MXPA04000147A - Agente terapeutico. - Google Patents

Abstract

Anti-HLA y otros anticuerpos estan presentes en suero de cabra Despues de inyeccion de material antigeno HIV y forman la base para un tratamiento efectivo el mas sorprendente de HIV, esclerosis multiple y otras condiciones.

Description

AGENTE TERAPEUTICO La presente invención se refiere a un agente terapéutico, en particular, pero no excl usivamente, un agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades que involucran una respu esta inmune proliferante .

ANTECEDENTES DE LA I NVENCIO N La WO 97/02839 se refiere a Supresión Viral , Tratamiento y Prevención de Infecciones Virales. Proporcio na un método para producir anticuerpos neutralizantes para el tratamiento de una infección viral en un paciente, que comprende los pasos de : a. exponer un mamífero a un virus de manera que dicho mamífero produzca anticuerpos neutralizantes para d icho virus , y b. recolectar dichos anticuerpos neutralizantes de dicho mamífero.

En los ejemplos, se obtiene una vacuna para HIV designada AAV2 mediante la mezcla de virus de H IV con anticuerpos neutralizantes de H IV obtenidos de una cabra . La WO- 01 /60156 se refiere a Compo siciones de Anticuerpo Neutralizante y Poíenciadoras de Manera Inmunomoduladora. Proporciona una composición ¡nmunomodulatora que comprende: Anticuerpos heterólogos específicos para un antígeno; y Un antígeno, en don de los anticuerpos heterólogos fo rman un complejo con el antígen o para combinación con un po rtador farmacéutico .

Los ejemplos son similares a aquellos de Wo 97/02839, y otra vez se obtiene una vacuna para HIV designada AAV2 mezclando virus de HIV con anticuerpos neutralizantes de HIV obtenidos de una cabra. La Wo 02/07760 concierne a un Agente Terapéutico. Proporciona un método para prevenir la infección con HIV o tratar un individuo infectado con HIV, que comprende los pasos de: (1) exposición de un sistema inmune de cabra al HIV; (2) purificación de anticuerpo de la cabra después del reto del HIV; y (3) tratamiento de un individuo con el anticuerpo obtenido en el paso 2 anterior. En pruebas clínicas preliminares basadas en el producto de anticuerpo de la WO 02/07760, pacientes con HIV han sido tratados exitosamente usando suero de una cabra después de reto con HIV. De preferencia, el tratamiento emplea una composición de suero que puede obtenerse mediante un proceso que involucra cultivar anticuerpos efectivos en una cabra, sacar sangra de la cabra, demostrar la capacidad de neutralización de HIV en la sangre extraída, precipitar sólidos usando sulfato de amonio sobresaturado u otro agente de precipitación adecuado, separar el precipitado, disolver el precipitado en un medio acuoso adecuado y dializar la solución con un corte de 5 a 50,000 -Daltons, de preferencia de 7 a 30,000 Daltons, más preferiblemente de 8,500 a 15,000 Daltons, especialmente aproximadamente 10,000 Daltons. El método de inmunización de cabra puede ser intramuscular, pero pueden utilizarse también otras técnicas estándar tales como administración subcutánea o intradérmica. El proceso de purificación puede ser completado también mediante otros métodos de acción de fraccionamiento usados comúnmente (ácido caprílico, por ejemplo) siempre que se use el residuo total. Más particularmente, el tratamiento emplea típicamente un suero de cabra obtenido de la siguiente manera.

Ejemplo de Producción de Suero de Cabra Se inoculó una cabra medianté inyección intramuscular con virus HIV-3b Iisado suspendido en un sobrenadante comercial normal, usando una inyección intramuscular de HIV-3b a una concentración de 109 partículas virales por mi. El virus se mató por calor previamente a 60° C durante 30 minutos. Se sacaron muestras de sangre después de un intervalo apropiado, tal como dos semanas, para una evaluación inicial. En el procedimiento optimizado, la cabra se inyecta cada semana durante cuatro semanas, después a las seis semanas el animal se desangra para obtener el reactivo. Se sacan aproximadamente 400 ce de sangre de la cabra con una técnica estéril. El área para extracción con aguja se rasura y prepara con betadina. Se usa una aguja calibre 18 para sacar aproximadamente 400 ce de sangre del animal. Es de notarse que el animal puede tolerar la extracción de aproximadamente 400 ce de sangre sin que el animal sufra de cualesquiera efectos perjudiciales. El animal no tiene que ser sacrificado. El animal puede ser desangrado otra vez en aproximadamente 10 a 14 días después de reponer su volumen de sangre . Se confirmó la presen cia de anticuerpos potencialmente útiles. Una vez que se confirmó la presencia de tales reactivos entonces se tomó sang re de la cabra entre 4 a 6 semanas y se centrifugó para separar el suero. Después se filtraron 300 mi de suero para remover coágulos grandes y materia en pa rtículas. El suero se trató entonces con sulfato de amonio sobresaturado (solución al 45% a temperatura ambiente) para precipitar anticuerpos y otros materiales. La solución resultante se centrífugo a 5000 rpm durante 5 min utos, después de lo cual se removió el fluido sob renadante. La inmunoglobulina precipitada se resuspendió en salina amortiguada con fosfato ('PBS buffer', ver Sambrook y colaboradores, 'Molecu lar Cloning, A Laboratory Manual', 1989) suficiente para redisolver el precipitado . La solución se d ializó entonces a través de una membran a con u n corte de peso molecular de 1 0, 000 Daltons. La diális is se llevó a cabo en buffer PBS, se cambió cada cuatro horas durante un periodo de 24 horas. La diálisis se llevó a cabo a 4o C. Después de 24 horas de diálisis se vaciaron los contenidos de la bolsa de diálisis en un matraz estéril. La solución se ajustó de tal manera que la masa por un idad de volumen = 10 mg por mi . La dilución se llevó a cabo usando PBS. La solución resultante se filtró entonces a través de un filtro de 0.2 micrones a un contenedor estéril . Desp ués de la filtración, la solución se dividió en alícuotas en dosis sencillas de 1 mi y se almacenó a -22° C antes de usarse. El reactivo está entonces listo para usarse.

