JP5014562B2 - 治療薬 - Google Patents

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Description

本発明は、治療薬、特に増殖性免疫応答(proliferative immune response)を伴う疾患を治療するための治療薬に関するが、それだけには限定されない。
国際公開第97/02839号は、ウイルス感染のウイルス抑制、治療および予防に関する。患者のウイルス感染を治療するための中和抗体の製造方法を提供しており、
a.ほ乳類がウイルスに対する中和抗体を産生するように、前記ほ乳類を前記ウイルスに曝露する段階、および
b.前記ほ乳類から前記中和抗体を収集する段階が含まれる。実施例では、HIVウイルスとヤギから得られたHIV中和抗体を混合することによってAAV2と称されるHIVワクチンを得ている。
国際公開第01/60156号は、中和抗体および免疫調節促進組成物に関する。
抗原に特異的な異種抗体、および
抗原を含む免疫調節組成物であって、
前記異種抗体が薬剤担体と組み合わさるために抗原と複合体を形成する組成物を提供している。実施例は国際公開第97/02839号の場合と同様で、また、HIVウイルスとヤギから得られたHIV中和抗体を混合することによってAAV2と称されるHIVワクチンを得ている。
国際公開第02/07760号は、治療薬に関する。
(1)ヤギ免疫系をHIVに曝露する段階、
(2)HIVチャレンジ後、ヤギから抗体を精製する段階、および
(3)患者を前記の段階2で得られた抗体で治療する段階を含むHIV感染の予防方法またはHIVに感染した患者の治療方法を提供している。
国際公開第02/07760号の抗体生成物に基づいた予備臨床試験では、HIVチャレンジ後のヤギの血清を使用したHIV患者の治療は成功した。
好ましくは、この治療では、ヤギで有効な抗体を生じさせ、ヤギから血液を採取し、採取した血液のHIV中和能を示し、血液から固形物を除去し、過飽和硫酸アンモニウムまたはその他の適切な沈殿剤を使用して固形物を沈殿させ、沈殿を分離し、適切な水性媒体で沈殿を溶解し、カットオフ5から50000ダルトン、好ましくは7から30000ダルトン、より好ましくは8500から15000ダルトン、特に約10000ダルトンでこの溶液を透析することを含む方法によって得ることができる血清組成物を使用する。ヤギの免疫方法は筋肉内とすることができるが、皮下または皮内投与などのその他の標準的方法もまた使用することができる。全残渣を使用するならば、精製方法はまた、その他の通常使用される分画作用方法(たとえば、カプリル酸)によって完了することができる。
より詳細には、この治療では一般的に以下の方法で得られたヤギ血清を使用する。
ヤギ血清の産生の例
ヤギに、市販の標準上清に懸濁させた溶解HIV-3bウイルスを1ml当たり109ウイルス粒子の濃度で筋肉内注射して接種した。ウイルスは60℃で30分間加熱して予め死滅させておいた。血液試料を適切な間隔を空けて、たとえば最初の評価のためには2週間後に採取した。最適な方法では、ヤギに4週間毎週注射して、その後6週目に採血して反応物(reagent)を得た。
約400ccの血液を滅菌技法によってヤギから採取する。針で採取する部分を剃毛し、ベタジンで準備する。18ゲージの針を使用して、動物から約400ccの血液を採取する。動物はいかなる有害な反応を起こすことなく約400ccの血液採取に耐えられることに留意されたい。動物を殺処分する必要はない。その後、約10日から14日して血液量が再び補充された後、動物から再度採血することができる。
潜在的に有用な抗体の存在を確認した。このような反応物の存在が一旦確認されたら、血液を4〜6週の間にヤギから採取し、遠心分離して血清を得る。次に、血清300mlを濾過して、大きな凝血塊および粒状物質を除去した。次に血清を過飽和硫酸アンモニウム(室温で45%溶液)で処理して、抗体およびその他の物質を沈殿させた。得られた溶液を5000rpmで5分間遠心し、その後上清液を除去した。沈殿したイムノグロブリンは、沈殿を再溶解させるのに十分なリン酸緩衝生理食塩水(「PBS緩衝液」、Sambrook et al.「Molecular cloning, A Laboratory Manual」、1989参照)に再懸濁した。
次に、この溶液を分子量カットオフ10000ダルトンの膜で透析した。PBS緩衝液を4時間毎に交換して24時間透析を行った。透析は4℃で行った。
24時間透析した後、透析バッグの内容物を滅菌ビーカーにあけた。単位体積当たりの質量が10mg/mlになるように、この溶液を調節した。PBSを使用して希釈した。次に、得られた溶液を0.2ミクロンフィルタで滅菌容器に濾過した。濾過後、溶液を1回用量1mlずつに分割し、使用前は-22℃で保存した。
この反応物を次に使用するために準備した。
たとえば、硫酸アンモニウムの濃度を変更したり、試薬を変更したりして、この方法に変更を加えてもよい。同様に、透析のカットオフは10000ダルトンである必要はない。
国際公開第97/02839号 国際公開第01/60156号 国際公開第02/07760号 Sambrook et al.「Molecular cloning, A Laboratory Manual」、1989 www..kcl.ac.uk/kis/schools/life_sciences/life_sci/baum.html Immunology Today, 1996, February, 17, 64-70 Brown et al.(J Immunological methods 1997, 200:79-88) Saifuddin M et al.(Clin. Exp. Immunology 2000, 221: 324-331)
ヤギ血清を使用した治療の一部として、その他の有益な結果が得られることに留意されたい。たとえば、I型糖尿病を有するHIV患者では、主たるHIV感染だけでなく、糖尿病の症状の改善も認められた。ある種類の癌を有するHIV患者では、癌およびHIV症状の寛解が認められた。
HIV感染患者並びに多発硬化症およびある種の癌などの異なる症状を有する患者で著しい臨床改善が認められたという知見は、これらの疾患は全て慢性的な炎症状態であることと関係している可能性がある。
本発明では、抗HLA活性の存在下でヤギ血清の活性が存在することが発見された。
驚いたことに、HIVで免疫したヤギがin vitroで使用する古典的な活性化アッセイの1つである混合リンパ球反応アッセイを無効にすることができる血清を生じることは容易に示すことができた。これはヤギ血清に固有のある種の特性である可能性を考えると、注射していないヤギの血清がこれらのアッセイでなんら活性を示さなかったことは興味深かった。
この活性が、HLAクラスII抗体に対する活性と密接に関連していることもまた示した。これが分子擬態応答を表しているかどうかはわからず、ウイルスが発芽して、感染細胞から放出するとき、ウイルスが持っているHLAクラスIIをヤギが認識するのか、またはこのようなHLA(MHC分子)はウイルスとは別に放出されるが一緒に精製され、したがって抗体はまたこのような細胞膜成分に合わせて作られるのかはわからない。実際に、ケモカイン受容体および関連分子などのその他の細胞膜分子もまたこの調製物に存在し、有益な治療効果を変更する抗体応答を誘導することが可能であることを見逃さなかった。しかし、見逃したとしても、抗HLA応答は非常に優勢のようなので、その他の細胞膜分子は観察された抗炎症応答の誘導に関して重要ではあるが、必ずしも必要ではない単独の役割を果たす可能性があると考えられる。
異なるウイルス/細胞調製物で免疫した別々のヤギから得られた血清で研究したところ、カクテルを注射したヤギではおそらく将来のワクチン設計に非常に重要となる多くのHIVエンベロープの陰性部分、すなわち沈黙部分を認める免疫応答が生じた。
本発明の一態様では、増殖性免疫応答を伴う疾患で使用するために、HLAクラスII抗原を認識する抗体を提供する。
血清中にはHLAクラスIIおよびクラスIの両方に対する高力価の抗体があり、最高濃度の抗体を有するものは混合リンパ球応答を最も無効にし、臨床面で最も効果を有するようである。
驚いたことに、FASに対する抗体、主要なアポトーシスリガンドが極めて多いことを発見した。実際に、これらはMHCクラスII抗体と関係があった。理論と結びつけはしないが、FASに対する高力価抗体は、FAS抗原に抗体が結合して数分以内に即時アポトーシスを引き起こし、細胞を死に至らしめるという仮説を立てた。これによってMSの障害に関連すると考えられる毒性ケモカインの阻害が引き起こされる可能性がある。
したがって、本発明では、FASに対する抗体はHIV、多発硬化症およびその他の症状の治療に重要であり、治療においてクラスIIおよびクラスIに対するその他の抗体と共に利益をもたらす可能性があることを報告する。
本発明の一態様では、このような治療に感受性のある疾患の治療における抗FAS抗体の使用を提供する。
さらに、本発明はまた、抗HLA抗体および/または抗FAS抗体を含有する組成物、このような組合せを使用した治療方法を提供する。
