CZ305565B6

CZ305565B6 - Způsob výroby 3-O-deaktivovaného 4´-monofosforyllipidu A (3D-MLA)

Info

Publication number: CZ305565B6
Application number: CZ2003-2895A
Authority: CZ
Inventors: Kent R. Myers; D. Scott Snyder
Original assignee: Corixa Corporation
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2015-12-16
Also published as: HUP0304091A3; CN1928107A; SI1461418T1; US20140243513A1; NZ528204A; WO2002078637A2; RU2006140606A; DK2465937T3; JP2008255335A; JP2004535477A; US20070212758A1; RU2302463C2; BR0208535A; AU2002306962B2; JP2012057170A; RU2003131677A; US20030031684A1; BRPI0208535B8; CA2440249A1; IL189651A0

Abstract

Způsob výroby lipopolysacharidu (LPS) zahrnující: a) pěstování kultury hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene v mediu; b) udržování kultury ve stacionární fázi po dobu nejméně 5 h; c) sklízení buněk z kultury; a d) extrakci LPS z buněk. Způsob umožňuje výrobu LPS, který může být použit pro výrobu 3-O-deacylovaného monofosforyllipidu A (3D-MLA) s nejméně 20 % mol. hexaacylovaných členů rodiny.

Description

Způsob výroby 3-O-deaktivovaného 4'-monofosforyllipidu A (3D-MLA)

Oblast techniky

Přihláška se obecně týká oblasti biosyntetické výroby 3-O-deacylovaného 4'-monofosforyllipidu A (3D-MLA). Konkrétněji se zabývá metodami zvyšujícími výtěžek požadovaných rodin 3D-MLA nebo minimalizací nákladů na purifikaci lipopolysacharidových (LPS) prekurzorů 3DMLA.

Dosavadní stav techniky

Již dlouhou dobu je známo, že enterobakteriální lipopolysacharidy (LPS) jsou účinnými stimulátory imunitního systému. Submikrogramová množství LPS mohou navodit rozmanité odpovědi, ať již prospěšné nebo škodlivé. Skutečnost, že některé odpovědi jsou škodlivé a některé mohou být fatální, znemožňuje klinické použití LPS per os. Bylo pozorováno, že složkou LPS, která nese největší zodpovědnost za endotoxickou aktivitu, je lipid A.

Proto bylo věnováno velké úsilí pro ovlivnění toxických vlastností LPS nebo lipidu A, aniž by se snížily imunostimulační přínosy těchto sloučenin. Za pozornost stojí snahy Edgara Ribiho ajeho spolupracovníků, které vyústily ve výrobu derivátu lipidu A - 3-O-deacylovaného 4'-monofosforyllipidu A (3D-MLA; přípravky obsahující 3D-MLA jsou komerčně dostupné pod obchodním jménem MPL® od firmy Corixa Corporation (Seattle, WA)). Ukázalo se, že 3D-MLA má v podstatě stejné imunostimulační vlastnosti jako lipid A, ale nižší endotoxicitu (Myers et al., U.S. Patent 4 912 094). Myers et al. také popsali metodu výroby 3D-MLA, jak je uvedena dále. Nejprve jsou LPS nebo lipid A získané z hluboce zvrásněného mutantního kmene gram-negativní bakterie (např. Salmonella minnesota R595) refluxovány v roztocích minerálních kyselin střední síly (např. 0,1 N HCI) po dobu přibližně 30 minut. To vede k defosforylaci v pozici 1 redukujícího konce glukosaminu a odstranění sacharidu v pozici 6' neredukuj iciho glukosaminu lipidu A. Poté je defosforylovaný lipid A s odstraněným sacharidem (neboli monofosfoiyllipid A nebo MLA) podroben alkalické hydrolýze například rozpuštěním v organickém rozpouštědle, jako je roztok chlorofomrmethanol (CM) 2:1 (v/v), saturací vodným roztokem 0,5 M N₂CO₃opH 10,5 a rychlým odpařením rozpouštědla. To vede k selektivnímu odstranění skupiny βhydroxymyristové kyseliny v pozici 3 lipidu A, jehož výsledkem je vznik 3-O-deacylovaného 4'-monofosforyllipidu A (3D-MLA).

Kvalita 3D-MLA produkovaného výše uvedenou metodou je vysoce závislá na čistotě a složení LPS získaného z gram-negativní bakterie. Například složka LPS nazývaná lipid A je směsí velmi podobných druhů, které obsahují mezi 5 až 7 skupinami mastných kyselin. Při vzniku 3D-MLA, jak je zřejmé z výše uvedeného popisu, je jedna skupina mastné kyseliny odstraněna a tím vzniká 3D-MLA s 4 až 6 skupinami mastných kyselin. Obecně je 3D-MLA s nejméně 6 skupinami mastných kyselin považován za výhodný z hlediska kombinace zachovaných nebo zesílených imunostimulacních přínosů, snížení toxicity a dalších požadovaných vlastností (Qureshi a Takayama, v „The Bacteria“, Vol. XI (Iglewski a Clark, eds.), Academie Press, 1990, pp. 319-338).

Jako další příklad, extrakce LPS z gram-negativní bakterie v průmyslovém rozsahu obvykle zahrnuje metodu Chena (Chen et al., J. Infect. Dis. 128: 543 (1973)); konkrétně extrakci za použití CM, která vede ke vzniku CM fáze bohaté na LPS a fosfolipidy, z této fáze mohou být později LPS purifikovány. Purifikace LPS z frakce CM bohaté na LPS a fosfolipidy však obvykle zahrnuje několik precipitačních kroků, aby byl získán LPS o dostatečné čistotě pro použití v imunostimulačních aplikacích, jako je například použití jako adjuvans pro vakcíny.

-1 CZ 305565 B6

Proto by bylo žádoucí mít metody pro snadnou přípravu vysoce čistých přípravků obsahujících LPS. Dále by bylo žádoucí míst metody pro přípravu přípravků obsahujících LPS, který by obsahoval 3D-MLA se zvýšeným obsahem hexaacylované rodiny.

Pro přípravu kultur gram-negativních bakterií obsahujících snadno purifikovatelný LPS byly použity známé fermentační techniky. Tyto fermentační techniky obvykle zahrnují sklizeň bakteriálních kultur v časné stacionární fázi při použití standardních bakteriologických technik. Bylo však pozorováno, že stupeň acylace LPS produkovaného ze známých podmínek je variabilní. Například obsah heptaacylovaných druhů v lipidu A z S. minnesota R595 může kolísat od 20 % do 80 % v závislosti na výrobní šarži (Rietschel et al., Rev. Infect. Dis. 9: S527 (1987)). Výsledkem této variability v obsahu heptaacylované rodiny by byly signifikantní rozdíly v obsahu hexaacylované rodiny v 3D-MLA připravené z těchto šarží LPS.