Se pueden hacer cambios en este procedimiento, tales como por ejemplo variar la concentración del sulfato de amonio o cambiar otros reactivos. De manera similar el corte de diálisis no necesita ser en 10,000 Daltons.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Como parte de los tratamientos que usan el suero de cabra, se notó que hubieron otros resultados benéficos. Por ejemplo, en pacientes con HIV con diabetes Tipo 1, se notó una mejoría no solamente en su infección de HIV primaria, sino también en los síntomas de la diabetes. Para pacientes con HIV con ciertos tipos de cánceres, se notaron remisiones en los cánceres así como también en los síntomas de HIV. Los hallazgos de una mejoría clínica significativa en pacientes infectados con HIV así como también en aquellos pacientes con condiciones diversas tales como esclerosis múltiple y algunos cánceres tienen el vínculo potencial de que todas estas enfermedades están en estados inflamatorios crónicos. De acuerdo con la presente invención, encontramos que la actividad del suero de cabra reside en la presencia de actividad anti-HLA. Para nuestra sorpresa fuimos capaces de demostrar fácilmente que las cabras inmunizadas con HIV produjeron sueros que son capaces de cambiar el ensayo de respuesta de linfocitos mezclados que es uno de los ensayos clásicos de activación usados in vitro. Pensando que esto podría ser alguna propiedad inherente del suero de cabra, quedamos impresionados cuando los sueros de cabra no inyectados fallaron en tener cualquier actividad en estos ensayos. Demostramos también que esta actividad está asociada estrechamente con la actividad contra anticuerpos de HLA clase II. No sabemos si esto representa una respuesta de mimetismo molecular o si la cabra ve el HLA clase II llevado por el virus conforme brota y se muda de células infectadas, o de manera tal que HLA (moléculas de MHC) se muda separadamente del virus, pero co-purificado de manera que los anticuerpos son hechos también para tales componentes de membrana celular. De hecho, no ha escapado a nuestra atención que otras moléculas de membrana celular tales como los receptores de quimocina y moléculas relacionadas pueden estar también en la preparación e inducir respuestas de anticuerpo las cuales están modulando el efecto terapéutico benéfico. Sin embargo, si es así, parece que las respuestas anti-HLA son muy dominantes y creemos que éstas pueden jugar un papel significativo, pero no necesariamente solitario con respecto a la inducción de las respuestas anti-inflamatorias observadas. Hemos estudiado sueros de diferentes cabras inmunizadas con diferentes virus/preparaciones celulares y se puede mostrar que cabras inyectadas con cóctel produjeron una respuesta inmune que ve muchas de las partes crípticas, es decir silentes de la envoltura de HIV que bien puede ser muy importante en el diseño de una vacuna futura. En un aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo que reconoce un antígeno de HLA ciase II para uso en una enfermedad que involucra una respuesta inmune proliferante. Con los títulos altos de anticuerpos para HLA, ambas clase II y clase I en los sueros, aquellos con los niveles más altos de anticuerpos son aquellos que cambian mejor las respuestas de linfocitos mezclados y parecen tener la mejor eficacia en la situación clínica. Para nuestra sorpresa, encontramos que los anticuerpos para FAS, un ligando de apoptosis principal, fueron extremadamente altos. De hecho correlacionaron con los anticuerpos MHC Clase II. Sin estar limitados por alguna teoría, hacemos la hipótesis de que anticuerpos de títulos altos para FAS podrían conducir a apoptosis inmediata en unos pocos minutos de que el anticuerpo se pegue al antígeno de FAS y las células pudieran ser muertas. Esto podría conducir a la inhibición de las quimocinas tóxicas, las cuales se piensa que están involucradas en la incapacidad de MS. Así, con la presente invención, reportamos que anticuerpos para FAS pueden ser importantes en el tratamiento de HIV, Esclerosis Múltiple y otras condiciones y pueden tener un co-beneficio con los otros anticuerpos para clase II y clase I en el tratamiento. En un aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti-FAS para uso en el tratamiento de enfermedad susceptible a tal tratamiento. Además, esta invención proporciona también composiciones que contienen anticuerpo anti-HLA y/o anticuerpo anti-FAS y métodos de tratamiento que usan tales combinaciones. El uso principal de la presente invención es para los sueros que contienen anti-HLA como un tratamiento para enfermedades con niveles inapropiadamente elevados de HLA. Estas incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus, cirrosis biliar primaria, cirrosis autoinmune y condiciones autoinmunes virales b y c que involucran corazón, pulmones, piel, tracto gastrointestinal, ríñones, cerebro, CNS. Más generalmente, condiciones que pueden ser tratadas mediante la presente invención incluyen HIV, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, daño axonal o de nervios o daño relacionado o cánceres y otras enfermedades o condiciones con un componente inflamatorio. La presencia de anti-FAS hace a los sueros particularmente adecuados para enfermedades asociadas con células activadas de manera crónica las cuales pueden secretar mensajeros dañinos tales como citocínas y quimocinas. Estas incluyen esclerosis múltiple, todas las formas de condiciones inflamatorias crónicas del sistema nervioso así como también de infecciones crónicas tales como cánceres virales, bacteriales y tropicales asociados con lesiones inflamatorias crónicas, en particular aquellas de los pulmones, páncreas, hígado, intestino grueso, nodos linfáticos, piel especialmente cánceres de células dañadas y células básales pueden también beneficiar tumores primario y secundario del cerebro y médula espinal. Las mejorías observadas en la función nerviosa en aquella gente nervios dañados traumáticamente sugiere una propiedad del factor de crecimiento neuronal y de aquí que pueda usarse para trauma, daño post-infección, por ejemplo barra-guillian, daño maligno, etc., neuropatías asociadas con diabetes, alcoholismo, envenenamiento con metales u otras toxinas, etc. Los beneficios observados en el cabello y tono y color de la piel sugieren otras propiedades únicas que no pueden ser explicadas por las observaciones anteriores, re anticuerpos, etc., a la fecha, es decir, antienvejecimiento, reportes de actividad reducida de cáncer secundario con este suero sugieren actividad anti-cáncer directa, esto puede ser relacionado con la actividad de FAS, pero puede ser debido también a otros agentes aun no identificados. En un aspecto, el anticuerpo se obtiene de preferencia a partir de una cabra la cual ha sido vacunada contra la rabia. En una variación, la presente invención se extiende a anticuerpo producido por caballos, ovejas y otros animales adecuados. El anticuerpo se puede obtener de una manera similar a la dada para el anticuerpo de cabra, y puede ser evaluado por las actividades anti-HLA y/o anti-FAS. En una variación más, no es necesario el uso de virus HIV como un inmunógeno para dar el anticuerpo y se emplean células sanguíneas blancas humanas o antígenos de célula-línea-membrana derivada de humano como inmunógeno para dar una preparación de anticuerpo efectiva. Además, concebimos que el anticuerpo puede ser reemplazado por el inmunógeno, es decir la composición terapéutica puede comprender el material de HIV o las células blancas de sangre. En otra variante aun, a continuación de la desactivación por calor se puede usar también una solución de sobrenadante en la cual se ha cultivado un cultivo viral o una que es capaz de lo mismo, pero que no ha sido usada para cultivar un cultivo como un inmunogeno que producirá una respuesta de anticuerpo adecuada. Se puede usar cualquier solución sobrenadante u otro medio que sea adecuado para el cultivo ¡n vitro de HIV u otro virus para producir un inmunogeno aceptable, el cual producirá una respuesta de anticuerpo efectiva. El sobrenadante de un medio de crecimiento de un cultivo de células tal como PMBC o la línea de células inmortales de cáncer como se usa para cultivar HIV 111b se dan como ejemplo. El HIV u otro virus seleccionado no necesita estar presente para producir un inmunogeno efectivo para crear la preparación de anticuerpo. De preferencia, el anticuerpo de esta invención es un anticuerpo policlonal que reconoce un repertorio antígeno HLA clase II y antígeno gp 120, o que reconoce FAS. Nuestros hallazgos sugieren que es preferible tener un antígeno HLA clase II. Se pueden cultivar anticuerpos adecuados empleando como inmunogeno una selección de antígenos, de preferencia un cóctel de antígenos. Es posible que el uso de un rango de diferentes antígenos den origen a un anticuerpo que reconoce estructuras comunes de los antígenos que dan una respuesta más fuerte en el paciente. Tenemos la hipótesis de que una selección de aislados de HIV proporcionará epitopes con variaciones menores en estructura y resultará un pan-anticuerpo. Así, para generar el suero, preferimos emplear un cóctel de diferentes virus de HIV producidos principalmente en PMBCs, en lugar de usar células T solamente. El cóctel contiene adecuadamente 2, 3, 4, 5, 6 o más de tales virus. Los virus están de preferencia en la forma de lisadps. Ejemplos de lisados preferidos incluyen los siguientes aislados de HIV-1: 91US056, 92HT593, 92US723, 92US657, 92US660 y 92US714. De preferencia el cóctel incluye por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 o todos los 6 de estos aislados en particular. La activación de células, por ejemplo con Concanavalin A, puede dar ventajas y por ejemplo se pueden lograr niveles más altos de actividad anti-dopamina usando Con A. SULA (no activada) no tuvo aumento significativo en los niveles de anti-dopamina R por arriba de la línea de base en O. D. Mientras tanto, lo tuvo el HIV 3B (promedios de 12 cabras y conejó). También hubo un aumento en niveles de Dopamina R entre las células PMBC con Con A activado en el cóctel. En otra variación todavía, una solución de sobrenadante adecuada para el cultivo in vitro del virus de HIV, pero no limitado a HIV en la forma de ya sea PMBC u otro medio tal como una línea de células inmortales tal como se usa por ejemplo con el fin de cultivar HIV 111b por su cuenta sin la introducción del virus si el calor mata en la manera normal usada, si el virus no está presente produce una preparación efectiva de anticuerpos. Tales anticuerpos sé pueden obtener también usando proteínas que contienen los péptidos aislados a partir de lisados de HIV, péptidos sintéticos, proteínas de fusión bacteriana y proteínas/péptidos de fuentes filogenéticamente no relacionadas que contienen o mimetizan el cultivo de células deseado u otros desechos de sobrenadante. Se pueden obtener y probar anticuerpos para lisado.