本発明は主に、不適切に高濃度のHLAを有する疾患の治療として抗HLAを含有する血清に使用する。これらには、多発硬化症、慢性関節リウマチ、糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性硬変および心臓、肺、皮膚、胃腸管、腎臓、脳、CNSのウイルス性bおよびc自己免疫疾患が含まれる。より一般的には、本発明によって治療可能な症状には、HIV、炎症性疾患、自己免疫疾患、軸索または神経の障害または関連する機能障害または癌および炎症要素を有するその他の疾患または症状が含まれる。
抗FASが存在すると、おそらくサイトカインおよびケモカインなどの損傷メッセンジャを分泌している慢性的に活性化された細胞に関連した疾患に特に適した血清が形成される。これらには、多発硬化症、全ての形態の神経系慢性炎症状態および慢性炎症病変、特に肺、膵臓、肝臓、腸、リンパ節、皮膚、特に扁平上皮細胞および基底細胞癌の慢性炎症病変に関連したウイルス、細菌および熱帯性癌が含まれ、脳および脊髄の1次および2次腫瘍にもまた有益である。
神経に外傷損傷を受けた人の神経機能に改善が認められたことによって、神経成長因子の特性が示唆され、したがって外傷、感染後の障害、たとえばギランバレー、悪性腫瘍障害など、糖尿病に関連した神経障害、アルコール中毒、金属またはその他の毒素による中毒などのために使用することが可能である。
毛髪および皮膚の色調に対して認められた効果によって、前記の現在までの抗体などに関する観察では説明できないその他の特有の特性、すなわち抗加齢が示唆され、この血清によって続発性癌活性が減少するという報告によって、直接的な抗癌活性はFAS活性と関連している可能性があるが、未確認因子のようにその他のものに起因する可能性もある。
一態様では、抗体は狂犬病に対して予防接種したヤギから得ることが好ましい。
変更例では、本発明はウマ、ヒツジおよびその他の適切な動物から得られた抗体にも適用される。この抗体は、ヤギ抗体用に用いた方法と同様の方法で得ることができ、抗HLAおよび/または抗FAS活性を評価することができる。さらに変更例では、抗体を得るための免疫原としてHIVウイルスを使用する必要はなく、ヒト白血球細胞またはヒト由来細胞系膜抗原を免疫原として使用して、効果的な抗体調製物が得られる。さらに、抗体を免疫原と交換することができ、すなわち治療組成物にHIV物質または白血球細胞を含めることができるものと考える。
他の変更例では、ウイルス培養物が増殖した上清溶液、または同様の能力があるが、培養物を増殖させるために使用しなかったものを加熱によって不活性化した後、適切な抗体応答を生じる免疫原として使用することもまた可能である。HIVまたは他のウイルスのin vitro増殖に適切な任意の上清溶液またはその他の媒体を使用して、効果的な抗体応答を生じる許容可能な免疫原を産生することが可能である。PMBCまたはHIV 111b増殖用に使用したような癌不死細胞株などの細胞培養増殖培地の上清が例として挙げられる。HIVまたはその他選択したウイルスは、抗体調製物を精製するための効果的な免疫原を産生させるために存在させる必要はない。
好ましくは、本発明の抗体はHLAクラスII抗原レパートリーおよびgp120抗原を認識し、またはFASを認識するポリクローナル抗体である。我々の発見によって、HLAクラスII抗原を有することが好ましいことが示唆される。
適切な抗体は、免疫原として選択した抗原、好ましくは抗原カクテルを使用することによって引き起こすことができる。異なる抗原範囲を使用することによって、患者においてより強力な応答をもたらす抗原の共通構造を認識する抗体を生じることが可能である。HIV単離物を選択することによって構造に小さな変動があるエピトープがもたらされ、汎抗体が得られるという仮説を立てた。
したがって、血清を作製するために、T細胞単独で使用するよりもPBMCにおいて主に産生される様々なHIVウイルスのカクテルを使用することが好ましい。このカクテルはこのようなウイルスを2、3、4、5、6種またはそれ以上含有することが好ましい。このウイルスは細胞溶解物の形態であることが好ましい。好ましい細胞溶解物の例には、以下のHIV-1単離物、91US056、92HT593、92US723、92US657、92US660および92US714が含まれる。このカクテルは、少なくともこれら特定の単離物を1、2、3、4、5種または6種全てを含有することが好ましい。
たとえばコンカナバリンAによる細胞の活性化は有利で、Con Aを使用してたとえば高い濃度の抗ドーパミン活性を実現することができる。(活性化していない)SHULAは、O.D.の基線を上回る抗ドーパミンR濃度を有意には上昇させなかった。一方、HIV 3B(12種のヤギおよびウサギの平均)は上昇させた。カクテルのCon A活性化PBMC細胞の間ではドーパミンR濃度もまた上昇していた。
さらに他の変更例では、HIVに限定はしないが、in vitroにおけるHIVウイルスの増殖に適切な上清溶液は、PBMCまたは、たとえばHIV 111bを増殖させるために使用したような不死細胞株などのその他の媒体の形態であり、通常の方法を使用してウイルスを熱によって死滅させればHIVウイルスが存在しておらず、ウイルスを誘導しなくてもそれ自体で、効果的な抗体調製物を産生するだろう。
このような抗体はまた、HIV細胞溶解物から単離されたペプチド、合成ペプチド、細菌融合蛋白質および所望する細胞培養物またはその他の上清残渣を含有するか、または模倣する系統発生学的に関係のない原料から得られた蛋白質/ペプチドを含有する蛋白質を使用して得ることができる。細胞溶解物に対する抗体を得て、試験することができる。
最近の理論に結びつけはしないが、本発明の抗体はHIVまたはこのような免疫応答に関連したその他の症状に必要な種類の細胞増殖を抑制するように作用するようである。したがって、たとえば、本発明は多発硬化症の治療での適用が見出される。
ヤギ血清から得られた抗体の抗HLAおよび抗FAS活性の重要性に気が付いた今、このような一連のヤギ血清の秘めた有用性を評価することが可能となった。単純なアッセイで、抗HLAおよび/または抗FAS活性の存在を評価することができ、患者への投与に適した血清候補の同定が可能となる。
本発明では、1種または複数の、好ましくは少なくとも数種のHIV単離物を動物に投与し、免疫応答を起こさせ、動物から血液を採取し、抗HLA抗体および/または抗FAS抗体の存在をモニターし、ヒトの治療に適した抗HLAおよび/または抗FAS血清を調製することを含む血清、特にヤギ血清の調製方法を提供する。
通常複数の動物を使用して、効果的な血清をより多く産生する動物を評価することができる。次にこのような産生量の多い動物を繁殖させて、本発明に特に適した動物の系統を形成することができる。
通常品質管理方法を採用して、抗HLA抗体の存在、一般的な一連の抗HLA抗体、および/または抗FAS抗体の存在、一般的な一連の抗FAS抗体を確認する。バッチとバッチを相互に関係づけて、標準化した生成物を得る。
MLRを劇的に阻害する血清の能力に基づいて、この血清が強力な抗炎症薬として作用することができることが示唆された。これを実施される機構はいくつかあり、HLA認識の阻害はおそらくそのうちの1つであろう。
熱処理によって妨害されることが知られている唯一の活性であることから、補体がこのヤギ血漿の活性に関連しているので、たぶん他の作用機構があるだろう。たぶん補体は、患者の弱くなった脱出機構を活性化することができるだろう。たとえば、ウイルスおよび腫瘍細胞を殺すことを目的とする抗体と殺すことを目的とする細胞媒介抗体の両方には補体が必要で、補体がないと効果または機構が全体的に失われる。
さらに、本発明は、個々の特異的抗体を単離するために設計されたのではない血清抽出技術によって、適切に誘発されたヤギの血液から得ることができる活性成分を含む組成物を提供する。特に本発明では、誘発したヤギの血清から個々の抗体を得るために完全に精製したり、抽出したりすることなく、活性成分、おそらく抗HLA抗体および/または抗FAS抗体が一緒になった混合物を単離することを考える。
一般的に、非ヒト宿主から得られた抗体をヒトに注射することは禁忌(counter-indicate)である。強力な免疫応答が通常外来抗体自体に起こる。しかし、驚いたことに、ヤギ血清抽出物を使用するとその他の外来動物蛋白質で予測される免疫応答は生じないことが発見された。ヤギ血清抽出物の注射は、免疫抑制患者と正常人の両方に耐容性がある。
本発明は特に、HIV誘発したヤギから得られた、おそらく抗体分子の全集団が含まれている血清抽出物を使用する。理論に結びつけることは望まないが、このような取り組みは重要な利益を有するものと考える。このような血清抽出物で治療した患者は、治療して数分以内に著しい効果を示した。
殺菌したウイルスを具体的に確認したヤギに筋肉内注射によって注射し、インキュベートして、その後血液を計量して採取し、しかるべく加工した。
任意選択で血清の所望する抗体活性を試験し、任意選択で1種または複数の抗融合能、AIDSウイルスの中和活性、食作用増強能およびヒトの体への許容性を試験する。
選択したヤギにHIVウイルスを接種した後、外来蛋白質抗原に曝露した後の免疫応答を初期研究に従って記録した。次に、ヒトに使用できるように調製するために、抽出した血清をさらに加工した。
HIVを動物に接種することによって生じた反応物を、本発明の方法によって加工し、改良すると、AIDS複合体の全体性が完全に変わることが示された。
