物细胞时，就会表现出多种的生物活性。脂多糖的生理作用是通过存在于宿主细胞的细胞膜表面的Toll样受体(TLR)4而体现的。

培养革兰氏阴性菌后，可以对其进行提取以获得脂多糖。其中由明尼苏达沙门氏菌R595菌株（Salmonella minnesota, strain R595）获得的脂多糖，在中等强度的无机酸溶液条件下酸水解可产生单磷酰脂质A（MPL）。经进一步的温和碱水解可获得3-O-脱酰基单磷酰脂质A (3D-MPL)，3D-MPL在疫苗佐剂中有着广泛的应用。

现有的脂多糖提取方法中，多数方法是采用氯仿和甲醇的混合物（CM）在高温下（一般为50℃以上）对革兰氏阴性菌进行提取，由于产物中含有大量磷脂，还需要一系列的甲醇沉淀步骤以去除磷脂，需要消耗大量溶剂，操作比较复杂且提取率较低；同时，氯仿有毒且沸点较低，常温下就很容易挥发，在加热的情况下更会加速挥发甚至沸腾，一旦渗漏会对操作人员和环境产生毒害作用，同时还会影响产品的得率，因此需要高压条件的辅助，而过滤提取液通用的陶瓷滤膜脆性较大、弹性较小，又往往难以承受较高的压力，容易造成损耗、增加提取成本。另一些方法中使用包含苯酚的溶剂进行提取，由于苯酚具有毒性，也不适合大规模生产。因此，需要开发一种适于大规模生产、操作简便安全的脂多糖提取方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种脂多糖提取装置及提取方法，特别适用于中试规模和更大规模的提取。

本发明的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种脂多糖提取装置，包括洗菌系统、干燥系统和提取系统，所述洗菌系统包括相互连接的储液单元、循环单元以及设在所述循环单元内的第一过滤单元，所述储液单元用于存储待处理的革兰氏阴性菌培养液和洗菌溶剂、并将经过所述过滤单元过滤浓缩的菌液回收，所述循环单元用于将所述培养液和所述洗菌溶剂的混合体系输送至所述第一过滤单元进行过滤和浓缩，并使浓缩后的菌液回流至所述储液单元中、同时将渗滤液排出；

所述干燥系统用于对所述菌液除去溶剂、干燥并粉碎，得到菌干粉；

所述提取系统包括反应釜以及与所述反应釜连接设置的进料单元、搅拌单元、第二过滤单元和出料单元，所述第二过滤单元包括不锈钢滤膜和加压单元，所述不锈钢滤膜设在所述反应釜内与所述出料单元的连接处，所述不锈钢滤膜的孔径≤2μm、厚度为1~2mm；所述进料单元用于向所述反应釜内输送菌干粉和抽提液；所述搅拌单元用于对所述反应釜内的反应体系进行50~120rpm的搅拌、在20~30℃下进行提取；所述第二过滤单元用于在反应结束后对所述反应体系施加和维持压力，使所述反应体系在一个大气压的条件下通过所述不锈钢滤膜进行过滤；所述出料单元用于将滤液转移出来进行收集。

本发明中，第一过滤单元采用陶瓷滤膜（优选为0.2μm孔径），可以对菌体和溶有磷脂、培养基等杂质的洗菌溶液进行有效分离；循环单元在储液单元和第一过滤单元之间构建一个循环通道，使储液单元内的混合体系能反复进入第一过滤单元内进行过滤和浓缩。干燥系统可以含有离心机或负压抽滤装置（例如布氏漏斗）、用于去除溶剂，还可以含有烘箱、用于将剩余的菌体烘干（也可以采用自然风干的方式，此时可以不含有烘箱）。提取系统中，采用不锈钢滤膜替换传统的陶瓷滤膜，可以承受较高的压力，在加压的情况下也可以正常使用。现有的适用于此类工艺条件的不锈钢滤膜受工艺和使用场景的影响，孔径均较大、一般不小于5μm，而申请人将不锈钢滤膜改进成特定的厚度和小孔径后，发现无论是过滤效果还是抗压性能都完全可以适应脂多糖提取的需要（或者说，至少是完全可以适应本发明的提取方法的需要）。该装置可以在常温常压下进行提取，从而降低加温和加压的成本，同时减少硬件（主要是滤膜）的损耗和有机溶剂挥发的风险，降低目标产物的流失；也可以适应传统的高温高压提取条件，在使用传统方法降低有毒物质挥发扩散风险的同时，同样可以降低滤膜的损耗。通过将物料在多个系统之间转移、分别进行各步操作，相比于传统的在一个反应体系内进行完整的操作，可以显著提高提取率、同时大大节约洗菌溶剂和抽提液的用量，从而降低生产成本。

进一步地，所述循环单元包括循环泵和连接所述循环泵与所述储液单元的循环管路，所述第一过滤单元设在所述循环管路内。优选地，循环管路中设有两组或多组过滤单元。

一种优选的实施方式是，为便于生产和安装，循环管路可分多段、按照蛇形排列连接，具体包括连接储液单元出液口与所述循环泵的入口管、连接所述储液单元进液口的出口管、以及入口管和出口管之间的过滤管（可以为1根、2根、3根或更多），每段过滤管内设置一组过滤单元（即一根管式陶瓷膜）；循环泵相应地使用陶瓷专用泵；每根过滤管123上方还连接有一根废液管，用于将渗漏出的洗菌溶剂从循环管路中排出（有机溶剂可以用专门的废液桶收集，后续清洗管道时的废液按照具体成分分别处理，可以用废液桶收集，确认无毒的水性溶液也可以直接排入下水道）。

为方便观察流量情况和过滤产物的固液比，可以在储液单元和出口管上设置流量计（优选为便于观察的玻璃管流量计、或金属管浮子流量计），还可以在两根过滤管之间设置流量计，以便对过滤过程中的流量进行实时监测。

具体实施时，储液单元可以采用不锈钢反应罐，具体可以采用单层反应罐或夹套式反应罐（如采用单层反应罐，还可以另外增设恒温反应槽，例如恒温加热—冷却循环槽，以此来保持洗菌过程中反应体系温度稳定）。