S in limitación por nuestra teoría actu al, parece que el anticuerpo de esta invención actúa pa ra suprimir la proliferación de células del tipo q ue se requiere por H IV u otras condiciones de pendientes en tal respuesta inmune. Así, por ejemplo, la p resente invención e ncuentra aplicación en el tratamiento de esclerosis múltiple. Estando consientes ahora del significado de la actividad de anti-H LA y anti-FAS del anticuerpo del suero d e cabra, ahora se hace posib le evaluar la utilidad probable de un rango de tales sueros de cabra. Un simple ensayo puede eval uar la presencia de actividad de anti-HLA y/o anti-FAS, y permite la identificación del suero candidato adecuado para la administración a pacientes. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para preparar un suero, especialmente suero de cabra , que comprende administrar uno o más, de preferencia por lo menos varios , aislados de H IV al animal, permitir que se desarrolle una respuesta inmune, sacar sangre del animal, supervisar la presencia de anticuerpo anti-H LA y/o anticuerpo anti-FAS y preparar un suero anti-HLA y/o anti-FAS pa ra tratamiento de un ser humano. Usualmente se e mplearán múltiples an imales y los animales pueden ser evaluados por aquellos qu e dan los mejores rendimientos de suero efectivo . Tales mejores animales p ueden entonces ser criados para proporcionar un linaje de animales especialmente adecuados para la presente invención. Se adoptarán usualmente procedimientos de control de calidad para asegurar la presencia de anticuerpo anti-HLA, típicamente un rango de anticuerpos anti-HLA, y/o de anticuerpo anti-FAS, típicamente un rango de anticuerpos anti-FAS. Se pueden llevar a cabo correlaciones de lote a lote para dar un producto normalizado. Con base en la habilidad del suero para inhibir dramáticamente el MLR, se sugiere que este suero puede estar actuando como un fuerte agente anti-inflamatorio. Hay un número de mecanismos por los que eso podría ser efectuado y la inhibición del reconocimiento de HLA es uno de los más probables. Otro mecanismo de acción puede muy bien ser debido al hecho de que un complemento está involucrado en la actividad de este plasma de cabra ya que es la única actividad conocida que se evita mediante el tratamiento con calor. El complemento bien puede estar permitiendo que mecanismos desertores debilitados de los pacientes estén activos. Por ejemplo, tanto la aniquilación viral y de células tumorales objetivos del anticuerpo como la aniquilación dirigida mediada por anticuerpo ambas requieren complemento y hay una carencia total de efecto o mecanismo en la ausencia de complemento. Además, la invención proporciona una composición que incluye el componente activo que puede derivarse de la sangre de una cabra adecuadamente retada mediante una técnica de extracción de suero que no está diseñada para aislar anticuerpos individuales, específicos. En particular, la invención concibe el aislamiento del componente activo, posiblemente una mezcla de anticuerpos anti-HLA y/o anticuerpos anti-FAS cooperantes, a partir del suero de sangre de la cabra retada, sin purificación y extracción exhaustivas para obtener un anticuerpo individual. En general, la inyección a seres humanos de anticuerpos derivados de un huésped no humano está contraindicado. Normalmente se monta una fuerte respuesta inmune contra los mismos anticuerpos extraños. Sin embargo, de manera sorprendente, se ha descubierto que el uso de extracto de suero de cabra no provoca las reacciones inmunes que se anticipan con otras proteínas animales extrañas. La inyección de extracto de suero de cabra es tolerada tanto por pacientes inmunosuprimidos como por individuos normales. La presente invención usa específicamente un extracto de suero, el cual comprende posiblemente la población total de moléculas del anticuerpo, derivado del reto a una cabra con HIV. Sin que desear estar restringidos por la teoría, creemos que tal enfoque tiene beneficios significativos. Los pacientes tratados con tal extracto de suero mostraron beneficios significativos después de minutos de haber sido tratados. Un virus muerto se inyecta a una cabra específicamente identificada, mediante inyección intramuscular, y se permite la incubación, después se extrae una cantidad medida de sangre y se modifica en consecuencia. El suero se prueba opcionalmente para la actividad de anticuerpo deseada, y opcionalmente uno o más de habilidad anti-fusión, neutralización del virus del SIDA, su habilidad para aumentar la fagocitosis y su aceptabilidad por el cuerpo humano. Después de la inoculación de una cabra seleccionada con el virus de H IV, se notó u na respuesta inm une después de haber sido expuesta a un antígeno de proteína extraña, de acuerdo con estudios anteriores . El suero extraído fue modificado adicionalmente después con el fin de prepararlo para uso hu mano. Los reactivos producidos en respuesta a un animal que se inocula con HIV y modificados y refinados mediante los procedimientos presentes, han mostrado que invierten totalmente el complejo de SI DA. La explicación de cómo esto es logrado realmente es compleja , pero cu ando se da1 a un individ uo quien es H IV positivo o con SIDA totalmente declarado resulta en: 1 . Una mejoría casi inmediata en la calidad de vida de los pacientes . 2. Una proliferación de células CD4 y CD8 que se generan , por lo que aumenta el conteo de células CD4 y CD8. 3. Una dismin ución en la carga viral de los pacientes hasta un cero teórico generalmente en incrementos de 0.5 logs. 4. Una red ucción de valores de P24 hasta cero. En esencia esto quiere decir q ue es posible regresar el sistema inmune de los pacientes hasta lo normal y elimin ar el virus, aun que se desconoce en el presente cuanto d urará este estado, con tres años y aumentan d o la observación actual . El tratamiento se da por medio de una inyección su bcutánea, en cantidades que varían entre un/décimo y d iez ce y está diseñ ado para entregar la medicación tan ráp ida como sea posible al sistema linfático . Con la presente invención , la dosis preferida para un paciente con H IV es usuaimente 1 mi por semana o según se requiera, dada como una dosis dividida en ambos brazos. La admin istración cada 2 o 3 semanas es típica , después cada 3 meses. Para pacientes con cán cer, 0.3 mi por semana parece ser lo mejor. En la mayoría de los casos, el tratamiento h a sido conducido una vez cada cuatro semanas durante un periodo de tres meses . Las observaciones generales del mismo son como sigue : 1 . La depresión moderada a severa se invirtió en menos de sesenta minutos después de la inyección. 2. Los pacientes recuperaron su apetito generalmente en dos horas después de la inyección y buscaron comida activamente. 3. En aproximadamente dos semanas del primer tratamiento los pacientes comenzaron a ganar peso . 4. Reportes de laboratorio independiente confirmaron q ue de 4 a 6 seman as después del primer tratamiento las cargas virales y los valores P24 fueron abatidos sustancialmente y que las células CD4 y CD8 estaban aumentando dramáticamente. 5. No se observaron efectos secundarios. Es importante n otar q ue la presente medicación , a diferencia de tratamientos actuales, no requiere que el paciente mantenga un régimen estricto de horario o d iariamente y depende de una simple inyección que se administra ya sea semanalmente o mensualmente. De preferencia , la composición se purifica y consiste esencial mente solo de un extracto de suero purificado. En una variación más, se pueden purificar también anticuerpos como un todo o seleccionarlos y agruparlos de acuerdo con un requerimiento específico de la enfermedad a partir del complejo de suero o mezcla de plasma mediante procedimientos convencionales o cualquier otro adecuado, incluyendo, pero no limitado a, por ejemplo cromatografía de inmuno-afinidad, precipitación de sales, cromatografía por intercambio de iones, cromatografía por tamaño, cromatografía por afinidad, en combinación según sea apropiado o deseado. Con el anticuerpo anti-HLA, y/o anticuerpo anti-FAS, de la presente invención, se puede considerar también la terapia en combinación, pero puede no ser necesaria. El extracto de suero de cabra producido como se describe en la presente puede ser formulado de acuerdo con la invención en una composición para inhibir la replicación viral in vitro o in vivo. Como tal, la invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden el reactivo de cabra de la presente invención, adecuado para el tratamiento de enfermedad, tal como enfermedad viral. El reactivo de la presente invención puede ser mezclado con portadores farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier sólido (tabletas, pildoras, cápsulas, gránulos, etc.) con composición adecuada, para administración oral, tópica o parenteral y pueden comprender un portadqr. Las composiciones pueden necesitar que sean estériles cuando se administren pareriteralmente. Usualmente se emplea una dosis de prueba para ver si la persona desarrolla una reacción alérgica al suero de cabra hiperinmune. Una inyección intradérmica es seguida por una espera de 30 minutos para ver si hay una reacción inmediata la cual se manifiesta como edema, eritemia y comezón. Si esta reacción es negativa, entonces la suposición es de que una reacción sensitiva inmediata es lo más probable que ocurra. Una reacción alérgica no excluye a la persona, sin embargo, un tratamiento potencial salva-vida debido a una posible reacción alérgica. La administración de la composición de la invención puede ser mediante cualquier método adecuado tal como mediante infusión intravenosa, de manera subcutánea, inyección intramuscular, precipitación oral, administración intraperitoneal e intravenosa. La dosificación correcta variará de acuerdo con la formulación particular, el modo de aplicación y el sitio particular, huésped y la condición a ser tratada. Se tomarán en cuenta otros factores como edad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, régimen de excreción, condición del huésped, combinaciones de fármacos, sensibilidad a la reacción y severidad de la enfermedad. La administración se puede llevar a cabo de manera continua o periódicamente dentro · de la dosis máxima tolerada. Este producto, a diferencia de la mayoría de otros tratamientos, no requiere que el paciente mantenga un régimen estricto de horario o diariamente para la toma de pildoras y depende de la administración de una simple inyección periódica. Loá sistemas inmunes de los pacientes que fueron tratados hace más de dos años y han permanecido con el proyecto, parecen haberse estabilizado y regresado a los niveles operativos normales. Para el tratamiento de HIV, este producto está diseñado para disminuir la inflamación causada por el HIV, así permite que el sistema inmune humano, sin la necesidad de productos químicos altamente tóxicos, redirigirse así mismo contra el virus. La medicación a diferencia de sus competidores puede usarse en dosis más pequeñas ya sea como una profilaxis cuando se sospecha de una infección, o durante las etapas tempranas de la enfermedad. A diferencia de los fármacos existentes, los cuales necesitan con frecuencia tomarse diariamente por el resto de la vida de los pacientes, un tratamiento típico depende de una simple inyección que se administra por un doctor ya sea semanal o mensualmente. Un programa normal de tratamiento es de tres meses de duración, con un procedimiento de seguimiento anticipado a los seis meses, doce meses y dos años o según sea necesario en caso de que aparezca el virus. La composición de la presente invención puede usarse con otros fármacos para proporcionar una terapia en combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o proporcionarse como una composición separada para administración al mismo tiempo. La invención se extiende también a un método de generación de una composición protectora que comprende un reactivo para uso en protección de una especie que no sea cabra, el método que comprende inmunizar una cabra con un antígeno que no es de cabra (por ejemplo un virus o proteína extraña) y purificar el extracto de suero producido en la cab ra después del reto con el antígeno . El reactivo se puede usar entonces para proteger al animal, que no es una cabra, del antígen o utilizado como inmunógeno. La presente invención se refiere además, al uso de una composición que comprende el extracto de suero de una cabra después del reto con un virus de H IV h umano en medicina y al uso de una composición que comprende la población total de anticuerpos de una cabra después del reto con un virus de HIV humano en la preparación de un medicamento para el tratamiento de condiciones que incluyen HIV y S I DA. De preferencia, la composición de la presente invención es tratada por un a o todas de las siguientes: precipitación con sulfato de amonio al 45 % , congelación a - 70° C durante 24 horas o microfiltración . El producto de anticuerpo de esta invención es de uso para el tratamiento de enfermedades con un componente inflamatorio e incluye no solamente H IV, sino también diabetes, artritis reumatoide, neuritis, mieloma múltiple , cáncer colorectal , etc. Ejemplos adicio nales se dan en artículos por H. Baum, para lo cual ver su sitio de internet en www. kcl. ac. uk/ki s/schools/life sciences/life sci/bau m. html , de manera notable en su artículo sobre mimetismo molecular en Immunology Tod ay, 1 996, feb rero 1 7 , 64-70, incorporado a la presente por referencia. En un aspecto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de pacientes q uienes no tienen H IV. En particular, el método de tratamiento puede ser para tratar diabetes o cáncer en pacientes que no tienen H IV.

La recuperación vista en muchos de los pacientes MS, junto con el humor elevado reportado a la hora de recibir el tratamiento, ha provocado que veamos la actividad contra receptores en el CN.S que puede estar involucrado en la estimulación nerviosa y posible regeneración. Hemos buscado los varios sueros para actividad contra un número de antígenos y hemos encontrado actividad contra el receptor de dopamina, receptor de serotonina, receptor p75 del factor de crecimiento de nervios y la quimocina CXCL10 (IP10). En consecuencia, la invención se extiende al anticuerpo contra uno o más de los receptor de dopamina, receptor de serotonina, receptor p75 de factor de crecimiento de nervios y la quimocina CXCL10 (IP10). Una o más de estas actividades de anticuerpo puede estar presente, sola o en combinación con actividad de anti-HLA y/o anti-FAS. Estando conscientes ahora del significado de la actividad contra el receptor de dopamina, receptor de serotonina, receptor p75 de factor de crecimiento de nervios o quimocina CXCL10 del anticuerpo a partir del suero de cabra, se hace posible ahora evaluar la utilidad probable de un rango de tales sueros de cabra. Un simple ensayo puede evaluar la presencia de tal actividad y permitir la identificación del suero candidato adecuado para administración a los pacientes. En particular, la combinación de anticuerpos anti-FAS y/o anti-HLA puede ser importante, junto con anticuerpo contra uno o más de receptor de dopamina, receptor de serotonina, receptor p75 de factor de crecimiento de nervios o quimocina CXCL10 y así los ensayos podrían dirigirse a las varias actividades de anticuerpo para asegurar su presencia en el producto.