これが実際にどのように達成されるかを説明するのは複雑であるが、HIV陽性または末期AIDSの患者に投与したときの結果は次の通りである。
1.ほとんどすぐに患者の生活の質が改善される。
2.CD4およびCD8細胞の増殖が起こり、それによってCD4およびCD8細胞数が増加する。
3.患者におけるウイルス負荷量が一般的に0.5logずつ増加して理論的にゼロに減少する。
4.P24値がゼロに減少する。
結局、患者の免疫系を正常に戻して、ウイルスを排除することが可能であること意味するが、この状態がどの位持続するのか現在のところはわかっておらず、現在の観察では3年近くである。
男女含めて10歳以上の約200人において、この薬剤による治療は成功を収め、いかなる再発も副作用の発生も認められなかった。
治療は、皮下注射によって施され、量は10分の1ccと10ccとの間で変化させ、リンパ系に可能な限り速やかに薬剤を送達させるように設計する。本発明では、HIV患者への好ましい用量は必要であれば通常週1mlで、両腕に半々ずつ投与する。2または3週間隔で投与することが一般的であり、その後は3カ月間隔で投与する。癌患者の場合は、週に0.3mlが最適なようである。
ほとんどの場合において、治療は4週間に1回3カ月に渡って実施した。同様に見られた一般的な所見は以下の通りである。
1.注射後60分未満で中程度から重症の鬱が回復する。
2.一般的に注射後2時間以内に患者の食欲が回復し、活発に食物を求めるようになる。
3.最初の治療から約2週間以内に、患者の体重が上昇し始める。
4.最初の治療から4から6週間後にウイルス負荷量およびP24値が実質的に下降し、CD4およびCD8細胞が劇的に増加することが独立した研究室報告によって確認された。
5.副作用は全く認められなかった。
本発明の薬物治療は、現在の治療とは異なり、患者が毎時間または毎日投与計画を厳守する必要がなく、毎週または毎月投与される簡単な注射に委ねられている。
組成物は精製して、本質的に精製した血清抽出物のみから成ることが好ましい。さらなる変更として、抗体は、全体として、または選択して、およびグループに分けて、疾患に特異的な必要性に応じて複合血清または血漿混合物から、限定はしないが、たとえば免疫親和性クロマトグラフィ、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、サイズクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、適切であるならば、または所望するならばそれらを組み合わせた通常または任意のその他の適切な方法によって精製することもまた可能である。
本発明の抗HLA抗体および/または抗FAS抗体による併用治療もまた考えられるが、必要ではない。
本明細書で説明したように生成したヤギ血清抽出物は、本発明にしたがってin vitroまたはin vivoでウイルス複製を阻害する組成物に製剤することが可能である。このように、本発明はまた、疾患、たとえばウイルス疾患の治療に適した本発明のヤギ反応物を含む医薬組成物に関している。本発明の反応物は適切な薬剤として許容される担体と混合することができる。
医薬組成物の例には、適切な組成物を有する固形物(錠剤、丸剤、カプセル、顆粒など)または経口、局所または非経口投与が含まれ、担体を含めることが可能である。この組成物は、非経口で投与するときは滅菌することが必要とされる。
通常ヒトにおいて過免疫ヤギ血清に対するアレルギー反応が起こるかどうかを確認するために試験投与を行う。皮内注射の後、30分待機して水腫、紅斑および掻痒として表れる中間反応があるかどうかを確認する。この反応が陰性であれば、直ちに敏感反応が生じるらしいことが想定される。しかし、アレルギー反応は、アレルギー反応が起こりうるために人が有効な救命治療を受けるのを阻むものではない。
本発明の組成物の投与は、静脈内注入、皮下、筋肉内注射、経口調製物、腹腔内および静脈内投与などによる任意の適切な方法によって行うことができる。正確な用量は、特定の調合、適用様式、および適所、宿主および治療する症状に応じて変化する。年齢、体重、性別、食事、投与期間、排泄速度、宿主の状態、併用薬剤、過敏反応および疾患の重症度などのその他の要因を考慮すべきである。投与は、最大耐量以内で継続的に、または定期的に実施することができる。
この生成物は、その他のほとんどの治療法とは異なり、患者が毎時または毎日服薬計画を厳守する必要はなく、簡単な定期的注射による投与に委ねられている。2年にわたって治療を受け、計画が続行している患者の免疫系は、安定化しており、正常な機能程度に回復しているようである。
HIVの治療では、この生成物はHIVによって生じる炎症を低下させるように設計されており、したがって毒性の高い化学物質を必要とせずにヒト免疫系を再度ウイルスに差し向ける。この薬物は、その競争相手とは異なり、感染が疑われる場合に予防的に、または疾患の早期段階により少ない量で使用することができる。
生存中毎日服薬する必要があることが多い既存の薬剤とは異なり、一般的な処置は簡単な注射を医師によって毎週または毎月注射することに委ねられている。通常の処置計画は、3カ月間で、必要であれば事前に立てた経過観察方法を6カ月、12カ月および2年後に行い、ウイルスの再発を観察した。
本発明の組成物は、他の薬剤と一緒に使用して、併用治療を提供することが可能である。その他の薬剤は同じ組成物の一部を形成し、または同時に投与するための別の組成物として形成されることが可能である。
本発明はまた、非ヤギ種を保護するために使用する反応物を含む保護組成物の作製方法であって、非ヤギ抗原(たとえば、ウイルスまたは外来蛋白質)によってヤギを免疫して、この抗原で誘発した後ヤギで産生される血清抽出物の精製することを含む方法に適用される。次にこの反応物を使用して非ヤギ動物を免疫原として使用した抗原から防御することが可能である。
本発明はさらに、ヒトHIVウイルスで誘発した後のヤギの血清抽出物を含有する組成物を薬物中で使用すること、およびヒトHIVウイルスで誘発した後のヤギの全抗体集団を含有する組成物をHIVおよびAIDSを含む症状を治療するための薬物の調製で使用することに関する。
本発明の組成物は、以下の、45%硫酸アンモニウムによる沈殿、-70℃での24時間の凍結または精密濾過の1種または全てによって処理する。
本発明の抗体生成物は、炎症要素を有する疾患の治療に使用され、HIVだけでなく、糖尿病、慢性関節リウマチ、神経炎、多発骨髄腫、結腸直腸癌などが含まれる。H Baumの文献に他の例は挙げられており、特に本明細書に参考として援用した彼のウェブサイトwww..kcl.ac.uk/kis/schools/life_sciences/life_sci/baum.html、にあるImmunology Today, 1996, February, 17, 64-70の分子擬態に関する文献に見出される。
一態様では、本発明は、HIVを有さない患者の治療方法を提供する。特に、この治療方法は非HIV患者の糖尿病または癌の治療用であることができる。
MS患者の多くで、治療を受けて1時間以内に躁状態と共に回復が報告されたことによって、神経刺激および再生の可能性に関与することが可能なCNSの受容体に対する活性を探索することを思いついた。いくつかの抗原に対する活性について様々な血清をスクリーニングしたところ、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、神経成長因子受容体p75およびケモカインCXCL10(IP10)に対する活性が見出された。
したがって、本発明はドーパミン受容体、セロトニン受容体、神経成長因子受容体p75およびケモカインCXCL10(IP10)の1種または複数に対する抗体にも関与する。これらの抗体の1種または複数は、単独または抗HLAおよび/または抗FAS活性と一緒に存在する可能性がある。
ヤギ血清から得られた抗体のドーパミン受容体、セロトニン受容体、神経成長因子受容体p75およびケモカインCXCL10に対する活性の重要性に気が付いたので、このような一連のヤギ血清に秘められた有用性を評価することが可能になった。簡単なアッセイでこのような活性の存在を評価することができ、患者に投与するために適した候補血清を同定することが可能である。特に、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、神経成長因子受容体p75およびケモカインCXCL10の1種または複数に対する抗体と共に抗FAS抗体および/または抗HLA抗体の組合せは重要であり得るので、したがってアッセイは様々な抗体活性を目標とし、製品中にこれらが存在することを確かめることが可能である。
本発明はまた、通常抗FAS抗体および/または抗HLA抗体と共に、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、神経成長因子受容体p75およびケモカインCXCL10(IP10)の1種または複数に対する抗体を含有する組成物、およびこのような組合せを使用した治療方法を提供する。
