PL216741B1 - Zastosowanie poliklonalnego koziego przeciwciała anty-HLA klasy II - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie poliklonalnego koziego przeciwciała anty-HLA klasy II.

WO 97/02839 dotyczy supresji wirusowej, leczenia i zapobiegania zakażeniom wirusowym. Dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciał neutralizujących do leczenia zakażenia wirusowego u pacjenta, obejmującego dwa etapy:

a. poddanie ssaka działaniu wirusów tak, że omawiany ssak wytwarza przeciwciała neutralizujące wobec tych wirusów; oraz

b. zbieranie tych przeciwciał neutralizujących od ssaka.

W przykładach, uzyskiwana jest szczepionka przeciwko HIV, określona jako AAV2, poprzez mieszanie wirusa HIV z przeciwciałami neutralizującymi HIV otrzymanymi od kozy.

WO 01/60156 dotyczy przeciwciała neutralizującego i immunomodulatorowych kompozycji wzmacniających. Dostarcza kompozycję immunomodulatorową obejmującą:

przeciwciała heterologiczne, specyficzne dla antygenu; oraz antygen, przy czym przeciwciała heterologiczne tworzą kompleks z antygenem do kombinacji z nośnikiem farmaceutycznym. Przykłady są podobne do tych z WO 97/02839, i ponownie uzyskiwana jest szczepionka przeciwko HIV, określona jako AAV2, poprzez mieszanie wirusa HIV z przeciwciałami neutralizującymi HIV uzyskiwanymi od kozy.

WO 02/077 60 dotyczy środka terapeutycznego. Dostarcza sposobu zapobiegania zakażeniu HIV lub leczenia osobnika zakażonego HIV, obejmującego etapy:

(1) wystawienie systemu odpornościowego kozy na działanie HIV;

(2) oczyszczenia przeciwciała z kozy po prowokacji HIV; oraz (3) leczenia osobnika przeciwciałem uzyskanym w etapie 2, powyżej.

We wstępnych badaniach klinicznych, w oparciu o produkt z WO 02/07760, pacjentów z HIV leczono z powodzeniem przy użyciu surowicy z kozy po prowokacji z HIV.

Korzystnie, leczenie wykorzystuje kompozycję surowicy, którą można uzyskać poprzez proces obejmujący wytworzenie skutecznych przeciwciał u kozy, pobieranie krwi od kozy, wykazanie zdolności neutralizującej HIV w pobranej krwi, usunięcie masy stałej z krwi, wytrącenie masy stałej przy zastosowaniu nasyconego siarczanu amonu lub innego odpowiedniego czynnika do wytrącania, oddzielenie osadu, rozpuszczenie osadu w stosownym wodnym podłożu i dializowanie roztworu z wartością odcięcia 5 do 50000 Daltonów, korzystnie 7 do 30000 Daltonów, korzystniej 8500 do 15000 Daltonów, szczególnie około 10000 Daltonów. Sposób immunizacji kozy może być domięśniowy, lecz można zastosować także inne standardowe techniki, jak podawanie podskórne lub śródskórne. Proces oczyszczania może być także przeprowadzony za pomocą innych powszechnych metod frakcjonowania (przykładowo kwasem kaprylowym), przy czym całkowity produkt jest stosowany.

Bardziej konkretnie, leczenie zazwyczaj wykorzystuje surowicę kozią uzyskaną w następujący sposób.

Kozia surowica może być wytwarzana w następujący sposób:

Kozę szczepiono domięśniowo lizatem wirusa HIV-3b zawieszonym w normalnym dostępnym na rynku supernatancie, przy pomocy zastrzyku z HIV-3b o stężeniu 10⁹ cząsteczek wirusa na ml.

Wcześniej wirusa zabijano przez ogrzewanie w 60°C przez 30 min. Po odpowiedniej przerwie czasowej, takiej jak dwa tygodnie, pobierano próbki krwi do wstępnego oszacowania. W zoptymalizowanej procedurze, koza jest szczepiona co tydzień przez cztery tygodnie, a następnie w szóstym tygodniu jest skrwawiana w celu uzyskania reagenta.

₃

Około 400 cm³ krwi jest pobieranych od kozy w sterylnych warunkach. Obszar wkłucia igły jest ₃ golony i odkażany preparatem betadyny. Do pobrania od zwierzęcia około 400 cm³ krwi stosowana ₃ jest igła ze światłem 18. Ważne jest aby zwierzę mogło tolerować pobranie około 400 cm³ krwi bez cierpienia z powodu jakichkolwiek niewykrywalnych efektów. Zwierzę nie musi być zabite. Zwierzę jest ponownie skrwawiane w około 10 do 14 dni po odzyskaniu swojej objętości krwi.

Potwierdzano obecność potencjalnie przydatnych przeciwciał. Po potwierdzeniu obecności takich reagentów, krew pobierano następnie od kozy pomiędzy 4-6 tygodniem i wirowano w celu oddzielenia surowicy. Następnie 300 ml surowicy filtrowano w celu usunięcia dużych skrzepów i materiału makrocząsteczkowego. Następnie surowicę podawano działaniu wysyconego siarczanu amonu (roztwór 45% w temperaturze pokojowej) w celu wytrącenia przeciwciał i innego materiału. Uzyskany roztwór wirowano przy 5000 rpm przez 5 min., po czym usuwano płynny nadsącz. Wytraconą immunoglobulinę zawieszano w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem („bufor PBS, patrz

PL 216 741 B1

Sambrook i wsp. „Molecular cloning, A Laboratory Manual, 1989), wystarczającym do ponownego rozpuszczenia osadu.

Następnie roztwór dializowano przez błonę o wartości odcięcia 10000 Daltonów. Dializę przeprowadzano w buforze PBS, zmienianym co cztery godz., przez okres 24 godz. Dializę prowadzano w 4°C.

Po 24 godzinach dializy zawartość woreczka dializacyjnego przenoszono do sterylnej zlewki. Roztwór dostosowano tak, aby masa na jednostkę objętości wynosiła 10 mg na ml. Rozcieńczanie prowadzano przy użyciu PBS. Uzyskany roztwór filtrowano następnie przez filtr 0,2 mikrona do sterylnego pojemnika. Po filtracji roztwór porcjowano w pojedyncze 1 ml dawki i przechowywano przed użyciem w -22°C.

Reagent jest następnie gotowy do użycia.

W powyżej procedurze można łatwo wprowadzić, takie jak przykładowo, zmiana stężenia siarczanu amonu lub zmiana na inne reagenty. Podobnie wartość odcięcia przy dializie nie musi wynosić 10000 Daltonów.

Dla części sposobów leczenia z zastosowaniem koziej surowicy, odnotowano wystąpienie innych korzystnych rezultatów. Przykładowo, u pacjentów z HIV z cukrzycą typu I, obserwowano polepszenie stanu wywołanego nie tylko pierwotnym zakażeniem HIV, ale także złagodzenie objawów cukrzycy. U pacjentów HIV z niektórymi rodzajami nowotworów, odnotowano remisje nowotworów, tak samo jak objawów HIV.

Ujawnienia znaczącej klinicznej poprawy pacjentów zakażonych HIV, tak samo jak pacjentów z różnymi schorzeniami takimi jak stwardnienie rozsiane i niektóre przypadki raka, mają potencjalne takie powiązanie, że wszystkie te choroby są przewlekłymi stanami zapalnymi.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, ujawniliśmy, że aktywność koziej surowicy jest związana z obecnością aktywności anty-HLA.

Ku naszemu zdziwieniu byliśmy w stanie z łatwością zademonstrować, że kozy immunizowane HIV wytwarzały surowice, które są zdolne do wyłączenia testu odpowiedzi mieszanych limfocytów, który jest jednym z klasycznych testów aktywacji in vitro. Myśląc, że może być to cecha właściwa koziej surowicy, byliśmy pod wrażeniem, kiedy surowica nie zaszczepionej kozy nie posiadała aktywności w tych testach.

Wykazaliśmy także, że aktywność ta jest ściśle związana z aktywnością przeciwciał przeciwko HLA klasy II. Nie wiemy czy reprezentuje to mimikrę odpowiedzi molekularnej, czy koza reaguje na HLA klasy II niesione przez wirusa, kiedy ulega on namnażaniu i jest uwalniany z zakażonych komórek lub czy takie HLA (cząsteczki MHC) są zrzucane niezależnie z wirusa, lecz są wspólnie oczyszczane tak, że przeciwciała wytwarzane są także wobec takich składników błony komórkowej. Rzeczywiście, nie uszło naszej uwadze, że inne cząsteczki błony komórkowej, takie jak receptory chemokin i cząsteczki pokrewne mogą także być w preparacie i mogą indukować odpowiedź przeciwciał, które modulują korzystny efekt terapeutyczny. Jednakże jeśli ma to miejsce to, wydaje się, że odpowiedzi anty-HLA są dominujące i uważamy, że mogą odgrywać znaczącą, lecz nie koniecznie odosobnioną, rolę w odniesieniu do indukowania obserwowanych przeciwzapalnych odpowiedzi.

Badaliśmy surowicę z różnych kóz immunizowanych różnymi preparatami wirusa/komórki i mogliśmy pokazać, że kozy, które otrzymały zastrzyk z koktajlu wytwarzały odpowiedź immunologiczną, która widzi wiele kryptycznych, tzn. cichych części otoczki HIV, które mogą być bardzo ważne w projektowaniu przyszłej szczepionki.

Niniejszym ujawnione jest przeciwciało, które rozpoznaje antygen HLA klasy II do zastosowania w chorobie, która wymaga proliferacyjnej odpowiedzi immunologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie poliklonalnego koziego przeciwciała anty-HLA klasy II do wytwarzania leku do stosowania u ludzi w leczeniu chorób związanych z proliferacyjną odpowiedzią odpornościową, przy czym choroba jest chorobą zapalną, autoimmunizacyjna, uszkodzeniem aksonu lub nerwu lub rakiem. Korzystnie choroba jest wybrana z grupy obejmującej stwardnienie rozsiane (MS), reumatoidalne zapalenie stawów i zapalenie nerwu. Ponadto korzystnie poliklonalne kozie przeciwciało anty-HLA klasy II do zastosowania według wynalazku jest wywołane prowokacją przez HIV. Korzystniej przeciwciało to wykazuje aktywność anty-HLA i anty-HIV.

Spośród surowic o wysokich mianach przeciwciał wobec HLA, zarówno klasy II jak i klasy I, najlepiej wyłączały mieszane odpowiedzi limfocytów i wydają się mieć najlepszą skuteczność w sytuacjach klinicznych te, które mają najwyższe poziomy przeciwciał.

Ku naszemu zdziwieniu stwierdziliśmy, że przeciwciała wobec FAS, głównego liganda apoptozy, miały wyjątkowo wysokie miana. Rzeczywiście korelują one z przeciwciałami MHC klasy II. Bez

PL 216 741 B1 wiązania się z tą teorią, stawiamy hipotezę, że wysokie miano przeciwciał wobec FAS mogłoby prowadzić do natychmiastowej apoptozy, w ciągu kilku minut od przyłączenia przeciwciała do antygenu FAS, i komórka mogłaby zostać uśmiercona. Mogłoby to prowadzić do zahamowania toksycznych chemokin, co do których uważa się, że biorą udział w upośledzeniu w MS.

Zatem, wykazaliśmy niniejszym, że przeciwciała wobec FAS mogą być ważne w leczeniu HIV, stwardnienia rozsianego i innych stanów oraz mogą być współużyteczne z innymi przeciwciałami wobec klasy II i klasy I w leczeniu.

Zatem ujawniono niniejszym, że przeciwciało anty-FAS może być stosowane w leczeniu choroby podatnej na takie leczenie.

Niniejszym opisane zostały kompozycje zawierające przeciwciała anty-HLA i/lub przeciwciała anty-FAS oraz sposoby leczenia wykorzystujących takie kombinacje.