Esta invención proporciona también composiciones que contienen . anticuerpo contra uno o más de receptor de dopamina, receptor de serotonina, receptor p75 de factor de crecimiento de nervios o quimocina CXCL10, usualmente también con anticuerpo anti-FAS y/o anticuerpo anti-HLA y métodos de tratamiento usando tales combinaciones. En una variación, la presente invención se extiende a anticuerpos producidos a partir de caballo, oveja y otros animales adecuados. El anticuerpo se puede obtener en una manera similar a aquella dada para el anticuerpo de cabra y puede evaluarse para actividades contra uno o más de HLA, FAS, receptor de dopamina, receptor de serotonina, receptor p75 de factor de crecimiento de nervios y/o quimocina CXCL10. En una variación más, no es necesario el uso de virus de HIV como inmunógeno para dar el anticuerpo y se emplean células sanguíneas blancas humanas como inmunógeno para dar una preparación de anticuerpo efectiva. Además, concebimos que el anticuerpo puede ser reemplazado por el inmunógeno, es decir la composición terapéutica puede comprender el material de HIV o las células blancas de la sangre. De manera más general, parece que los anticuerpos efeótivos pueden ser obtenidos usando como inmunógeno células (o mezclas de cóctel de proteínas) que se originan en un ser humano. Los anticuerpos a partir de estas células humanas se hacen entonces en una especie huésped, usándose el producto de anticuerpo final otra vez en un ser humano. Las mezclas de cóctel de proteínas pueden ser de una homología extremadamente similar entre el donador original y el receptor. Esta homología permite que el concepto de proteínas o células, por ejemplo, de orígenes neurales de simio son capaces de trabajar en u n ser humano. Los cócteles de proteína conservados a partir de u n animal estrechamente relacio nado son de interés. También se espera que haya una relación entre el tipo de HLA de la persona qu e donó la cél ula original y el tipo de H LA del receptor. Esta relación podría exp licar algo de la viariabilidad que se ha visto y puede ser tomada en cuenta al seleccion ar una formulación para igualar a un paciente. Además , conceb imos usar líneas celulares activadas o de cáncer de diferentes partes del cuerpo, incluyendo líneas de células de blastomas neura les , carcinomas de páncreas, carcinomas de células de próstata y escamosas. Se pueden predecir diferencias sutiles entre los anticuerpos creados entre estos tipos de cél ulas dife rentes para dar un perfil muy diferente y podría ayudar a apuntar a ciertos sistemas de órganos en un sentido muy amplio. Existe alguna evide ncia de que la vacuna contra la rabia dada a las cab ras puede ser responsable del efecto terapéutico observado. Filtramos sueros de cabras obtenidos en Gales, incluyendo un grupo de 3 sue ros diferentes (sueros normales) y de un cabrito donador, q ue no ha tenido vacunas preventivas para la rabia u otras. Estos an imales no tuvieron anticuerpos activos. En otra variación aún , concebimos que la muda de componentes de la membrana celular durante la propagación de células in vitro puede proporcio nar los antíg enos a los cuales las es pecies de cabra u otras pueden d irigir respuestas anticuerpo. Esto puede ocurrir en la ausencia de infección viral.

FIGURAS Las Figuras 1 a 9 se refieren a la determinación de la presencia de anticuerpos anti-HLA clase II; Las Figuras 10 a 16 se refieren a estudios de MLR; Las Figuras 17 a 19 se refieren a la determinación de la presencia de anticuerpos anti-FAS; Las Figuras 20 a 29 se refieren a la determinación de la presencia de anticuerpos adicionales; y La Figura 30 proporciona perfiles para sueros de cabras inmunizadas con diferentes inmunógenos.

EJEMPLOS DE LA INVENCION Los siguientes detalles representan nuestro procedimiento actual para preparar el producto de anticuerpo. Ejemplo de Producción de Sueros de Cabra Se inoculó una cabra mediante inyección intramuscular con cóctel viral de HIV lisado y formulado con auxiliar de Freunds. El virus se mató por calor previamente a 60° C durante 30 minutos. Se extrajeron muestras de sangre después de un intervalo apropiado, tal como dos semanas, para la evaluación inicial. En el procedimiento optimizado, la cabra se inyecta cada semana durante cuatro semanas, después a las seis semanas el animal se desangra entonces para obtener el reactivo.

Se extraen aproximadamente 400 ce de sangre de la cabra bajo una técnica estéril. El área para la extracción por aguja se rasura y se prepara con betadina. Se usa una aguja calibre 18 para extraer aproximadamente 400 ce de sangre del animal. Es de notarse que el animal puede tolerar la extracción de aproximadamente 400 ce de sangre sin que el animal sufra de efectos perjudiciales. El animal no tiene que ser sacrificado. El animal puede ser desangrado otra vez después en aproximadamente 10 a 14 días después dé que reponga su volumen de sangre. Se confirmó la presencia de anticuerpos potencialmente útiles, teniendo en mente la actividad deseada del anticuerpo. Una vez que se confirmó la presencia de tales reactivos, se tomó sangre entonces de la cabra entre las semanas 4 y 6. El producto base de sangre se centrifuga después para separar el suero con el fin de crear el reactivo. Se filtraron entonces 300 mi de suero para eliminar coágulos grandes y materia en partículas. El suero se trató después con sulfato de amonio sobresaturado (solución al 45% a temperatura ambiente), para precipitar anticuerpos y otro material. La solución resultante se centrífugo a 5000 rpm durante 5 minutos, después de lo cual se eliminó el fluido sobrenadante. La inmunoglobulina precipitada se resuspendió en solución salina amortiguada con fosfato ('amortiguador de PBS', ver Sambrook y colaboradores, 'Molecular Cloning, A Laboratory Manual', 1989) suficiente para redisolver el precipitado. La solución se dializó después a través de una membrana con un corte de peso molecular de 10,000 Dáltons. La diálisis se llevó a cabo en amortiguador de PBS, se cambió cada 4 horas durante un período de 24 horas. La diálisis se llevó a cabo a 4o C. Después de 24 horas de diálisis los contenidos de la bolsa de diálisis se vaciaron en un matraz estéril. La solución se ajustó de manera que la masa por unidad de volumen = 10 mg por mi. La dilución se llevó a cabo usando PBS. La solución resultante se filtró después a través de un filtro de 0.2 micrón en un contenedor estéril. Después de la filtración, la solución se dividió en alícuotas para dosificaciones sencillas de 1 mi y se almacenaron a - 22° C antes de usarse. El reactivo está entonces listo para usarse.

Conversión de Plasma a Suero: Materiales: Reactivo Fórmula Grado Cantidad Requerida por Litro de Agua Cloruro de NaCI USP/EP/BP 8.76 g Sodio Oríofosfato NaH2P04 USP/EP/BP 0.2 g dibásico de sodio Ortofosfato Na2HP04 USP/EP/BP 1.55 g básico disódico Sulfato de Sal de sodio, peso 100 g dextrán molecular 500,000 Agua para N/A Baxter 1 litro irrigación Duran N/A N/A N/A esterilizado 1 x 150 mi Duran N/A N/A N/A esterilizado 2 x 2 litros Placa agitadora N/A N/A N/A magnética & pulga magnética esterilizada Filtro Sartolab N/A - 0.2 um N/A o Midisart 1 x Bolsas Stedim 6 x 1 L Bolsas N/A N/A N/A estériles 1 x 100 ml_ Preparación de solución de sulfato de dextrán de100 mg/mL. Disolver la cantidad requerida de cloruro de sodio, ortofosfato dibásico de sodio y ortofosfato básico disódico en 1 litro de agua para hacer 1 litro de solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Cuando se han disueTto completamente, salpicar lentamente 10 g de sulfato de dextrán en 100 ml_ de PBS agitada magnéticamente. Mezclar durante un mínimo de 10 minutos para la solubilización completa. Filtrar en 0.2 um a un contened or estéril (por ejemplo bolsa de 1 00 mL) y almacenar a temperatura ambiente sino se requ iere para uso inmediato. Esta es la solución de reserva de sulfato de dextrán.

Conversión de plasma a suero. Pesar el volumen requerido de plasma que se va a tratar usando un factor de conversión de 1 .0275, es decir 1000 mL pesan 1 027.5 g. Agregar 1 0 mL de la sol ución de reserva de sulfato de dextrán a cada 1000 mL del plasma (concentración final de 1 mg/mL). Agitar magnéticamente a temperatura ambiente durante 30 min utos.

Transferir a bolsas Stedim de 1 litro. Centrifu gar a 4000-4200 rpm (fuerza centrífuga relativa = 4910 g) durante u n mínimo de 30 minutos a 22 ° C. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante a una bolsa Sted im de 1 L y desechar el p recipitado. Tarar el núme ro req uerido de bolsas Stedim de 1 L. Filtrar el sobrenadante en 0.2 u m a bolsas Stedim de 1 L. Cada bolsa debe conten er aproximadamente 500 mi del sobrenada nte filtrado. Registrar el volu men de suero en cada bolsa. Numerar e identificar cada bolsa. Si el su ero no se va a procesar inmediatamente, almacenar refrige rado a 4-8° C durante períodos de 7 d ías o a - 20° C para períodos más prolongados .

Preparación de Sulfato de Sodio al 36% p/v.

Materiales : Pesar 1 .5 litros de ag ua (su poniendo 1 m L = 1 g ramo) en el Duran esterilizado de 2 L. Calentar agua a 30-35° C colocando el Duran en una incubadora precalentada durante por lo menos 1 hora. I ntroducir una pulga magnética estéril y colocar en el agitador magnético. Agregar lentamente los 360 g de sulfato de sodio con agitación . Mantener la agitación hasta q ue la sal esté completamente disuelta y la solución sea clara . Si la solución no está suficientemente caliente o se deja enfriar, la sal comenzará a cristalizar en la solución. La sal puede ser red isuelta calentando la solución a 50° C. Filtrar el litro de la so lución de sulfato de sodio al 36% p/v en 0.2 um a una bolsa Stedim de 1 litro. Etiquetar la bolsa en concordancia. Filtrar los 500 m L restantes a una bolsa Sted im separada.

Proceder a agregar 500 m L adicionales de agua-para-inyección mediante filtración y etiquetar esta bolsa con sulfato de sodio al 1 8% p/v .

Precipitación de Inmunoglobulinas a Partir de Suero Usando Sulfato de Sodio . Nota. El plasma d ebe ser desfibrinado mediante el método de sulfato de dextrán antes del tratamiento con sulfato de sodio .

Material es: Reactivo Fórmula Grado Cantidad Suero filtrado 1 litro Solución de sulfato de sodio al N/A 1.5 litros 36% Solución de sulfato de sodio al N/A 1 litro 8% Salina amortiguada con fosfato N/A 2 litros Agua-para-irrigación N/A Baxter N/A Filtro profundo N/A N/A N/A Filtro de 0.2 um N/A 0.2 um N/A Bolsa Stedim para diafiltración N/A N/A N/A Calentar el suero filtrado en las bolsas de Stedim usando el paquete de incubadora a 30-35° C. Tomar muestras de 2 x 5 ml_. Agregar un volumen igual de solución de sulfato de sodio al 36% caliente al suero en las bolsas, por ejemplo 500 ml_ dé solución de sal:500 ml_ de suero. Mezclar suavemente la mezcla de salrsuero (solución blanca cremosa) agitando las bolsas manualmente o colocándolas en una placa de agitación. Mezclar durante 30 minutos. Pesar y equilibrar las bolsas y centrifugar a 4000-4200 rpm durante un mínimo de 30 minutos a 25-30° C. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante para desecharlo. Tratar de evitar revolver el precipitado. Tomar una muestra de 1 x 5 ml_ del sobrenadante.

