CN102746414B - 一种细菌脂多糖的沉降方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细菌脂多糖的沉降方法，它包括如下步骤：（1）取含有细菌脂多糖的溶液，冷冻至完全凝固，解冻；（2）将步骤（1）处理后的溶液进行低速离心，得到的沉淀，即为细菌脂多糖。本发明提供的细菌脂多糖的沉降方法简单，克服现有超速离心处理条件苛刻、成本高的缺陷，克服化学纯化需用大量化学试剂导致高成本且污染环境的弊端，具有广泛的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及细菌脂多糖的沉降方法，属于生物制品领域。
背景技术
G-细菌在自然界广泛存在，能从水、土壤、动植物及人体中分离出G-细菌。细菌脂多糖（LPS）是G-细菌外膜的组成成分，其是由脂质A、核心多糖和O-侧链三部分组成。LPS会引起广谱非特异性的病理生理反应，比如发烧、白细胞数变化、弥散性血管内凝血、低血压、休克或者死亡，其抗原性很强，极小剂量的内毒素即可导致大部分动物死亡，因此，人用药物尤其是注射制剂需要对内毒素（热原质）限量，例如葡萄糖注射液、白蛋白、球蛋白、细胞因子、多糖类疫苗、蛋白类疫苗均要对产品进行热原质检测并控制在一定水平，超限热原质必须从产品中除去。另一方面，LPS是重要的保护性抗原，在各种动物模型中，LPS抗原表现出良好的免疫原性和免疫保护作用，可以将纯化的LPS制作成为疫苗，预防疾病发生。
从含有LPS的溶液中除去或者纯化细菌脂多糖的方法包括化学纯化方法和物理分离方法，化学纯化是用乙醇、核酸酶、蛋白酶、丙酮等化学试剂纯化，成本高且污染环境。
物理分离方法主要是超速离心分离方法，如，周炳荣等，“细菌内毒素（脂多糖）提取及纯化技术”，药用微生物学，药学情报通讯1989年第7卷第1期中LPS纯化方法即采用最常用的超速离心（4万转×4小时，共三次），在这一条件下，LPS可沉淀下去，而蛋白质、核酸多糖则保留在上清液中，除去上清液即可得到较为纯化的LPS，经计算，4万转应大于15万g。超速离心的方法可以克服化学纯化方法的缺陷，但是因为超速离心的离心力大，通常大于100,000g，离心时间长，通常大于10h，处理量小,并且，现有技术中，离心力大于100000g的离心机的价格会显著高于离心力低于100000g的离心机，导致生产成本高，难以大规模工业应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的物理方式沉降细菌脂多糖的方法。
本发明细菌脂多糖的沉降方法，它包括如下步骤：
（1）取含有细菌脂多糖的溶液，冷冻至完全凝固，解冻；
（2）将步骤（1）处理后的溶液离心，得到的沉淀，即为细菌脂多糖。
其中，步骤（1）所述冷冻的温度为-10℃～-80℃。优选地，所述冷冻的温度为-20℃~-40℃。
其中，步骤（1）所述解冻的温度大于0℃且小于80℃。优选地，所述解冻的温度大于0℃且小于等于70℃，可以保证蛋白制品不会失活。
其中，步骤（2）所述离心条件是，离心力为1000~30000g，离心时间大于10min。优选地，所述离心力为6000g，离心时间为30~60min。
其中，所述含有细菌脂多糖的溶液是细菌脂多糖提取液，或者污染细菌脂多糖的生物制品或药品。
生物制品是指用基因工程、细胞工程、发酵工程等生物学技术制成的免疫制剂或有生物活性的制剂。
所述细菌脂多糖提取液可以采用细菌脂多糖提取液的常用提取方法提取，如，采用三氯醋酸法、酚水法、高压超声处理法或者DMSO法。其中,DMSO是二甲基亚砜。
所述污染细菌脂多糖的生物制品是疫苗、抗毒素、血清、免疫球蛋白、凝血因子、生长因子、干扰素或者白蛋白。
本发明细菌脂多糖的沉降方法，先对细菌脂多糖的溶液进行冷冻和解冻后，仅需低速离心即可达到分离细菌脂多糖的目的，克服了传统物理分离细菌脂多糖需超速离心的缺陷，成本低廉，操作方便，具有良好的工业应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明细菌脂多糖的沉降方法
取三氯醋酸法提取的细菌脂多糖提取液，-80℃下冷冻，10℃解冻，2000g离心60min，所得沉淀即为细菌脂多糖。
实施例2本发明细菌脂多糖的沉降方法
取酚水法提取的细菌脂多糖提取液，-10℃下冷冻，70℃解冻，30000g离心10min，所得沉淀即为细菌脂多糖。
实施例3本发明细菌脂多糖的沉降方法
取被LPS污染的人血白蛋白，-20℃下冷冻，50℃解冻，6000g离心30min，沉淀即为除掉的细菌脂多糖。
实施例4本发明细菌脂多糖的沉降方法
取被LPS污染的疫苗，-50℃下冷冻，80℃解冻，4000g离心50min，沉淀即为除掉的细菌脂多糖。
以下通过铜绿假单胞菌IATS分型系统的菌株实验，证明本发明有益效果：
实验例1LPS纯化
铜绿假单胞菌购自ATCC（美国模式菌种保藏中心，American Type CultureCollection），其保藏号为铜绿假单胞菌IATS 11型ATCC33358。
1、实验方法
(1)菌体收集
铜绿假单胞菌IATS 11型ATCC33358菌株按常规方法培养。菌体制备可采用液体发酵或固体克氏瓶培养收集，在菌种启封、菌种检定后，进行细菌培养、杀菌脱毒，最后离心收集菌体。
（2）酚水法提取LPS
LPS的提取采用酚水法提取，首先用注射用水将菌体配制成20%的菌液，再加入等体积的事先配制好的90%苯酚液，置65~68℃水浴振荡提取60min，冷却后4000~8000rmp离心50min，抽取水相层LPS提取液，用预热至68℃注射用水补充提取液到原体积，重复提取3次。汇总水相层LPS提取液，再次离心后用进行透析，透析采用级别为纯化水以上的水液透析，每天换水2~3次，至少透析3天。