一种优选的实施方式中，所述不锈钢滤膜的孔径为1.25μm。

该孔径至少对于本发明而言是最佳的尺寸，孔径过大会导致杂质残留过多、影响过滤的效果，孔径过小会增加制作成本、同时影响过滤的效率和产量。

一种优选的实施方式中，所述滤膜层的厚度为1.5mm。

该厚度是具有上述规格的滤膜对于本发明而言的最佳尺寸，厚度过大会降低过滤的速度、影响过滤的效率；厚度过小又会过于轻薄，搅拌物料时容易受涡流的影响而移动，从而导致物料渗漏至出料单元的位置、影响产品的纯度。

进一步地，所述加压单元包括进气口，所述进气口通过进气管路与外部供气装置（高压气瓶）连接，用于向所述反应釜内通气以提供一个大气压的压力、使所述反应体系通过所述不锈钢滤膜进行过滤。

本发明中采用的是气体升压的方式，即向反应釜内充入气体（优选为惰性气体，为了节约成本，也可以选择压缩空气或氮气）以提高压力。

进一步地，所述反应釜包括依次连接的盖体、罐体和底座，所述搅拌单元包括驱动电机和搅拌器，所述搅拌器一端连接在所述盖体上、另一端伸入所述罐体内。优选地，为了避免摩擦和防止撞击，罐体顶部边缘和底座顶部边缘均可设置柔性的垫片，该垫片优选为环形。为方便组装和固定，盖体与罐体之间、罐体与底座之间均通过常规的连接机构进行连接，例如卡箍、法兰等，可以同时设置多组连接机构。

进一步地，所述搅拌器包括位于所述罐体内不同高度或不同平面且彼此分离的至少两组搅拌头。

进一步地，所述搅拌器包括搅拌杆以及设在所述搅拌杆上不同高度的第一搅拌头和第二搅拌头。

一种优选的实施方式中，所述第一搅拌头设在所述搅拌杆端部，所述第二搅拌头设在所述第一搅拌头上方，且所述第二搅拌头的直径小于所述第一搅拌头。

搅拌时，流体绕轴作旋转运动，当流速达到一定高度时，液体表面会形成漩涡，导致流体从桨叶周围周向卷至桨叶区的流量减少、混合效果严重降低。因此，本发明设置了两个不同高度的搅拌头，可以对液体进行分级搅拌，从而可有效避免漩涡的产生。两个搅拌头可以沿同一轴旋转、也可以沿不同轴旋转，当不同轴时，还可以产生偏心搅拌的效果，能提高液体物料的湍流程度，对避免漩涡产生也能起到重要作用。

具体实施中，从制作成本和使用成本（只用一台电机驱动）的角度考虑，选择了两个搅拌头同轴的方式。第一搅拌头选择直径较大的形式（优选为结构简单、占用体积较小的两片式桨叶搅拌头），可以充分搅动反应釜中的液体物料、同时不会过多占用罐内容积；第二搅拌头则尽量缩小（优选为三叶推进式）、直径小于第一搅拌头，可以更集中在涡流产生的位置，进一步提高了抑制漩涡的效果。此外，还可以将第一搅拌头设在靠近罐体底部的位置，增加搅拌深度，也可以在一定程度上避免旋涡的产生。

进一步地，所述罐体内远离内壁处设有温度传感器，所述温度传感器在高度上位于所述第一搅拌头与所述第二搅拌头之间。

一种优选的实施方式中，所述盖体下方远离中心处还设有延长结构，所述温度传感器设在所述延长结构底部。

温度传感器可用于监控物料的实时温度，当物料在搅拌过程中温度逐渐升高时，即提示可以采取调整反应参数等方式进行控制，防止有机溶剂挥发扩散、甚至沸腾。传统的此类设备都是将温度传感器安装在内壁上，因为不处于物料的中心、又受到容器内壁的影响，测得的温度往往存在误差；本发明中将温度传感器设在罐体内部，可以使温度传感器与物料充分接触、测量更加稳定。温度传感器可以固定在搅拌杆上，也可以另外设置一个固定装置（例如在盖体或罐体内壁上设置一个延长臂）来安装。在本发明中，申请人在盖体底部增设一个延长结构（可以是杆状、柱状、板状、环状、钩状或任何具有一定长度、能够插入物料中的形状），能够深入物料中；同时，该延长结构的端部应位于第一搅拌头与第二搅拌头之间，从而避免影响搅拌、并能真正测得物料中心位置的实时温度。

进一步地，所述进料单元包括设在所述盖体上的进料口，所述出料单元包括设在所述底座上的出料口、以及独立设置的储液罐，所述出料口与所述储液罐顶部的进液口通过管路连接，所述储液罐底部还设有出液口。

一种优选的实施方式中，所述进液口设在所述储液罐的底部。

另一种优选的实施方式中，所述进液口设在所述储液罐的顶部、并深入所述储液罐的底部。

现有的此类市售反应釜都带有配套的储液罐，并且由于生产工艺和使用惯性的原因，进液口均是设在储液罐顶部的。滤液从反应釜底部放出后、通过管路直接输送到顶部的进液口，此时由于高度差的关系，反应釜底和管路内往往会有料液存留，从而造成产物损失，同时也会对滤网和管路造成堵塞。虽然理论上可以通过调整摆放高度来消除高度差，但在实际使用中需要在通风橱或其他通风良好的实验环境中进行操作，操作空间有限，难以随意调整。申请人对此做出了两种改进，一是将进液口转移到储液罐的底部、直接将高度差消除；二是进液口位置不变、但长度延长至接近储液罐的底部，通过改变液体排出的高度来间接消除高度差，从而克服这一问题。

进一步地，所述罐体底部设有滤膜支撑板，所述不锈钢滤膜设在所述滤膜支撑板上方；所述滤膜支撑板上设有网孔，且所述网孔的孔径大于所述不锈钢滤膜的孔径。

滤膜支撑板可以作为骨架结构，全程对不锈钢滤膜起到支撑作用；为了便于让滤液通过、同时降低制作成本，滤膜支撑板可以具有比不锈钢滤膜更大的孔径，例如4mm、6mm、8mm或更大，这样滤液通过滤膜层后可以更顺利地通过骨架层、从出料单元排出，可以提高过滤速度。

一种优选的实施方式中，所述滤膜支撑板高度低于所述罐体底部边缘的高度、并与所述罐体底部边缘形成一个嵌槽，所述不锈钢滤膜设在所述嵌槽内、边缘通过柔性的垫圈（优选为聚四氟乙烯材质）与所述嵌槽边缘贴合，防止不锈钢滤膜与嵌槽发生摩擦或碰撞而造成损坏。