Głównym zastosowaniem surowicy zawierającej anty-HLA jest leczenie chorób z nieprawidłowo wysokimi poziomami HLA. Obejmują one stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzycę, pierwotną marskość żółciową wątroby, marskość autoimmunizacyjną i zaburzenia immunologiczne związane z wirusem b i c dotyczące serca, płuca, skóry, przewodu żołądkowo-jelitowego, nerki, mózgu, CNS. Ogólnie, stany chorobowe, które można leczyć z zastosowaniem rozwiązań według wynalazku obejmują HIV, choroby zapalne, choroby autoimmunizacyjne, uszkodzenia aksonu lub nerwu lub pokrewne upośledzenie lub nowotwory oraz inne choroby lub stany z komponentą zapalną.

Obecność anty-FAS sprawia, że surowice są szczególnie przydatne w chorobach związanych z przewlekle aktywowanymi komórkami, które być może wydzielają niszczące przekaźniki, takie jak cytokiny i chemokiny. Obejmują one stwardnienie rozsiane, wszystkie formy przewlekłych stanów zapalnych układu nerwowego, jak również przewlekłe infekcje takie jak wirusowe, bakteryjne i miejscowe nowotwory związane z przewlekłymi zapalnymi zmianami chorobowymi, w szczególności dotyczącymi płuc, trzustki, wątroby, jelita, węzłów chłonnych, skóry, w szczególności nowotwory komórek płaskich nabłonka i komórek warstwy podstawnej, mogą także przekładać się na pierwotnego i wtórnego raka mózgu i rdzenia kręgowego.

Obserwowane poprawy funkcji nerwowych u osób z urazowym uszkodzeniem nerwów sugerują właściwość czynnika wzrostu neuronów, w wyniku czego może być stosowany przy urazie, uszkodzeniu po zakażeniu np. Guillian-Barre, uszkodzeniu o charakterze nowotworowym itp., neuropatiach związanych z cukrzycami, w alkoholizmie, przy zatruciach metalami lub innymi toksynami itp.

Obserwowane korzystne wpływy na odcień i kolor włosów i skóry sugerują inne unikatowe właściwości, których nie można dotychczas wytłumaczyć powyższymi obserwacjami dotyczącymi przeciwciał itp., tzn. właściwości zapobiegające starzeniu się; doniesienia o redukcji wtórnej aktywności nowotworowej przez surowice sugerują bezpośrednią aktywność przeciwnowotworową, która może być związana z aktywnością FAS, lecz może dotyczyć innych jeszcze niezidentyfikowanych czynników.

W jednym aspekcie, przeciwciało korzystnie jest otrzymywane od kozy, która została zaszczepiona przeciwko wściekliźnie.

Niniejszym opisano również przeciwciało z konia, owcy i innych odpowiednich zwierząt. Przeciwciało można uzyskać w podobny sposób do tego podanego dla przeciwciała kozy oraz może być oszacowane pod kątem aktywności anty-HLA i/lub anty-FAS. Ponadto do uzyskania antygenu nie jest konieczne stosowanie wirusa HIV jako immunogenu; jako immunogen dający skuteczny preparat przeciwciała wykorzystywane są ludzkie białe krwinki lub antygeny błonowe linii komórkowej pochodzenia ludzkiego. Ponadto, wyobrażamy sobie, że przeciwciało można zamienić przez immunogen, tak, że kompozycja terapeutyczna może obejmować materiał HIV lub białe krwinki.

Alternatywnie, po inaktywacji termicznej roztwór supernatantu, w którym prowadzono hodowlę wirusa lub taki, w którym jest to możliwe, lecz nie był stosowany do hodowli, można także zastosować jako immunogen, który będzie wytwarzać odpowiednią odpowiedź przeciwciał. Do wytwarzania dopuszczalnego immunogenu, który będzie wytwarzał skuteczną odpowiedź przeciwciał można zastosować dowolny roztwór supernatantu lub pożywkę, która jest odpowiednia do hodowli in vitro HIV lub innego wirusa. Przykładem mogą być pożywki do hodowli kultur tkankowych, jak PMBC, lub linii unieśmiertelnionych komórek nowotworowych, jakie zastosowano do hodowli HIV 111b. Nie jest konieczne, aby HIV lub inny wybrany wirus był obecny w celu wytworzenia skutecznego immunogenu do wytwarzania preparatu przeciwciała.

Przeciwciało do zastosowania według niniejszego wynalazku jest przeciwciałem poliklonalnym, które rozpoznaje zestaw antygenu HLA klasy II i antygenu gp 120, lub które rozpoznaje FAS. Ujawnienia nasze sugerują, że korzystny jest antygen HLA klasy II.

PL 216 741 B1

Odpowiednie przeciwciała można wywołać przez wykorzystanie jako immunogenu wybranych antygenów, korzystnie koktajlu z antygenów. Jest możliwe, aby użycie szeregu różnych antygenów dało przeciwciało, które rozpoznaje wspólne struktury antygenów dając silniejszą odpowiedź u pacjenta. Zakładamy hipotetycznie, że dobór izolatów HIV dostarczy epitopów z niewielkimi wariantami struktury i wynikiem tego powstanie przeciwciało ogólne (ang. pan-antibody).

Zatem, w celu wytworzenia surowicy, zalecamy wykorzystanie koktajlu z różnych wirusów HIV wytworzonych głównie w PBMC, niż stosowanie samych komórek T. Koktajl stosownie zawiera 2, 3, 4, 5, 6 lub większą liczbę takich wirusów. Wirusy korzystnie są w postaci lizatów. Przykłady korzystnych lizatów obejmują następujące izolaty HIV-1: 91US056, 92HT593, 92US723, 92US657, 92US660 i 92US714. Korzystnie koktajl obejmuje co najmniej 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 tych wyszczególnionych izolatów.

Aktywację komórek można polepszyć, przykładowo konkanawaliną A (konA), i przykładowo przy użyciu konA można osiągnąć wyższe poziomy aktywności dla anty-dopaminy. SHULA (nieaktywowane) nie wykazał znaczącego wzrostu poziomów anty-R dopaminy powyżej poziomu podstawowego w O.D., podczas gdy HIV 3 B (średnia z 12 kóz i królika) miał. Nie było także wzrostu poziomów R dopaminy pomiędzy komórkami P3MC w koktajlu aktywowanymi konA.

W jeszcze innym wariancie roztwór supernatantu, stosownego do hodowli wirusa HIV in vitro, lecz nie wyłącznie HIV, w postaci PBMC, lub innej pożywki, jak dla linii unieśmiertelnionych komórek, takiej jak jest użyta przykładowo w celu hodowli HIV Illb będzie w swojej postaci, bez wprowadzonego wirusa, jeśli zabito go przez podgrzanie stosowane w normalny sposób, tak że wirus HIV nie będzie obecny do wytwarzania obecnie preparatu skutecznego przeciwciała.

Przeciwciała takie można także uzyskać stosując białka zawierające peptydy wyizolowane z lizatów HIV, peptydy syntetyczne, bakteryjne białka fuzyjne i białka/peptydy z filogenetycznie niespokrewnionych źródeł, które zawierają lub przypominają pożądaną hodowlę komórkową lub inne resztki supernatantu. Przeciwciała do lizatu można odzyskać i testować.

Bez związania z żadną aktualną teorią, wydaje się, że przeciwciało stosowane według niniejszego wynalazku działa poprzez supresję proliferacji takiego rodzaju komórek, który jest wymagany przez HIV lub innych warunków zależnych od takiej odpowiedzi odpornościowej. Zatem, przykładowo, niniejszy wynalazek znajduje zastosowanie w leczeniu stwardnienia rozsianego.

Przy znajomości znaczenia aktywności przeciwciał anty-HLA i anty-FAS z koziej surowicy, jest obecnie możliwe oszacowanie prawdopodobnego wykorzystania szeregu takich kozich surowic. Prosty test może ocenić obecność aktywności anty-HLA i/lub anty-FAS i pozwolić na zidentyfikowanie wytypowanej surowicy jako odpowiedniej do podawania pacjentom.

Niniejszym opisano sposób wytwarzania surowicy, w szczególności surowicy koziej, który obejmuje podawanie zwierzęciu jednego lub większej liczby, korzystnie co najmniej kilku, izolatów HIV, oczekiwanie na rozwinięcie się odpowiedzi odpornościowej, pobranie krwi od zwierzęcia, monitorowanie obecności przeciwciała anty-HLA i/lub anty-FAS oraz wytworzenie surowicy anty-HLA i/lub anty-FAS stosownej do leczenia ludzi.

Zazwyczaj będzie wykorzystanych wiele zwierząt i zwierzęta można ocenić pod kątem tego, które da większą ilość skutecznej surowicy. Takie przydatniejsze zwierzęta można następnie hodować dostarczając linii zwierząt szczególnie przydatnych w zastosowaniach według wynalazku.

Zazwyczaj będą zaangażowane procedury kontroli jakości w celu potwierdzenia obecności przeciwciała anty-HLA, typowo zakresu przeciwciał anty-HLA i/lub przeciwciała anty-FAS, typowo zakresu przeciwciał anty-FAS. Można przeprowadzać porównania od serii do serii w celu uzyskania wystandaryzowanego produktu.

W oparciu o zdolność surowicy do istotnego zahamowania MLR, sugeruje się, że taka surowica może działać jako silny czynnik przeciwzapalny. Istnieje wiele mechanizmów, które mogą być odpowiedzialne za ten efekt i jednym z najbardziej prawdopodobnych jest zahamowanie rozpoznawania HLA.

Inny mechanizm działania może równie dobrze być związany z faktem, że do aktywności osocza koziego wymagany jest komplement jako, że jest to jedyna znana aktywność zachowywana podczas podgrzewania. Komplement może pobudzić aktywność osłabionych mechanizmów u pacjenta. Przykładowo, zarówno przeciwciało w sposób ukierunkowany zabijające zawirusowaną lub nowotworową komórkę, jak przeciwciało kierujące zabijaniem za pośrednictwem komórki wymagają komplementu i przy nieobecności komplementu występuje całkowita utrata efektu lub mechanizmu.

Ponadto, kompozycja tu ujawniona obejmuje aktywny składnik, który może pochodzić z krwi stosownie prowokowanej kozy, dzięki technice ekstrakcji surowicy, która nie jest przeznaczona do

PL 216 741 B1 izolacji swoistych przeciwciał jednego rodzaju. W szczególności, rozwiązania według wynalazku wykorzystują izolację aktywnego składnika, możliwie mieszaninę współdziałających przeciwciał anty-HLA i/lub przeciwciał FAS, z surowicy krwi prowokowanej kozy, bez uciążliwego oczyszczania i ekstrakcji w celu uzyskania przeciwciała jednego rodzaju.

W ogólności wstrzyknięcie ludziom przeciwciał pochodzących od gospodarza nie będącego człowiekiem nie jest zalecane. Zazwyczaj podnosi się silna odpowiedź odpornościowa przeciwko samym obcym przeciwciałom. Jednakże zaskakująco ujawniono, że zastosowanie ekstraktu surowicy koziej nie prowokuje reakcji odpornościowych, których oczekuje się dla innych obcych białek zwierzęcych. Wstrzyknięcie ekstraktu surowicy koziej jest tolerowane zarówno przez pacjentów z immunosupresją jak i przez osobników zdrowych.

Niniejszy wynalazek specyficznie wykorzystuje ekstrakt surowicy, który może obejmować całą populację cząsteczek przeciwciał, pochodzącą z kozy prowokowanej HIV. Bez chęci wiązania z teorią, uważamy, że takie podejście posiada znaczące korzyści. U pacjentów leczonych takim ekstraktem surowicy widoczna jest znacząca poprawa w ciągu minut po podaniu.

Zabity wirus jest wstrzykiwany do swoiście zidentyfikowanej kozy, za pośrednictwem domięśniowego zastrzyku i pozwala się na jego inkubację, po czym określona ilość krwi jest pobierana i stosownie modyfikowana.

Surowica jest ewentualnie badana pod kątem aktywności pożądanego przeciwciała i ewentualnie pod kątem jednej lub większej liczby spośród zdolności przeciw-fuzyjnej, neutralizacji wirusa AIDS, zdolności do wzmacniania fagocytozy i jej tolerancji przez organizm ludzki.