変更として、本発明はウマ、ヒツジおよびその他の適切な動物が産生した抗体に適用される。抗体は、ヤギ抗体と同様の方法で得ることができ、HLA、FAS、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、神経成長因子受容体p75および/またはケモカインCXCL10の1種または複数に対する活性を評価することができる。さらなる変更として、抗体を得るために免疫原としてHIVウイルスを使用する必要はなく、ヒト白血球細胞を免疫原として使用して効果的な抗体調製物を得る。さらに、抗体を免疫原と交換することができ、すなわち治療組成物にHIV物質または白血球細胞を含めることができるものと考える。
より一般的には、効果的な抗体は、免疫原としてヒト由来の細胞(または蛋白質カクテル混合物)を使用して得ることができるようである。次に、これらのヒト細胞から得られた抗体は宿主種で産生され、最終段階の抗体生成物はヒトに戻して使用する。蛋白質カクテル混合物では、元の提供者と受容者との間で非常に類似した相同性を有することが可能である。この相同性によって、たとえばサルの神経起点の蛋白質または細胞はヒトでも作用できるという概念が可能となる。関連の近い動物から得られた蛋白質カクテルは保存性が高いことは興味深い。
元の細胞を提供したヒトのHLAタイプと受容者のHLAタイプの間に関連があることもまた期待される。この関係によって、確認される変化のいくつかは説明することが可能で、患者に合うように調合を選択するとき配慮することができる。
さらに、神経芽細胞腫、膵臓癌、前立腺癌および扁平上皮癌から得られた細胞株を含む体の異なる部分から得られた活性化した細胞株、または癌細胞株を使用することは実現可能と考えられる。これらの異なる細胞種の間で生じた抗体の微妙な違いを予測することによって、非常に異なる特性をもたらすことができ、非常広い意味である種の器官系を標的とする一助となることが可能である。
ヤギに対する狂犬病ワクチンの投与は観察された治療効果に関与するという証拠がいくつか得られている。3種類の異なる血清(正常血清)の収集物および提供動物である子ヤギの血清を含めてウェールズ地方産のヤギから得られた血清をスクリーニングしたところ、狂犬病またはその他の予防ワクチンは認められなかった。これらの動物には活性のある抗体はなかった。
他の変更として、in vitroにおける細胞増殖中に放出される細胞膜成分はヤギまたはその他の種が抗体応答を起こす抗原となることが可能であると考える。ウイルス感染がない場合にこのようなことが起こる可能性がある。
以下に現在抗体生成物を調製するための我々の方法を詳細に示す。
ヤギ血清の生成の実施例
ヤギに筋肉内注射によって溶解しフロインドアジュバントで処方したHIVウイルスカクテルを接種した。ウイルスは予め60℃で30分間熱殺菌した。血液試料を適切な間隔で、たとえば2週間して、最初の評価のために採取した。最適な方法では、ヤギに毎週4週間注射して、その後6週間後に反応物を得るために採血した。
約400ccの血液を無菌技法によってヤギから採取する。針抽出部位を剃毛して、ベタジンで準備する。18ゲージの針を使用して動物から約400ccの血液を採取する。動物は有害な反応を起こすことなく約400ccの血液採取に耐えられることに留意されたい。動物を殺処分する必要はなかった。次に、約10日から14日して血液量が再び補充された後、動物から再度採血することができる。
所望する抗体活性について考えた場合、潜在的に有用な抗体の存在が確認された。このような反応物の存在が一旦確認されたら、4〜6週の間にヤギから採血した。
次に反応物を生成するために基礎となる血液生成物を遠心して、血清を分離する。次に、血清300mlを濾過して、大きな凝血塊および粒状物質を除去した。次に血清を過飽和硫酸アンモニウム(室温で45%溶液)で処理して、抗体及およびその他の物質を沈殿させた。得られた溶液を5000rpmで5分間遠心し、その後上清液を除去した。沈殿したイムノグロブリンは、沈殿を再溶解するために十分なリン酸緩衝生理食塩水(「PBS緩衝液」、Sambrook et al.「Molecular cloning, A Laboratory Manual」、1989)に再懸濁した。
次に、この溶液を分子量カットオフ10000ダルトンの膜で透析した。透析はPBS緩衝液中で実施して、24時間の間4時間毎に交換した。透析は4℃で実施した。
24時間透析した後、透析バッグの内容物を滅菌ビーカーにあけた。単位量当たりの質量が1ml当たり10mgになるように、この溶液を調節した。PBSを使用して希釈を実施した。次に、得られた溶液を滅菌容器に0.2ミクロンフィルタで濾過した。濾過後、溶液を1回用量1mlずつに分割し、使用前に-22℃で保存した。
この反応物を次に使用するために準備した。
血漿から血清への変換
材料
Figure 0005014562
100mg/mL硫酸デキストラン溶液の調製
必要量の塩化ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウムおよびオルトリン酸二水素二ナトリウムを1リットルの水に溶解して、1リットルのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を作製した。
少量の硫酸デキストラン10gをマグネティックで100ml PBSにゆっくり攪拌して完全に溶解させる。完全に溶解するために、最小限でも10分間混合する。滅菌容器(たとえば、100mLバッグ)に0.2μmで濾過し、すぐに使用する必要がなければ室温で保存する。これは、硫酸デキストラン保存溶液である。
血漿から血清への変換
換算係数1.0275を使用して(すなわち、1000mLは1027.5gである)、処理すべき血漿の必要量を計量する。
硫酸デキストラン保存溶液10mLを血漿1000mLそれぞれに添加する(最終濃度1mg/ml)。
室温で30分間マグネティックで攪拌する。1リットルのStedimバッグに移す。
4000〜4200rpm(相対遠心力=4910g)で最低30分間22℃で遠心する。
上清を注意深く1L Stedimバッグに吸引して入れ、沈殿物を廃棄する。
必要数の1L Stedimバッグの風袋を差し引く。
上清を0.2μmで濾過して1L Stedimバッグに入れる。それぞれのバッグには濾過した上清約500mlを入れる。
それぞれのバッグの血清量を記録する。それぞれのバッグに番号を付けて識別する。
血清をすぐに処理しないのであれば、7日間は冷蔵庫で4〜8℃で、それより長い期間は-20℃で保存する。
36%w/v硫酸ナトリウムを調製する。
材料
Figure 0005014562
水1.5リットル(1mL=1グラムと仮定する)を2L滅菌Duranに計量する。
Duranを予備加温したインキュベータに少なくとも1時間入れることによって30〜35℃まで水を温める。
滅菌マグネティック(magnetic flea)を入れ、マグネティックスターラーに載せる。
硫酸ナトリウム360gを攪拌しながらゆっくり添加する。
塩が完全に溶解して、溶液は透明になるまで攪拌を続ける。
溶液が十分温まらないか、冷却してしまった場合は、溶液から塩が結晶化し始める。この塩は、溶液を50℃まで加熱することによって再溶解することができる。
36%w/v硫酸ナトリウム溶液1Lを0.2μmで1リットルStedimバッグに濾過する。バッグに適当にラベルを貼る。
残りの500mLを別のStedimバッグに濾過する。濾過によってさらに500mLの注射用水を添加し、このバッグに18%w/v硫酸ナトリウムのラベルを貼る。
硫酸ナトリウムを使用して血清からイムノグロブリンを沈殿させる。
注意。血漿を硫酸ナトリウムで処理する前にデキストラン硫酸法によってフィブリンを取り除かなければならない。
材料
Figure 0005014562
インキュベータ装置を使用して、Stedimバッグの濾過した血清を30〜35℃に温める。2×5mLの試料を採取する。
等量の加温した36%硫酸ナトリウム溶液をバッグ内の血清に添加する。たとえば、塩溶液500mL:血清500mL
塩:血清の混合物(乳白色の溶液)を操作書通りにバッグを振動させるか、振動プレートに載せてゆっくり混合する。30分混合する。
バッグを秤にかけて重量を量り、4000〜4200rpmで最低30分間25〜30℃で遠心する。
注意深く上清を吸引して廃棄する。沈殿をかき乱さないようにする。上清試料1×5mLを採取する。
沈殿の入ったそれぞれのバッグに十分量の18%w/v硫酸ナトリウムを添加して、それぞれのバッグの重量を約1000gに調整する。
操作書通りに混合するか、最低10分間ロッカーで混合して、イムノグロブリン沈殿から取り込まれたアルブミンを洗浄する。
バッグを遠心機に移し、前述のように遠心を繰り返す。
上清を注意深く吸引して、廃棄する。沈殿をかき乱さないようにする。
それぞれの沈殿バッグに十分量のリン酸緩衝生理食塩水を添加して、それぞれのバッグの重量を約1000gに調整する。
操作書通りに混合するか、最低10分間ロッカーで混合して、バッグを冷蔵庫に移し、一晩保存する。
保存庫からバッグを取り出し、沈殿が再溶解したことを確かめる。
0.2μmで適切な大きさのダイアフィルトレーションバッグに濾過する。
2×5mLの試料を採取する。
イムノグロブリン溶液のバルク調製
限外濾過(UF)装置に少なくとも1枚の0.1m2 30,000MWCO膜を装着する。
0.5M〜1Mの水酸化ナトリウム溶液を最低30分間再循環させることによって系を消毒する。
系の水酸化ナトリウム溶液を排出し、水のpHが中性になるまで、洗浄水を流し続ける。
イムノグロブリン溶液を含有するダイアフィルトレーションバッグをUFに接続する。