Podstata vynálezu

V jednom provedení se přihláška týká způsobu výroby lipopolysacharidu (LPS) zahrnující:

a) růst kultury hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene v médiu;

b) udržování kultury ve stacionární fázi po dobu nejméně dvou hodin;

c) sklizení buněk z kultury; a

d) extrakci LPS z buněk.

Způsob umožňuje výrobu LPS poskytující 3D-MLA s relativně vysokým podílem (tj. nejméně 20 mol. %) rodin obsahujících 6 skupin mastných kyselin.

V dalším provedení je popsán způsob extrakce lipopolysacharidu (LPS) z kultury buněk hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene zahrnující:

a) extrakci buněk roztokem obsahujícím jako základ nejméně 75 hmotnostních % alifatického alkoholu o 1 až 4 uhlíkových atomech a doplňkovou vodu, čímž vznikají buňky se sníženým obsahem fosfolipidů;

b) extrakci buněk se sníženým obsahem fosfolipidů roztokem obsahujícím chloroform a methanol (CM), čímž vzniká roztok LPS v CM.

Tento způsob poskytuje roztoky LPS v CM, které mají snížený obsah fosfolipidů a jsou proto velmi vhodné pro další modifikaci na 3D-MLA a jeho purifikaci. Metoda zahrnuje relativně jednoduché a nenákladné kroky.

Krátký popis obrázků

Následující obrázky tvoří součást specifikace přihlášky a jsou uvedeny proto, aby byly dále demonstrovány určité aspekty přihlášky. Vynález může být lépe pochopen odkazem na jeden nebo více těchto obrázků v kombinaci s detailním popisem konkrétních provedení zde uvedených.

Obrázek 1 ukazuje TLC destičky ethanolových extraktů a vzorků LPS získaných za různých teplot ethanolových extrakcí. Destička vlevo ukazuje, zleva doprava, ethanolové extrakty při teplotách 22 °C, 37 °C a 50 °C. Vzorek zcela vpravo na této destičce je původní vzorek LPS. Destička vpravo ukazuje LPS získané z každé přípravy. Vzorky v drahách 3, 4 a 5 odpovídají LPS z buněk podrobených pre-extrakcím ethanolem při 22 °C, 37 °C, respektive 50 °C. Výrazné pruhy v Rf ~ 0,6 odpovídají nečistotám fosfolipidů a mastných kyselin. Množství těchto nečistot se snižuje se zvyšující se teplotou ethanolových extrakcí aje velmi nízké ve vzorku, který byl pre-extrahován při 50 °C.

-2CZ 305565 B6

Popis ilustrativních provedení

b) udržování kultury ve stacionární fázi po dobu nejméně dvou hodin;

c) sklizení buněk z kultury; a

d) extrakci LPS z buněk.

Lipopolysacharidy jsou hlavní lipidovou složkou vnější vrstvy vnější membrány gram-negativních bakterií. Lipopolysacharidová frakce gram-negativní bakterie obsahuje, kromě jiných složek, lipid A. Jak bylo popsáno, z lipidu A může být odstraněn sacharid a lipid A může být částečně defosforylován za vzniku monofosforyllipidu A (MLA) a MLA může být selektivně deacylován v pozici 3 za vzniku 3-O-deacylovaného-4'-monofosforyllipidu A (3D-MLA).

Lipid A produkovaný gram-negativními bakteriemi však obvykle obsahuje mnoho druhů, které mají stejnou základní strukturu lipidu A, ale liší se počtem skupin mastných kyselin, které obsahují. Skupiny druhů lipidu A se stejným počtem mastných kyselin jsou zde nazývány jako „rodiny“. Rodiny lipidu A s 4 až 7 skupinami mastných kyselin jsou vyráběny v průmyslovém rozsahu standardním kultivováním gram-negativních bakterií, jako je S. minnesota R595. Výsledný 3DMLA vyráběný z lipidu A např. z S. minnesota R595 obsahuje rodiny obvykle s 3 až 6 skupinami mastných kyselin (protože při vzniku 3D-MLA dochází ke ztrátě jedné skupiny mastné kyseliny).

Heterogenitu v složení rodiny 3D-MLA (díky lipidu A a MLA) lze přičíst dvěma zdrojům: 1) biosyntetické variabilitě v uspořádání lipidu A a 2) ztrátě skupin mastných kyselin z kostry lipidu A během zpracování 3D-MLA. Jedno z dalších vysvětlení, ačkoliv není teoreticky podloženo, předpokládá, že k biosyntetické variabilitě přispívá ne zcela absolutní substrátová specifita acyltransferas podílejících se na terminálních krocích biosyntézy lipidu A. Ke ztrátě skupiny mastných kyselin z kostry lipidu A může také docházet během kyselé a alkalické hydrolýzy obvykle používaných při výrobě 3D-MLA.

Překvapivě bylo zjištěno, že složení rodiny 3D-MLA může být pozměněno změnou parametrů procesu kultivace hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene, který produkuje lipid A. Konkrétně bylo objeveno, že výsledkem udržování kultury hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene ve stacionární fázi po dobu nejméně 5 hodin před sklizní je změna v podílu produkovaných rodin lipidu A tak, že obvykle nejméně 20 mol. % 3D-MLA, následně vyrobeného z lipidu A, obsahuje 6 mastných kyselin. S výhodou nejméně 50 mol. % 3D-MLA obsahuje 6 mastných kyselin. Udržování ve stacionární fázi po dobu 5,5 hodiny bylo nalezeno jako obzvláště účinné. To je odlišné od typických kultivačních procesů známých v oboru, kde ke sklizni dochází takřka okamžitě po vstupu kultury do stacionární fáze; u tohoto známého procesu je obsah rodin LPS vysoce variabilní a výsledkem je 3D-MLA s variabilním obsahem hexaacylované rodiny.