Po inokulacji wybranej kozy wirusem HIV, obserwowano odpowiedź odpornościową po ekspozycji na antygen obcego białka zgodnie z wcześniejszymi badaniami. Ekstrahowaną surowice modyfikowano następnie w celu przygotowania jej do użycia u ludzi.

Wykazano, że reagenty wytwarzane w odpowiedzi na inokulację zwierząt HIV i modyfikowane i udoskonalone za pomocą niniejszych procedur odwracają w całości zespół AIDS.

Wytłumaczenie w jaki sposób jest to osiągane w rzeczywistości jest złożone, lecz w odniesieniu do osobnika pozytywnego względem HIV lub z rozwiniętym AIDS osiąga się:

1. Prawie natychmiastowe polepszenie jakości życia pacjenta.

2. Generowanie proliferacji komórek CD4 i CD8, zwiększając tym samym liczbę komórek CD4 i CD8.

3. Obniżenie u pacjentów miana wirusa do teoretycznego zera zazwyczaj w przyrostach log 0,5.

4. Redukcję wartości P24 do zera.

Zasadniczo oznacza to, że możliwe jest przywrócenie układu odpornościowego pacjentów do normalnego stanu i wyeliminowanie wirusa, chociaż obecnie nie wiadomo jak długo stan taki będzie się utrzymywał; ostatnie obserwacje wskazują na trzy lata i powyżej.

Około dwustu ludzi w wieku 10 lat i powyżej, obu płci z powodzeniem wyleczono lekiem, i żaden z nich nie miał nawrotu choroby i nie cierpiał na skutek działań niepożądanych.

Leczenie jest stosuje się przez podskórny zastrzyk, w ilości w granicach pomiędzy jedną dzie₃ siątą a dziesięcioma cm³ i jest zaprojektowane tak, aby lek był dostarczany do układu Iimfatycznego jak szybko jest to możliwe. Według niniejszego wynalazku, korzystną dawką dla pacjenta z HIV jest zazwyczaj 1 ml tygodniowo lub ilość uzależniona od potrzeb, podawana jako podzielona dawka w oba ramiona. Typowe jest podawanie co 2 lub 3 tygodnie, a następnie co 3 miesiące. Dla pacjentów z nowotworem najlepsze wydaje się podawanie 0,3 ml tygodniowo.

W większości przypadków leczenie prowadzono jednokrotnie co cztery tygodnie przez okres trzech miesięcy. Ogólne obserwacje są następujące:

1. Umiarkowana lub ostra depresja była odwracana w czasie krótszym niż sześćdziesiąt minut po zastrzyku.

2. Pacjenci w ogólności w ciągu dwóch godzin po zastrzyku odzyskiwali apetyt i aktywnie poszukiwali jedzenia.

3. W ciągu około dwóch tygodni po pierwszym podaniu leku pacjenci zaczynali przybierać na wadze.

4. Raporty niezależnych laboratoriów potwierdziły, że 4 do 6 tygodni po pierwszym podaniu leku znacząco spadły miana wirusa i wartości P24 oraz, że dramatycznie wzrosła liczba komórek CD4 i CD8.

5. Nie obserwowano działań niepożądanych.

PL 216 741 B1

Ważny odnotowania jest fakt, że podawanie leku, odmiennie niż aktualne sposoby leczenia, nie wymaga aby pacjent stosował się do ścisłego godzinowego lub dziennego reżimu podawania leku i polega na prostym zastrzyku podawanym co tydzień lub co miesiąc.

Korzystnie, kompozycja jest oczyszczona i składa się zasadniczo jedynie z oczyszczonego ekstraktu surowicy. W kolejnym wariancie, przeciwciała mogą także być oczyszczone w całości lub wyselekcjonowane i zebrane według specyficznych wymagań choroby z kompleksu surowicy lub mieszaniny osocza, uzyskanymi za pomocą klasycznej lub dowolnej innej stosownej procedury, w tym, lecz nie wyłącznie, przykładowo za pomocą chromatografii immunopowinowactwa, wytrącania solą, chromatografii jonowymiennej, chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząstek, chromatografii powinowactwa i kombinacji odpowiednich lub pożądanych procedur.

Można też brać pod uwagę terapię złożoną z przeciwciałem anty-HLA i/lub przeciwciałem antyFAS, choć nie jest ona konieczna.

Ekstrakt surowicy koziej wytworzony w sposób jak tu opisano może być przygotowany w kompozycji do hamowania replikacji wirusa in vitro lub in vivo. Opisano niniejszym kompozycje farmaceutyczne obejmujące reagent z kozy, stosowny do leczenia choroby, takiej jak choroba wirusowa. Reagent taki może być zmieszany z odpowiednimi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami.

Przykłady kompozycji farmaceutycznych obejmują preparaty stałe (tabletki, pigułki, kapsułki, granulki itp.) o odpowiednim składzie lub do podawania doustnego, miejscowego, pozajelitowego i mogą one obejmować nośnik. Przy podawaniu pozajelitowym może być wymagane, aby kompozycje były sterylne. Zazwyczaj, w celu sprawdzenia czy u osoby pojawia się reakcja alergiczna na hiperimmunogenną surowicę kozią, stosowana jest dawka testująca. Po śródskórnym zastrzyku odczekuje się 30 minut w celu sprawdzenia czy pojawi się odczyn pośredni manifestujący się obrzękiem, rumieniem i świądem. Jeżeli odczyn ten jest negatywny, to przyjmowane jest założenie, że z dużym prawdopodobieństwem wystąpi bezpośredni odczyn wrażliwości. Reakcja alergiczna nie wyklucza jednakże osobnika od przejścia potencjalnego leczenia ratującego życie ze względu na możliwość wystąpienia reakcji alergicznej.

Podawanie kompozycji może odbywać się dowolnym ze stosownych sposobów, takich jak infuzja dożylna, podskórny, domięśniowy zastrzyk, podawanie preparatu doustnego, podawanie dootrzewnowe i dożylne. Prawidłowe dawki będą się różniły w zależności od określonych preparatów, sposobu podawania, a w szczególności miejsca, gospodarza i stanu poddawanego leczeniu. Pod uwagę powinny być wzięte inne czynniki takie jak wiek, masa ciała, płeć, dieta, czas podawania, częstość wydalania, stan gospodarza, kombinacje leków, wrażliwość reakcji oraz ciężkość przebiegu choroby. Podawanie można przeprowadzać w sposób ciągły lub okresowy z maksimum tolerowanej dawki.

Produkt ten, inaczej niż w większości innych sposobów leczenia, nie wymaga aby pacjent stosował się do ścisłego godzinowego lub dziennego przyjmowania pigułek i polega na prostym zastrzyku podawanym okresowo. Wydaj e się, że układy odpornościowe pacjentów, którzy byli leczeni przez dwa lata i pozostają w tym projekcie są stabilne i powróciły do prawidłowych funkcjonalnych poziomów.

Do leczenia HIV, produkt ten jest zaprojektowany w taki sposób aby tłumił zakażenie wywołane przez HIV, a tym samym pozwalał układowi odpornościowemu człowieka, bez potrzeby stosowania wysoko toksycznych związków chemicznych, na przekierowanie przeciwko wirusowi. Lek, w przeciwieństwie do jego konkurentów, można stosować w mniejszych dawkach zarówno w celach profilaktycznych, gdzie spodziewane jest zakażenie, lub podczas początkowych etapów choroby.

W odróżnieniu do istniejących leków, które często muszą być przyjmowane codziennie przez resztę życia pacjenta, typowe leczenie polega na prostym zastrzyku podawanym przez lekarza co tydzień lub co miesiąc. Program typowego podawania trwa trzy miesiące, z możliwością powtórzenia procedury co sześć miesięcy, dwanaście miesięcy i dwa lata lub kiedy jest to konieczne aby wirus nie pojawił się ponownie.

Kompozycja według niniejszego wynalazku może być stosowana z innymi lekami co daje terapię kombinowaną. Inne leki mogą stanowić część tej samej kompozycji lub mogą być dostarczane jako oddzielna kompozycja do podawania w tym samym czasie.

Niniejszym opisano sposób wytwarzania kompozycji ochronnej obejmującej reagent do zastosowania w ochronie gatunku innego od kozy, przy czym sposób obejmuje immunizację kozy antygenem nie pochodzącym od kozy (np. wirusem lub obcym białkiem) oraz oczyszczenie ekstraktu surowicy

PL 216 741 B1 wytworzonej w kozie po prowokacji antygenem. Reagent może następnie być także użyty do ochrony zwierzęcia nie będącego kozą przed antygenem stosowanym jako immunogen.

Kompozycja obejmująca ekstrakt surowicy z kozy po prowokacji ludzkim wirusem HIV oraz kompozycja obejmująca populację wszystkich przeciwciał z kozy po prowokacji ludzkim wirusem HIV mogą być stosowane do wytwarzania leku do leczenia stanów włączając HIV i AIDS.

Korzystnie kompozycja jest poddawana jednej lub wszystkim następującym procedurom: wytrącanie w 45% siarczanie amonowym, zamrażanie w -70°C przez 24 godz. lub mikrofiltracja.

Produkt przeciwciał jest stosowany do leczenia choroby z komponentą zakażenia i obejmuje nie tylko HIV, ale także cukrzycę, reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie nerwu, szpiczaka rozsianego, raka jelita grubego itp. Dalsze przykłady podano w artykułach H. Bauma, które można przeczytać na stronie internetowej www.kcl.ac.uk/kis/schools/life sciences/life sci/baum.html, w szczególności w jego artykule o mimikrze molekularnej w Immunology Taday, 1996, Luty 17, 64-70.

Możliwe jest leczenie pacjentów, którzy nie mają HIV. W szczególności sposób leczenia może być stosowany do leczenia cukrzycy lub raka u pacjentów, którzy nie mają HIV.

Powrót do zdrowia obserwowany u pacjentów z MS, obok odnotowanego polepszenia nastroju w ciągu godziny od otrzymania, leku skłonił nas także do poszukiwania aktywności przeciwko receptorom CNS (ośrodkowego układu nerwowego), która może być wymagana do stymulacji wzrostu nerwów i do możliwej regeneracji. Przeszukaliśmy różne surowice pod kątem aktywności skierowanej przeciw wielu antygenom i znaleźliśmy aktywność przeciw receptorowi dopaminy, receptorowi serotoniny, receptorowi czynnika wzrostu neuronów p75 oraz chemokinie CXCL 10 (IP10).

Zatem, opisane tu przeciwciało jest skierowane przeciwko jednemu lub kilku z następujących czynników: receptor dopaminy, receptor serotoniny, receptor czynnika wzrostu neuronów p75 oraz chemokina CXCL 10 (IP10). Aktywności jednego lub kilku z tych przeciwciał mogą być obecne pojedynczo lub w kombinacji z aktywnością anty-HLA i/lub anty-FAS.

Znając obecnie znaczenie aktywności przeciwciała z surowicy koziej skierowanej przeciw receptorowi dopaminy, receptorowi serotoniny, receptorowi czynnika wzrostu neuronów p75 lub chemokinie CXCL 10 stało się możliwe określenie prawdopodobnego wykorzystania szeregu takich kozich surowic. Prosty test pozwala na oszacowanie obecności takiej aktywności i pozwolić na zidentyfikowanie konkretnej surowicy do podania pacjentom. W szczególności, może być ważna kombinacja przeciwciał anty-FAS i/lub anty-HLA, obok przeciwciała skierowanego przeciwko jednemu lub kilku z następujących czynników: receptor dopaminy, receptor serotoniny, receptor czynnika wzrostu neuronów p75 oraz chemokina CXCL 10 i zatem testy mogą być ukierunkowane na aktywności różnych przeciwciał w celu potwierdzenia obecności w produkcie.