PBS(イムノグロブリン溶液の10x量)を含有するバッグを蠕動ポンプを介してダイアフィルトレーションバッグに接続する。
保持経路をダイアフィルトレーションバッグに接続する。
ダイアフィルトレーション経路を排出バッグに接続する。
ポンプのスピードとバルブの調節器具を使用して入口の圧力および出口の圧力を入口2.0バール、出口0.5バールに調節して、生成物を限外濾過装置でゆっくり処理し続ける。
イムノグロブリン溶液の濃度を約50g/Lにする。開始濃度を考慮し、除去する液体量を測定することによって計算する。たとえば、
開始溶液が25g/Lで2リットルであれば50gである。ダイアフィルトレーションで除去する溶液の量は1リットルである。したがって、濃度は50/l=50g/Lである。
ダイアフィルトレーションの流速を測定し、PBSを含有するバッグからのポンプ速度をこの流速に等しくなるように調節する。
緩衝液の10倍量が交換するまで、ダイアフィルトレーションを継続する。すなわち、IgG溶液1リットルにはPBS 10リットルが必要である。
系のダイアフィルトレーションによって濃縮したIgG溶液をダイアフィルトレーションバッグに排出する。バッグの接続を外して、少なくとも1LのPBSを含有するPBSバッグを直接系に接続する。
PBS洗浄溶液を再循環させ、この洗浄液をIgG溶液含有バッグに回収する。
バルク調合したIgG溶液を予め重量を測定したStedimバッグに0.2μmで濾過する。
濾過した溶液の試料1mLの採取が完了したら、蛋白質濃度を評価する。
バッグの重量を測定し、IgG溶液の量を計算する。
蛋白質濃度およびIgGの量を使用して、溶液を最終濃度10mg/mLに希釈するために必要なPBSの量を計算する。たとえば、
IgGの量=1300mL。蛋白質濃度=30mg/mL
IgGの全量=39000mg
必要濃度=最終濃度10mg/mL
したがって、必要な最終量=39000/10=3900mLである。現在の量は1300mLである。したがって、添加するために必要なPBSの量は、3900-1300=2600mLである。
PBSをバルク調合用IgG溶液を含有するバッグに濾過し、10mg/mLで最終的に必要な量を実現する。
使用する試薬を調製し、1週間までであれば冷蔵保存することができ、それ以上長い間保存することが必要であれば-20℃で凍結する。
これらの方法は変更が可能で、たとえば硫酸ナトリウムの濃度を変更したり、試薬を交換したりすることが可能である。同様に、透析のカットオフは10000ダルトンである必要はない。
活性の機序
序論
AIDS患者にHIVで免疫したヤギの血清を投与すると、場合によっては見かけ上劇的に改善されるらしいことが非公式の研究によって示されたので、可能性のある機構を探索している。ヤギにHIVを注射すると、免疫応答の特異は高いと考えられるが、これに基づいて多発硬化症、場合によっては癌の患者で認められた利益は説明できない。
研究の科学的根拠
Dalgleishおよびその共同研究者らは、数年前にHIV進入口としてのCD4受容体を発見したが、HIVは感染がAIDSに進行するにつれてCD4細胞を殺して、測定可能なほど減少させるという古典的な解釈はこの病気の発生の説明には適さない。この解釈にうまく合わない主な観察点には、
(1)感染からAIDSの発症までに長い期間があること(約10年)。
(2)ほとんど全てのチンパンジーおよびHIVに感染したヒトの約5%でこの疾患が認められないこと。チンパンジーはヒトと同様の受容体および共受容体を備えており、CD4数が減少していない感染チンパンジーでも容易にウイルスを検出することができることが含まれる。
これらの観察に基づいて、研究者等は感染から疾患に進展する患者とそうでない患者との間の違いの定義を探してきた。疾患を予測させる主なものは、初期感染に続く免疫活性化の程度およびその持続濃度である。言い換えると、免疫活性化が高ければ高いほど、疾患の期間は短い。中程度の活性化では、AIDSに進展するまでに長い期間がかかり、ウイルスの複製があっても免疫活性化がおこらないことがチンパンジーおよび数少ないヒトにおける役割である。
このことに関して「免疫活性化」という用語は免疫全体の活性化を意味しており、すなわち、T細胞の全サブセットおよびB細胞を含めた免疫系の全ての側面が活性化されることを意味していることを示すことは重要である。免疫全体の活性化の原因として認識されていることは3つだけある。
そのうちのまず1つ目は、HIVによって明らかに示される抗原の超変動性であるが、この超変動性は進行性ではない感染ヒトおよびチンパンジーで検出される。
第2の可能性は、スーパー抗原で、これは抗原特異的機構を無視して、免疫系全体の活性化をもたらす。10年前、当初熱心に研究されていたが、HIVに関連しては、これらの発見を説明する確信の持てるスーパー抗原は発見されなかった。WestbyおよびDalgleishは、スーパー抗原の可能性を示唆するT細胞レパートリーの変動性は、専らCD4集団が減少した結果であり、違いは無作為なCD4の破壊によって説明することが可能であることを示した。
体は外来細胞または外来器官を発見すると、それに対して慢性的な応答を起こすというのが唯一他の解釈である。このようなことは、移植、特に骨髄移植後しばしば臨床的に生じ、慢性的移植片対宿主病(GVH)として知られている。このような場合では、少数でも外来細胞が生き残りさえすれば、HIV感染患者に見られるのと同様の積極的な自己免疫応答を導く免疫系全体を活性化するために十分である。この疾患の臨床的特徴は、ウイルスが発見される前に、合衆国の免疫学の第一人者であるNIH(USA)のGene Shearerがこの疾患は輸血または性交渉によって伝達された外来細胞によって誘導される可能性があることを示唆したAIDSと著しく類似している。その後の2、3カ月してウイルスが発見され、第VIII因子(細胞遊離生成物)による伝達が発見されたことによって、この所見の重要性が無意味になった。
全体的な活性化についての説明は他にないので、DalgleishおよびHabeshawはウイルスが(自己および既存の抗原を決定する分子である)HLAクラスIまたはクラスIIを模倣することができるという証拠を探した。GP120のいくつかの配列は既にHLAとわずかな相同性があることが報告されていたが、我々はHLAクラスIおよびHLAクラスIIの両方に構造的な相同性を示したHIVエンベロープ(GP120)の主要領域を同定することができた。Elizabeth Hounsell(MRC)は、詳細な構造が知られているHLA分子を背景にしてGP120を形作ることができた。これらの分子および配列をベースにして、HabeshawおよびHounsellは、ウイルスはヒトではHLA-B8によって「外来」として見なされ、ヒトではHLA-B27によって「自己」として見なされることを示唆した。イギリスでMRCによって実施されたHIV全体のHLAマーカー研究においてHLAの違いのみが重要で、HLA-B8を有するヒトでは疾患の進行する速度が残りの集団よりもはるかに速く、長期非進行者または極めてゆっくりした進行者ではHLA-B27であることは今では公表された事実である。
その後の研究によって、
(1)外来細胞(すなわち、異なるHLA型)によるチャレンジに対する応答に関わるキラーT細胞はまた、HIVに感染した自己細胞を殺すこと、
(2)(自己であることを決定するHLA分子に構造的に相同であると考えられる)GP120として知られているHIVウイルスのエンベロープは、HLAと非常によく似た様式でペプチドに結合することができることが示された。さらに、T細胞はペプチドを増加させ、GP120に似たHLAはまたペプチドを有するGP120に応答するが、ペプチドを有さないGP120には応答しないことによって、ペプチドに結合する能力、したがって感受性のある患者において慢性免疫活性化を引き起こす能力はその構造が非常に重要であることが示唆された。
(3)さらに近年、我々はペプチドがHLAに結合する領域がGP120上に存在し、Sodroski教授がボストンのDana Faberで実施して下さったように、分子のこの部分を除去すると、ペプチドはもはや結合しないことを示した。
衝撃的な前記の観察によって、系の免疫を活性化すると理論的にスイッチが切れ、したがって疾患が進行しないことが示唆された。この点に関して、主に2つのことが観察され、1つはこの科学的知識の結果としての臨床研究であり、骨髄不全のためもうAZTを処方できない患者にステロイド、重篤な副作用なしには長期間投与することができない古典的かつ非常に強力な抗炎症剤を投与した。GUH疾患に非常によく似た古典的特徴を有する非常に病状の重い患者がステロイドによって著しく改善することを認めることができたが、この効果を及ぼすために必要な用量は非常に高く、長期間実行することは不可能であることを示すことができた。さらに近年、Duke大学(USA)のグループは、HIV用にステロイドを投与された患者ではウイルス負荷は減少し、投与すれば投与するほど自己免疫(慢性移植片対宿主病の古典的な特徴)として見なされたものに対抗することが示された。簡単に言うと、特にHLAクラスIまたはクラスIIの誘導する経路に作用する抗炎症剤は、HIV感染に有益であることの科学的根拠である。
アッセイおよび結果