进一步地，所述罐体底部与所述底座顶部之间设有相互配合的定位结构。

进一步地，所述定位结构为形状和尺寸相互适配的凸起与凹槽，所述凸起优选为球形或半球形。

一种优选的实施方式中，所述定位结构设在所述罐体底面与所述底座顶面上。

另一种优选地实施方式中，所述定位结构设在所述罐体与所述底座的外壁上。

实际使用中，将罐体与底座扣合时，需要罐体将垫圈完全压紧，否则会留有缝隙、容易导致漏液，而由于垫圈边缘较细且质量较轻，被碰到后很容易从凹槽中翻起甚至脱离，而现有的此类设备中对于垫圈是否被完全压紧并没有明确的标志，必须多次观察、摸索、试探方能成功。鉴于此，申请人提出了改进方式，即在罐体底面与底座顶面（即二者的接触面）上设置相互适配的凸起和凹槽，利用凸起和凹槽的相互配合来确定底座完全扣合；为了方便凸起的试探和移动，将其设置为球形或半球形。例如，在罐体底面设置几个球状凸起（优选为3个）（类似于定位销的作用）、在底座顶面对应设置几个凹槽，或将凸起和凹槽调换位置。凸起与凹槽还可以设置在罐体与底座的外壁上，类似于法兰的结构，也可以起到定位和固定的作用。

进一步地，所述盖体上还设有与所述罐体连通的冷凝器。

虽然在提取过程中始终采用的是常温的条件，但液体物料经过一定的时间搅拌，本身的温度也会提高。因此，为避免有机溶剂挥发扩散到环境中，可以在反应釜上增加一个冷凝装置，即，增加一个冷凝管，有机溶剂扩散至冷凝管中后即发生冷凝、回流至反应釜中继续反应。

本发明另一方面提供了一种应用上述脂多糖提取装置进行脂多糖提取的方法，包括如下步骤：

S1：用所述洗菌系统对培养得到的革兰氏阴性菌进行清洗、过滤和浓缩；

S2：用所述干燥系统对经过清洗和过滤的菌液去除溶剂、干燥并粉碎，得到菌干粉；

S3：用所述提取系统进行脂多糖提取，将所述菌干粉与抽提液通过所述进料单元加入所述反应釜中，用所述搅拌单元对物料以50~120rpm的转速进行搅拌，在20~30℃下进行提取；所述抽提液包含至少一种醇、至少一种卤代烃以及石油醚，所述醇为甲醇和乙醇中的至少一种，所述卤代烃为氯仿和二氯甲烷中的至少一种；

S4：反应结束后，用所述第二过滤单元对反应体系施加和维持压力、使所述反应体系在一个大气压的条件下通过所述不锈钢滤膜进行过滤，并通过所述出料单元将过滤后的提取液转移并收集起来；

S5：将所述提取液浓缩后加入预冷的有机溶剂，收集析出的沉淀，即得到脂多糖。

一种优选的实施方式中，所述干燥的革兰氏阴性菌被研磨成粉末状。

经证实，干燥粉末的提取效率相比菌液或湿菌显著提高，适合快速、较大规模的提取操作。

进一步地，所述抽提液包含甲醇、氯仿以及石油醚，所述石油醚的沸程为30~60℃。

一种优选的实施方式中，所述抽提液中甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3~5):(1~2):(5~7)。

一种优选的实施方式中，S3中的提取温度为23~27℃。采用本发明提供的设备和方法，仅凭室温条件就可以完成提取，可大大降低提取中的能耗以及安全风险。

一种优选的实施方式中，S3的提取过程重复2~3次，单次提取时间为2~3小时。每一批次的革兰氏阴性菌提取物经过数次重复提取后，相较于只提取一次，残留的脂多糖能得到充分提取，可以显著提升提取率。

一种优选的实施方式中，S3中抽提液与菌干粉重量的比例为5~20ml/g。

进一步地，S1的具体方法如下：

将革兰氏阴性菌培养物添加到所述储液单元中，向其中添加清洗溶剂，利用所述循环单元将混合体系循环输送至所述过滤单元进行过滤和浓缩，将滤液收集到所述储液单元中并转移。

一种优选的实施方式中，所述清洗溶剂为水、醇类或醇类的水溶液，例如甲醇或乙醇。

进一步地，清洗完成后，去除所述清洗溶剂的方法为离心或过滤。

一种优选的实施方式中，所述预冷的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，预冷的温度为-30~-10℃、优选为-25~-15℃。

进一步地，所述革兰氏阴性菌选自明尼苏达沙门氏菌R595、空肠弯曲菌、大肠杆菌K12菌株CS2429、大肠杆菌D31m4、大肠杆菌F515以及奇异变形杆菌R45中的一种或多种。

本发明第三方面提供了一种应用于上述装置或上述方法的革兰氏阴性菌脂多糖抽提液，其包含至少一种醇、至少一种卤代烃以及石油醚，所述醇为甲醇和乙醇中的至少一种，所述卤代烃为氯仿和二氯甲烷中的至少一种。

进一步地，所述醇为甲醇，所述卤代烃为氯仿，所述石油醚的沸程为30~60℃。

一种优选的实施方式中，所述抽提液中甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3~5):(1~2):(5~7)。

本发明第四方面提供一种制备脂多糖衍生物的方法，包括以下步骤：

S1：利用前述的方法提取脂多糖；

S2：对所述脂多糖进行酸水解和/或碱水解得到脂多糖衍生物。

在一些实施方式中，S2的具体方法为，对所述脂多糖进行酸水解得到磷酰脂质A（MPL），或者对所述脂多糖先后进行酸水解和碱水解得到3-O-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种脂多糖提取装置，包括洗菌系统、干燥系统和提取系统三大部分，使用时先通过洗菌系统对革兰氏阴性菌培养物进行清洗，去除其中的磷脂等杂质，之后直接将清洗过的菌液转移出来，通过干燥系统去除溶剂（采用离心或过滤的方式）并干燥（烘干或晾干）、制成菌干粉，再转移至提取系统进行提取，相比于直接在原反应体系中进行提取，可以显著提高提取率、同时大大节约洗菌溶剂和抽提液的用量，从而降低生产成本。提取过程将陶瓷膜换为不锈钢滤膜，能有效提高系统的承压能力，从而可缩短过滤周期、提高生产效率。该设备既可以用于高温高压条件提取，也可以用于常温常压条件提取，有效降低了硬件损耗和安全风险，不仅能在实验室的小规模提取中使用，更适用于中试规模甚至更大规模的生产操作。