Kompozycje tu opisane mogą obejmować przeciwciało skierowane przeciwko jednemu lub kilku z następujących czynników: receptor dopaminy, receptor serotoniny, receptor p75 czynnika wzrostu neuronów oraz chemokina CXCL 10, zazwyczaj wraz z przeciwciałem anty-FAS i/lub przeciwciałem anty-HLA oraz sposoby leczenia przy użyciu tych kombinacji.

W innym wariancie, przeciwciało może być wytworzone w koniu, owcy i w innym stosownym zwierzęciu. Przeciwciało można uzyskać w podobny sposób do tego podanego dla przeciwciała koziego i można scharakteryzować pod kątem aktywności wobec jednego lub kilku z następujących czynników: HLA, FAS, receptor dopaminy, receptor serotoniny, receptor czynnika wzrostu neuronów p75 oraz chemokina CXCL 10. W kolejnym wariancie, nie jest konieczne stosowanie wirusa HIV jako immunogenu w celu wytworzenia przeciwciała i jako immunogen do wytworzenia skutecznego preparatu przeciwciała wykorzystane są ludzkie białe krwinki. Ponadto, rozpatrujemy, że przeciwciało można zastąpić przez immunogen to znaczy, kompozycja terapeutyczna może obejmować materiał HIV lub ludzkie białe krwinki.

Ogólniej, okazuje się, że skuteczne przeciwciała można uzyskać przy użyciu jako immunogenu komórek (lub mieszanin koktajli białkowych) pochodzących od człowieka. Przeciwciała z tych komórek ludzkich są następnie wytwarzane w gatunku gospodarza, a produkt ostatecznych przeciwciał jest stosowany ponownie u człowieka. Mieszaniny koktajli białkowych mogą mieć wyjątkowo wysoką homologię pomiędzy pierwotnym dawcą i biorcą. Homologia ta pozwala na to, aby białka lub komórki, przykładowo, pochodzące z neuronów małpy zastosować u człowieka. Interesujące są silnie konserwowane koktajle białkowe gatunków zwierząt blisko ze sobą spokrewnionych.

Oczekuje się także, że będzie istniało pokrewieństwo pomiędzy typem HLA osoby, która oddaje pierwotne komórki i typem HLA biorcy. To pokrewieństwo może wyjaśnić pewne obserwowane zróżnicowanie i może być brane pod uwagę przy wyborze preparatu pasującego do pacjenta.

PL 216 741 B1

Ponadto, rozpatrujemy użycie aktywowanych lub nowotworowych linii komórkowych z różnych części ciała, włączając linie komórkowe z nowotworów niedojrzałych komórek nerwowych, raków trzustki, raków prostaty i płaskokomórkowych. Można przewidzieć, że subtelne różnice pomiędzy przeciwciałami wytworzonymi z zastosowaniem tych różnych typów komórek doprowadzą do otrzymania bardzo zróżnicowanego profilu i mogą pomóc w dotarciu do określonych układów narządów w bardzo szerokim znaczeniu.

Istnieją dowody na to, że szczepionka przeciw wściekliźnie podana kozom może być odpowiedzialna za obserwowany efekt terapeutyczny. Przebadaliśmy surowice z kóz otrzymane z Walii, obejmujące pulę 3 różnych surowic (normalne surowice) i z koźlęcia dawcy, które nigdy nie stykały się ze szczepionką przeciw wściekliźnie ani innymi szczepionkami ochronnymi. Zwierzęta te nie posiadały aktywnych przeciwciał.

W jeszcze innym wariancie rozpatrujemy, że składniki błony komórkowej zrzucone w czasie namnażania komórek in vitro mogą dostarczyć antygeny przeciwko którym koza czy inny gatunek zwierząt może skierować odpowiedzi za pośrednictwem przeciwciał. Może to się pojawić przy braku zakażenia wirusowego.

Figury

Figury 1 do 9 dotyczą określenia obecności przeciwciał anty-HLA klasy II;

Figury 10 do 16 dotyczą badań na MLR;

Figury 17 do 19 dotyczą określenia obecności przeciwciał anty-FAS;

Figury 20 do 29 dotyczą określenia obecności dalszych przeciwciał; oraz

Figura 30 dostarcza profile surowic z kóz immunizowanych różnymi immunogenami.

Przykłady

Następujące szczegółowe opisy przedstawiają aktualną procedurę wytwarzania produktu przeciwciał.

Przykład wytwarzania koziej surowicy

Kozę szczepiono domięśniowo lizatem koktajlu wirusa HIV w adiuwancie Freunda. Wcześniej wirusa zabijano przez grzanie w 60°C przez 30 min. Po odpowiedniej przerwie czasowej, jak dwa tygodnie, pobierano próbki krwi do wstępnego oszacowania. W zoptymalizowanej procedurze, koza jest szczepiona co tydzień przez cztery tygodnie, a następnie w szóstym tygodniu jest skrwawiana dla ₃ uzyskania reagenta. Około 400 cm³ krwi jest pobieranych od kozy w sterylnych warunkach. Obszar ₃ wkłucia igły jest golony i odkażany preparatem betadyny. Do pobrania od zwierzęcia około 400 cm³ krwi stosowana jest igła ze światłem 18. Ważne jest, aby zwierzę mogło tolerować pobranie około ₃

400 cm³ krwi bez cierpienia z powodu jakichkolwiek niewykrywalnych efektów. Zwierzę nie musi być zabite. Zwierzę jest ponownie skrwawiane w około 10 do 14 dni po odzyskaniu swojej objętości krwi.

Obecność potencjalnie przydatnych przeciwciał potwierdzano biorąc pod uwagę aktywność pożądanego przeciwciała. Po potwierdzeniu obecności takich reagentów, krew pobierano następnie od kozy pomiędzy 4-6 tygodniem.

Dla uzyskania reagenta krew jest następnie wirowana w celu oddzielenia surowicy. Następnie 300 ml surowicy filtrowano w celu usunięcia dużych skrzepów i materiału makrocząsteczkowego. Następnie surowicę podawano działaniu wysyconego siarczanu amonu (roztwór 45% w temperaturze pokojowej) w celu wytrącenia przeciwciał i innego materiału. Uzyskany roztwór wirowano przy 5000 rpm przez 5 min., po czym usuwano płynny nadsącz. Wytrąconą immunoglobulinę zawieszano w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem („bufor PBS”, patrz Sambrook i wsp. „Molecular cloning, A Laboratory Manual, 1989), wystarczającym do ponownego rozpuszczenia osadu.

Następnie roztwór dializowano przez błonę o wartości odcięcia 10000 Daltonów. Dializę przeprowadzano w buforze PBS, zmienianym co cztery godz., przez okres 24 godz. Dializę przeprowadzano w 4°C.

Po 24 godz. dializy zawartość woreczka dializacyjnego przenoszono do sterylnej zlewki. Roztwór dostosowywano tak, aby masa na jednostkę objętości = 10 mg na ml. Rozcieńczenie przeprowadzano przy użyciu PBS. Uzyskany roztwór filtrowano następnie przez filtr 0,2 mikrona do sterylnego pojemnika. Po filtracji roztwór porcjowano w pojedynczych 1 ml dawkach i przechowywano przed użyciem w -22°C.

Reagent jest następnie gotowy do użycia.

Przekształcenie osocza w surowicę:

Materiały:

PL 216 741 B1

Reagent	Wzór	Klasa	Ilość wymagana na litr wody
Chlorek sodowy	NaCl	USP/EP/BP	8,76 g
Ortofosforan jednosodowy	NaH2PO4	USP/EP/BP	0,2 g
Ortofosforan dwusodowy	NaH2PO4	USP/EP/BP	1,55 g
Siarczan dekstranu		Sól sodowa, masa cząsteczkowa 500000	100 g
Woda do przepłukiwania	N/A	Baxter	1 litr
1 x 150 ml wysterylizowana butelka Duran	N/A	N/A	N/A
2x2 l wysterylizowane butelki Duran	N/A	N/A	N/A
Mieszadło magnetyczne i sterylna magnetyczna pchełka	N/A	N/A	N/A
1 x filtr Sartolab lub Midisart	N/A	0,2 pm	N/A
6 x 1 l torebki Stedim
1 x 100 ml sterylna torba	N/A	N/A	N/A

Wytworzenie 100 mg/ml roztworu siarczanu dekstranu

Zawiesić wymaganą ilość chlorku sodowego, ortofosforanu jednosodowego i ortofosforanu dwusodowego w 1 I wody do uzyskania 1 I roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Po całkowitym rozpuszczeniu powoli wsypywać 10 g siarczanu dekstranu do 100 ml PBS mieszanego na mieszadle magnetycznym. Mieszać przez minimum 10 min. do całkowitego rozpuszczenia. Przefiltrować przez filtr 0,2 pm do sterylnego pojemnika (np. 100 ml torby) i przechowywać w temp. pokojowej jeśli roztwór jest wymagany do szybkiego użycia. Jest to roztwór podstawowy siarczanu dekstranu.

Przekształcenie osocza w surowicę

Zważyć wymaganą objętość osocza, która ma być traktowana przy użyciu czynnika przekształcającego 1,0275, tzn. 1000 ml waży 1027,5 g.

Dodać 10 ml roztworu podstawowego siarczanu dekstranu do każdego 1000 ml osocza (końcowe stężenie 1 mg/ml).

Mieszać na mieszadle magnetycznym w temp. pokojowej przez 30 min. Przenieść do 1 I torebek Stedim.

Żwirować przy 4000-4200 rpm (stosowna siła wirowania = 4910 x g) przez minimum 30 min.

w 22°C.

Delikatnie odessać supernatant do 1 I torebki Stedim i usunąć osad.

Wytarować potrzebną ilość 1 I torebek Stedim.

Przefiltrować supernatant przez filtr 0,2 pm do sterylnych torebek Stedim, tak aby każda torebka zawierała średnio 500 ml przefiltrowanego supernatantu.

Zapisać objętość surowicy w każdej torebce. Każdą torebkę opisać numerem i oznakować.

Jeśli surowica nie ma być używana natychmiast, przechowywać w lodówce w 4-8°C przez okresy do 7 dni lub w -20°C przez dłuższe okresy czasu.

Wytwarzanie 36% wag./obj. siarczanu sodowego Materiały:

Reagent	Wzór	Klasa	Ilość wymagana na litr wody
Bezwodny siarczan sodowy		USP/EP/BP	360 g
Woda do przepłukiwania	N/A	Baxter	1,5 litra
1 x 2 l wysterylizowana butelka Duran	N/A	N/A	N/A
Mieszadło magnetyczne i sterylna magnetyczna pchełka	N/A	N/A	N/A
1 x filtr Sartolab lub Midisart	N/A	0,2 pm	N/A
2 x 1 l torebki Stedim	N/A	N/A	N/A

PL 216 741 B1

Odważyć 1,5 I wody (założyć, że 1 ml = 1 gram) do 2 I wysterylizowanej butelki Duran.

Podgrzać wodę do 30-35°C przez umieszczenie butelki Duran w podgrzanym inkubatorze na co najmniej 1 godz.

Wrzucić sterylną pchełkę magnetyczną i umieścić na mieszadle magnetycznym.

Mieszając powoli dodawać 360 g siarczanu sodowego.

Mieszać do momentu całkowitego rozpuszczenia soli, kiedy mieszanina jest przezroczysta.

Jeśli roztwór nie jest wystarczająco podgrzany lub jeśli dopuści się do schłodzenia roztworu sól zacznie krystalizować z roztworu. Sól można ponownie rozpuścić przez podgrzanie roztworu do 50°C. Przefiltrować 1 I 36% wag./obj. roztworu siarczanu sodowego przez filtr 0,2 pm do sterylnej 1 I torebki Stedim. Odpowiednio oznakować torebkę.