Pojmem „hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen“ se rozumí kmen gram-negativní bakterie s hluboce zvrásněným fenotypem. „Hluboce zvrásněný“ fenotyp znamená, že polysacharidový zbytek navázaný na lipid A obsahuje pouze 2-3 zbytky kyseliny 2-keto-3-deoxy-D-mannooktulonové (KDO). S výhodou je hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen vybrán z rodu Salmonella. Ještě výhodněji, pokud je hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen zrodu Salmonella, je to druh Salmonella minnesota, aještě výhodněji je to kmen Salmonella minnesota R595. Mohou být použity i další hluboce zvrásněné mutantní bakteriální kmeny, jako jsou, mezi jinými, kmeny Próteus mirabilis.

-3CZ 305565 B6

Pro pěstování hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene může být použita jakákoliv vhodná technika. Obvykle bude tato technika zahrnovat použití nejméně jednoho bioreaktoru průmyslového rozsahu. V jednom provedení zahrnuje technika inokulaci relativně malého (např. 15 1) bioreaktoru buňkami hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene, napěstování hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene až do stacionární fáze s následným aseptickým přenosem obsahu 15 1 bioreaktoru do velkého (např. 750 1) bioreaktoru.

Pěstování může být prováděno v jakémkoliv médiu, ať už známém, nebo objemném, které by umožňovalo růst hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene. V jednom výhodném provedení je médiem médium M9, směs anorganických solí doplněná dextrosou a kaseinovým hydrolyzátem. Složení MD je dobře známo osobám znalým oboru.

Poté, co byl hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen udržován ve stacionární fázi po dobu nejméně 5 hodin, mohou být buňky sklizeny z kultury a LPS extrahován z buněk. Pro sklizení buněk z kultury a extrakci LPS z buněk mohou být použity známé techniky, výhodná technika extrakce LPS z buněk je však popsána níže.

Sklizení může být provedeno jakoukoliv známou technikou. V jednom výhodném provedení je obsah bioreaktoru poté, co byla buněčná kultura udržována ve stacionární fázi po dobu nejméně 5 hodin, vypumpován do úhlového filtračního přístroje, aby se oddělilo vyčerpané médium od buněk.

LPS je poté extrahován z buněk jakoukoliv vhodnou technikou. Známé techniky zahrnují metodu Galanose, která obsahuje extrakci LPS směsí fenolu, chloroformu a petroletheru (PCP) s následným odpařením chloroformu a petroletheru, přidání acetonu a vody, aby se vysrážely LPS, a opětovné získání LPS centrifugaci nebo filtrací (Galanos et al., Eur. J. Biochem. 9: 245 (1969)), a metodu Chena, citovanou výše, která zahrnuje extrakci LPS směsí chloroformu a methanolu (CM) následovanou sérií kroků precipitací methanolem.

Zdokonalení metody Chena je popsáno níže aje upřednostňováno pro výrobu LPS a jeho derivátu pro komerční použití.

Bez ohledu na extrakční techniku je výsledkem v podstatě čistý vysušený LPS, který může být dále zpracováván postupnou kyselou a zásaditou hydrolýzou, aby vznikl 3D-MLA, jak je uvedeno v Ribi, U.S. Pat. 4 436 727, a v Myers et al., U.S. Pat. 4 912 094, které jsou zde uvedeny jako odkazy. Pokud shrneme výstup těchto odkazů jako výhodné provedení výroby 3D-MLA, je LPS zreagován s organickou nebo anorganickou kyselinou a poté zlyofilizován, aby se získal MLA. Anorganickou kyselinou je s výhodou kyselina chlorovodíková, kyselina sírová nebo kyselina fosforečná. Organickou kyselinou je s výhodou kyselina toluensulfonová nebo kyselina trichloroctová. Reakce může být provedena při teplotě mezi 90 °C a 130 °C po dostatečně dlouhou dobu pro dokončení hydrolýzy, obvykle mezi 15 minutami a 60 minutami. MLA může být zreagován s rozpouštědlem, s výhodou acetonem, aby se rozpustily mastné kyseliny a další nečistoty, a poté je rozpouštědlo obohacené o nečistoty a mastné kyseliny odstraněno.

Poté se MLA podrobí slabému alkalickému opůsobení, aby se selektivně odstranila β-hydroxymyristová kyselina v pozici 3 MLA (za slabých alkalických podmínek je labilní pouze β-hydroxymyristová kyselina v pozici 3). Slabé alkalické opůsobení může být provedeno ve vodném nebo organickém médiu. Vhodná organická rozpouštědla zahrnují methanol nebo další alkoholy, dimethyl-sulfoxid (DMSO), dimethyl-formamid (DMF), chloroform, dichlormethan nebo mezi dalšími i jejich směsi. Mohou být také využity i kombinace vody a organických rozpouštědel mísitelných s vodou.

Alkalická báze použitá pro provedení hydrolýzy je s výhodou vybrána z hydroxidů, uhličitanů, fosfátů nebo aminů. Příklady anorganických bází zahrnují, kromě jiných, hydroxid sodný, hydroxid draselný, uhličitan sodný, uhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný a hydrogen-4CZ 305565 B6 uhličitan draselný. Příklady organických bází zahrnují, kromě jiných, alkylaminy (jako jsou, kromě jiných, diethylamin a triethylamin).

Ve vodném médiu se pH pohybuje obvykle mezi 10 a 14, s výhodou mezi 10 a 12. Hydrolýza je obvykle prováděna při 20 °C až 80 °C, s výhodou mezi 50 °C až 60 °C po dobu 10 minut až 48 hodin.

Jedna výhodná technika alkalické hydrolýzy zahrnuje rozpuštění MLA v CM 2:1 (v/v), saturaci roztoku vodným pufrem 0,5 M Na₂CO₃ s pH 10,5 a následné rychlé odpaření rozpouštědla při 45 až 50 °C za tvorby vakua (přibližně 100 mm Hg).

a) extrakci buněk roztokem obsahujícím nejméně 75 % alifatického alkoholu s 1 až 4 uhlíkovými atomy a doplňkovou vodu, výsledkem extrakce jsou buňky se sníženým obsahem fosfolipidů;

b) extrakci buněk se sníženým obsahem fosfolipidů roztokem obsahujícím chloroform a methanol, čímž vzniká roztok LPS v chloroformu a methanolu.

Buňky hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene, jejich kultivace a metody přípravy kultury jsou takové, jak byly popsány výše. S výhodou je hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen vybrán z rodu Salmonella a Escherichia. Ještě výhodněji, pokud je hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen z rodu Salmonella, je to druh Salmonella minnesota, a ještě výhodněji je to kmen Salmonella minnesota R595. Jestliže je hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen z rodu Escherichia, pak je to s výhodou druh Escherichia coli, a ještě výhodněji je to kmen Escherichia coli D3 lm4.