附图说明

图1为本发明提供的脂多糖提取装置的结构简图；

图2为实施例1提供的脂多糖提取装置中洗菌系统的结构示意图；

图3为实施例1提供的脂多糖提取装置中提取系统的结构示意图；

图4（a）为图3中搅拌器的正视图；

图4（b）为图3中搅拌器的俯视图；

图5（a）为图3中底座的俯视图；

图5（b）为图3中底座的纵向剖视图；

图6为实施例2中出料单元的连接方式示意图；

图7为实施例3中出料单元的连接方式示意图；

图8（a）为实施例4中底座的俯视图；

图8（b）为实施例4中罐体的仰视图；

图8（c）为实施例4中定位结构的纵向剖视图；

图9（a）为实施例5中底座的俯视图；

图9（b）为实施例5中罐体的仰视图。

其中：1. 洗菌系统；11. 储液单元；111. 第一流量计；12. 循环单元；121. 循环泵；122. 入口管；123. 过滤管；124. 出口管；125. 废液管；126. 第二流量计；127. 恒温反应器；13. 第一过滤单元；2. 干燥系统；3. 提取系统；31. 反应釜；311. 盖体；312. 罐体；313. 底座；314. 凸起；315. 凹槽；316连接片；32. 进料单元；33. 搅拌单元；331. 驱动电机；332. 搅拌杆；333. 第一搅拌头；334. 第二搅拌头；335. 温度传感器；336. 延长结构；34. 第二过滤单元；341. 不锈钢滤膜；342. 进气口；343. 滤膜支撑板；344. 嵌槽；345. 垫圈；35. 出料单元；351. 出料口；352. 储液罐；353. 进液口；36. 冷凝器。

实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

术语定义

本发明中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。

本发明中，术语“左右”通常是指在指定数值以上或以下0.5%-10%的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。

本发明中，如未进行具体说明，则有机试剂的浓度均为体积浓度。

本发明中所述的“固定”/“连接”/“安装”等，如未进行具体说明，可以为固定连接（如铆接、销连接、键连接、螺纹连接）、活动连接（如固定支点连接、滑动连接、轴承连接、齿轮连接）或柔性连接（如弹簧连接、万向轴连接、链条连接）等；如需要完全固定、不可移动的形式，也可以直接采用焊接或一体成型的形式。

本发明中，所述的“陶瓷膜”又称无机陶瓷膜，是已无机陶瓷材料经特殊工艺制备而成的非对称膜，分为管式陶瓷膜和平板陶瓷膜两种。本发明实施例中采用的是管式陶瓷膜，其管壁密布微孔，在压力作用下，原料液在膜管内或膜管外流动，小分子物质（或液体）透过膜，大分子物质（或固体）被膜截留，从而达到分离、浓缩、纯化的目的，是一种“错流过滤”的流体分离方式。在下文实施例中，为满足浓缩和清洗菌液中杂质的需要，陶瓷膜应选择0.1~0.5μm孔径，其中最优选为0.2μm；为配合循环管路使用，下文实施例中选择1178mm×25mm规格的陶瓷膜，优选为19通道或7通道，也可以为其他数量的通道。

本发明中，“进料单元”为向反应釜内输送革兰氏阴性菌培养物和抽提液的通道，一般可理解为是进料口，可以是刚性（如不锈钢）或柔性（如聚四氟乙烯）的材质；在具体使用时，还可以在进料口出增设一个漏斗状、瓶状或筒状的结构，便于倾倒液体物料、并可用于承接倾倒时溢出进料口的多余的物料。

本发明中，“搅拌单元”为用于将革兰氏阴性菌培养物（菌液或干菌）与抽提液充分混合的工具，具体包括驱动电机、搅拌头和可用于固定并带动搅拌头旋转的搅拌杆，搅拌头以搅拌杆为轴，可以直接固定在搅拌杆上、或是通过某种附加固定装置间接与搅拌杆连接；附加固定装置可以为任何能够进行固定和连接的实体结构，例如杆状、板状、环状、夹状等。

本发明中，搅拌头可以采用任何常用的形式，如桨式、齿片式、弯叶开启涡轮、折叶开启涡轮、锚式、框式、螺带式、螺杆式、弯叶圆盘涡轮、平直叶圆盘涡轮、推进式、布鲁马金式等。在下文的实施例中，为在确保搅拌范围最大化的前提下控制成本，第一搅拌头选择结构最简单、占用体积最小的桨式搅拌器，可以在搅拌范围最大的情况下尽可能多地盛装物料；第二搅拌头选择推进式中最简单的三叶推进式，能够在中心处充分、均匀地进行搅拌，从而有效阻止涡流的形成。

本发明中，为满足过滤提取液的需要，不锈钢滤膜的孔径应≤2μm，具体可以为1.75μm、1.5μm、1.25μm或1μm，或上述任意两个相邻数值之间的任意值。在下文实施例中，具体选用1.25μm孔径，使提取率和样品纯度都能达到最佳水平。不锈钢滤膜的厚度为1~2mm，具体可以为1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm或2mm，或其中任意两个相邻数值之间的任意值。在下文实施例中，具体选用1.5mm，可以确保过滤速度与过滤稳定性的最大化。

本发明中的抽提液包含低分子醇、卤代烃和石油醚。

本发明中的低分子醇是指含有1-3个碳原子的醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等。在本发明的实施方式中，优选的低分子醇为甲醇或乙醇，更有选为甲醇。

本发明中的卤代烃是指烃分子中的氢原子被卤素原子取代后的化合物。在本发明的实施方式中，卤代烃优选为氯代烃或溴代烃，更优选为氯代烃。本发明中的卤代烃可以为一卤代烃、二卤代烃和多卤代烃，优选为多卤代烃。本发明中的卤代烃的烃基为1-2碳原子数的饱和烃，在优选的实施方式中，本发明中的卤代烃为二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等，优选为氯仿。

本发明中的石油醚是一种轻质石油产品，是低相对分子质量的烃（主要是戊烷及己烷）的混合物，也可以由具有类似组分的烃混合物来代替。在本发明中，石油醚的沸程为30-60℃。

在本发明优选的实施方式中，所述抽提液包含甲醇、氯仿和石油醚，其体积比为(3-5):(1-2):(5-7)，例如优选为3:1:5、3:1:6、3:1:7、4:1:5、4:1:6、4:1:7、5:1:5、5:1:6、5:1:7、3:2:5、3:2:6、3:2:7、4:2:5、4:2:6、4:2:7、5:2:5、5:2:6、5:2:7等。