（3）本发明方法处理
透析结束后抽取5ml做定量细菌内毒素检测，其余收集起来并放置于-20℃低温冰柜，7d后将其转移至室温进行解冻，解冻完成后装于容量为1000ml离心杯，每次离心6个离心杯，在6000g离心力的情况下离心50min。离心完成后，抽取5ml上清液做定量细菌内毒素检测,另取100ml冻干瓶5个，每瓶装30ml上清液并进行冻干，冻干后分析核酸和蛋白质含量。取一个离心杯所得沉淀,用注射用水进行复溶至原体积1000ml,抽取5ml复溶液做定量细菌内毒素检测。
细菌内毒素定量检测按中国药典2010版附录XII E细菌内毒素检测法中的动态浊度法进行；蛋白质含量检测按中国药典2010版附录XI B蛋白质测定法第二法Lowry法进行，牛血清白蛋白作为标准；核酸含量检测按中国药典2010版附录II A紫外-可见分光光度法进行；冻干制品水分检测按中国药典2010版附录XII D水分测定法第二法甲苯法进行。
2、实验结果
经检测，检测结果见表1和表2：
表1细菌内毒素定量检测结果
表2本发明方法处理后上清液冻干后各成分检测结果
上述数据表明，经本发明方法处理后，所得沉淀为LPS，所得上清液中，LPS大部分除去，除去率为94%，剩余部分主要成分为核酸和蛋白质，说明本发明方法可以充分沉淀LPS。
实验例2LPS纯化
铜绿假单胞菌购自ATCC（美国模式菌种保藏中心，American Type CultureCollection），其保藏号为铜绿假单胞菌IATS 4型ATCC33351。
1、实验方法
(1)菌体收集
铜绿假单胞菌IATS 4型ATCC33351菌株按常规方法培养。菌体制备可采用液体发酵或固体克氏瓶培养收集，在菌种启封、菌种检定后，进行细菌培养、杀菌脱毒，最后离心收集菌体。
（2）酚水法提取LPS
LPS的提取采用酚水法提取，首先用注射用水将菌体配制成20%的菌液，再加入等体积的事先配制好的90%苯酚液，置65~68℃水浴振荡提取60min，冷却后4000~8000rmp离心50min，抽取水相层LPS提取液，用预热至68℃注射用水补充提取液到原体积，重复提取3次。汇总水相层LPS提取液，再次离心后用进行透析，透析采用级别为纯化水以上的水液透析，每天换水2~3次，至少透析3天。
（3）本发明方法处理
透析结束后抽取5ml做定量细菌内毒素检测，其余收集起来并放置于-40℃低温冰柜，5d后将其转移至37℃进行解冻，解冻完成后装于容量为1000ml离心杯，每次离心6个离心杯，在5000g离心力的情况下离心60min。离心完成后，抽取5ml上清液做定量细菌内毒素检测,另取100ml冻干瓶5个，每瓶装30ml上清液并进行冻干，冻干后分析核酸和蛋白质含量。取一个离心杯所得沉淀,用注射用水进行复溶至原体积1000ml,抽取5ml复溶液做定量细菌内毒素检测。
细菌内毒素定量检测按中国药典2010版附录XII E细菌内毒素检测法中的动态浊度法进行；蛋白质含量检测按中国药典2010版附录XI B蛋白质测定法第二法Lowry法进行，牛血清白蛋白作为标准；核酸含量检测按中国药典2010版附录II A紫外-可见分光光度法进行；冻干制品水分检测按中国药典2010版附录XII D水分测定法第二法甲苯法进行。
2、实验结果
经检测，上清液的检测结果见表3和表4；沉淀的检测结果为：所得的沉淀为LPS。
表3细菌内毒素定量检测结果
表4本发明方法处理后上清液冻干后各成分检测结果
上述数据表明，经本发明方法处理后，所得沉淀为LPS，所得上清液中，LPS大部分除去，除去率为92%，剩余部分主要成分为核酸和蛋白质，说明本发明方法可以充分沉淀LPS。
综上，本发明提供的细菌脂多糖的沉淀方法很容易除去或者纯化细菌脂多糖，且方法简单，条件温和，对离心装置要求低，生产成本低，具有良好的工业应用前景。
Claims (1)
1.一种细菌脂多糖的沉降方法，其特征在于：它包括如下步骤：
（1）取含有细菌脂多糖的溶液，冷冻至完全凝固，解冻；
（2）将步骤（1）处理后的溶液离心，得到的沉淀，即为细菌脂多糖；
所述含有细菌脂多糖的溶液是细菌脂多糖提取液。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述冷冻的温度为-10℃~-80℃。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述冷冻的温度为-20~-40℃。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述解冻的温度大于0℃且小于等于80℃。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述解冻的温度大于0℃且小于等于70℃。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述离心条件是，离心力为1000~30000g，离心时间大于10min。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述离心力为6000g，离心时间为30~60min。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌脂多糖提取液是采用三氯醋酸法、酚水法、高压超声处理法或者DMSO法制备的细菌脂多糖提取液。
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