První extrakční krok může být proveden jakýmkoliv alifatickým alkoholem s krátkým řetězcem. Alifatický alkohol může být lineární, větvený nebo cyklický. S výhodou má alifatický alkohol 2 až 4 uhlíkové atomy aje mísitelný s vodou. Ještě výhodněji je tímto alifatickým alkoholem ethanol.

Roztok obsahující alifatický alkohol může obsahovat jakýkoliv podíl alifatického alkoholu od 75 % hmotn. výše. S výhodou roztok obsahuje mezi 85 % hmotn. a 95 % hmotn. alifatického alkoholu. Hlavním doplňkem v roztoku je voda. Mohou být také přítomny stopy dalších sloučenin z důvodu neúplné purifikace nebo jiné kontaminace alifatického alkoholu a vody v roztoku.

Teplota, při které je prováděn první extrakční krok, může být jakákoliv teplota, která zaručuje dostatečně účinnou extrakci fosfolipidu z kultivovaných buněk. S výhodou je to teplota mezi 35 °C a 65 °C. Ještě výhodněji je to teplota mezi 45 °C a 55 °C.

Ostatní parametry prvního extrakčního kroku, jako jsou, mezi dalšími, rychlost přidávání roztoku alifatického alkoholu, doba kontaktu roztoku a buněk a třepání nebo naopak ponechání v klidu, mohou být rutinně měněny osobou s obvyklými znalostmi oboru.

Výsledkem prvního extrakčního kroku jsou i) fáze roztoku alifatického alkoholu bohatá na fosfolipidy a ii) buňky se sníženým obsahem fosfolipidů. LPS složka buněčných membrán se oddělí téměř dokonale od buněk se sníženým obsahem fosfolipidů.

Druhý extrakční krok zahrnuje extrakci buněk se sníženým obsahem fosfolipidů roztokem chloroform:methanol (CM).

-5CZ 305565 B6

Pro druhý extrakční krok může být použit jakýkoliv poměr chloroformu a methanolu, o němž je známo, že je vhodný pro použití pro extrakci LPS z buněčných membrán (jako např. ve způsobu podle Chena). Typicky je poměr chloroformu k methanolu mezi 2:1 a 9:1. Pro získání LPS z buněk se sníženým obsahem fosfolipidů mohou být také použity směsi rozpouštědel se stejnými vlastnostmi, jako má CM.

Výhoda předkládaného způsobu oproti způsobu Chena spočívá v odstranění fosfolipidů v prvním extrakčním kroku. Zatímco výsledkem extrakce pomocí CM v Chenově způsobu je roztok LPS, který obsahuje podstatné množství fosfolipidů, výsledkem druhého extrakčního kroku podle této přihlášky, který je prováděn na buňkách se sníženým obsahem fosfolipidů, je roztok bohatý na LPS, který však téměř neobsahuje fosfolipidy. Alternativní metody výroby přípravků obsahujících LPS, které relativně neobsahují fosfolipidy, jako je metoda Galanose (viz výše), jsou méně vhodné, protože je není možné přizpůsobit průmyslové výrobě, používají směsi rozpouštědel, které vyvolávají obavy o zdraví a bezpečnost (např. fenol:chloroform:petrolether), případně obojí·

Díky tomu, že v roztoku LPS takřka nejsou přítomné fosfolipidy, je další purifikace LPS podle této metody obecně jednodušší a méně nákladná než podle metody Chena. Bylo zjištěno, že odpařením chloroformu a methanolu z roztoku LPS může být získán suchý LPS o dostatečné čistotě.

LPS může být popřípadě dále zpracován, například v kyselém hydrolyzačním nebo alkalickém hydrolyzačním kroku popsaných výše, aby vznikl MLA nebo 3D-MLA.

3D-MLA vyrobený podle způsobů popsaných výše může být použit na různé účely. Jedním výhodným použitím je použití jako imunostimulantu nebo adjuvans pro farmaceutické přípravky obsahující imunogenní polynukleotid, polypeptid, protilátku. T-buňku nebo antigen-prezentující buňku (APC). Imunostimulantem nebo adjuvans je myšlena v podstatě jakákoliv sloučenina, která zesiluje nebo znásobuje imunitní odpověď (protilátkovou a/nebo buněčně zprostředkovanou) na exogenní antigen.

Jedním typem imunitní odpovědi, který může MLA nebo 3D-MLA vyrobený podle této přihlášky stimulovat, je typ Thl. Bylo pozorováno, že kombinace monofosforyllipidu A (MLA), s výhodou 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (3D-MLA), spolu s hlinitou solí je účinná jako adjuvans pro navození odpovědi převážně typu Thl. Vysoké hladiny cytokinů typu Thl (např. IFN-γ, TNFa, IL-2 a IL—12) mají tendenci navozovat indukci buněčně zprostředkovaných imunitních odpovědí na podávaný antigen. Na druhou stranu, vysoké hladiny cytokinů typu Th2 (např. IL-4, IL-5, IL-6 a IL—10) mají tendenci navozovat indukci protilátkových imunitních odpovědí. Po aplikaci farmaceutického přípravku obsahujícího MLA nebo 3D-MLA bude u pacienta podpořena imunitní odpověď, která zahrnuje odpovědi typů Thl a Th2. Pokud je odpověď převážně typu Thl, pak se zvýší hladina cytokinů typu Thl více než hladina cytokinů typu Th2. Hladiny těchto cytokinů mohou být snadno měřeny použitím standardních metod. Pro souhrn rodin cytokinů je doporučena publikace Mosmann a Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989.

V jednom výhodném provedení systém adjuvans zahrnuje kombinaci monofosforyllipidu A (MLA), s výhodou 3D-MLA, s derivátem saponinu (jako je Quil A nebo jeho deriváty, včetně QS21 a QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escin; Digitonin; nebo saponiny z Gypsophila nebo z Chenopodium quinoá), jako je kombinace QS21 a 3D-MLA adjuvans, jak bylo popsáno ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní přípravek, kde je účinek QS21 zmírněn cholesterolem, jak bylo popsáno ve WO 96/33739. Další výhodné přípravky zahrnují emulzi oleje ve vodě a tokoferol. Další zvláště výhodný přípravek adjuvans obsahující QS21, 3D-MLA a tokoferol v emulzi oleje ve vodě je popsán ve WO 95/17210.