在本发明的实施方式中，S2中的革兰氏阴性菌在提取前被研磨成粉状，由此可提高提取率。

在本发明的实施方式中，S3中提取温度为20-30℃，优选的提取温度可以为23~27℃（即室温），例如23℃、24℃、25℃、26℃或27℃。收集提取液的方法可以为离心或过滤。

在本发明的实施方式中，抽提液体积与干燥细菌细胞重量的比值为5-20ml/g，例如6ml/g、7ml/g、8ml/g、9ml/g、10ml/g、12ml/g、15ml/g、18ml/g等。

在本发明的实施方式中，S3中单次提取时间为2-3小时，每批次的革兰氏阴性菌可重复提取2-3次。例如，在提取后可通过离心或过滤来收集提取液，然后将离心后的沉淀物或过滤后的滤渣再次加入到抽提液中进行提取，如此进行2次或3次，可以提高脂多糖的提取率。

在本发明的实施方式中，S3中的提取在底部具有过滤网的反应釜中进行，提取完成后，通过加压过滤收集提取液。

在本发明的实施方式中，在干燥革兰氏阴性菌之前，还包含清洗革兰氏阴性菌的步骤，清洗次数可以为1-3次。清洗革兰氏阴性菌采用的溶剂为水和醇类中的一种或多种，所述的水优选为纯水，包括通过蒸馏、去离子、离子交换处理或反渗透获得的水，优选的水是无菌水。所述醇类优选为甲醇或乙醇。所述醇类可以为约75%至约95%(v/v)的醇的水溶液。在提取步骤之前用水洗涤能够降低提取的脂多糖中杂质的量，利用醇类洗涤可以降低与脂多糖共同提取的磷脂的量。

在一些实施方式中，可以首先利用水进行洗涤，然后用甲醇进行洗涤。在一些实施方式中，可以首先利用水进行洗涤，然后用乙醇进行洗涤。一些实施方式中，可以首先利用水进行洗涤，然后用甲醇进行洗涤，最后用乙醇进行洗涤。一些实施方式中，可以首先利用水进行洗涤，然后用乙醇进行洗涤，最后用甲醇进行洗涤。在一些实施方式中，可以首先利用乙醇进行洗涤，然后用甲醇进行洗涤。在一些实施方式中，可以首先利用甲醇进行洗涤，然后用乙醇进行洗涤。在以上所有的洗涤步骤中，洗涤可以为一次、两次或更多次。

在本发明的一个实施方式中，利用装有孔径为0.2μm的多通道圆柱形陶瓷膜的过滤单元清洗革兰氏阴性菌。清洗完成后可以通过离心或过滤去除用于清洗革兰氏阴性菌的溶剂，得到的革兰氏阴性菌可通过晾干或烘干的方式进行干燥，得到干燥的革兰氏阴性菌。

在一些实施方式中，S5中通过蒸发溶剂来浓缩滤液，优选地，通过减压蒸馏（例如旋蒸法）的方式进行蒸发溶剂。

在一些实施方式中，S5中预冷的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，有机溶剂的体积为滤液浓缩液的1-5倍，优选为2-4倍。有机溶剂预冷的温度为-30℃至-10℃，优选为-25℃至-15℃，例如-20℃。

在一些实施方式中，S5中通过离心收集析出的沉淀。离心的转速为2000-20000rpm，优选为5000-15000rpm，例如8000rpm、10000rpm或12000rpm，离心时间为5-25min，优选为10-20min，例如15min。优选地，收集的沉淀可以进一步利用预冷的有机溶剂分散，离心后收集沉淀，如此重复2-3次，以提高脂多糖的纯度。

本发明的方法中使用的细菌细胞可以为沙门氏菌属(Salmonella)或埃希杆菌属(Escherichia)的细菌细胞。其中，沙门氏菌属(Salmonella)可以为明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)种，特别是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595菌株。可选的细菌细胞还可以为空肠弯曲菌(Compylobacter jejuni)、大肠杆菌(E. coli)K12菌株CS2429、大肠杆菌(E. coli) D31m4、大肠杆菌(E. coli)菌株F515和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株R45。

本发明还提供了制备脂多糖衍生物的方法，包括利用本发明的方法从革兰氏阴性菌的细菌细胞提取脂多糖(LPS)，对脂多糖进行酸水解和/或碱水解得到脂多糖衍生物。

在一个实施方式中，将脂多糖(LPS)在0.1M HCl中回流大约30分钟，将在1位的磷酸基(dephosphorylation)以及6’位的糖基(decarbohydration)脱去，产生单磷酰脂质A（MPL）。在一个实施方式中，通过MPL的温和碱水解获得了3-O-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)，3D-MPL具有进一步降低的毒性。

以下实施例中使用的部分电子设备型号及厂家如下：

设备名称	厂家	型号
			陶瓷专用泵	南方泵业股份有限公司	CDMF10-18-KSWSC
减速电机	诺德公司	172.1F-90LB/4 EAR1
			金属管浮子流量计	常州成丰流量仪表有限公司	LZZX-32/RR1/M9/B1/Y
玻璃管液位计	常州成丰流量仪表有限公司	HG5/16/25/RF
			恒温加热-冷却循环槽	无锡申科仪器有限公司	W-O-VI-5

实施例1 脂多糖抽提装置

本实施例提供了一种脂多糖提取装置，如图1~3所示，包括洗菌系统1、干燥系统2和提取系统3，其中洗菌系统1包括储液单元11（不锈钢反应罐）、循环单元12（具体为一组蛇形排列的循环管路）以及陶瓷专用泵，循环管路包括连接储液单元11出液口与循环泵121的入口管122、连接储液单元11进液口的出口管124、以及入口管122和出口管124之间的2根过滤管123，每根过滤管123内设置一根管式陶瓷膜（本实施例中采用0.2μm孔径、1178mm×25mm×19通道的陶瓷膜）作为第一过滤单元13，每根过滤管123上方还连接有一根废液管125；储液单元11上设有用于观察罐内液体体积的第一流量计111（选用玻璃管流量计），出口管124上还设有用于观察循环管路内液体实时流量的第二流量计126（选用金属管浮子流量计）。如果储液单元11是单层罐，则洗菌系统1中还要配套增加恒温反应器127，恒温反应器127连接在入口管122上，对管路内的液体进行温度控制（如果储液单元11有夹套结构则不需要）。