Agregar a cada bolsa de precipitado un volumen suficiente del sulfato de sodio al 18% p/v para reponer el peso de cada bolsa hasta alrededor de 1000 g. Mezclar manualmente o mediante agitador durante un mínimo de 10 minutos para sacar la albúmina atrapada del precipitado de inmunoglobulina. Transferir las bolsas a la centrífuga y repetir la centrifugación como antes. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante para desechar. Tratar de evitar revolver el precipitado. Agregar a cada bolsa de precipitado un volumen suficiente de la salina amortiguada con fosfato para reponer el peso de cada bolsa hasta alrededor de 1000 g. Mezclar manualmente o mediante agitador durante un mínimo de 10 minutos y transferir las bolsas a refrigeración para almacenar una noche.

Retirar las bolsas del almacenaje y asegurar que el precipitado se ha resolubilizado. Filtrar en 0.2 um en una bolsa de diafiltración de tamaño adecuado.

Tomar muestras de 2 x 5 ml_.

Formulación a Granel de Solución de Inmunoglobulina. Fijar el dispositivo de ultrafiltración (UF) con por lo menos una membrana MWCO de 0.1 m2, 30,000. Sanitizar el sistema recirculando una solución de hidróxido de sodio 0.5 M-1M durante un mínimo de 30 minutos.

Drenar el sistema de la solución de hidróxido de sodio y proceder a inundar con agua-para-irrigación hasta que el pH del agua sea neutro. Conectar la bolsa de diafiltráción que contiene la solución de inmunoglobulina a la UF. Conectar una bolsa que contiene PBS (10 x el volumen de la solución de inmunoglobulina) vía una bomba peristáltica a la bolsa de diafiltráción. Conectar la línea de reténido a la bolsa de diafiltráción. Conectar la línea de diafiltrado a una bolsa de desechos. Proceder a procesar lentamente el producto a través del dispositivo de ultrafiltración, ajustar las presiones de entrada y salida a 2.0 bar de entrada y 0.5 bar de salida, usando los ajustes de velocidad de bomba y de válvula. Proceder a concentrar la solución de inmunoglobulina hasta alrededor de 50 g/L. Esto se calcula tomando en cuenta la concentración de partida y midiendo la cantidad del líquido eliminado. Por ejemplo: La solución de partida es 2 litros a 25 g/L = 50 g. El volumen de solución eliminada en diafiltrado es 1 litro. Por lo tanto la concentración es 50/1 = 50 g/L. Medir el régimen de flujo del diafiltrado y ajustar la velocidad de la bomba de la bolsa que contiene el PBS hasta igualar este régimen de flujo. Proceder a continuar la diafiltráción hasta que hayan sido intercambiados 10 volúmenes de amortiguador, es decir un litro de solución de IgG requiere 10 litros de PBS.

Drenar el sistema de la solución de IgG diafiltrada concentrada hacia la bolsa de diafiltración,. Desconectar la bolsa y conectar la bolsa de PBS que contiene por lo menos 1 litro de PBS directamente hacia el sistema. Recircular la solución de enjuague de PBS y recuperar este enjuagado hacia la bolsa que contiene la solución de IgG. Proceder a filtrar en 0.2 um la solución de IgG formulada a granel en una bolsa Stedim prepesada. Cuando se complete, tomar una muestra de 1 mL de la solución filtrada y evaluar la concentración de proteína. Pesar la bolsa y calcular el volumen de la solución de IgG. Usar la concentración de proteína y el volumen de IgG, calcular el volumen de PBS requerido para diluir la solución hasta una concentración final de 10 mg/mL, por ejemplo: Volumen de IgG = 1300 mL. Concentración de proteína = 30 mg/mL. Cantidad total de IgG = 39,000 mg. Requerimiento = 10 mg/mL de concentración final. Por lo tanto, volumen final requerido = 39,000/10 = 3,900 mL. Volumen actual es 1,300 mL. Por lo tanto, volumen de PBS requerido a ser agregado es de 3,900-1300 = 2,600 mL. Filtrar PBS en la bolsa que contiene la solución de IgG formulada a granel para alcanzar el volumen final requerido en 10 mg/mL. El reactivo está listo para usarse y puede ser almacenado bajo refrigeración hasta por 1 semana, o congelado a -20° C para requerimientos más prolongados de almacenamiento.. Pueden hacerse cambios en estos procedimientos, tales como por ejemplo variando la concentración del sulfato de sodio o cambiando sus reactivos. De manera similar el corte de la diálisis no necesita ser a los 10,000 Daltons.

Modo de Actividad Introducción Las observaciones privadas indican que los pacientes con SIDA que se les dio suero de cabras inmunizadas con HIV parecen mejorar aparentemente de manera dramática en algunos casos y buscamos un mecanismo potencial. Aunque las cabras se inyectan con HIV y se piensa que la respuesta inmune es altamente específica, esta base no explica el beneficio observado en pacientes con esclerosis múltiple y en algunos casos, cáncer.

Bases Científicas del Estudio Aunque Dalgleish y colegas descubrieron al receptor de CD4 como el portal de entrada para HIV hace varios años, la interpretación clásica de que HIV mata células CD4 las cuales declinan mesurablemente conforme progresa la infección a SIDA no fue una explicación adecuada de la patogénesis. Mayores observaciones que no ajustan bien con esta interpretación incluyen: (1) El largo período de tiempo a partir de la infección hasta el comienzo de SIDA (aproximadamente una década). (2) La a usencia de enfermedad en casi todos los chimpancés en aproximadamente 5% de gente infectada con HIV. Los ch impancés tiene n los m ismos receptores y co-receptores que los seres humanos y el virus puede ser detectado fácilmente en chimpancés infectados quienes abaten sus conteos de CD4. Con base en estas observaciones, los investigadores han buscado defin ir la difere ncia entre aquellos ind ividuos quienes desarrollan la enfermedad con la infección y aquellos quienes no la desarrollan. El principal pronosticador de la enfermedad es el grado de activación inmune que sigu e a la infección inicial y el nivel en el cu al persiste. En otras palabras, mientras mayor és la activación inmune, más corto es el tiempo para la enfermedad . Un grado moderado de activación podría con ducir a un tiempo más prolongado antes del desarrollo de S I DA y una ausencia de activación in mune aún con rep licacion de virus es el papel en chimpancés e individuos raros. Es importante señalar que el términ o "activación inmune" en este contexto significa activación pan-inmu ne, es decir todos los aspectos del sistema inmune se activan , lo cual incluye todos los subconju ntos de células T así como también célu las B . Hay solamente tres causas reconocidas de activación pan-inmune. La primera de éstas es la hiper-varia bilidad en el antígeno que exh ibe claramente HIV, sin embargo, la hiper-variabilidad se detecta en gente y chimpancés infectados quienes no progresan. La segunda posibilidad es un súper antígeno , el cual deriva el mecanismo d e antígeno específico y causa la activació n del sistema inmune entero. A pesar de un entusiasmo inicial hace una década, no se ha encontrado un súper antígeno convincente que se asocie con el HIV que explique estos hallazgos. Westby y Dalgleish mostraron que la variabilidad del repertorio de las células T que había sugerido la posibilidad de un súper antígeno fue enteramente como un resultado de la declinación en población de CD4 y las diferencias pudieran ser explicadas mediante destrucción de CD4 aleatoria. La única otra explicación es que el cuerpo ha visto una célula u órgano extraño y ha montado una respuesta crónica para ése. Clínicamente esto ocurre con frecuencia después de un trasplante y en particular trasplantes de médula y se conoce como injerto crónico versus enfermedad de huésped (GVH). En este escenario, aún la supervivencia de unas pocas células extrañas es bastante para activar él sistema inmune entero conduciendo a respuestas auto-inmunes agresivas similares a aquellas encontradas en pacientes infectados con HIV. Los aspectos clínicos de esta enfermedad son tan notablemente similares al SIDA que antes del descubrimiento del virus, un inmunólogo líder de los Estados Unidos, Géne Shearer de la NIH (EUA) sugirió que la enfermedad pudiera ser inducida por células extrañas transmitidas vía transfusiones sanguíneas o coito sexual. El descubrimiento del virus en los siguientes pocos meses y la transmisión mediante el Factor VIII (un producto libre de células) condujo a que el significado de esta observación se ignorara. La ausencia de otra explicación para la pan-activación condujo a Dalgleish y Habeshaw a buscar evidencia de que el virus pudiera ser capaz de mimetizar HLA Clase I o Clase II (que son las moléculas que determinan antígenos por sí mismos y presentes). Aunque algunas secuencias de GP120 ya han sido publicadas con menor homología a HLA, fuimos capaces de identificar una región mayor de la envoltura de HIV (GP120) que había marcado homología estructural para ambas HLA Clase I y HLA Clase II. Elizabeth Hounsell (MRC) fue capaz de modelar GP120 en la parte trasera de aquellas moléculas de HLA cuya estructura se conocía en detalle. Con base en estas moléculas y secuencias, Habeshaw y Hounsell predijeron que el virus podría ser visto como "extraño" por gente con HLA-B8 y también ser visto como "propio" por gente con HLA-B27. Ahora es un asunto de hecho publicado que las únicas diferencias de HLA con significado en un estudio marcador de pan-HIV HLA conducido en el RU por el MRC es que gente con HLA-B8 desarrolló la enfermedad a un índice muy lejos de ser el más rápido que el resto de la población y que los que no progresan a largo plazo o los que progresan extremadamente lentos son HLA-B27. Trabajos subsiguientes han mostrado que: (1) Células T aniquiladoras montadas en respuesta a un reto con células extrañas (es decir tipo HLA diferente) matarán también a células propias infectada con HIV. (2) Que la envoltura del virus HIV conocida como GP120 (que creemos tiene homología estructural con las moléculas de HLA que se autodetermínan), puede unir péptidos en una manera muy similar a HLA. Además, las células T cultivadas para los péptidos y el HLA que mimetiza GP120 responderá también a GP120 con el péptido, pero no a GP120 sin ei péptido sugiriendo que la habilidad de unir péptidos puede ser muy importante en su confirmación y de aquí la habilidad para causar activación inmune crónica en sujetos susceptibles. (3) Más recientemente hemos mostrado que la región donde los péptidos se unen en HLA está presente en GP120 y que si esta parte de la molécula se elimina, como fue realizado amablemente por el Profesor Sodroski en el Dana Faber en Boston, los péptidos ya no se unirán. El impacto de las observaciones anteriores sugiere que la activación del sistema inmune podría, en teoría, desconectarse y que la enfermedad, por lo tanto, pudiera no progresar. Hay dos observaciones principales en este respecto, una de las cuales fue un estudio clínico como un resultado de esta ciencia en la cual los pacientes quienes no podían ya tomar AZT debido a deficiencia estrecha se puso en esferoides un agente anti-inflamatorio clásico de fuerte impacto que no puede ser dado durante períodos largos sin efectos secundarios significativos. Fuimos capaces de ver una mejoría marcada de pacientes muy enfermos con características clásicas que recuerdan fuertemente la enfermedad de GUH con esferoides y fuimos capaces de mostrar que la dosis requerida para ejercer este efecto fue extremadamente alta y no una proposición práctica a largo plazo. Más recientemente un grupo en la Duke University (EUA) ha mostrado que la carga de virus cae en pacientes administrados con esteroides para HIV lo cual se está haciendo ahora más y más para combatir lo que se ve como auto-inmunidad (una característica clásica de enfermedad de huésped de injerto crónica). Brevemente, hay uha base científica de que un agente anti-inflamatorio que funcionó particularmente en la H LA Clase 1 o Clase II indujo trayectorias, podría ser benéfica en infección con HIV.