-6CZ 305565 B6

Následující příklady jsou uvedeny pro demonstrování výhodných provedení vynálezu. Osobami zkušenými v oboru by mělo být oceněno, že techniky popsané v následujících příkladech představují techniky objevené původcem tak, aby dobře fungovaly během provádění metody uvedené ve vynálezu, a proto by měly být považovány za výhodné postupy pro jejich provádění. Osoby zkušené v oboru by však ve světle této přihlášky měly ocenit, že může být učiněno mnoho změn ve specifických provedeních, která jsou uvedena, a stále mohou být získány obdobné výsledky, aniž by byl opuštěn duch či záměr vynálezu.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1 - Obecné metody

A. Přípravy médií

Růst buněk se provádí v médiu M9, které se připraví zkombinováním sterilních roztoků anorganických solí, kaseinového hydrolyzátu a dextrosy. Roztok solí M9 se obvykle připraví ve fermentoru a obsahuje následující soli: 2,0 g/1 NaCl; 0,2 g/1 MgSO₄. 7H₂O; 3,0 g/1 KH₂PO₄; 6,0 g/1 Na₂HPO₄ a 1,0 g/1 NHtCl. Sterilní roztoky 20% (w/v) kaseinového hydrolyzátu (20 ml/1) a 50% (w/v) dextrosy (32 ml/1) se poté asepticky přidají do fermentoru, aby se získalo kompletní médium.

B. Pěstování inokula

Typicky se do sterilní 250 ml Erlenmeyerovy baňky nalije 50 ml sterilního média M9. Rozmrazí se ampule inokula Salmonella minnesota R595 (přibližně 10⁸ cfů) a přidá se do baňky, která se uzavře gázovou zátkou. Kultura se inkubuje při 37 °C po dobu 6 až 8 h, dokud není pozorován masivní růst.

C. Pěstování buněk

Kultury Salmonella minnesota R595 se pěstují ve fermentoru BioFlo III (New Brunswick Scientific, lne.) vybaveném 2,5 1 skleněnými nádobami. V typickém experimentu se do nádoby nalije 2,0 1 roztoku solí M9, zautoklávuje a následně se asepticky přidají sterilní roztoky kaseinového hydrolyzátu a dextrosy. Fermentor se vybaví přívodními trubkami pro protipěnící látku (0,1% SAG-471, Witco Corp.) aNH₄OH (30%), a také sondami pro měření pH, dO₂ a pěny. pH média se upraví na 6,9 pomocí dávky NFEOH. Fermentor se poté zaočkuje celou kulturou inokula a inkubuje se při 37 °C za probublávání vzduchem (obvykle 2,0 1 za min) a třepání (obvykle 50 rpm). Růstová fáze kultury se monitoruje měřením optické hustoty při 590 nm. Buňky se sklidí buď centrifugací, nebo úhlovou průtokovou filtrací, promyjí se vodou a lyofilizují.

D. Extrakce lipopolysacharidu (LPS)

LPS se izoluje podle metodiky Qureshiho et al. (1986) s malými úpravami. V typickém experimentu se nejprve sušené buňky rozmíchají na koncentraci 20 mg/ml v 90% ethanolu (v/v) a dále se míchají při pokojové teplotě po 1 h a pak se znovu získají vakuovou filtrací. Poté se buňky podrobí druhé ethanolové extrakci následované po sobě jdoucími extrakcemi acetonem a diethyletherem (15 min každá extrakce, obě při koncentraci 40 mg/ml vzhledem k původní hmotnosti) a výsledný etherový prášek se nechá na vzduchu vysušit přes noc. Mezitím se připraví roztok fenol (89%): chloroform:petrolether 19:45:72 (nInIn; zkracováno na PCP) a nechá se ustát přes noc. Etherový prášek se rozsuspenduje v PCP, ze kterého se slije přebytek vody, na koncentraci 70 mg/ml. Roztok se míchá po dobu 30 min a pak se zcentrifuguje (3000 x g, 15 min, 0 až 5 °C). Supematantová frakce se slije do nádoby s kulatým dnem a buněčná peleta se podruhé extrahuje pomocí PCP. Supematantové frakce se slijí a rotačně se odpařují při 40 °C, dokud se neodstraní

-7CZ 305565 B6 téměř všechna těkavá rozpouštědla. Poté se změří zbývající objem. Po kapkách se přidá voda až do té doby, než se objeví trvalý zákal, a poté se k fenolovému roztoku za rychlého míchání přidá 5 objemů acetonu následováno 1 objemem diethyletheru (obojí vychlazené v ledové lázni). Roztok se umístí do ledové lázně na dobu 30 min a poté se vysrážený LPS získá centrifugací (5000 x g, 15 min, 0 až 5 °C). Aby se získal veškerý LPS, který nesedimentoval při centrifugaci, je obecně nutné provést gravitační filtraci supernatantové frakce. LPS se jednou promyje minimálním objemem vychlazeného acetonu, znovu se získá centrifugací/filtrací a poté se usuší pomocí vakua. Typický výtěžek je 4 až 5 % vzhledem k počáteční váze suchých buněk.

E. Příprava 4'-monofosforyllipidu A (MLA)

LPS se rozsuspenduje ve vodě na koncentraci 10 mg/ml pomocí sonikační lázně o teplotě 45 až 55 °C, aby se napomohlo disperzi pevné látky. Výsledný roztok by měl být lehce zakalený bez částic viditelných pouhým okem. K tomuto roztoku se přidá 1 objem 0,2 N HC1 a pak se roztok umístí do lázně s vroucí vodou na dobu 15 min. Reakce se ukončí v ledové lázni a roztok se extrahuje 5 objemy (vzhledem k původnímu roztoku LPS) roztoku chloroforrmmethanol 2:1 (v/v). Bifazický roztok se zvortexuje a fáze se oddělí pomalou centrifugaci (500 až 1000 x g). Odebere se spodní fáze a odpaří se v atmosféře dusíku za vzniku hrubého MLA.

F. Příprava 3-O-deacylovaného 4'-monofosforyllipidu A (3D-MFA)

Hrubý MFA se rozpustí v roztoku chloroform:methanol 2:1 (v/v) na koncentraci mezi 1 až 5 mg/ml a 3,0 ml tohoto roztoku se přenesou do 16 x 100 mm testovací zkumavky. Do zkumavky se přidá ještě 0,4 ml methanolu a pak se zkumavka umístí do vodní lázně o teplotě 50 °C na dobu 10 min. Reakce se zahájí přidáním 40 μΐ 0,5 M KHCO3, pH 10,5 a roztok se inkubuje při 50 °C po dobu 20 min. Na konci této doby se zkumavka vyjme z vodní lázně a reakce se zastaví přidáním 2,0 ml 0,1 N HC1 (vychlazené) a vše se zvortexuje. 3D-MFA se získá přidáním 1,0 ml methanolu, vortexováním, centrifugaci (500 až 1000 x g) a odpařením spodní (organické) fáze do sucha v atmosféře dusíku.