干燥系统2，用于将经过洗菌系统1清洗的菌液中的溶剂去除，可以不具有系统的连接结构，只要能执行相关功能即可。干燥系统2主要可以分成独立的两部分，第一部分为离心机或抽滤装置，用于将菌液中游离的溶剂去除；第二部分为烘箱或通风橱，用于将残留的溶剂去除、使菌液彻底干燥；还可以包括一个研磨装置，可以将干燥后的菌体研磨成粉末，用以获得菌干粉。具体组成部分可以根据实际情况进行选择。

提取系统3包括反应釜31（本发明实施例中的最大容量为35L）和与所述反应釜31相互配合的进料单元32、搅拌单元33、第二过滤单元34、出料单元35，该反应釜31为分体结构，包括依次连接的盖体311、罐体312和底座313。

盖体311上设有进料口（进料单元32）和搅拌单元33，底座313上设有出料口351，搅拌单元33包括驱动电机331和搅拌器。如图4（a）和4（b）所示，搅拌器包括连接在所述盖体311上的搅拌杆332、搅拌杆332上从下向上依次设有第一搅拌头333和第二搅拌头334，驱动电机331驱动搅拌杆332以50~120rpm的转速进行搅拌；在本实施例中，第一搅拌头333为两片式桨叶搅拌头、桨叶的直径接近反应釜31罐体312的直径；第二搅拌头334是三叶推进式，直径小于第一搅拌头333。第二过滤单元34用不锈钢滤膜341替换传统的陶瓷滤网，不锈钢滤膜341的孔径为1.25μm、厚度为1.5mm。盖体311下方远离中心处还设有一个杆状的延长结构336，温度传感器335设在延长结构336底部、高度位于第一搅拌头333与第二搅拌头334之间。盖体311上还设有进气口342，用于向内充气（主要采用压缩空气或氮气）加压，使物料通过不锈钢滤膜341进行过滤。出料单元35包括设在底座313上的出料口351和独立设置的储液罐352，出料口351与储液罐352顶部的进液口通过管路连接。

如图5（a）和5（b）所示，罐体312底部设有滤膜支撑板343，滤膜支撑板343高度低于罐体312底部边缘的高度、并与罐体312底部边缘形成一个嵌槽344，所述不锈钢滤膜341设在嵌槽344内、边缘通过柔性的垫圈345与嵌槽344边缘贴合，滤膜支撑板343上设有4mm孔径的网孔，便于过滤后的提取液流出。

实施例2 改进的脂多糖抽提装置

本实施例提供了一种脂多糖提取装置，通过改变反应釜31出液与储液罐352进液的高度差，解决提取液在出液管路内滞留的问题。如图6所示，其与实施例1的区别在于，进液口353设在储液罐352的底部。

现有的此类反应体系中，进液口353均设置在储液罐352顶部，滤液从反应釜31底部的出料口351放出后、通过管路直接输送到储液罐352顶部的进液口353，这一过程中存在高度差，往往会导致反应釜底和管路内有料液存留，从而造成产物损失，同时也会对滤网和管路造成堵塞。本实施例中将进液口353调整至储液罐352的下方，直接消除高度差，使提取液可以沿近似水平的线路运输，从而可减少甚至避免这一问题。另外，由于滤液排出是靠通入气体增加压力，因此几乎不存在储液罐352中收集的滤液发生倒流的可能，为防万一，也可以在进液口353内增设一个单向阀，从而彻底避免倒流的情况发生。

实施例3 改进的脂多糖抽提装置

本实施例提供了一种脂多糖提取装置，采用不同的方式解决了与实施例2相同的问题。如图7所示，其与实施例1的区别在于，进液口353设在储液罐352的顶部、并延伸至储液罐352的底部。

与实施例2相比，本实施例并未改变进液口353的位置，只是将其在罐体内的部分延长，通过改变液体排出的高度来间接消除高度差，同样也可以减少管路内液体留存。

实施例4 改进的脂多糖抽提装置

本实施例提供了一种脂多糖提取装置，通过在罐体312与底座313顶部之间设置相互配合的定位结构，解决组装不便的问题。如图8（a）、8（b）以及8（c）所示，其与实施例1的区别在于，底座313顶部设有若干球状的凸起314，罐体312底部设有与凸起314相适配的若干球状凹槽315。

凸起314与凹槽315配合，可以在组装罐体312和底座313时作为定位的标志，将罐体312固定在试验台上后，对底座313进行组装时，将凸起314贴合罐体312底部，慢慢旋转底座313直至凸起314插入凹槽315时，即可确定底座313已完全扣合，无需反复摸索和试探，避免垫圈345被掀起、造成漏液。凸起314理论上可以是各种形状，但设置成球形更便于在罐体312底部滑动。凸起314与凹槽315理论上可以是任何数量，但从稳定性和成本的角度综合考虑，3组是最佳选择。凸起314和凹槽315也可以交换位置，但当凹槽315设在底座313上时，更容易积累灰尘和污垢，增加了清洁的工作量。

实施例5 改进的脂多糖抽提装置

本实施例提供了一种脂多糖提取装置，采用不同的方式解决了与实施例4相同的问题。如图9（a）和9（b）所示，其与实施例1的区别在于，底座313的顶部边缘与罐体312的底部边缘均设有若干连接片316，凸起314和凹槽315均设在连接片上。

将凸起314与凹槽315设在延伸出去的连接片316上，此时二者的相互适配相当于连接片316的相互配合，此种连接方式类似于法兰的形式。基于与实施例4相同的理由，凸起314优选为为球形，凸起314与凹槽315以及连接片316的数量优选为3组，且凸起314设在底座313的连接片316顶部、凹槽315设在罐体312的连接片316底部。

实施例6 中试规模的脂多糖提取方法

采用实施例1提供的装置进行洗菌脂多糖的提取，具体方法如下：

（1）洗菌

取R595菌发酵后收集的培养物约15kg，加入到洗菌系统1的储液单元11中，向其中加入约40L甲醇，用陶瓷专用泵在1MPa的压力下抽取甲醇与菌体的混合体系至循环管路中，按照入口管122——过滤管123——过滤管123——出口管124的顺序进行流动，混合体系通过第一过滤单元13（陶瓷膜）过滤和浓缩后、回流至储液单元11中，从陶瓷膜渗滤出的溶有杂质的洗菌溶剂从废液管排出。第一流量计11与第二流量计126分别对储液单元11和循环管路内的液体实时流量进行监控，不断重复循环过程、对菌体进行反复清洗。当储液单元11内的固液比达到0.6时，即完成清洗，得到菌体悬浮液。