ヤギ血清が炎症特性を有するかどうかを確認するために、遺伝子背景の異なる2人の異なる患者の細胞を混合することによって生じた反応に血清を添加した。驚いたことに、血清はこの反応を極めて効果的に阻害した。多くの分子抗体を使用して、ヤギ反応性に近い唯一の抗体は抗HLAクラスIIであることを確認することができた。抗クラスI抗体は、この反応を部分的に減少させるのみであった。HIV V3ループに対する抗体はワクチンの主要な標的であることは科学界の大方の判断であり、実際に全体的活性化を損なわせることは非常に興味深い。この発見は、ウイルスに対する免疫応答によって実際に増殖が起こり、ウイルスの「放出を助けるので、免疫活性化理論に合致しており、この発見によってどうしてこの領域を目標とするワクチンはそれほど効果がないのかを説明できるだろう。
不可思議な特性はヤギのものと見なされることが多いこと、および他の動物から得られた血清は特定のアッセイにおいて望ましくない活性を有する可能性があることを念頭に置いて、全く活性を持たない非ワクチン化ヤギ血清を得た。次に、異なる予防接種計画で様々なヤギから得られた他の血清を得た。驚いたことに、この血清はHIVエンベロープおよびHLAクラスIIのみを確認することを示すことができた。実際に、HLAに対して著しい相同性を有することが知られているウイルスのより小さな部分は、この血清によって確認できない。
したがって、我々は非常に驚いたことにカクテル注射と1種類単独の注射の間に大きな違いがあることを確認し、GP120の保存されたHLA領域のレパートリーがカクテル注射したヤギの血清によって積極的に認識された。
このデータは、HIV注射したヤギは強力な抗MHCクラスII様応答を生じ、これは異なる単離物を使用することによって拡大することができるという事実に要約される。これがどのように生じるかは以下のように説明することが可能である。
(1) HIVエンベロープはHLAクラスIIと非常に類似しているので、完全に異なるHLAレパートリーを有するヤギ免疫系によってこのように認識される。
(2) 第2の可能性としては、免疫原、すなわちウイルス調製物では、ウイルスが発芽する細胞表面にあるHLAが見出され、免疫応答はウイルスにではなく、一緒に結合したHLAに起こる。
(3) 第3の説明には、前記の2つの説明の組合せが含まれる。発芽しているウイルスは準備が整うとHLAと融合することが可能で、この結合はヤギ血清によって非常に強く見出される。最近の報告では、ウイルスがHLAを備えた細胞から発芽して、HLAが膜に取り込まれなければ、ウイルスは感染しないままであることが示された。このことは、宿主から得られたHLAの中には細胞進入機構を活性化するものがあるに違いないことを意味している。
本明細書で、我々はHIV調製物を注射したヤギがHLAクラスII分子に対する強力な抗体応答を起こすことを示した。いくつかの疾患では、単に細胞が過剰発現したHLAクラスIIを含むため、破壊的な炎症病変を引き起こすことが知られている。多くの種類の自己免疫疾患はこの特性を備えているが、最もよく知られている例の1つは多発硬化症である。したがって、ヤギの免疫応答がこれらの分子に対する耐性を打ち破り、この過程が臨床的な利益を伴うことが可能な強力な抗炎症過程をin vivo で生じさせることはあり得る。これが長期間にわたって高用量のステロイドを使用した症例であり、ヤギ血清を慢性的に投与しても著しい副作用がない場合、明らかに有利であるだろう。
強力な抗HLAクラスIIである抗HIV応答は、抗AIDSワクチンの必要条件としておそらく欠かせないものであり、我々はHIVワクチン候補を作製するためにこの応答を詳細に分析することに関心を持っている。
HIV-1免疫ヤギ血清および抗炎症特性
導入
HIV-3Bウイルス溶解物または6種類の異なるHIV-1単離物のNIHウイルスカクテルで免疫した動物からヤギ血清を入手した。この血清の中には既に良好な効果をもたらす実験的治療計画の一部として使用されたが、その作用機構がわかっていないものがある。作用機構を明らかにするために、HIV-1、gp120、HLA-DR1に対してELISAプレートで血清をスクリーニングして、ウイルス表面の糖蛋白質の異なる領域からペプチドを選択したところ、いくつかはHLAと配列相同性を有していた。
材料および方法
血清および抗体
患者治療に使用してきた元のHIV-3B免疫ヤギ血清試料およびHIV-3Bウイルス溶解物で免疫した数頭のヤギ(動物番号0125番、0126番、0127番、0128番、0129番は1999年9月14日、1999年9月21日に免疫し、9月29日および2000年11月07日に再度免疫した)の試料には、採血および免疫日程に関する情報が添えられていた。ELISAは、後期段階(2000年11月30日および2000年12月01日)で得られた血液の血清試料をスクリーニングするために単純に選択した。動物番号378番を以下のHIV単離物(92HT593、92US657、92US660、92US714、92US723、91US056)から成るNIHウイルスカクテルで免疫した。免疫は11月7日および28日に実施した。2001年1月25日に得た血液から得られた血清をELISAスクリーニングに使用した。対照ヤギ血清もまた提供した。血清と一緒に、ELISAと混合リンパ球反応研究の両方に抗ヒトHLA-DRおよび抗ヒトHLA-DR、DPおよびDQ(Pharmingen)を含め、MLR研究にはHarvey Holmes博士(MRC ADIS reagents programme, National Institute for Biological Standards and Control, Potter's Bar, UK)を通じてJ Laman博士から入手したHIV-i IIJb(IRIQRGPGR)のV3ドメインに特異的なマウス抗gp120IgG(EVA3047)を含めた。
ペプチドおよび蛋白質
組換えHIV-i IIIB gp120は、チャイニーズハムスターの卵巣細胞で産生させ、MRC AIDS reagents programでHarvey Holmes博士を介してJ Raina博士から頂いた。組換えHLA-DR1は、ペプチド結合実験で使用したDon C. Wiley教授から頂いた蛋白質と同じであった。この研究で使用したHIV-1ペプチドを表1に挙げる。ペプチドARP7022、ARP7 10、ARP740-23、-28、-42、-44、-45、-46および-47はMRC AIDS reagents programmeでHarvey Holmes博士から頂いた。対照ペプチドP12は、HIV-1 gp120のCS領域のスクランブル配列を表し、School of Biological and Chemical Sciences, Birkbeck College London, UKのE. F. Hounsell教授から頂いた。ペプチドは小分けして使用するまで-20℃で保存した。
ELISA
ELISAは、Brown et al.(J Immunological methods 1997, 200:79-88)が記載した方法と同様の方法に従って実施した。ペプチドは0.05M 炭酸塩/重炭酸塩pH9.6結合緩衝液と16μg/mlで混合し、蛋白質は1μg/mlで混合して、Immulon 4 LIBX 高結合マイクロタイタープレート(Dynex Technologies, INC. 14340 Sullyfield Circle, Chantilly, VA 20151-1683, USA)に2連で一晩40℃でコーティングした。ウェルをPBSに5mg/mlで溶かしたカゼインでブロックして、一晩40℃で放置した。ヤギ血清をPBS/0.25%カゼインで1/500および1/1000倍に希釈し、一方精製抗体はそれぞれ1/1000および1/3000倍に希釈して、37℃で1時間インキュベートした。ウェルをWellwash 4 machine(Denley)を使用してPBS/0.05%Tween 20で3回洗浄した。
固定したヤギ抗体は、PBS/0.25%カゼイン/0.01%Tween 20で1/1000に希釈したペルオキシダーゼ複合マウスモノクローナル抗ヤギ/ヒツジIgGクローンGT-34(SIGMA)を使用して検出し、抗HLA抗体はヤギ抗マウスIgGペルオキシダーゼ複合体(SIGMA)を使用して37℃で1時間インキュベートして検出した。もう1回洗浄した後、新たに調製したO-フェニレンジアミン二塩酸塩基質(OPD、SIGMA)をウェル内で室温において暗所でインキュベートして、15分後2.5M H2SO4を50μl/ウェル添加することによって反応を停止させた。OD値はマイクロプレートリーダーを使用して492nmで測定した。
表１．アッセイで使用したペプチド
ARP7022:(DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC)
HIV gp41(593-616)の保存領域から得られた24残基ペプチドは、ほとんどのヨーロッパおよびアフリカのHIV陽性血清によって認識された。対照ペプチド。
ARP710:(VKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR)
HIV gp120(486-508)の保存されたC末端(CS)ドメインから得られた23残基ペプチドは、gp120/41切断部位を導いた。HLAとの構造的な相同性を有する。
ARP740/23:(RPVVSTQLLLNGSLAEEEVV)