Příklad 2 - Analytické metody

A. Chromatografie MFA a podobných vzorků na tenké vrstvě (TFC)

Všechny analýzy TFC se provádějí pomocí destiček o rozměrech 5 x 10 cm potažených Silikagelem 60 (E Merck). Vzorky se obvykle nanášejí na TFC destičky jako roztoky o koncentraci 10 mg/ml v roztoku chloroforrmmethanol 4:1 (v/v). Pomocí kapilární pipety se nanášejí 3 μΐ roztoku (30 μg vzorku) jako malé kapky 5 mm od sebe. Destičky se vyvíjejí rozpouštěcím systémem obsahujícím chloroform/methanol/vodu/hydroxid amonný 50:31:6:2 (v/v). Pruhy se na vyvíjených destičkách vizualizují nasprejováním roztokem 10% (w/v) kyseliny fosfomolybdenové v ethanolu následovaném pražením při 150 až 160 °C. V některých případech se relativní intenzity skvrn kvantifikují skenovací denzitometrií pomocí přístroje Shimadzu CS9000U Duál Wavelenght Flying Spot Scanner (Shimadzu Corp.) při použití skenovací vlnové délky 520 nm.

B. Analýza MFA/3D-MFA vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPFC)

Vzorky, které mají být analyzovány, se nejprve převedou na formu volné kyseliny promytím roztoku 3 až 5 mg vzorku v 5 ml chloroforrmmethanol (2:1 v:v) pomocí 2 ml 0,1 N HC1. Bifazický systém se zvortexuje, zcentrifuguje a spodní (organická) fáze se přenese do testovací zkumavky a odpaří se pod proudem dusíku. Zbytek se poté methyluje za použití diazomethanu. Ve zkratce, etherový roztok diazomethanu se připraví navážením 60 až 100 mg l-methyl-3-nitro-l-nitrosoguanidinu (MNNG; Aldrich) v ampuli o obsahu 2 gramů, přidáním 60 μΐ diethyletheru na mg MNNG a následným přidáním 9 μΐ 5 N NaOH na mg MNNG během míchání roztoku při méně

-8CZ 305565 B6 než -10 °C. Po skončení reakce se citrónově žlutá etherová fáze usuší přenesením do druhé ampule, která obsahuje několik peciček NaOH, a vše se míchá při méně než -10 °C. Kyselinou promytý vzorek se rozpustí v 1 ml roztoku chloroforrmmethanol 4:1 (v:v), umístí se do lázně o teplotě méně než -10 °C a po kapkách se přidá roztok diazomethanu a vše se míchá až do doby, kdy přetrvává slabě nažloutlé zabarvení. Rozpouštědlo se poté odpaří při pokojové teplotě pod proudem dusíku a vzorek se dále suší pod vakuem po dobu nejméně 30 min.

Chromatografické analýzy se provedou na koloně s reverzní fází Cu (Nova-Pak, velikost částic 4 pm, 8 mm x 10 cm [Waters]). Methylované vzorky se rozpustí v roztoku chloroform:methanol 4:1 (v/v) na koncentraci 100 pg/ml a přefiltrují se přes 0,45 pm PTFE stříkačkový filtr. Obvykle se použije injekční objem 20 až 25 pl následovaný elucí s lineárním gradientem 20 až 80% isopropanolu v acetonitrilu po dobu 60 min při rychlosti průtoku 2 ml/min a monitorování při 210 nm.

C. Analýza obsahu rodiny LPS pomocí HPLC

LPS bývá vysoce heterogenním materiálem díky variabilitě v 1) počtu sacharidových zbytků v O-antigenní a centrální oblasti, 2) polárních substitucích v centrální oblasti a fosfátech v lipidu A a 3) počtu a poloze mastných kyselin připojených na páteř lipidu A. Tento poslední zdroj variability je předmětem zájmu vzhledem k obsahu rodiny 3D-MLA (MPL®). Hydrolýza LPS na MLA a 3D-MLA odstraňuje variabilitu v O-antigenní a centrální oblasti, avšak vytváří také další heterogenitu díky nekontrolovatelné ztrátě O-vázaných mastných kyselin. To zabraňuje přesnému stanovení stavu acylace neporušeného LPS. Aby bylo možné tomuto se vyhnout, byla vynalezena metoda, kde jsou fosfáty a centrální oblast odstraněny za mírných podmínek, které nevedou ke ztrátě O-vázaných mastných kyselin. Výsledný defosforylovaný lipid A (nulový fosforyllipid A nebo ZPL) může potom být analyzován metodou HPLC, která přesně určí stav acylace ve výchozím LPS.