（2）干燥

将收集到的菌体悬浮液于8000rpm的转速下离心20min，弃去上清、收集菌体；将收集到的菌体晾干、碾碎，烘干后研磨成菌干粉，颜色呈淡土黄色，将菌干粉密封、置于-20℃下保存备用。

（3）提取

取4kg菌干粉从进料单元添加到设有不锈钢滤膜341的反应釜31中，加入配置的CMP（氯仿:甲醇:石油醚=4:1:6）抽提液30L，用驱动电机331驱动搅拌器以50~120rpm的转速进行搅拌，在实验室的室温（约25℃）下进行提取。搅拌2h后，向罐内充入压缩空气，在一个大气压水平的压力下进行加压过滤，使罐内的提取液通过不锈钢滤膜341，过滤后从出料口351将滤液转移至储液罐352中。重复提取和过滤步骤两次，将三次提取液合并。

将提取液从储液罐352放出，用布氏漏斗PTFE膜进行抽滤，将收集的滤液转入旋转蒸发仪中，42℃旋蒸至无冷凝回流，用1L CM（氯仿：甲醇=4:1）溶液溶解旋转蒸发仪内壁的附着物，加入冷甲醇2L，析出沉淀，在离心机中以10000rpm离心15min，收集沉淀。沉淀室温充分通风干燥，得到纯化的脂多糖。

在提取过程中，间隔1小时取样，以提取的LPS重量与干燥细菌细胞重量的比值来计算样品的提取率。

结果表明，利用CMP提取时，首次提取2小时后，提取率即达到1.66%，此后即使延长提取时间，但提取率增长缓慢，因此，CMP常温下提取时，优选的提取时间为2-3小时。

将滤渣提取第二次时，2小时后，提取率为0.9%，提取第3次时，提取率降低到0.62%，此后再次提取发现提取率明显降低，可见，利用CMP提取时，通过提取2-3次，可达到较高的总提取率。

在该实施例中，发明人还研究了利用湿菌（即细菌细胞未经干燥）进行提取时，提取率相对于干菌提取的变化情况。发明人意外地发现，利用湿菌提取时，提取率相对于干菌提取要低20%-30%左右，这可能是由于在干燥后，细菌外膜中的脂多糖更容易溶于抽提液中，因而提取率提高，单位产量的脂多糖所需的抽提液体积降低，从而降低成本。另外，发明人还发现，利用将干燥细菌细胞研磨后得到的菌干粉进行提取时，提取率相对于干菌（即仅干燥，未研磨）可进一步提高约8-12%。

实施例7 不同组成的抽提液对提取率的影响

利用由不同体积比的氯仿:甲醇:石油醚组成的抽提液进行提取，测量提取率，结果如表1所示。

表1 不同组成的抽提液提取效果比较

组别	抽提液的组成氯仿:甲醇:石油醚（体积比）	提取率（%）
			1	3:1:7	1.23
2	5:2:5	1.15
			3	4:2:6	2.03
4	3:2:5	1.59
			5	4:2:7	1.62
6	3:2:6	1.36
			7	4:1:7	2.37
8	5:2:6	1.33
			9	4:2:5	1.75
10	3:2:7	1.41

可见，利用上述不同体积比的氯仿-甲醇-石油醚抽提液进行提取时，在常温下均可以获得较高的提取率。

另外，发明人还研究了分别利用二氯甲烷-甲醇-石油醚抽提液、氯仿-乙醇-石油醚-抽提液以及二氯甲烷-乙醇-石油醚抽提液提取脂多糖时提取率的变化情况。结果表明，在采用上述3种抽提液时，在常温下均可提取脂多糖，但提取率相对于由氯仿-甲醇-石油醚抽提液均有所降低。

实施例8 单次提取抽提液使用量的考察

按照不同的提取体系固液比（干燥细菌细胞重量与抽提液体积的比例）进行抽提试验，比较提取率的变化，结果如表2所示。

表2 不同固液比的反应体系提取效果比较

组别	固液比（g:ml）	提取率（%）
			1	1:5	1.5
2	1:10	2.85
			3	1:20	4.06
4	1:30	4.10
			5	1:50	4.56
6	1:70	4.69
			7	1:100	4.78

从表中可以看出，当提高抽提液的用量时，提取率可显著提高；当抽提液用量进一步提高、固液比继续减小至低于1:20时，提取率随抽提液用量的增加而提高的幅度开始明显放缓。如果继续增加抽提液的用量，不仅不能使提取率得到显著提升，还会大大提高生产成本。因此，综合提取率和生产成本等因素来考虑，抽提液体积与干燥细菌细胞重量的比例以5-20 ml/g为宜。

综上所示，使用本发明提供的装置进行脂多糖提取，可以显著提高提取率、并能有效节约有机溶剂的使用量，同时在多次试验中提取效果稳定、操作安全简便，适合用于中式规模甚至更大规模的脂多糖提取操作。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (33)

1.一种脂多糖提取装置，其特征在于，包括洗菌系统(1)、干燥系统(2)和提取系统(3)，所述洗菌系统(1)包括相互连接的储液单元(11)和循环单元(12)、以及设在所述循环单元(12)内的第一过滤单元(13)，所述储液单元(11)用于存储待处理的革兰氏阴性菌培养液和洗菌溶剂、并将经过所述过滤单元过滤浓缩的菌液回收，所述循环单元(12)用于将所述培养液和所述洗菌溶剂的混合体系输送至所述第一过滤单元(13)进行过滤和浓缩，并使浓缩后的菌液回流至所述储液单元(11)中、同时将渗滤液排出；

所述干燥系统(2)用于对所述菌液除去溶剂、干燥并粉碎，得到菌干粉；

所述提取系统(3)包括反应釜(31)以及与所述反应釜(31)连接设置的进料单元(32)、搅拌单元(33)、第二过滤单元(34)和出料单元(35)，所述第二过滤单元(34)包括不锈钢滤膜(341)和加压单元，所述不锈钢滤膜(341)设在所述反应釜(31)内与所述出料单元(35)的连接处，所述不锈钢滤膜(341)的孔径≤2μm、厚度为1～2mm；所述进料单元(32)用于向所述反应釜(31)内输送所述菌干粉和抽提液；所述搅拌单元(33)用于对所述反应釜(31)内的反应体系进行搅拌以进行提取操作；所述第二过滤单元(34)用于在反应结束后对所述反应体系施加和维持压力，使所述反应体系通过所述不锈钢滤膜(341)进行过滤；所述出料单元(35)用于将滤液转移出来进行收集。