Przefiltrować pozostałe 500 ml do oddzielnej torebki Stedim. Następnie dodać przez filtr dodatkowe 500 ml wody do zastrzyków i zaznaczyć, że torebka zawiera 18% wag./obj. siarczanu sodowego. Wytrącanie immunoglobulin z surowicy przy użyciu siarczanu sodowego Uwaga: Osocze musi zostać odwłóknione przy użyciu metody z siarczanem dekstranu. Materiały:

Reagent	Wzór	Klasa	Ilość
Przefiltrowana surowica			1 litr
Roztwór 36% wag./obj. siarczanu sodowego	N/A		1,5 litra
Roztwór 18% wag./obj. siarczanu sodowego	N/A		1 litr
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	N/A		2 litry
Woda do przepłukiwania	N/A	Baxter	N/A
Filtr wgłębny	N/A	N/A	N/A
Filtr 0,2 pm	N/A	0,2 pm	N/A
Torebka Stedim do diafiltracji	N/A	N/A	N/A

Podgrzać przefiltrowaną surowicę w torebkach Stedim przy użyciu inkubatora ustawionego na 30-35°C. Pobrać próbki 2 x 5 ml.

Do surowicy w torebkach dodać równą objętość podgrzanego roztworu 36% siarczanu sodowego, np. 500 ml roztworu soli: 500 ml surowicy.

Delikatnie wymieszać mieszaninę sól: surowica (kremowy biały roztwór) poprzez ręczne kołysanie torebek lub poprzez umieszczenie na kołysce. Mieszać przez 30 min.

Zważyć i zrównoważyć torebki i odwirować przy 4000-4200 rpm przez minimum 30 min.

w 25-30°C.

Usunąć delikatnie odciągnięty supernatant. Starać się nie naruszyć osadu. Pobrać próbkę supernatantu 1 x 5 ml.

Do każdej torebki z osadem dodać wystarczającą objętość 18% wag./obj. siarczanu sodowego tak, aby waga każdej torebki wynosiła około 1000 g.

Mieszać ręcznie lub na kołysce przez minimum 10 min. w celu wypłukania niewychwyconej albuminy z osadu immunoglobulin.

Przenieść torebki do wirówki i powtórzyć wirowanie jak wyżej.

Usunąć delikatnie odciągnięty supernatant. Starać się nie naruszyć osadu.

Do każdej torebki z osadem dodać wystarczającą objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanem tak, aby waga każdej torebki wynosiła około 1000 g.

Mieszać ręcznie lub na kołysce przez minimum 10 min. i przenieść torebki do lodówki w celu przechowania przez noc.

Wyjąć torebki z przechowywania i upewnić się, że osad się rozpuścił.

Przefiltrować przez filtr 0,2 pm do odpowiedniego rozmiaru torebki do diafiltracji.

Pobrać próbki 2 x 5 ml.

Przygotowanie dużej ilości roztworu immunoglobuliny ₂

Ustawić zestaw do ultrafiltracji (UF) z co najmniej jedną 0,1 m² błoną 30000 MWCO.

Poprawić stan sanitarny systemu przez przepuszczenie roztworu 0,5 M - 1 M wodorotlenku sodowego przez minimum 30 min.

PL 216 741 B1

Odprowadzić z systemu roztwór wodorotlenku sodowego i przepłukać wodą do przepłukiwania aż pH wody będzie neutralne.

Do UF podłączyć torebkę do diafiltracji zawierającą roztwór immunoglobuliny.

Do torebki do diafiltracji podłączyć za pomocą pompy perystaltyczne] torebkę zawierającą PBS (10 x objętość roztworu immunoglobuliny).

Podłączyć linię zbierającą do torebki diafiltracyjnej.

Podłączyć linię diafiltracyjną do torebki z odpadami.

Przejść do wolnego przetwarzania produktu poprzez urządzenie do ultrafiltracji, ustawiając ciśnienie wlotu i wylotu jako 2,0 bary przy wlocie i 0,5 bara przy wylocie, przy zastosowaniu przystosowanej szybkości pompy i ustawienia zaworu.

Przejść do zagęszczania roztworu immunoglobuliny do około 50 g/l. Jest to obliczane biorąc pod uwagę stężenie wyjściowe i pomiar ilości odrzuconego płynu. Przykładowo:

Roztwór wyjściowy wynosi 2 litry co przy 25 g/l = 50 g. Objętość roztworu odrzuconego w diafiltracie wynosi 1 I. Zatem stężenie wynosi 50/1 = 50 g/l.

Zmierzyć szybkość przepływu diafiltratu i ustawić szybkość pompy dla wypływu z torebki zawierającej PBS równą szybkości przepływu.

Kontynuować diafiltrację do osiągnięcia wymiany 10 objętości buforu, tzn. 1 I roztworu IgG wymaga 10 I PBS.

Odprowadzić z systemu zagęszczony roztwór diafiltrowanej IgG do torebki diafiltracyjnej. Odłączyć torebkę i podłączyć bezpośrednio do systemu torebkę z PBS zawierającą co najmniej 1 I PBS.

Pozwolić na cyrkulację płuczącego roztworu PBS i przenieść popłuczyny do torebki zawierającej roztwór IgG.

Przeprowadzić filtrację dużej ilości roztworu preparatu IgG przez filtr 0,2 μm do wcześniej zważonej torebki Stedim.

Po wypełnieniu pobrać 1 ml próbkę przefiltrowanego roztworu i ocenić stężenie białka.

Zważyć torebkę i obliczyć objętość roztworu IgG.

Znając stężenie białka i objętość IgG obliczyć objętość PBS potrzebną do rozcieńczenia roztworu do końcowego stężenia 10 mg/ml, przykładowo:

Objętość IgG = 1300 ml. Stężenie białka = 30 mg/ml

Całkowita ilość IgG = 39000 mg

Wymaganie = końcowe stężenie 10 mg/ml

Zatem wymagana końcowa objętość = 39000/10 = 3900 ml. Aktualna objętość wynosi 1300 ml. Zatem objętość PBS, którą należy dodać wynosi 3900 - 1300 = 2600 ml.

Przefiltrować PBS do torebki zawierającej dużą ilość roztworu preparatu IgG do osiągnięcia wymaganej objętości końcowej dla 10 mg/ml.

Reagent jest gotowy do użycia i może być przechowywany w lodówce do 1 tygodnia lub zamrożony w -20°C jeśli wymagany jest dłuższy okres przechowywania.

Można wprowadzić zmiany w tych procedurach, takie jak przykładowo zmiana w stężeniu siarczanu sodowego lub zamiana reagentów. Podobnie wartość odcięcia przy dializie nie musi wynosić 10000 daltonów.

Model aktywności

Wprowadzenie

Prywatne obserwacje wskazują na to, że pacjenci z AIDS, którzy otrzymali surowicę z kóz immunizowanych HIV wydają się poprawiać w niektórych przypadkach w oczywisty sposób i poszukujemy potencjalnych mechanizmów za to odpowiedzialnych. Chociaż kozom wstrzykiwano HIV i uważa się, że odpowiedź odpornościowa jest wysoce swoista te dane nie wyjaśniają obserwowanej poprawy pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i w niektórych przypadkach z rakiem.

Naukowe podstawy badania

Chociaż Daigleish i wsp. ujawnili kilka lat temu, że receptor CD4 jest bramką dla HIV, klasyczna interpretacja, że HIV zabija komórki CD4, których obniżanie się poziomu można mierzyć w miarę postępowania AIDS nie była wystarczającym wytłumaczeniem patogenezy. Główne obserwacje nie pasujące dobrze do tej interpretacji obejmują:

(1) długi okres czasu od zakażenia do początku AlDS (średnio dekada) (2) brak choroby u prawie wszystkich szympansów i średnio 5% osób zakażonych HIV. Szympansy posiadają te same receptory i ko-receptory co ludzie i wirusa można z łatwością wykrywać w zakażonych szympansach, które nie straciły swoich CD4.

PL 216 741 B1

Opierając się na tych obserwacjach, naukowcy starają się określić różnice pomiędzy osobnikami, którzy chorują po zakażeniu a tymi którzy nie chorują. Chorobę głównie przewiduje się na podstawie stopnia aktywacji odpornościowej po początkowym zakażeniu i po poziomie, na którym się on utrzymuje. Innymi słowy, im wyższa aktywacja odpornościowa tym krótszy czas do choroby. Umiarkowany stopień aktywacji może prowadzić do wydłużenia czasu przed rozwinięciem AIDS, a brak aktywacji odpornościowej nawet przy replikacji wirusa odgrywa rolę u szympansów i u niektórych osobników.

Ważne jest podkreślenie, że termin „aktywacja odpornościowa w użytym tu znaczeniu oznacza pełną aktywację odpornościową, tzn. aktywowane są wszystkie składniki układu odpornościowego, które obejmują wszystkie podtypy komórek T, jak i komórek B. Istnieją tylko trzy przypadki pełnej aktywacji odpornościowej.

Pierwszy z nich dotyczy hyperzmienności w antygenie, którą jasno wykazuje HIV, chociaż hyperzmienność jest wykrywana u zakażonych ludzi i szympansów, u których nie widać progresu choroby.

Drugą możliwością jest super-antygen, który omija mechanizm dla swoistego antygenu i wywołuje aktywację całego układu odpornościowego. Pomimo początkowego entuzjazmu dziesięć lat temu, nie znaleziono przekonującego super-antygenu związanego z HIV, który wyjaśniałby te ujawnienia. Westby i Dalgleish wykazali, że zmienność zestawu komórek T, która sugerowała możliwość istnienia super-antygenu była wyłącznie wynikiem zmniejszenia populacji CD4 i różnice można wytłumaczyć destrukcją przypadkowych CD4.

Jedynym innym wyjaśnieniem jest, że organizm widział obcą komórkę lub narząd i została wywołana przeciw nim chroniczna odpowiedź. Klinicznie zjawisko to zdarza się często po przeszczepie, a w szczególności w przeszczepach szpiku i jest znane jako przewlekła reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVH, ang. graft vs host). W takim scenariuszu przeżycie nawet kilku obcych komórek jest wystarczające do aktywacji całego układu odpornościowego, co prowadzi do agresywnych odpowiedzi autoimmunologicznych, podobnych do tych obserwowanych u pacjentów zakażonych HIV. Cechy kliniczne takiej choroby są w znacznej mierze podobne do AIDS, i przed odkryciem wirusa, wiodący immunolog USA, Gene Shearer z NIH (USA) sugerował, że choroba ta może być indukowana obcymi komórkami przeniesionymi przez transfuzje krwi lub stosunek płciowy. Ujawnienie wirusa w ciągu następnych kilku miesięcy i przenoszenie przez Faktor VI11 (produkt bezkomórkowy) doprowadziło do zauważenia znaczenia obserwacji, która do tej pory była ignorowana.

Brak innego wytłumaczenia dla pełnej aktywacji skłonił Daigleisha i Habeshowa do szukania dowodów na to, że wirus mógłby być zdolny do naśladowania HLA Klasy I lub Klasy 11 (które są cząsteczkami determinującymi swoje i obecne antygeny). Chociaż niektóre sekwencje GP120 już opublikowane mają niską homologię do HLA, zidentyfikowaliśmy główny region otoczki HIV (GP120) o znaczącej homologii strukturalnej zarówno do HLA Klasy I jak i Klasy II. Elizabeth Hounsell (MRC) stworzyła model GP120 na bazie cząsteczek HLA, których struktura była dokładnie poznana. Na podstawie tych cząsteczek i sekwencji Habeshow i Hounsell przewidzieli, że wirus mógł być widziany jako „obcy przez ludzi z HLA-B8, a także być widziany jako „własny przez ludzi z HLA-B27. Obecnie tematem publikacji jest fakt, że jedynymi różnicami mającymi znaczenie w badaniach markera HLA w pan-HIV, prowadzonych w Wielkiej Brytanii przez MRC jest to, że u ludzi z HLA-B8 choroba rozwija się znacznie szybciej, niż u reszty populacji oraz, że osobniki z długotrwałym brakiem progresji lub z wyjątkowo niską progresją posiadają HLA-B27.

Kolejna praca pokazała, że:

(1) Komórki T zabójcy (ang. killer), których liczba wzrasta w odpowiedzi na prowokację obcymi komórkami (np. różnego typu HLA) będą także zabijać własne komórki zakażone HIV.