Tato metoda se obvykle provádí následovně. 0,5 až 5,0 mg vzorku LPS se hydrolyzuje v 200 μΐ koncentrované kyseliny fluorovodíkové po dobu 3 až 4 h při 27 °C. Tato reakce musí být prováděna v pevně uzavřené teflonové zkumavce a v dobře odvětrávané digestoři. HF se odstraní odpařením pod proudem dusíku při pokojové teplotě a hydrolyzát se poté rozpustí v roztoku chloroforrmmethanol 4:1 (v/v) a přenese se do 16 x 100 mm skleněné testovací zkumavky a rozpouštědlo se odpaří pod proudem dusíku. Zbytek se rozsuspenduje v 1,0 ml 0,1% triethylaminu pomocí sonikace v lázni, přidá se 1,0 ml 40 mM NaOAc a zkumavka se ponoří do vroucí vodní lázně na dobu 30 až 45 min. Reakce se zastaví ochlazením v ledové lázni a ZPL se znovu získá extrakcí 5 ml roztoku chloroforrmmethanol 2:1 (v/v). Organická fáze se přenese do malé zkumavky se šroubovacím víčkem a rozpouštědlo se odpaří v atmosféře dusíku. Derivát ZPL se připraví přidáním 200 μΐ roztoku 10 mg/ml O-(3,5-dinitribenzyl)hydroxylamin-HCl (Regis Technologies, lne.) v pyridinu, pevným uzavřením zkumavky a následnou inkubací při 60 °C po dobu 3 h. Pyridin se odpaří v atmosféře dusíku a zbytek se dále suší pod vakuem dobu více jak 30 min. Zbytek se poté rozsuspenduje v 500 μΐ roztoku chloroforrmmethanol 2:1 (v/v) a nanese se na 0,5 až 1,0 ml vrstvu Accell-QMA (acetátová forma; Waters), která byla pre-ekvilibrována stejným rozpouštědlem. Kolona se promyje celkem 5,0 ml roztoku chloroforrmmethanol 2:1 (v/v) v několika malých dávkách a eluát se sbírá do 16 x 100 mm testovací zkumavky. Keluátu se přidají 2,0 ml 0,1 N HC1, bifazický systém se zvortexuje, krátce zcentrifuguje při 500 až 1000 x g a pak se spodní (organická) fáze přenese do další testovací zkumavky a odpaří se v atmosféře dusíku. Zbytek se rozpustí v 100 až 300 μΐ roztoku chloroforrmmethanol 4:1 (v:v) a přefiltruje přes 0,45 pm PTFE stříkačkový filtr. Filtr se dvakrát propláchne roztokem chloroforrmmethanol 4:1 (v/v) a filtrát se odpaří v atmosféře dusíku. Nakonec se filtrát převede do 50 až 150 μΐ roztoku chloroforrmmethanol 4:1 (v:v) a přenese se do autoinjektorové zkumavky pro HPLC analýzu. Podmínky HPLC jsou následující: kolona s reverzní fází Cu (např. Waters), 10 μΐ injekční objem, lineární gradient 20 až 80 % isopropanolu v acetonitrilu po dobu 60 min při průtoku 2 ml/min, monitorování při 254 nm.

-9CZ 305565 B6

Příklad 3 - Porovnání zastoupení rodiny MLA/3D-MLA z kultur sklízených v různých časech

Provede se série pokusů ve fermentoru s následujícími parametry: 2,0 1 média M9 (počáteční pH 6,84 až 6,87), průtok vzduchu 2 1 za min, třepání rychlostí 50 rpm, 37 °C, bez kontroly pH. Kultury se sledují měřením optické hustoty při 590 nm a růst kultury se zastaví v okamžiku, kdy se dosáhne požadovaného stadia růstu. Buňky se zpracují a extrahují, jak bylo popsáno výše, aby se získaly vzorky LPS, které se následně hydrolyzují na MLA a 3D-MLA a analyzují metodou HPLC (viz Příklady 1 a 2). Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1.

Tabulka 1. Zastoupení rodiny MLA a 3D-MLA z buněk sklízených v různých časech.

Pokus	Popis	Stáří kultury při sklízení	Doba ve stacionární fázi	MLA	3D-MLA
3-O- deacylovaný hexaacyl	heptaacyl	3-O- deacylovaný hexaacyl
A	Pozdní exponenciální	6,75 h	N/A	12,4 %	12,2 %	9,9%
B	Časná stacionární fáze	9,5 h	~0,5h	9,2%	6,8%	9,2%
C	Pozdní stacionární fáze	15 h	~6h	19,5 %	13,2 %	21,5 %

Data ukazují, že kultury 5. minnesota R959 mění během stacionární fáze stav acylace svých LPS, dochází ke zvýšení celkového obsahu 3-O-deacylovaných hexaacylovaných a heptaacylovaných druhů v MLA odvozených z těchto LPS, což následně zvyšuje i obsah 3-O-deacylovaných hexaacylovaných druhů v 3D-MLA připravených z těchto MLA.

Příklad 4 - Porovnání zastoupení rodiny LPS z kultur sklízených v různých časech

Provede se série pokusů ve fermentoru s následujícími parametry: 2,0 1 média M9 (počáteční pH 6,84 až 6,87), průtok vzduchu 2 1 za min, třepání rychlostí 225 rpm, 37 °C, bez kontroly pH. Stadia růstu kultur se sledují měřením optické hustoty při 590 nm. Buňky se zpracují a extrahují, jak bylo popsáno výše v Příkladu 1, aby se získaly vzorky LPS. LPS vzorky se hydrolyzují na ZPL a analyzují metodou HPLC, jak bylo popsáno v Příkladu 2. Výsledky jsou shrnuty v Tabulce

2.

- 10CZ 305565 B6

Tabulka 2. Zastoupení rodiny LPS z buněk sklízených v různých časech.

Pokus	Popis	Stáří kultury Při sklízení	Doba ve stacionární fázi	Obsah rodiny
3-O-acyl hexaacyl	3-O- deacylovaný hexaacyl	heptaacyl
A	Časná stacionární fáze	9h	~0,5h	76%	0%	24%
B	Pozdní stacionární fáze	15 h	~6h	48%	17%	19%

V LPS z buněk časné stacionární fáze (pokus A) se nedetekuje žádná 3-O-deacylovaná hexaacylovaná složka. Proto jediným zdrojem hexaacylovaných rodin 3D-MLA připravených z tohoto LPS by byl heptaacylovaný materiál (24 %). Naopak, LPS z buněk sklízených v pozdní stacionární fázi obsahuje jak heptaacylované, tak i 3-O-deacylované hexaacylované druhy ío (19%, respektive 17 %). Oba tyto druhy se budou podílet na obsahu hexaacylů v 3D-MLA (MPL®) připraveného z tohoto LPS. Neočekávaně se zjistilo, že buňky za určitých podmínek produkují 3-O-deacylované hexaacylované druhy LPS.

Příklad 5 - Účinek pre-extrakční teploty na čistotu LPS z S. minnesota R595

Buňky S. minnesota R595 se napěstují v 80 1 fermentoru (New Brunswick Scientific) za v podstatě stejných podmínek, jaké byly popsány v Příkladu 1. Buňky se zakoncentrují úhlovou průtokovou filtrací, ale necentrifugují, a suspenze pak obsahuje 51,5 mg suché buněčné hmoty na ml.

Připraví se tři roztoky, ve kterých se smíchají 150 ml alikvoty buněčné suspenze s 600 ml ethanolu. Ethanolové roztoky se míchají po dobu 1 hod při 22 °C, 37 °C a 50 °C a pak se zfiltrují. Buňky se podrobí druhé ethanolové extrakci za stejných podmínek kromě toho, že se použije 95% ethanol. Buňky se opětovně získají podtlakovou filtrací a přes noc se extrahují roztokem chloroform:methanol 4:1 (v/v) při 50 °C. Roztoky se přefiltrují a filtráty se rotačně odpaří dosucha a tak vzniknou vzorky LPS. Vzorky z filtrátů z první a druhé ethanolové extrakce získané při všech teplotách, stejně jako LPS získané z pre-extrahovaných buněk se analyzují chromatografií na tenké vrstvě podle metody v Příkladě 2. Obrázky destiček TLC jsou ukázány na Obrázku 1.