gp120のC2領域(252-271)から得られた20残基ペプチド。HLA DR4 β鎖と相同な配列を含有する。
ARP740/28:(NTRKRIRIQRGPGRAFVTIG)(302-321)
V3 ループHIV-1 gp120から得られた20残基ペプチド。
ARP740/42:(GQIRCSSNITGLLLTRDGGNS)(438-458)
DR-β1鎖との相同性を有する。
ARP740/44:(NNESEIFRLGGGDMRDNWRS)(459-478)
HLA-A2と相同な配列を含有する。
ARP740/45:(GQDMRDMWRSELYKYKVVKI)(469-488)
HLA-CおよびC5領域と交差反応する抗体、M38によって認識される配列。
ARP740/46:(ELYKYKVVKIEPLGVAPTKA)(469-478)
gp120のC5末端から得られた20残基ペプチド。C末端に相同性のある最初の3残基を含有する。
ARP740/47:(EPLGVAPTKAKRRVVQREKR)(479-498)
gp120のC5領域から得られた20残基ペプチド。HLAと構造的な相同性を有する。
P12.(RAKTVERKVERRK)
E.Hounsellから頂いたHIV gp120のCSドメインのスクランブル配列。WV陽性血清によっては認識されない。対照配列。
混合リンパ球反応阻害アッセイ
血液提供者
HLAクラスII不一致血液試料は、South Thames Blood transfusion service, Tooting, LondonのLiz Bucklandを通じて提供者の同意を得て入手した。
PBMC調製
新たに採取した静脈血をハンクス液(HBSS; SIGMA)で希釈して、注意深くHistopaque(SIGMA)に重層して、800gで20℃で25分間遠心した。PBMCを密度の界面からパスツールピペットで収集して、HBSSで3回洗浄して、ベックマンコールターカウンタを使用して計数した。
混合リンパ球阻害アッセイ
所定のMLRでは、2種類のHLAクラスII不一致患者のPBMCを10%熱不活性化ヒトAB血清(SIGMA)、L-グルタミン4nM、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)(SIGMA)および指定された刺激細胞または応答細胞を含有するRPMI 1640媒体に再懸濁した。細胞は、1×細胞/ウェルの刺激細胞および1×10〜細胞/ウェルの応答細胞と共に応答細胞と刺激細胞の比が10:1になるように3連でプレートに入れた。ヤギ血清および様々な抗体によって引き出された細胞増殖に対する阻害効果を測定するために、希釈していないヤギ血清3μlまたは精製抗体1μlを、混合細胞培養物を含有するウェルに添加し、37℃で5%CO2において6日間インキュベートした。培養物はトリチウム標識メチルチミジン(3H-Thd、Amersham)1μCiで5日目の細胞収集18時間前にパルス標識した。Tomtec Harvester 96 Mach III細胞収集装置を使用してガラスファイバフィルターマット上に細胞を収集し、Wallac 1450 microbeta液体シンチレーションカウンターを使用して3H-Thdの取り込みを測定した。結果は1分当たりの平均計数として示す(cpm)。
結果
ヤギ血清に存在する抗HLAクラスII抗体
多くがHLAと配列的および構造的に相同な配列を有するHIV-1 gp120の異なる領域から得られたHIV-1 gp120ペプチド(表1)を、異なるヤギ血清が認識できる範囲を調べた。これらのアッセイにおいて、溶解性HIV-1 gp120およびHLA-DR1もまた含めた。結果を図1から図9に示す。Bgはバックグラウンド値を示す。0.1を上回るOD値は、陽性結果として見なし、免疫前の血清ではいかなる抗原に対しても反応性は見られなかった。
異なる血清からは様々な結果が得られたが、概してHLA-DR1と反応する傾向が指摘された。免疫前の血清は、スクリーニングしたいかなるペプチドまたは蛋白質にも反応せず、血清番号0125番および0126番はあまり反応しなかった。しかし、その他の血清は全てHLA-DR1との反応の程度が高く、特に0127番および0128番は非常に高い反応性を示した。HLA-DR1に対する反応性を明確にするために抗ヒトHLA-DRおよび抗ヒトHLA-DR、DQおよびDPと一緒に図9で比較した。
抗HLA活性は興味深く、その理由は免疫する前にウイルスを培養した本当の細胞のHLA分子に対する活性を最もよく表しているからである。HIVはエンベロープの中にはgp120分子を発現するよりも多くのHLA分子、特に細胞内でアップレギュレートされているHLAクラスII分子が連なっている傾向があり、抗gp120および抗HLAクラスIIの活性を一緒にしたものは、HIVに対する良好な防御応答を示すものであり得る。ある種の血清の場合、特に0127番および0128番の場合、表面上に高濃度のクラスII分子を有するウイルスで免疫するとこれらのヤギでは強力な「アロ」応答が誘導されることが可能である。
NIHウイルスカクテルで免疫したヤギの血清0378番は、複数のHIV-iペプチドと万遍なく交差反応を示し、元の抗LILV-3Bヤギ血清とほぼ同様の抗HLA DR1濃度を備えており、この血清はHIV全体に対してよりよく作用できることが示された。この血清は、HLAとの相同性を有する一連のHIV-1ペプチドと非常によく反応する。対照のスクランブル配列P12と反応する血清はなく、反応はLIIVペプチドに特異的であることが示された。血清0127番および0128番は、非常に高い抗HLA DR活性量を含むので、HIV-i gp120への結合に関して最良の血清であることが示された。
ヤギ血清によるMLR阻害
図10および11のMLRでは、無作為なミスマッチ患者の細胞を使用した。これらは必ずしも増殖が最良ではなかったが(そのときは培地に問題があった)、ヤギ血清(それぞれの場合において元のHIV-3B免疫血清を使用した)によってMLRの増殖阻害が示される傾向が現れた。その後、増殖性のよいHLAクラスIIミスマッチ細胞(図12)を使用し始めた。抗HLA-DR抗体のように、ヤギ血清によって細胞増殖を完全に阻害することに成功し、抗炎症活性が示されることが可能である。
ELISAの結果から確認したことによって判断すると、抗HLA-DR抗体は阻害効果に関与していることが間違いないようである。広範囲の抗体は抗HLA-DR単独ほど効果的に増殖を阻害することはほとんど無理なようなので、我々は抗クラスII全体としての役割よりも抗HLA-DR抗体の役割を力説する。なぜこのようなことが起こるのかは不可解であるが、HLA-DRは炎症活性に関与する主要なクラスII抗原を表し、これに対する抗体は細胞内でシグナリングを起こして、複製を阻害することができる。したがって、ヤギ血清は抗炎症薬として作用して、細胞増殖を抑制することが可能なようである。ウイルスが誘導した細胞活性化がウイルス複製に必要であるHIV-1感染の場合、陽性の結果が予測され得る。表面では逆効果であるようだが、HIVは、関連レトロウイルスHTLV-1またはHTLC-2とは異なり、細胞を不死化せず、複製のための細胞活性化に完全に左右されるので癌も引き起こさないので、緩和な免疫抑制剤の導入によってウイルス複製および対照疾患を阻害するように作用することが可能である。
今日まで、感染した細胞を活性化する能力が比較的不十分なウイルスが感染して、うまく疾患を引き起こすことができる程度まで導くHIVについて公知のT細胞スーパー抗原は確認されていない。ウイルス関連HLA分子またはHIVとHLAとの間に見られる分子擬態と関連して、ウイルスが誘導する同種活性化が根幹となる理論を研究している。ヤギ血清は、おそらく全体の活性化を限定することによって患者の健康に単に寄与するのであろう。ウイルス複製におけるHLAクラスII分子、特にHLA-DRの重要性を示したSaifuddin M et al.(Clin. Exp. Immunology 2000, 221: 324-331)によって、同様の観察が文献に報告された。HLAクラスII分子に対する抗体は、クラスII発現細胞におけるウイルス発現を阻害することが報告されており、HIV-1転写の増強には誘導性MHCクラスIIトランス活性化因子(CIITA)が関与していることを示唆している。ヤギ血清の場合ではこれらの効果を効果的に確認することが可能である。増殖を増大させ、したがって全体の機構で逆効果になる可能性がある抗V3ループ抗体と比較した。gp120の変動しやすいV3ループ領域はウイルスのエスケープ変異を可能にさせるだけでなく、免疫系がさらに活性化するためのデコイとして作用する。不幸なことに、この領域を先取りすると最終的にウイルスにとっては有利で、活性はとても有用な可能性があるのに反して、免疫応答はより保存された領域から遠ざけられる。
抗炎症効果が本当にこの血清の主な活性形態であるならば、活性化過剰および細胞増殖が疾患症状、たとえば多発硬化症の根本である様々なその他の症状に有用になる可能性がある。将来の実験で、血清全てについてELISAを繰り返して、抗HLAおよびgp120活性の範囲を確認することが重要である。この場合、NIHウイルスカクテルで免疫した動物から得られた血清0378番は、HLA抗原およびHLA-DR1に対して相同なHIVペプチドの多くと効果的に反応するので、非常に興味が持たれる。
他の実験