(2) Otoczka wirusa HIV, znana jako GP120 (co do której wierzymy, że posiada strukturalną homologię z cząsteczkami HLA, która ją określa) może wiązać peptydy w bardzo podobny sposób jak HLA. Ponadto, komórki T wywołane peptydami i HLA przypominającymi GP120 będą także odpowiadać na GP120 z peptydem lecz nie na GP120 bez peptydu, co sugeruje, że zdolność do wiązania peptydów może być bardzo istotna przy jej potwierdzaniu, a tym samym przy potwierdzaniu zdolności do wywoływania chronicznej aktywacji odpornościowej u osobników wrażliwych.

(3) Ostatnio pokazaliśmy, że region w HLA do którego wiążą się peptydy jest obecny w GP120 i że jeśli ta część cząsteczki zostanie usunięta, co zostało przedstawione przez prof. Sodroskiego w Dana Faber w Bostonie, wówczas peptydy nie wiążą się więcej.

Powyższe obserwacje sugerują, że aktywacja odpornościowa układu może teoretycznie być wyłączona, a zatem choroba może nie postępować. Istnieją dwie główne obserwacje dotyczące tego, jedną z nich było badanie kliniczne, w wyniku którego pacjenci, którzy nie mogli dłużej brać AZT ze

PL 216 741 B1 względu na brak szpiku zostali przestawieni na steroidy, klasyczny ciężko uderzeniowy czynnik przeciwzapalny, którego nie można podawać przez dłuższy czasu bez wystąpienia działań niepożądanych. Byliśmy w stanie zaobserwować dzięki steroidom znaczące polepszenie bardzo chorych pacjentów, z klasycznymi objawami silnie przypominającymi chorobę GUH, oraz mogliśmy pokazać, że dawka wymagana do uzyskania takiego efektu była wyjątkowo wysoka i nie nadawała się do praktycznego zastosowania przez dłuższy okres czasu. Niedawno grupa z Duke University (USA) wykazała, że miano wirusa spada u pacjentów, którym podawane są steroidy przeciw HIV, co obecnie jest stosowane coraz częściej w walce z przypadkami uchodzącymi za autoimmunizację (klasyczną właściwość przewlekłej reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi). Krótko mówiąc, istnieje naukowa podstawa wskazująca na to, że czynnik przeciwzapalny, który działa w szczególności na szlaki indukowane HLA klasy I lub klasy II może być przydatny w leczeniu zakażenia HIV.

Testy i wyniki

W celu sprawdzenia czy kozie surowice posiadały właściwości przeciwzapalne, dodaliśmy je do mieszanin reakcyjnych utworzonych przez zmieszanie komórek od dwóch różnych osobników z różnym tłem genetycznym. Ku naszemu zdziwieniu były one wyjątkowo skuteczne w hamowaniu tej reakcji. Przy użyciu dużej liczby przeciwciał molekularnych, byliśmy w stanie zobaczyć, że jedynym przeciwciałem, zbliżonym do reaktywności koziego było przeciwciało anty HLA klasy II. Przeciwciała anty HLA klasy I tylko częściowo redukowały reakcję. Bardzo interesujące jest, że przeciwciała przeciw pętli V3 HIV, uważanej przez większość naukowców za miejsce docelowe dla szczepionki, w rzeczywistości zmniejszają pełną aktywację. Odkrycie to może być zgodne z teorią aktywacji odpornościowej jako, że odpowiedź odpornościowa przeciw wirusowi w rzeczywistości daje wzrost i poparcie dla wirusa do „odcięcia i może tłumaczyć dlaczego szczepionki wycelowane w ten region są także nieskuteczne.

Mając na uwadze, że kozom często są przypisywane magiczne właściwości i że surowice z innych zwierząt mogą posiadać niespodziewaną aktywność w specyficznych testach, uzyskaliśmy surowicę z nie szczepionej kozy, która wcale nie posiadała aktywności. Następnie posiadaliśmy surowice z różnych kóz poddanym różnym schematom szczepienia. Ku naszemu zdziwieniu mogliśmy wykazać, że surowice te rozpoznają jedynie otoczkę HIV i HLA klasy II. Rzeczywiście, mniejsze porcje wirusa, o których wiadomo, że mają znaczną homologię z HLA nie były rozpoznawane przez surowice.

Następnie byliśmy wyjątkowo zdziwieni widząc, że podstawową różnicą pomiędzy wstrzyknięciem koktajlu a wstrzyknięciem pojedynczego izolatu jest to, że zestaw konserwowanych regionów HLA w GP120 był aktywnie rozpoznawany przez surowice z kóz zaszczepionych koktajlem.

Interpretację tych wyników podsumowuje fakt, że kozy zaszczepione HIV wytwarzały silną odpowiedź przeciw typowi MHC klasy II, którą można poszerzyć przez użycie różnych izolatów. Możliwe interpretacje tego zjawiska są następujące:

(1) Otoczka HIV jest tak podobna do HLA klasy II, że jest jako taka rozpoznawana przez układ odpornościowy kóz, który posiada całkowicie inny zestaw HLA.

(2) Drugą możliwością jest to, że w immunogenie tzn. preparacie wirusa, HLA umiejscowiona na powierzchni komórek przez które pączkuje wirus jest porywana i odpowiedź odpornościowa nie jest skierowana wobec wirusa lecz wobec towarzyszącej HLA.

(3) Trzecie wytłumaczenie obejmuje kombinacje dwóch powyższych wytłumaczeń. Możliwe jest, że pączkujący wirus łączy się z HLA w czasie wytwarzania i że taka kombinacja jest bardzo silnie rozpoznawana przez surowice kozie. Ostatnie doniesienie pokazuje, że o ile wirus nie pączkuje przez komórkę z HLA i nie włączy HLA do błony pozostaje wirusem niezakaźnym. Oznacza to, że musi posiadać on jakąś pochodną HLA z komórki gospodarza do aktywacji mechanizmu wchodzenia do komórki.

Wykazaliśmy tutaj, że kozy szczepione preparatami HIV wytwarzają silną odpowiedź przeciwciał przeciwko cząsteczce HLA klasy II. Wiadomo, że szereg chorób wytwarza destruktywne zmiany czysto zapalne ponieważ zaangażowane komórki nadprodukują HLA klasy II. Chociaż wiele typów chorób autoimmunologicznych posiada tę właściwość, jednym z najlepiej poznanych przykładów jest stwardnienie rozsiane. Może być ono zatem przypadkiem, w którym odpowiedź odpornościowa kozy przerywa tolerancję na te cząsteczki i proces ten może pozwolić na pojawienie się silnego procesu przeciwzapalnego in vivo, któremu może towarzyszyć poprawa kliniczna. Będzie oczywistą korzyścią jeśli w tym przypadku zamiast długoterminowego stosowania wysokiej dawki steroidu zostanie zastosowane stałe podawanie koziej surowicy o ile nie wystąpią skutki niepożądane.

PL 216 741 B1

Odpowiedź anty-HIV, która jest silną odpowiedzią przeciw HLA klasy II, może dostarczać koniecznego połączenia spełniającego prawdziwe wymaganie dla szczepionki przeciw AlDS i zamiarem naszym jest dokładna analiza tej odpowiedzi w celu wytworzenia kandydata na szczepionkę HIV.

Surowice z kozy immunizowanej HIV-1 i właściwości przeciwzapalne

Wprowadzen ie

Dostarczono kozie surowice ze zwierząt immunizowanych lizatem wirusowym HIV-3B lub koktajlem wirusowym NIH z 6 różnych izolatów HIV-1. Niektóre z tych surowic były wcześniej stosowane jako część trybu eksperymentalnego leczenia dającego dobre efekty, chociaż mechanizm ich działania jest nieznany. W celu ustalenia mechanizmu działania przebadaliśmy surowice na płytkach ELISA pod kątem gp120 HIV-1, HLA-DR1 i wybranych peptydów z różnych regionów powierzchniowej glikoproteiny wirusa, z których niektóre niosły sekwencję homologiczną z HLA.

Materiały i metody

Surowice i przeciwciała

Dostarczono próbki pochodzące z surowic kóz immunizowanych HIV-3B, które były stosowane do leczenia pacjentów z próbkami pochodzącymi z szeregu kóz immunizowanych lizatami wirusowymi HIV-3B (zwierzęta #0125, #0126, #0127, #0128, #0129 immunizowane 14 września 1999, 21 września 1999 i ponownie 29 września i 7 listopada 2000) wraz z informacją dotyczącą danych o pobieraniu krwi i immunizacji. Do testu ELISA wybraliśmy po prostu próbki surowic z krwi pobranej w późnych etapach (30 listopada 2000 i 1 grudnia 2000). Zwierzę #378 immunizowano koktajlem wirusowym NIH składającym się z następujących izolatów HIV (92HT5 93, 92US657, 92US660, 92US714, 92US723, 91US056). Immunizacje przeprowadzano 7 i 28 listopada. W badaniu ELISA użyto surowice pobrane z krwi 25 stycznia 2001. Dostarczono także surowice z kozy kontrolnej. Obok surowic dostarczyliśmy przeciwciała przeciwko ludzkiemu HLA-DR i przeciwko ludzkiemu HLA-DR, DP i DQ (Pharmingen) zarówno w teście ELISA jak i badaniach reakcji mieszanych limfocytów i mysie anty-gp 120 IgG (EVA3047) swoiste dla domeny V3 z HIV-i ILJb (IRIQRGPGR) otrzymane od dr J. Laman za pośrednictwem dr Harvey Holmes (program MRC AIDS reagents, National Institute for Biological Standards and Control, Potter's Ba, UK) w czasie badań MLR.

Peptydy i białka

Zrekombinowane gp120 HIV-i IIIB wytworzono w komórkach jajowych chomika syryjskiego i dostarczono przez dr J Raina za pośrednictwem dr Harvey Holmes w programie MRC AIDS reagents. Zrekombinowane HLA-DR 1 było białkiem dostarczonym przez prof. Don C. Wiley, tym samym co stosowane podczas badań z wiązaniem białka. Peptydy HIV-1 zastosowane w badaniu przedstawiono w tabeli 1. Peptydy ARP7022, ARP7 10, ARP40-23, -28,-42, -44, -45, -46 i -47 otrzymano od dr Harvey Holmes w programie MRC AIDS reagents. Peptyd kontrolny P12 reprezentuje startową sekwencję regionu CS z gp120 HIV-1 i został dostarczony przez prof. E.F. Hounsell, School of Biological and Chemical Sciences, Birkbeck College London, UK. Rozporcjowane peptydy przechowywano do czasu użycia w -20°C.

Testy ELISA

Testy ELISA przeprowadzano według protokołu podobnego do opisanego przez Brown i wsp. (J. Immunological methods 1997, 200:79-88). Peptydy i białka mieszano z 0,05 M węgIanowo/wodorowęglanowym buforem do wiązania o pH 9,6, odpowiednio 16 ąg/ml i 1 ąg/ml i opłaszczano nimi w duplikatach płytki Immulon 4 LIBX high binding Microtiter (Dynex Technologies, INC. 14340 Sullyfield Circle, Chantilly, VA 20151-1683, USA) przez noc w 40°C. Studzienki blokowano przy użyciu 5 mg/ml kazeiny w PBS i pozostawiano w 10°C. Kozie surowice rozcieńczano 1/500 i 1/1000 razy w PBS/0,25% kazeina, podczas gdy oczyszczone przeciwciała rozcieńczano, odpowiednio, 1/1000 i 1/3000 razy i inkubowano przez 1 godz. w 37°C. Studzienki płukano 3 razy PBS/0,05% Tween 20 przy użyciu urządzenia Wellwash 4 (Danley).