Obrázek 1 ukazuje destičky TLC s ethanolovými extrakty a vzorky LPS získanými při různých teplotách během ethanolových extrakcí. Destička vlevo ukazuje, zleva doprava, ethanolové extrakty při teplotách 22 °C, 37 °C a 50 °C. Vzorek zcela vpravo na této destičce je původní vzorek LPS. Destička vpravo ukazuje LPS získané z každé přípravy. Vzorky v drahách 3, 4 a 5 odpovídají LPS z buněk podrobených pre-extrakcím ethanolem při 22 °C, 37 °C, respektive 50 °C. Výrazné pruhy v R_f ~ 0,6 odpovídají fosfolipidovým nečistotám a nečistotám mastných kyselin. Množství těchto nečistot se snižuje se zvyšující se teplotou ethanolových extrakcí a je velmi malé ve vzorku, který se pre-extrahuje při 50 °C.

Z destiček TLC na Obrázku 1 je zřejmé, že pre-extrakce ethanolem při zvýšených teplotách je účinná pro odstranění nečistot, které se jinak ko-extrahují roztokem chloroform:methanol 4:1 (v/v). Výsledkem pre-extrakce při 50 °C je LPS, které téměř neobsahuje tyto nečistoty.

- 11 CZ 305565 B6

Příklad 6 - Porovnání LPS získaných s a bez pre-extrakce ethanolem

V 750 1 fermentoru (B. Braun) se napěstují tři várky buněk S. minnesota R595 za v podstatě stejných podmínek, jaké byly uvedeny v Příkladě 1. Buňky se sklidí úhlovou průtokovou filtrací a z každé várky se získají vzorky buněčné suspenze, které se zlyofilizují. Zbytek buněk se podrobí dvěma pre-extrakcím 90% ethanolem při 50 °C po dobu 1 h. Mezi extrakcemi se buňky opětovně získají úhlovou průtokovou filtrací. Buňky se poté přes noc extrahují roztokem chloroform:methanol 4:1 (v/v) za zpětného proudění. Extrakt se znovu získá úhlovou průtokovou filtrací a odpaří se dosucha. Lyofilizované vzorky buněk se extrahují přes noc roztokem chloroforrmmethanol 4:1 (v/v) za zpětného proudění a roztoky se přefiltrují a filtráty se odpaří dosucha. Vzorky LPS získané s a bez ethanolové pre-extrakce se analyzují metodou TLC tak, jak to bylo popsáno v Příkladě 2. Destičky TLC se skenují od Rf = 0,01 až 0,90 a pro všechny vzorky se vypočítá. poměr intenzity oblasti LPS (Rf = 0,01 až 0,20) a celkové intenzity. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3.

Tabulka 3. Čistota LPS z buněk pre-extrahovaných a nepre-extrahovaných ethanolem.

Pokus	Číslo šarže	Procento celkové intenzity v oblasti LPS¹
bez ethanolové pre- extrakce	s ethanolovou pre- extrakcí
A	48020-B2698C	7	86
B	48020-C0598A	11	83
C	48020-C0598B	14	88

Poznámka:

Procento celkové intenzity v oblasti LPS = [(intenzita v R_f = 0,01 až 0,020)/(intenzita v Rf = 0,01 až 0,90)] x 100

Výsledky v Tabulce 3 ukazují, že LPS získaný po pre-extrakci buněk S. minnesota R595 90% ethanolem při 50 °C je podstatně čistší než materiál z buněk bez pre-extrakce.

Všechny zde popsané a nárokované metody mohou být prováděny bez přílišného experimentování ve smyslu této přihlášky. Přestože přípravky a metody tohoto vynálezu byly popsány jako výhodná provedení, bude osobám zkušeným v oboru zřejmé, že může být aplikováno mnoho odchylek u jednotlivých kroků nebo sledů kroků u metod popsaných zde, aniž by došlo k odklonu od konceptu, ducha a záměru vynálezu. Konkrétněji, bude zřejmé, že určité látky, které jsou chemicky i fyziologicky podobné, mohou nahradit látky popsané zde a byly by získány tytéž nebo podobné výsledky. Všechny takovéto substituenty a modifikace zřejmé osobám zkušeným v oboru jsou považovány za součást ducha, záměru a konceptu vynálezu, jakje definováno v připojených nárocích.

Průmyslová využitelnost

Metody uvedené v této přihlášce zvyšují výtěžek požadovaných rodin 3D-MLA nebo minimalizují náklady na purifikaci lipolysacharidových (LPS) prekurzorů 3D-MLA. 3D-MLA vyrobený podle metod popsaných výše může být použit na různé účely. Jedním výhodným použitím je po- 12CZ 305565 B6 užití jako imunostimulantu nebo adjuvans pro farmaceutické přípravky obsahující imunogenní polynukleotid, polypeptid, protilátku, T-buňku nebo antigen-prezentující buňku (APC).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby lipopolysacharidového přípravku (LPS), vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) pěstování kultury hluboce zvrásněného mutantního bakteriálního kmene v médiu;

b) udržování kultury ve stacionární fázi po dobu nejméně 5 h;

c) sklízení buněk z kultury; a

d) extrakci LPS z buněk.
2. Způsob výroby lipopolysacharidového přípravku (LPS) podle nároku 1, vyznačující se t í m , že hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen je z rodu Salmonella.
3. Způsob výroby lipopolysacharidového přípravku (LPS) podle nároku 2, vyznačující se tím, že hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen z rodu Salmonella je z druhů Salmonella minnesota.
4. Způsob výroby lipopolysacharidového přípravku (LPS) podle nároku 3, vyznačující se tím, že hluboce zvrásněný mutantní bakteriální kmen z druhů Salmonella minnesota je kmen Salmonella minnesota R595.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že médiem je médium M9.
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že udržování se provádí po dobu 5 hod až 6 hod.
7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, v y z n a č u j í c í se t í m , že LPS může být použit pro výrobu 3D-MLA s nejméně 20 % mol. hexaacylovaných členů rodiny.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž7, vyznačující se tím, že dále zahrnuje podrobení LPS postupné kyselé hydrolýze a alkalické hydrolýze za vzniku 3D-MLA.