2.如权利要求1所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述循环单元(12)包括循环泵(121)和连接所述循环泵(121)与所述储液单元(11)的循环管路，所述第一过滤单元(13)设在所述循环管路内。

3.如权利要求2所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述循环管路包括连接所述储液单元(11)出液口与所述循环泵(121)的入口管(122)、连接所述储液单元(11)进液口的出口管(124)、以及所述入口管(122)和出口管(124)之间的至少一根过滤管(123)，每根所述过滤管(123)内设有一组所述第一过滤单元(13)；每根所述过滤管(123)上方还连接有一根废液管(125)。

4.如权利要求1所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述不锈钢滤膜(341)的孔径为1.25μm。

5.如权利要求1所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述不锈钢滤膜(341)的厚度为1.5mm。

6.如权利要求1所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述加压单元包括进气口(342)，所述进气口(342)通过进气管路与外部供气装置连接，用于向所述反应釜(31)内通入压缩气体、使所述反应体系通过所述不锈钢滤膜(341)进行过滤。

7.如权利要求1所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述反应釜(31)包括依次连接的盖体(311)、罐体(312)和底座(313)，所述搅拌单元(33)包括驱动电机(331)和搅拌器，所述搅拌器一端连接在所述盖体(311)上、另一端伸入所述罐体(312)内。

8.如权利要求7所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述搅拌器包括位于所述罐体(312)内不同高度或不同平面且彼此分离的至少两个搅拌头。

9.如权利要求8所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述搅拌器包括搅拌杆(332)以及设在所述搅拌杆(332)上不同高度的第一搅拌头(333)和第二搅拌头(334)。

10.如权利要求9所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述第一搅拌头(333)设在所述搅拌杆(332)端部，所述第二搅拌头(334)设在所述第一搅拌头(333)上方，且所述第二搅拌头(334)的直径小于所述第一搅拌头(333)。

11.如权利要求9所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述罐体(312)内远离内壁处设有温度传感器(335)，所述温度传感器(335)在高度上位于所述第一搅拌头(333)与所述第二搅拌头(334)之间。

12.如权利要求11所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述盖体(311)下方远离中心处还设有延长结构(336)，所述温度传感器(335)设在所述延长结构(336)底部。

13.如权利要求7所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述进料单元(32)包括设在所述盖体(311)上的进料口，所述出料单元(35)包括设在所述底座(313)上的出料口(351)、以及独立设置的储液罐(352)，所述出料口(351)与所述储液罐(352)的进液口(353)通过管路连接。

14.如权利要求13所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述进液口(353)设在所述储液罐(352)的底部。

15.如权利要求13所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述进液口(353)设在所述储液罐(352)的顶部、并延伸至所述储液罐(352)的底部。

16.如权利要求7所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述底座(313)顶部设有滤膜支撑板(343)，所述不锈钢滤膜(341)设在所述滤膜支撑板(343)上方；所述滤膜支撑板(343)上设有网孔，且所述网孔的孔径大于所述不锈钢滤膜(341)的孔径。

17.如权利要求16所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述滤膜支撑板(343)高度低于所述罐体(312)底部边缘的高度、并与所述罐体(312)底部边缘形成一个嵌槽(344)，所述不锈钢滤膜(341)设在所述嵌槽(344)内、边缘通过柔性的垫圈(345)与所述嵌槽(344)边缘贴合。

18.如权利要求17所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述罐体(312)底部与所述底座(313)顶部之间设有相互配合的定位结构。

19.如权利要求18所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述定位结构为形状和尺寸相互适配的凸起(314)与凹槽(315)。

20.如权利要求19所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述凸起(314)为球形或半球形。

21.如权利要求19所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述定位结构设在所述罐体(312)底面与所述底座(313)顶面上。

22.如权利要求19所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述定位结构设在所述罐体(312)与所述底座(313)的外壁上。

23.如权利要求1～22中任一项所述的脂多糖提取装置，其特征在于，所述盖体(311)上还设有与所述罐体(312)连通的冷凝器(36)。

24.一种应用权利要求1～23中任一项所述的脂多糖提取装置进行脂多糖提取的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：用所述洗菌系统(1)对培养得到的革兰氏阴性菌进行清洗、过滤和浓缩；

S2：用所述干燥系统(2)对经过清洗和过滤的菌液去除溶剂、干燥并粉碎，得到菌干粉；

S3：用所述提取系统(3)进行脂多糖提取，将所述菌干粉与抽提液通过所述进料单元(32)加入所述反应釜(31)中，用所述搅拌单元(33)对物料以50～120rpm的转速进行搅拌，在20～30℃下进行提取；所述抽提液包含甲醇、氯仿以及石油醚，所述石油醚的沸程为30～60℃，所述抽提液中甲醇、氯仿和石油醚的体积比为(3～5):(1～2):(5～7)；

S4：反应结束后，用所述第二过滤单元(34)对反应体系施加和维持压力、使所述反应体系在一个大气压的条件下通过所述不锈钢滤膜(341)进行过滤，并通过所述出料单元(35)将过滤后的提取液转移并收集起来；

S5：将所述提取液浓缩后加入预冷的有机溶剂，收集析出的沉淀，即得到脂多糖。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，S3中的提取温度为23～27℃。

26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，S3的提取过程重复2～3次，单次提取时间为2～3小时。

27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，S3中所述抽提液与所述菌干粉重量的比例为5～20ml/g。

28.如权利要求24所述的方法，其特征在于，S1的具体方法如下：

将革兰氏阴性菌培养物添加到所述储液单元(11)中，向其中添加清洗溶剂，利用所述循环单元(12)将混合体系循环输送至所述过滤单元进行过滤和浓缩，将滤液收集到所述储液单元(11)中并转移。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述清洗溶剂为水、醇类或醇类的水溶液。

30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，清洗完成后，去除所述清洗溶剂的方法为离心或过滤。

31.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述预冷的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，预冷的温度为-30～-10℃。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述预冷的温度为-25～-15℃。

33.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌选自明尼苏达沙门氏菌R595、空肠弯曲菌、大肠杆菌K12菌株CS2429、大肠杆菌D31m4、大肠杆菌F515以及奇异变形杆菌R45中的一种或多种。