Unieruchomione kozie przeciwciała wykrywano przy użyciu skoniugowanych z peroksydazą monoklonalnych mysich antykoza/owca IgG klonu GT-34 (SIGMA) rozcieńczonych 1/1000 w PBS/0,25% kazeina/0,01% Tween 20, a przeciwciała anty-HLA wykrywano przy użyciu kozich anty-mysich IgG skoniugowanych z peroksydazą (SIGMA) inkubowanych przez 1 godz. w 37°C. Po kolejnej rundzie płukania, świeżo przygotowany substrat dichlorowodorek O-fenylenodiaminy (OPD; SIGMA) inkubowano w studzienkach w temperaturze pokojowej w ciemności i reakcje hamowano po 15 min. przez dodanie 50 ąl/studzienkę 2,5 M H2SO4. Wartości OD mierzono przy długości fali 492 nm stosując czytnik do mikropłytek.

PL 216 741 B1

Tabela 1. Peptydy stosowane w testach

ARP7022: (DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC) aminokwasowy peptyd z konserwowanego regionu gp41(593-616) HIV rozpoznawany przez większość europejskich i afrykańskich surowic HIV pozytywnych.

ARP710: (VKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR) aminokwasowy peptyd pochodzący z konserwowanego końca C (CS) domeny gp120 (486-508) HIV prowadzący do miejsca cięcia gp120/41. Posiada strukturalną homologię z HLA.

ARP740/23: (RPVVSTQLLLNGSLAEEEVV) aminokwasowy peptyd pochodzący z regionu C2 gp120 (252-271) HIV prowadzący do miejsca cięcia gp120/41. Posiada homologię sekwencji z łańcuchem β HLA DR4.

ARP740/28: (NTRKRIRIQRGPGRAFVTIG) (302-321) aminokwasowy peptyd pochodzący z pętli V3 gp120 HIV-1

ARP740/42: (GQIRCSSNITGLLLTRDGGNS) (438-458)

Posiada homologię z łańcuchem DR-βΙ.

ARP740/44: (NNESEIFRLGGGDMRDNWRS) (459-478)

Posiada homologię sekwencji z łańcuchem HLA-2A.

ARP740/45: (GQDMRDMWRSELYKYKVVKI)(469-488)

Sekwencja rozpoznawana przez M38, przeciwciało reagujące krzyżowo z HLA-C oraz regionem CS.

ARP740/46: (ELYKYKVVKIEPLGVAPTKA) (469-478) aminokwasowy peptyd pochodzący z końca C5 gp120. Posiada 3 pierwsze reszty aminokwasowe homologiczne z końcem C.

ARP740/47: (EPLGVAPTKAKRRVVQREKR(479-498) aminokwasowy peptyd pochodzący z końca C5 gp120. Posiada 3 pierwsze reszty aminokwasowe homologiczne z końcem C. Posiada strukturalną homologię z HLA.

P12: (RAKTVERKVERRK)

Startowa sekwencja domeny CS gp120 HIV dostarczona przez E. Hounsell. Nie rozpoznawana przez surowice pozytywne WV.

Sekwencja kontrolna.

Testy hamowania reakcji mieszanych limfocytów (MLR)

Dawcy krwi

Próbki krwi z niedobranymi HLA klasy II były dostarczane za przyzwoleniem dawców przez Liz Buckland z South Thames Blood transfusion service, Tooting, London.

Wytwarzanie PBMC

Krew świeżo pobraną z żyły rozcieńczano w roztworze Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, SIGMA), ostrożnie pokrywano pojemniki typu Histopaque (SIGMA) i wirowano przy 800 g przez 25 min. w 20°C. PBMC zbierano z interfazy gęstości pipetą Pasteura, płukano 3 razy w HBSS i liczono przy użyciu licznika Beckman Coulter.

Testy reakcji mieszanych limfocytów

Dla danej MLR, PBMC z dwóch osobników z niedobranymi HLA klasy II rozpuszczano w podłożu RPMI 1640 zawierającym 10% inaktywowaną grzaniem ludzką surowicę AB (SIGMA), 4 nM L-glutaminy, penicylinę (100 U/ml) i streptomycynę (100 μg/ml) (SIGMA) i zaplanowane komórki stymulujące lub reagujące. Komórki wysiewano w trzykrotnych powtórzeniach, stymulujące przy 1 x komórki/studzienkę i reagujące przy 1 x 10-komórek/studzienkę, co dawało stosunek stymulujące-reagujące jak 10:1. W celu określenia efektów inhibitorowych na proliferację komórek wymuszonych przez kozie surowice i różne przeciwciała, 3 μI nie rozcieńczonych surowic kozich lub 1 μl oczyszczonego przeciwciała dodawano do studzienek zawierających zmieszane hodowle komórkowe i inkubowano w 37°C w 5% CO₂ przez 6 dni. Do hodowli podawano plusowo 1 uCi rytowanej metylotymidyny (³H-Thd; Amersham) 5 dnia, 18 godz. przed zbieraniem komórek. Komórki zbierano przy użyciu urządzenia Tomtec Harvester 96 Mach III cell harvester na filtry z włókna szklanego i mierzono włą₃ czenie ³H-Thd przy użyciu licznika Wallac 1450 microbeta ze scyntylacją płynną. Wyniki przedstawiono jako średnią liczbę impulsów na minutę (cpm).

Wyniki

Przeciwciała anty-HLA klasy II obecne w kozich surowicach

Ustaliliśmy zasięg w jakim różniące się kozie surowice rozpoznają peptydy gp120 HIV-1 wzięte z różnych regionów gp120 HIV-1, z których wiele niesie homologię sekwencji i strukturalną z HLA

PL 216 741 B1 (tabela 1). Do testów włączyliśmy także rozpuszczalne gp120 HIV-1 i HLA-DR1. Wyniki przedstawiono na fig. 1 do 9. Bg oznacza poziomy tła. Od powyżej 0,1 traktowano jako wynik pozytywny dający brak reaktywności z antygenami obserwowanych w immunizowanych wstępnie surowicach.

Różne surowice dały różniące się wyniki lecz ogólnie z tendencją reagowania z HLA-DRl. Immunizowane wstępnie surowice nie reagowały z żadnym z badanych peptydów lub białek i surowice #0125 i #0126 nie wykazywały żadnej reaktywności. Jednakże wszystkie inne surowice wykazywały wysokie poziomy reaktywności z HLA-DR1, w szczególności surowice #0127 i #0128, które posiadały bardzo wysokie reaktywności. Reaktywność z HLA-DR1 jest porównana na fig. 9 dla jasności z anty-ludzką HLA-DR i anty-ludzką HLA DR, DQ i DP.

Aktywność anty-HLA jest interesująca z tego powodu, że najprawdopodobniej reprezentuje aktywność przeciw cząsteczkom HLA samych komórek, w których hodowano wirusa przed immunizacją. Ponieważ HIV sam ciągnie więcej cząsteczek HLA w otoczce niż wytwarza cząsteczek gp120, w szczególności cząsteczek HLA klasy II, których wytwarzanie jest podwyższone w komórkach, kombinowana aktywność anty gp120 i anty-HLA klasy II może być tą, która reprezentuje dobrą odpowiedź ochronna przed HIV. Może to być przypadek niektórych surowic, w szczególności #0127 i #0128, że silna „allo odpowiedź była indukowana w tych kozach przez immunizację wirusem, który na swojej powierzchni niósł wysokie poziomy cząsteczek Klasy II.

Surowice #0378 z kozy immunizowanej koktajlem wirusowym NIH wykazywały najlepsze ze wszystkich reaktywności krzyżowych wobec wielu peptydów HIV-1 z poziomami anty-HLA DR1 średnio takimi samymi, jak pierwotne kozie surowice anty-LILV-3B co sugeruje, że surowice te mogą być ogólnie lepsze wobec HIV. Surowice te reagują bardzo dobrze z szeregiem peptydów HIV-1 niosących homologię z HLA. Żadna z surowic reagujących ze startową sekwencją kontrolną P12 nie pokazała, że reaktywność była swoista dla peptydów LIIV. Surowice #0127 i #0128 reprezentują najlepsze surowice w takim znaczeniu, że wiążą się z gp120 HIV zawierając bardzo wysoką aktywność anty-HLA DR.

Hamowanie MLR przez kozie surowice

Dla MLR pokazanych na fig. 10 i 11 stosowaliśmy komórki z losowo wybranych osobników. Chociaż niekoniecznie dawały one najwyższą proliferację (w tym czasie wystąpił problem z pożywkami), pojawiła się tendencja wykazująca hamowanie proliferacji podczas MLR przez surowice kozie (W każdym przypadku stosowano surowice pierwotnie immunizowane HIV-3B). Następnie zaczęliśmy stosować komórki z niedobranymi HLA klasy II (fig. 12), które dawały lepszą proliferację. Tak jak przeciwciała anty-HLA DR, surowice kozie dają całkowite zahamowanie proliferacji komórek i wydaje się, że posiadają aktywność przeciwzapalną.

Sądząc po wynikach z ELISA, jest bardzo prawdopodobne, że za efekt hamowania odpowiedzialne są przeciwciała anty-HLA DR. Podkreślamy rolę raczej przeciwciał anty-HLA DR niż przeciwciał przeciw całej klasie II, ponieważ wydaje się, że przeciwciało o szerokim zakresie nie hamuje proliferacji tak skutecznie jak samo przeciwciało anty-HLA DR. Dlaczego tak się dzieje jest tajemnicze, chociaż może być tak, że HLA-DR stanowią główny antygen klasy II związany z aktywnością zapalną i przeciwciała przeciwko niemu mogą prowadzić do przekazania sygnału w komórkach, który powoduje zahamowanie replikacji. Surowice kozie mogą zatem działać jako czynnik przeciwzapalny, wpływający na supresję proliferacji komórek. Może to rokować pozytywny wynik w przypadku zakażenia wirusem HIV-1, gdzie zaindukowana wirusem aktywacja komórkowa jest kluczowa dla replikacji wirusa. Chociaż na powierzchni może wystąpić brak produkcji, wprowadzenie łagodnego czynnika immunosupresyjnego może hamować replikację wirusa i kontrolować chorobę, ponieważ HIV, inaczej niż pokrewne retrowirusy HTLV-1 lub HTLV-2, nie unieśmiertelnia komórek i nie wywołuje nowotworu, a więc jest całkowicie zależny od aktywacji komórki do proliferacji.

Do tej pory nie zidentyfikowano superantygenu komórek T dla HIV, który prowadzi do wskazania w jaki sposób wirus, który wydaje się być stosunkowo słabo wyposażony do aktywowania komórek które infekuje, może wywołać chorobę. Stworzyliśmy teorię, zgodnie z którą u korzeni leży alloaktywacja indukowana wirusem, związana z cząsteczkami HLA towarzyszącymi wirusowi lub z mimikrą molekularną obserwowaną pomiędzy HIV i HLA. Możliwe, że surowice kozie przyczyniają się do dobrego samopoczucia pacjenta po prostu przez ograniczenie pełnej aktywacji. Obserwacje podobnych linii przeprowadzono w artykule napisanym przez Saifuddin M. i wsp. (Clin. Exp. Immunology 2000, 221: 324-331), którzy wykazali istotną rolę cząsteczek HLA klasy II, w szcze-gólności HLADR, w replikacji wirusa. Zauważyli oni, że przeciwciała do cząsteczek HLA klasy II hamują ekspresję wirusa w komórkach wytwarzających klasę II i zasugerowali, że do wzmocnienia transkrypcji

PL 216 741 B1

HIV-1 wymagana jest obecność indukowanego transaktywatora MHC klasy II (CIITA). Możliwe, że efekty te skutecznie obserwujemy w przypadku kozich surowic. Porównaj to z przeciwciałem przeciw pętli V3, które powoduje wzrost proliferacji i może przez to uniemożliwiać produkcję w ogólnym schemacie. Wysoce zmienny region pętli V3 z gp120 nie tylko pozwala na ucieczkę zmutowanych wirusów lecz także działa jako pułapka dla systemu odpornościowego dla dalszych rund aktywacji. Niestety wcześniejsze zajęcie tego regionu jest ostatecznie korzystne dla wirusa i utrzymuje odpowiedź odpornościową z dala od bardziej konserwowanych regionów, przeciwko którym aktywność może być bardziej przydatna.