以下のデータは既に実施された同様の実験から得られたもので、通常の治療がもはや適していない多発硬化症およびAIDSに罹ったボランティアの治療形態として使用したヤギ血清中に抗HLA抗体を確認した。我々の研究では、治療後これらの患者の回復におけるヤギ血清について提案されている抗炎症作用機構を解明することが必要である。これは、以前抗HLA抗体が発見されたときに提案された。しかし、細胞がFAS受容体を発現して数時間以内にアポトーシスを誘導する能力があるとするならば、ここでこのヤギ血清には抗FAS抗体の役割が存在することを付け加える。
注目すべきことにFAS/APO-1(CD95)は、活性化リンパ球に大量に存在し、これによって情報伝達することよって、FASリガンドまたは抗FAS抗体のいずれかと交差反応した後関与した細胞の自殺を促す。これらの分子の役割は、感染した細胞を殺す細胞毒性免疫応答においてだけでなく、抗原が消失して宿主に有害な可能性のある細胞の定常的な増殖が阻止された後の免疫応答のダウンレギュレートにも極めて重要である。したがって、この経路は安定した免疫応答を維持するために極めて重要と考えられる。
HIV感染の場合では、免疫系は異常に活性化しているようであり、HIVの過程のために活性化した細胞を必要とするので、ウイルス複製のためにたくさんの余地を与えている。多発性硬化症患者では、非常に活性化した細胞が血液脳関門を通り、髄鞘損傷を引き起こし、プラーク形成および神経機能の欠損を生じさせる。
ヤギ血清に存在する抗HLA抗体(少なくとも抗HLA DR)の活性によって媒介される抗炎症機構は、患者の回復の後に起こる機構である可能性がある。現在、抗FAS抗体は様々な範囲でヤギ血清中に存在することを発見したので、多発硬化症とAIDSの患者両方の活性様式について提案したこの抗炎症機構では抗HLA抗体と抗FAS抗体の役割を結びつけることを提案する。これらの抗体は最も活性化した細胞を標的とし、抗HLA抗体が免疫活性を低下させる間に死に至らしめるものと考える。次に、その後サイトカインおよびケモカイン産生を劇的に減少させ、多発硬化症の場合はミエリンに対する免疫攻撃を終結させ、活性化した細胞が不十分なHIV感染患者の場合は、ウイルス負荷を減少させ、ウイルスを分泌しているか、または分泌しようとしている細胞の死をもたらすことが可能である。
実験操作
応答対象から得られたヤギ血清は混合リンパ球反応(MLR)に添加すると細胞に損傷を与えるという結果が得られる抗FAS抗体を探索し始めた。MLRは異なるHLA型の2人の別々のヒトから得られたリンパ球が非特異的方法で反応した結果で、リンパ球の増殖と代謝回転の増加が引き起こされる。自己免疫反応はいずれもHLAクラス2分子上に不適切に発現する自己ペプチドに対して生じるので、これは抗炎症抗体を試験するよい系であると思う。
図13から16は、血清を入れた、および入れない最近のMLRのいくつかを撮影した写真である。
図13は、72時間後の混合リンパ球反応の写真である。
図14は、72時間後の免疫前血清と混合したMLRである。
いずれの場合においても、MLR自体には有意な変化はなかった。実際に、免疫前血清はMLRを促進する。
図15は、血清0125番を添加したMLRである。この血清は、HLAおよび/またはFAS抗体の存在が少ないか、または無視できる免疫不応答と考えられるヤギから得られ、応答対象における抗HLA DRを確認したときの以前のELISA結果といくらか相関していた。
図16は、血清0127番を添加したMLRで、非常に良好な応答物であることが示された。MLRではPBMCの多くに著しい細胞破壊が見られる。この結果は、現在治療に使用している血清調製物と共に強力な応答物の全てについて同じである。
MLRにおける場合のように、強い活性細胞の破壊を誘導することができる抗体を探索することに決めた。したがって、FAS受容体と交差反応することが可能で、アポトーシスを起こすために必要なシグナルを誘導できるFASに対する抗体の存在を探索した。その結果、FASに対するELISAを実施して、最良の応答対象と考えられ、かつ抗HLA抗体の以前の結果を補うヤギ血清においてこのような抗体が存在することを示した。
これらの結果は、我々の以前のデータと共に、細胞増殖の減少は細胞破壊によるものであるという我々がMLRの結果で見出したものとよく相関している。
最近のELISAの結果から、通常の治療がもはや適さない多発硬化症(MS)およびAIDSに罹っているボランティアの治療形態として使用したヤギ血清中における他の活性成分候補の同定に着手した。
以下のELISAの結果は、1000分の1に希釈した免疫前血清でスクリーニングしたものである。スクリーニングした抗原はオバルブミン、HLA-DR1(DR1)、Fas、神経成長因子受容体p75(NGFr)、セロトニン受容体(Ser R)、ドーパミン受容体(Dop R)、CXCL 10およびインターフェロン-ガンマ(MIG)によって誘導されたモノカインである。
ドーパミン受容体に対する抗体が血清中に高濃度で存在する一方、その他のいかなる抗原にも不活性であることは既に明白である。しかし、既に治療に使用されてきた元の3B血清およびT細胞株で産生されたHIV IIIbで免疫したヤギから生じた血清0127では、NGFr、ドーパミン受容体およびCXCL10に対する活性を含めてこれらの抗原の多くに対する活性がある。
HLAおよびFASに対する活性もまた明白で、我々は既に提案した抗炎症機構と一致している。この主題と一致して、現在ではCXCL10および神経増殖因子受容体p75(NGF Rp75)に対する活性を付け加えることが可能である。CXCL10に対する抗血清は、CNSのCD4+T細胞およびマクロファージ浸潤を減少させ、TH1サイトカインIFN-γの発現を消失させ、再ミエリン化を増加させることによって、マウスの多発硬化症モデルにおける疾患の重症度を大きく減少させ有益であることが近年示された。炎症病変に局在する細胞は通常、受容体CXCR3を介して炎症TH1細胞に結合し、引き付けるCXCL10を産生するとするならば、このことは興味深い。したがって、ヤギ血清中の抗体によるケモカインの中和またはその受容体のブロックは、おそらくヤギ血清について提案した作用の抗炎症機構の一部であろう。
一方、神経増殖因子受容体NGF R p75に低親和性の抗体は、NGFが受容体に到達するのをブロックすることによって、別の抗炎症機構でもあるHIV感染単球およびマクロファージの細胞死に関連する。興味深いことに、これらの受容体に対する抗体の最高濃度は、T細胞単独よりもPBMCで主に産生される6種類の異なるHIVウイルスのカクテルで免疫したヤギによって産生された血清0378に存在することを発見した。この活性は、4000分の1に希釈しても非常に高いままであった。
したがって、我々は、両疾患の場合において血清について提案された抗炎症作用機構に合わせて、これらの抗原に対する活性を付け加える。我々はまた、治療と非常に関連があるという意味で関係があるのでドーパミンおよびセロトニン受容体に対する活性を付け加える。
最近これらのヤギから得られた免疫前血清と共にHIVで予防接種した多くの新たなヤギ(707-718)をスクリーニングした。上に示した元の免疫前血清のようにドーパミン受容体に対する抗体を示したものはなかったが、狂犬病ワクチンを行わなかったウェールズ地方のヤギと比較して、数頭のヤギは平均してこのような抗体を高濃度に有していた。元の免疫前試料で認められたより高い濃度は、過去のいずれかの時点である種の環境要因に曝露され、その後強力な応答が生じたことによる可能性がある。
他の免疫原
他の変更として、抗体を得るための免疫原としてHIVウイルスを使用することは必要なく、ヒト白血球細胞を免疫原として使用して効果的な抗体調製物が得られる。図30は、HIVカクテル、およびSHULAと称するヒト白血球細胞で免疫したヤギ血清の特性を示す。
抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 抗HLAクラスII抗体の存在に関して示した図である。 MLR研究に関する図である。 MLR研究に関する図である。 MLR研究に関する図である。 MLR研究に関する図である。 MLR研究に関する図である。 MLR研究に関する図である。 MLR研究に関する図である。 抗FAS抗体の存在に関して示した図である。 抗FAS抗体の存在に関して示した図である。 抗FAS抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 他の抗体の存在に関して示した図である。 異なる免疫原で免疫したヤギの血清の特性を示した図である。

Claims (5)

  1. 炎症性疾患、自己免疫疾患、または癌、及び軸索または神経の障害の治療である、増殖性免疫応答を伴うヒトにおける疾患の治療に使用するための薬剤の調製における、HIVによるチャレンジによって生じるポリクローナルヤギ抗HLAクラスII抗体の使用。
  2. 前記抗体が抗HLAクラスII活性および抗HIV活性を有する請求項１に記載の使用。
  3. 前記疾患が多発性硬化症である請求項１に記載の使用。
  4. 前記疾患が慢性関節リウマチである請求項１に記載の使用。
  5. 前記疾患が神経炎である請求項１に記載の使用。
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