Ensayos y Resultados Con el fin de ver si el suero de cabra tenía algunas propiedades inflamatorias, lo agregamos a reacciones formadas mezclando las células de dos in dividuos diferentes con antecedentes genéticos diferentes. Para nuestra sorpresa fue extremadamente efectivo al in hibir esta reacción. Usando un gran número de anticuerpos molecu lares, fuimos capaces de ver que el único anticuerpo que llegó cerca de la reactividad de la cabra fue u n anti-H LA Clase I I . Los anticuerpos anti-Clase I redujeron esta reacción solamente de manera parcial. De gran interés es q ue los anticuerpos para la hélice de H IV V3 j uzgada por la mayoría de la comun idad científica que es el objetivo principal para un a vacuna, hace actualmente esta pan-activación peor. Este h allazgo podría ajusfar con la teoría de activación in mu ne a medida que la respuesta in mune al virus da crecimiento real mente y estímu lo al virus para "des pegar" y esto pod ría explicar porque las vacunas apuntadas a esta región son tan inefectivas . Teniend o en mente q ue las propiedades mágicas han sido adscritas con frecuencia a cabras y ese suero de otros anima les puede tener inesperada mente una actividad en ensayos específicos , obtenemos sueros de cabras no vacunadas que no tienen ninguna actividad . Tuvimos desp ués sueros adicionales de diferentes cabras con programas de vacunación diferentes. Para nuestra sorpresa podemos mostrar q ue estos sueros solamente ven la envoltura de HIV y HLA Clase II. De hecho, porciones más pequeñas del virus las cuales se conocen por tener una homología significativa con HLA no son vistas por los sueros. Por lo tanto, nos sorprendimos extremadamente de ver una mayor diferencia entre la inyección del cóctel y una inyección de aislado, porque el repertorio de regiones de HLA conservadas en la GP120 son reconocidas activamente por sueros de la cabra inyectada con el cóctel.

La interpretación de esta información se resume por el hecho de que cabras inyectadas con HIV produjeron un anti-MHC Clase II fuerte como respuesta que puede ser ampliada utilizando aislados diferentes. La interpretación posible de cómo sucede esto es como sigue: (1) La envoltura de HIV es tan similar a HLA Clase II que se reconoce como tal por el sistema inmune de las cabras que tiene un repertorio de HLA completamente diferente. (2) La segunda posibilidad es que en el inmunógeno, es decir, la preparación del virus, el HLA que se asienta sobre la superficie de las células a través de las cuales brota el virus, va a ser recogido y que la respuesta inmune no es para el virus, sino para el HLA co-asociado. (3) La tercera explicación involucra una combinación de las dos explicaciones anteriores. Es posible que el virus que brota se ha fusionado con HLA como se prepara y que esta combinación es vista muy fuertemente por los sueros de cabras. Un reporte reciente muestra que a menos que el virus brote a través de una célula con HLA e incorpore el HLA a la membrana entonces el virus permanece no infeccioso. Esto significa que debe tener algo de HLA derivado de la célula huésped para activar el mecanismo de entrada a la célula. Aquí hemos mostrado que las cabras- inyectadas con preparaciones de HIV hacen una respuesta fuerte de anticuerpo a la molécula de HLA Clase II. Es sabido que un número de enfermedades producen lesiones inflamatorias destructivas simplemente porque las células involucradas sobreexpresan HLA Clase II. Aunque muchos tipos de enfermedad autoinmune comparten esta propiedad, uno de ios mejores ejemplos conocidos es el de la esclerosis múltiple. Puede ser, por lo tanto el caso donde la respuesta inmune de la cabra rompe la tolerancia para esas moléculas y que este proceso pudiera permitir que ocurriera un fuerte proceso anti-inflamatorio in vivo el cual podría estar asociado con un beneficio clínico. Habrá ventajas obvias si este fuera el caso del uso de esteroides en altas dosis a largo plazo si la administración crónica del suero de cabra está libre de efectos secundarios significativos. La respuesta de anti-HIV que es fuertemente anti-HLA Clase II bien puede proporcionar un vínculo vital como el requerimiento verdadero de una vacuna anti-SIDA y es nuestra intención disecar esta respuesta para producir una vacuna HIV candidata.

Sueros de Cabra Inmunizada con HIV-1 y Propiedades Anti-inflamatorias. Introducción Se proporcionaron sueros de cabra de animales Inmunizados con lisado viral HIV-3B o un cóctel viral de NIH de seis diferentes aislados de VHI-1. Algunos de los sueros había sido usado previamente como parte de regímenes de tratamiento experimental para buen efecto, sin embargo el mecanismo mediante el cual actúa es desconocido. Para determinar un mecanismo de acción revisamos los sueros en placas de ELISA contra HIV-1 gp120, HLA-DR1 y péptidos seleccionados de diferentes regiones de la glicoproteína de la superficie del virus, algunos teniendo homología de secuencia con HLA.

Materiales y Métodos Sueros y Anticuerpos Se proporcionaron muestras de los sueros de cabra inmunizada con H1V-3B que habían sido usados para tratamiento de pacientes junto con muestras de un número de lisados virales de HIV-3B de cabras inmunizadas (animales # 0125, # 0126, # 0127, # 0128, # 0129 inmunizados el 14 de septiembre de 1999, 21 de septiembre de 1999 y otra vez en el 29 de septiembre y 07 de noviembre de 2000) así como también información concerniente a las fechas de sangrado e inmunización. Para el ELISA, simplemente escogemos revisar muestras de sueros tomadas de los sangrados de producción en las etapas tardías (30 de noviembre de 2000 y 01 de diciembre de 2000). El animal # 378 fue inmunizado con un cóctel viral de NIH que consiste de los siguientes aislados de HIV (92HT593, 92US657, 92US660, 92US714, 92US723, 91US056). Las inmunizaciones se realizaron en el 7 y el 28 de noviembre. Se usaron sueros tomados de un sangrado de producción del 25 de enero de 2001 para revisión con ELISA. Los sueros de cabra de control se proporcionaron también. Junto con los sueros incluimos HLA-DR anti-humano y HLA-DR anti-humano, DP y DQ (Pharmingen) en ambos estudios de ELISA y reacción de Linfocito Mezclado e IgG anti-gp120 de ratón (EVA 3047) específico para el dominio V3 de HlV-i MJb (IRIQRGPGR) obtenido del Dr. J. Laman a través del Dr. Harvey Holmes (programa de reactivos MRC para SIDA, Instituto Nacional para Estándares Biológicos y Control, Potter's Bar, RU) durante el estudio de MLR.

Péptidos y Proteínas Se produjo HlV-i IIIB gp120 recombinante en células de ovario de hámster chino y proporcionado por el Dr. J. Raina vía el Dr. Harvey Holmes en el programa de reactivos para SIDA MRC. El HLA-DR 1 recombinante fue la misma proteína proporcionada por el Prof. Don C. Wiley usado durante experimentos de aglutinación de péptidos. Los péptidos de HIV-1 usados en el estudio están listados en la Tabla 1. Los péptidos ARP7022, ARP7 10, ARP740-23, -28, -42, -44, -45, -46 y -47 se obtuvieron del Dr. Harvey Holmes en el programa de reactivos para SIDA MRC. El péptido P12 de control representa una secuencia revuelta de la región CS de HIV-1 gp120 y se proporcionó por el Prof. E. F. Hounsell, Escuela de Ciencias Biológicas y Químicas, Birkbeck College, Londres, RU. Los péptidos se almacenaron en alícuotas a -20° C hasta su uso.

ELISAS Se realizaron ELISAs siguiendo un protocolo similar al descrito por Brown y colaboradores (métodos J. Immunological 1997, 200:79-88). Se mezclaron péptidos y proteínas con 0.05 M, pH 9.6, amortiguador de aglutinación de carbonato/bicarbonato a 16 g/ml· y 1 µ?/?t?? respectivamente y recubiertos en duplicado sobre placas de Microtitulación de Alto Aglutinamierito Immulon 4 LIBX (Dynex Technologies, INC. 14340 Sullyfield Circle, Chantilly, VA 20151-1683, EUA) durante una noche a 40° C. Los pozos se bloquearon usando 5 mg/ml de caseína en PBS y dejados una noche a 40° C. Se diluyeron sueros de cabra 1/500 y 1/1000 veces en PBS/0.25% de caseína mientras que anticuerpos purificados se diluyeron 1/1000 y 1/3000 veces respectivamente y se incubaron durante 1 hora a 37° C. Los pozos se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20 al 0.05% usando una máquina Wellwash 4 (Denley). Se detectaron anticuerpos de cabra inmovilizados usando peroxidasa conjugada con Anti-Cabra Monoclonal de Ratón/clon de IgG de Oveja GT-34 (SIGMA) diluido 1/1000 en PBS/Caseína al 0.25%/Tween 20 al 0.01% y anticuerpos anti-HLA detectados usando una peroxidasa conjugada de IgG anti-ratón de cabra (SIGMA) incubado durante 1 hora a 35° C. Enseguida de otra ronda de lavados, se incubó substrato de dihidrocloruro de O-fenilendiamiría preparado recientemente (OPD; SIGMA) en los pozos a temperatura ambiente en la oscuridad y las reacciones se detuvieron después de 15 minutos mediante la adición de 50 µ?/???? de H2S04 2.5 M. Se midieron los valores de OD a 492 nm usando un Lector de Microplaca.