Jeśli efekty przeciwzapalne są rzeczywiście głównym sposobem aktywności surowic, mogą być przydatne w wielu innych stanach, w których hiperaktywność i proliferacja komórek leżą u korzeni objawów chorobowych, przykładowo w stwardnieniu rozsianym. Dia dalszych doświadczeń ważne jest powtórzenie ELISA dla wszystkich surowic w celu potwierdzenia zakresu aktywności anty-HLA i gp120. W tym przypadku jesteśmy bardzo zainteresowani surowicą #0378 od zwierzęcia immunizowanego koktajlem wirusowym NIH ponieważ reaguje ona skutecznie z wieloma peptydami HIV niosącymi homologię z antygenami HLA jak również z HLA-DR1.

Dalsze doświadczenia

Następujące dane pochodzą z doświadczeń podobnych do tych podjętych wcześniej, gdzie zidentyfikowaliśmy przeciwciała anty-HLA w koziej surowicy, która była zastosowana jako forma leczenia wolontariuszy cierpiących na stwardnienie rozsiane i AIDS, wówczas gdy tradycyjna terapia nie była dłużej stosowna. Nasza praca dotyczy ujawnienia działania zaproponowanego mechanizmu przeciwzapalnego surowicy koziej w powrocie do zdrowia pacjentów poddanych leczeniu. Było to zaproponowane wcześniej, kiedy zauważono przeciwciała anty-HLA. Jednakże obecnie dodaliśmy rolę dla przeciwciał anty-FAS obecnych w koziej surowicy, dając im zdolność do indukowania w ciągu godzin apoptozy komórek wytwarzających receptor FAS.

Przekazywanie przez FAS/APO-1 (CD95), dostrzegalnie obecnego w dużej ilości na aktywnych limfocytach, sygnału może indukować tę komórkę do popełnienia samobójstwa po połączeniu z ligandem FAS lub przeciwciałem anty-FAS. Rola tych cząsteczek jest wyjątkowo ważna nie tylko w cytotoksycznej odpowiedzi odpornościowej zabijającej zainfekowane komórki, ale także w obniżeniu poziomu regulacji odpowiedzi odpornościowej po zaniknięciu antygenu zapobiegającej stałej proliferacji komórek, która może być szkodliwa dla gospodarza. Zatem szlak ten jest uważany za niezbędny do utrzymywania zbalansowanej odpowiedzi odpornościowej.

W przypadku zakażenia HIV, układ odpornościowy widziany jest jako nieprawidłowo aktywny, dający dużą przestrzeń do replikacji wirusa jako, że do procesu tego wymagane są komórki aktywowane. U pacjentów ze stwardnieniem rozsianym silnie aktywowane komórki przechodzą barierę krew mózg i są odpowiedzialne za niszczenie otoczki mielinowej w wyniku czego powstają płytki demielinizacyjne i następuje utrata funkcji neuronowych.

Mechanizm przeciwzapalny, zachodzący za pośrednictwem aktywności przeciwciał anty-HLA (przynajmniej anty HLA DR), obecny w koziej surowicy może być mechanizmem stojącym za powrotem do zdrowia pacjenta. Obecnie odkryliśmy obecność przeciwciał anty-FAS w surowicy koziej w różnych zakresach i proponujemy połączenie ról przeciwciał anty-HLA i anty-FAS w proponowanym mechanizmie przeciwzapalnym, jako sposobie aktywności zarówno u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym jak i AIDS. Proponujemy, że przeciwciała te trafiają w najaktywniejsze komórki czego wynikiem jest ich śmierć podczas gdy przeciwciała anty-FAS tłumią każdą aktywność odpornościową. Następnie może zachodzić dramatyczna redukcja wytwarzania cytokin i chemokin wynikiem czego jest terminacja ataku odpornościowego na mielinę w przypadku stwardnienia rozsianego lub redukcja miana wirusa w przypadku pacjentów zakażonych HIV, co daje utratę aktywowanych komórek i śmierć komórek wydzielających lub wokół komórek wydzielających wirusa.

Praca doświadczalna

Przystąpiliśmy do poszukiwania przeciwciał anty-FAS dysponując obserwacjami, że surowica kozia od osobników odpowiadających niszczyła komórki po dodaniu do reakcji mieszanych limfocytów (MLR). MLR są utworzone z limfocytów 2 różnych osób z różnymi typami HLA reagującymi w niespe cyficzny sposób, w wyniku czego dochodzi do proliferacji limfocytów i wzrostu obrotu metabolicznego. Czujemy, że jest to dobry system do badania przeciwciał przeciwzapalnych jako, że reakcje wszystkie autoimmunologiczne są skierowane na nieprawidłowe wytwarzanie własnych peptydów na cząsteczkach HLA klasy 2.

Figury 13 do 16 są zdjęciami z niektórych ostatnich MLR, z i bez surowicy.

PL 216 741 B1

Figura 13 jest zdjęciem reakcji mieszanych limfocytów po 72 godz.

Figura 14 jest MLR zmieszaną z immunizowaną wstępnie surowicą po 72 godz.

We wszystkich przypadkach nie ma znaczących zmian w porównaniu z samą MLR. W rzeczywistości surowica immunizowana wstępnie pobudza MLR.

Figura 15 jest MLR z dodaną surowicą #0125. Surowica ta pochodzi z kozy, uważanej za nieodpowiadającą na immunizację dlatego, że posiadała niskie lub nieistotne przeciwciała HLA i/lub FAS, co korelowało z naszymi wcześniejszymi wynikami ELISA, kiedy identyfikowaliśmy anty-HLA DR w osobnikach odpowiadających.

Figura 16 jest MLR z dodaną surowicą #0127, dla której wykazano, że bardzo dobrze odpowiada. Istnieje znacząca destrukcja komórek z wielu PBMC w MLR. Wynik ten jest podobny dla wszystkich silnie odpowiadających wraz z preparatem surowicy stosowanym obecnie do leczenia.

Zdecydowaliśmy się na poszukiwanie przeciwciała zdolnego do indukcji niszczenia wysoce aktywnych komórek, która mogła mieć miejsce w MLR. Zatem poszukiwaliśmy obecności przeciwciał przeciw FAS, które mogłyby być zdolne do krzyżowego łączenia z receptorem FAS i do indukowania sygnałów koniecznych do wystąpienia apoptozy. W konsekwencji przeprowadziliśmy test ELISA przeciwko FAS, który pokazał obecność takich przeciwciał w surowicach z kóz o których uważano, że odpowiadają i które uzupełniały poprzednie wyniki z przeciwciałami anty-HLA.

Wyniki te wraz z wcześniejszymi danymi dobrze korelują z tym co widzieliśmy w naszych wynikach MLR ze zredukowana proliferacją komórek wynikającą z uszkodzenia komórek.

Na podstawie ostatnich wyników testu ELISA podjęliśmy się zidentyfikowania dalszych prawdopodobnie aktywnych składników w surowicy koziej, którą stosowano jako formę leczenia wolontariuszy cierpiących na stwardnienie rozsiane (MS) i AIDS, wówczas gdy tradycyjna terapia nie była dłużej stosowna.

Poniżej przedstawiono wyniki przeszukiwania testem ELISA przeprowadzonego przy rozcieńczeniu immunizowanej wstępnie surowicy 1 do 10000. Przeszukiwanymi antygenami były: albumina jaja kurzego, HLA-DR1 (DR1), Fas, receptor czynnika wzrostu neuronów p75 (NGFr), receptor serotoniny (Ser R), receptor dopaminy (Dop R), CXCL 10 i monokina indukowana przez interferon gamma (MIG).

Jest już oczywiste, że przeciwciało przeciwko receptorowi dopaminy jest obecne w wysokich stężeniach w surowicy, podczas gdy nie ma aktywności do żadnego innego antygenu. Chociaż istnieje aktywność przeciwko wielu spośród tych antygenów w pierwotnej surowicy 3B, która była wcześniej stosowana do leczenia i w surowicy 0127 wytwarzanej z kozy immunizowanej HIV IIIb wytworzonym w linii komórek T, włączając aktywność przeciw NGFr, receptorowi dopaminy i CXCL 10.

Aktywność przeciwko HLA i FAS jest znowu oczywista i zgodna z proponowanym już przez nas mechanizmem przeciwzapalnym. Zgodnie z tym możemy obecnie dodać aktywność przeciw CXCL 10 i receptorowi czynnika wzrostu neuronów p75 (NGF R p75). Pokazano ostatnio, że surowica odpornościowa przeciw CXCL 10 jest korzystna dzięki znaczącemu redukowaniu ostrości choroby w mysim modelu stwardnienia rozsianego poprzez redukowanie komórek T z CD4+ i makrofagowej inwazji przez CNS, obniżenie ekspresji cytokininy IFNy w TH1 i wzrost remielinizacji. Jest interesujące, że miejscowe komórki w zmianie zapalnej powszechnie wytwarzają CXCL 10, które wiążą i przyciągają zapalne komórki TH1 poprzez receptor CXCR3. Zatem neutralizacja chemokiny lub blokowanie jej receptora przez przeciwciała w surowicy koziej może z powodzeniem być częścią działania mechanizmu przeciwzapalnego jaki proponujemy dla koziej surowicy.

Tymczasem przeciwciała o niskim powinowactwie do receptora czynnika wzrostu neuronów NGF R p75 związane są ze śmiercią komórki, u monocytów i makrofagów zakażonych HIV, poprzez blokowanie NGF przed osiągnięciem receptora, co znowu stanowi inny mechanizm przeciwzapalny. Interesująco odkryliśmy silniejsze poziomy przeciwciał przeciwko tym receptorom obecne w surowicy 0378 wytwarzanej przez kozy immunizowane koktajlem 6 różnych wirusów HIV wytwarzanych pierwotnie raczej w PBMC niż w samych komórkach T. Aktywność ta pozostaje bardzo wysoka nawet przy rozcieńczeniu 1 do 4000.

Dlatego dodaliśmy aktywność przeciw tym antygenom w zgodzie z działaniem mechanizmu przeciwzapalnego proponowanego dla surowicy w przypadku obu chorób. Dodaliśmy także aktywność dla receptorów dopaminy i serotoniny jako dobrze wiązanych z leczeniem.

Przebadaliśmy wiele nowych kóz (707-718), które były ostatnio szczepione HIV wraz z immunizowaną wstępnie surowicą pochodzącą z tych kóz. Chociaż żadna z nich nie wykazała przeciwciała przeciwko receptorowi dopaminy, jak wykazywały pierwotne surowice przedstawione powyżej niektóre

PL 216 741 B1 z kóz posiadają w przybliżeniu wyższy poziom takiego przeciwciała w porównaniu z kozami z Walii, które nigdy nie dostały szczepionek przeciwko wściekliźnie. Wyższe poziomy obserwowane w pierwotnych immunizowanych wstępnie próbkach mogły być wynikiem wystawienia na jakiś czynnik środowiskowy w tym samym czasie w przeszłości, po którym nastąpiła silna odpowiedź.

Immunogen alternatywny

W dalszym wariancie, zastosowanie wirusa HIV jako immunogenu do uzyskania przeciwciała nie jest konieczne i do uzyskania skutecznego preparatu przeciwciał wykorzystywane są jako immunogen ludzkie białe krwinki. Figura 30 dostarcza profile surowic z kóz immunizowanych koktajlem HIV i ludzkimi białymi krwinkami oznaczonymi jako SHULA.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie poliklonalnego koziego przeciwciała anty-HLA klasy II do wytwarzania leku do stosowania u ludzi w leczeniu chorób związanych z proliferacyjną odpowiedzią odpornościową, przy czym choroba jest chorobą zapalną, autoimmunizacyjną, uszkodzeniem aksonu lub nerwu lub rakiem.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że poliklonalne kozie przeciwciało anty-HLA klasy II jest wywołane prowokacją przez HIV.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że przeciwciało wykazuje aktywność anty-HLA i anty-HIV.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą jest stwardnienie rozsiane.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą jest reumatoidalne zapalenie stawów.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobą jest zapalenie nerwu.