Tabla 1. Péptidos Usados Durante los Ensayos ARP7022: (DQQLLGl WGCSGKLICTTAVPWNC) 24 Residuos de péptido de una región conservada de HIV gp41 (593-616) reconocidos por la mayoría de los sueros HIV positivos Europeos y Africanos. Péptido de control. ARP710: (VKIEPLGVAPTKAKRRVVREKR) 23 Residuos de péptido derivados del dominio C-terminal (CS) conservado de HIV gp120 (486-508) que conducen al sitio de escisión gp120/41. Contiene homología estructural con HLA. ARP740/23: (RPVVSTQLLLNGSLAEEEVV) 20 Residuos de péptido derivados de la región C2 de gp120 (252-271). Contiene homología de secuencia con la hélice V3 de HIV-1 gp120. ARP740/28: (NTRKRIRIQRGPGRAFVTIG) (302-321) 20 residuos de péptido derivados de la hélice V3 HIV-1 gp120. ARP740/42: (GQIRCSSNITGLLLTRDGGNS) (438-458) Contiene homología con la cadena DR-ß?. ARP740/44: (NNESEIFRLGGGD RDNWRS) (459-478) Contiene homología de secuencia con HLA-A2. ARP740/45: (GQDMRDM WRSELYKYKVVKI) (469-488) Secuencia reconocida por M38, un anticuerpo que reacciona en cruz con HLA-C y la región C5. ARP740/46: (ELYKYKVVKIEPLGVAPTKA). (469-478) 20 residuos de péptidos derivados del término C5 de gp120. Contiene los primeros tres residuos de homología en el término C. ARP740/47: (EPLGVAPTKAKRRVVQREKR) (479-498) 20 residuos de péptido derivado de la región C5 de gp120. Contiene homología estructural con HLA. P12. (RAKTVERKVERRK) Secuencia revuelta del dominio CS de HIV gp120 suministrada por E. Hounsell. No reconocida por sueros WV positivos. Secuencia de control.

Ensayos de Inhibición de Reacción de Linfocitos Mezclados Donadores de Sangre Se proporcionaron muestras de sangre no igualadas de HLA Clase II con el consentimiento de donadores a través de Liz Buckland del Servicio de Transfusión de Sangre de South Thames, Tooting, Londres.

Preparación de PBMC Sangre venosa recién extraída se diluyó en Solución de Sal Equilibrada de Hanks (HBSS; SIGMA), yuxtapuesta cuidadosamente en Histopaque (SIGMA) y se centrífugo a 800 g durante 25 minutos a 20° C. Los PBMCs se cosecharon a partir de la interfase de densidad con una pipeta de Pasteur, se lavaron tres veces en HBSS y se contaron usando un contador de Beckman Coulter.

Ensayos de Inhibición de Linfocitos Mezclados Para un MLR dado, se resuspendieron en PBMCs de dos HLA Clase II individuales no igualados en medio RPMI 1640. que contiene sueros AB humanos inactivados por calor al 10% (SIGMA), L-glutamina 4 nM, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml) (SIGMA) y diseñados para células ya sea estimuladoras o de respuesta. Las células fueron enchapadas en triplicados con estimuladores en 1 x células/pozo y de respuesta a 1 x 10 ~ células/pozo para dar una relación de respuesta-estimuladoras de 10:1. Para determinar cualesquiera efectos inhibidores sobre proliferación de células exigidos por los sueros de cabra y varios anticuerpos, se agregaron 3 µ? de sueros de cabra sin diluir o 1 µ? de anticuerpo purificado a los pozos que contienen los cultivos de células mezcladas y se incubaron a 37° C en C02 al 5% durante 6 días. Los cultivos se impulsaron con 1 µ?? de metil-trimidina tritiatada (3H-Thd; Amersham) én el día 5, 18 horas antes de la cosecha de células. Se cosecharon células usando un cosechador de células Tomtec Harvester 96 Mach III sobre esterillas de filtro de fibra de vidrio e incorporación de 3H-Thd medidas usando un contador de destello de microbeta para líquido Wallac 1450. Los resultados se muestran como conteos medios por minuto (cpm).

Resultados Anticuerpos Anti-HLA Clase II Presentes en Sueros de Cabra Investigamos el grado hasta el cual los diferentes sueros de cabra podrían reconocer péptidos de HIV-1 gp120 tomados de diferentes regiones a través de HIV-1 gp120, muchos soportando homología de secuencia y estructural con HLA (Tabla 1). También incluimos HIV-1 gp120 y HLA-DR1 solubles en estos ensayos. Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 9. Bg representa niveles de origen. Se tomó un nivel OD por arriba de 0.1 como un resultado positivo dada la carencia de reactividad para cualquiera de los antígenos vistos con los sueros pre-inmunizados. Los sueros diferentes dieron resultados variables, pero apuntaron generalmente hacia una tendencia para reaccionar con HLA-DR1. Los sueros pre-inmunizados no fueron reactivos con ninguno de los péptidos o proteínas filtrados, y los sueros # 0125 y # 0126 no muestran ninguna gran reactividad. Sin embargo, todos los otros sueros demostraron altos niveles de reactividad con HLA-DR1, en particular # 0127 y # 0128 que tuvieron muy alta reactividad. La reactividad para HLA-DR1 se compara en la Figura 9 junto con HLA-DR anti-humano y HLA DR, DQ y DP antihumano para claridad. La actividad de anti-HLA es de interés por la razón de que representa posiblemente la mayor actividad contra las moléculas de HLA de las mismas células en que se cultivó el virus antes de la inmunización. Como el HIV tiende a arrastrar consigo más moléculas de HLA en su envoltura de las que expresan las moléculas de gp120, particularmente moléculas de HLA Clase II las cuales regulan en las células, la actividad combinada de anti-gp120 y anti-HLA Clase II puede ser lo que represente una buena respuesta protectora para HIV. Puede ser el caso de ciertos sueros, particularmente # 0127 y # 0128, que se indujo una fuerte respuesta "allo"-en estas cabras a través de inmunización con virus que llevan altos niveles de moléculas de Clase II en su superficie. Los sueros # 0378 de la cabra inmunizada con el cóctel viral NIH demostraron la mejor reactividad cruzada de toda la ronda para péptidos HlV-i múltiples con niveles anti-HLA DR1 aproximadamente iguales a los sueros de cabra anti-LILV originales que sugiere que estos sueros podrían funcionar mejor globalmente contra HIV. Estos sueros reaccionan muy bien con un rango de péptidos HIV-1 que tienen homología con HLA. Ninguno de los sueros reaccionaron con la secuencia P12 de control revuelta lo qué demuestra que la reactividad fue específica para los péptidos LIIV. Los sueros # 0127 y # 0128 representan los mejores sueros en términos de aglutinación a HlV-i gp120 mientras que contienen cantidadés muy elevadas de actividad anti-HLA DR.

Inhibición de MLR Mediante Sueros de Cabra Con los MLRs de las Figuras 10 y 11 usamos células de individuos no igualados al azar. Aunque éstos no producen necesariamente la mayor proliferación (en el momento había problemas con el medio), la tendencia pareció demostrar la inhibición de la proliferación durante MLRs mediante sueros de cabra (sueros inmunizados HIV-3B originales usados en cada caso). Subsiguientemente empezamos a usar células no igualadas de HLA-Clase II (Figura 12) que produjeron mejor proliferación. Como con el anticuerpo anti-HLA DR, los sueros de cabra tienen éxito en inhibir completamente la proliferación celular y pudiera aparecer que tienen actividad anti-inflamatoria. Juzgando por lo que hemos visto de los resultados de ELISA, es altamente probable que los anticuerpos anti-HLA DR sean responsables de los efectos inhibidores. Hacemos hincapié en el papel de anti-HLA DR en lugar de anti-Clase II como un todo como parece que el anticuerpo de amplio rango no inhibe la proliferación en ningún lugar cercano tan efectivamente como el anti-HLA DR solo. Porqué puede suceder esto, es misterioso, sin embargo, podría ser que HLA-DR representa el antígeno jefe de Clase II involucrado en actividad inflamatoria y anticuerpos contra éste pueden resultar en la señalación en células para inhibir la replicación. Los sueros de cabra podrían parecer, por lo tanto que actúan como un agente anti-inflamatorio, que suprimen la proliferación celular. Esto podría ser predecible de una producción positiva en el caso de infección con HIV-1 donde la activación celular inducida por virus es esencial para la replicación del virus. Aunque en la superficie puede parecer contraproducente, la introducción de un agente inmunosupresor suave podría actuar para inhibir la replicación del virus y controlar la enfermedad como HIV, a diferencia de los retrovirus relacionados HTLV- o HTLV-2, no inmortaliza las células y causa cáncer de manera que es enteramente dependiente de la activación celular para proliferación. Hasta la fecha no se ha identificado un superantígeno de células T conocido para HIV lo que conduce al punto de cómo un virus que apárece equipado con enfermedad relativamente para activar las células que infecta puede controlar la situación para causar enfermedad. Estamos investigando la teoría de que la alloactivación inducida por virus está en la raíz, sea asociado con las moléculas de HLA virales asociadas o el mimetismo molecular visto entre HIV y HLA. Los sueros de cabra contribuyen posiblemente al bienestar del paciente simplemente limitando esta pan-activación. Se han hecho observaciones a lo largo de líneas similares en un documento por Saifuddin M. y colaboradores (Clin.Exp. Immunology 2000, 221: 324-331) quien demostró la importancia de moléculas de HLA Clase II, en particular HLA-DR, en replicación viral. Notaron que los anticuerpos para moléculas HLA Clase II inhibían la expresión del virus en células de expresión Clase II y sugirieron el involucramiento del transactívador MHC Clase II inducible (CUTA) en el mejoramiento de la transcripción de HIV-1. Podríamos estar viendo efectivamente estos efectos en el caso de los sueros de cabra. Tomar esto en comparación con el anticuerpo de hélice anti-V3, el cual causa la proliferación incrementada y por lo tanto podría ser contraproducente en el esquema global de las cosas. La región de hélice V3 altamente variable de gp120 no solamente permite mutantes de escape viral, sino actúa también como un señuelo para el sistema inmune para rondas adicionales de activación. Desafortunadamente la preocupación con esta región es benéfica finalmente para el virus y mantiene la respuesta inmune lejos de regiones más conservadas, contra las cuales la actividad podría ser más útil. Si los efectos anti-inflamatorios son de hecho el modo principal de actividad de los sueros, de lo que podría ser útil para una variedad de otras condiciones donde la hiper-actividad y proliferación celular están en la raíz de los síntomas de la enfermedad, por ejemplo esclerosis múltiple. Para futuros experimentos es importante repetir los ELISAs para todos los sueros para confirmar la extensión de la actividad de anti-HLA y gp120. En este caso estamos muy interesados en los sueros # 0378 del animal inmunizado con el cóctel viral NIH ya que reacciona efectivamente con muchos de los péptidos de HIV que tienen homología con antígenos de HLA así como también HLA-DR1.

Experimentos Adicionales Los siguientes datos vienen de experimentos similares a aquellos previamente asumidos, donde identificamos anticuerpos de anti-HLA en los sueros de cabra que han sido usados como una forma de tratamiento para voluntarios que sufren de esclerosis múltiple y SIDA cuando la terapia convencional ya no fue adecuada. Nuestro trabajo involucra investigar un mecanismo propuesto de acción anti-inflamatorio para los sueros de cabra en la recuperación de estos pacientes enseguida del tratamiento. Esto se propuso previamente cuando se notaron los anticuerpos anti-HLA. Sin embargo, ahora agregamos un papel para los anticuerpos anti-FAS presentes en los sueros de cabra, dada su habilidad para inducir apoptosis en horas a células que expresan el receptor de FAS. FAS/APO- (CD95) está presente notablemente en cantidad elevada en linfocitos activos, señalando a través de lo que puede inducir que esa celda cometa suicidio enseguida del entrelazamiento con cualquiera FAS-ligando o un anticuerpo anti-FAS. El papel de estas moléculas es extremadamente importante no solamente en la respuesta inmune citotóxica para matar células infectadas, sino también en la desregulación de la respuesta inmune después que el antígeno ha desaparecido para evitar la proliferación constante de células que podría ser perjudicial para el huésped. Por lo tanto, esta trayectoria es considerada vital para el mantenimiento de una respuesta inmune equilibrada. En el caso de infección por HIV, el sistema inmune se ve que es anormalmente activo dando mucho espacio para la replicación viral como lo requieren las células activadas para este proceso. En pacientes con esclerosis múltiple, las células altamente activadas cruzan la barrera de sangre del cerebro y son responsables del daño a la funda de mielina, resultando en formación de placas y pérdida de función neural. El mecanismo anti-inflamatorio mediado a través de la actividad de anticuerpos anti-HLA (por lo menos anti'-HLA DR) presentes en los sueros de cabra podrían ser el mecanismo detrás de la recuperación del paciente. Ahora hemos encontrado anticuerpos anti-FAS presentes en los sueros de cabra en grados variables y propuestos para combinar los papeles de anticuerpos anti-HLA y anti-FAS en este mecanismo antiinflamatorio propuesto para el modo de actividad en ambos pacientes de esclerosis múltiple y SIDA. Proponemos que estos anticuerpos están apuntando a la mayoría de células altamente activas que resultan en su muerte mientras que los anticuerpos anti-HLA apagan cualquier actividad inmune. Podría seguir entonces la producción de citocina y quimocina reducida dramáticamente resultando en la terminación del ataque inmune en la mielina en el caso de esclerosis múltiple o carga viral reducida en el caso de pacientes infectados con HIV dada la carencia de células activadas y la muerte de células secretoras o a punto de secretar virus.

Trabajo Experimental Empezamos a buscar anticuerpos anti-FAS dadas las observaciones de que los sueros de cabra de los respondedores fueron dañando las células cuando se agregaron a reacciones de linfocitos mezclados (MLRs). Las LRs son el resultado de linfocitos de dos personas diferentes con tipos diferentes de HLA que reaccionan en una manera no específica resultando en proliferación de linfocitos y rotación incrementada. Sentimos que este es un buen sistema para probar anticuerpos anti-inflamatorios ya que las reacciones auíoinmunés están todas apuntadas a expresar mapropiadamente péptidos propios en moléculas de HLA Clase 2. Las Figuras 13 a 16 son fotos tomadas de algunas MLRs recientes, con y sin sueros. La Figura 13 es una foto de una reacción de linfocitos mezclados después de 72 horas. La Figura 14 es una MLR mezclada con sueros pre-inmunizados seguidos por 72 horas. En todos los casos no hay cambios significativos a partir de aquel con la MLR misma. De hecho, los sueros pre-inmunes promueven la MLR. La Figura 15 es una MLR con suero # 0125 agregado. Este suero viene de una cabra que fue considerada que no da respuesta a la inmunización en que estuvieron presentes anticuerpos HLA y/o FAS bajos o despreciables, algo que correlacionó con nuestros resultados previos de ELISA cuando identificamos anti-HLA DR en los respondedores.

La Figura 16 es una MLR con suero # 0127 agregado, que ha demostrado ser un muy buen respondedor. Hay una destrucción celular significativa de muchos de las PBMCs en la M LR. Este resultado es similar para todos los respondedores fuertes junto con la preparación de suero que se usa normalmente para tratamiento. Decidimos b uscar un anticuerpo capaz de inducir la destrucción de cél ulas altamente activas, como pod ría ser el caso en una M LR. Por lo tanto , buscamos la presencia de un anticuerpo co ntra FAS que pudiera ser capaz de entrelazarse con el receptor de FAS e in ducir las señales necesarias para que ocu rra la apoptosis . En consecuencia, realizamos un ELISA contra FAS que demostró la presencia de tales anticuerpos e n el suero de las cabras que fueron considerados los mejores respond edores y q ue complementaron los resultados previos con los anticuerpos anti-H LA. Estos resultados, ju nto con n uestra información previa , se corre lacionan bien con lo que hemos visto en nuestros resultados de M LR con la proliferación celular reducida q ue es debida a la destrucción celular. A partir de resu ltados recientes de E LISA emprend imos la identificación de posibles componentes activos adicionales en el su ero de cabra que ha sido usado como una forma d e tratamiento por voluntarios que sufren de esclerosis mú ltiple (MS) y SI DA donde ya n o es adecuada la terapia convencional. Más abajo los resultados de un filtro ELISA a una dilución de 1 en 1 000 del suero preinmu nizado. Los antígenos filtrados son Ovalbúmina, HLA-DR1 (DR1), Fas, réceptor p75 de factor de crecimiento de nervio (NGFr), receptor de serotonina (Ser R), receptor de dopamina (Dop R), CXCL 10 y Monocina inducida mediante interferon-gama (MIG). Ya es aparente que el anticuerpo para el receptor de dopamina está presente en altas concentraciones en el suero mientras que no hay actividad para cualquiera de los otros antígenos. Sin embargo, hay actividad contra muchos de esos antígenos en el suero 3B original, que ha sido usado previamente para tratamiento, y suero 0127 producido a partir de una cabra inmunizada con HIV lllb producido en una línea de células T, incluyendo actividad contra NGFr, el receptor de dopamina y CXCL10. La actividad contra HLA y FAS es otra vez aparente y se mantiene con el mecanismo anti-inflamatorio que ya hemos propuesto. Continuando con este tema podríamos ahora agregar actividad contra el CXCL10 y el receptor p75 de factor de crecimiento de nervio (NGF R p75). El anti-suero contra CXCL10 ha mostrado recientemente que es benéfico mediante la reducción enorme de la severidad de la enfermedad en un modelo murino de esclerosis múltiple a través de la reducción de células T CD4+ e invasión de macrófagos de CNS, disminuyendo la expresión de la citocina IFN-? TH1 e incrementando la remielización. Esto es interesante dado que las células locales en lesiones inflamatorias producen comúnmente CXCL10 que aglutina y atrae células inflamatorias TH1 vía el receptor GXCR3. Por lo tanto, la neutralización de esta quimocina o el bloqueo de su receptor por anticuerpos en el suero de cabra bien podría ser parte del mecanismo anti-inflamatorio de acción que hemos propuesto para el suero de cabra. Mientras tanto anticuerpos para el receptor NGF R p75 de factor de crecimiento de nervio están asociados con la muerte celular en monocitos y macrófagos infectados con HIV a través del bloqueo de NGF para que alcance el receptor, lo cual representa otra vez otro mecanismo anti-inflamatorio. Hemos encontrado de interés los niveles más fuertes de anticuerpos contra estos receptores que están presentes en el suero 0378 producido a través de cabras de inmunización con un cóctel de 6 diferentes virus de HIV producidos principalmente en PBMCs en lugar de células T solas. La actividad permanece muy alta aún con una dilución de 1 en 4000. Por lo tanto, agregamos la actividad contra estos antígenos, conservando el mecanismo anti-inflamatorio de acción propuesto para el suero en el caso de ambas enfermedades. También agregamos actividad a los receptores de dopamina y de serotonina como responsables de la sensación de bienestar asociado con el tratamiento. Filtramos muchas cabras nuevas (707-718) que habían sido vacunadas recientemente con el HIV junto con el suero preinmune de estas cabras. Aunque ninguna de ellas mostró anticuerpos contra el receptor de dopamina como el suero preinmune original mostrado anteriormente, algunas de las cabras tienen un promedio en un nivel superior de tal anticuerpo en comparación con las cabras de Gales las cuales nunca recibieron contra la rabia. Los niveles más altos vistos en la muestra preinmune original podrían ser debidos a la exposición a algunos factores ambientales en algún momento en el pasado seguido por una fuerte respuesta.

Inmunógeno Alternativo En una variación más, no es necesario el uso de virus HIV como inmunógeno para dar el anticuerpo, y se emplean células blancas de la sangre humanas como inmunógeno para dar una preparación de anticuerpo efectiva. La Figura 30 proporciona perfiles para sueros de cabras inmunizadas con el cóctel de HIV, y con células blancas de la sangre humana designadas SHULA.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Ei uso de un anticuerpo anti-HLA en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad que involucra una respuesta inmune proliferante.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-HLA es anticuerpo anti-HLA de cabra.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo anti-HLA de cabra es originado por reto mediante HIV.

4. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el anticuerpo es policlonal.

5. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el anticuerpo tiene actividad anti-HLA y anti-HIV.

6. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el medicamento es para tratamiento de HIV, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, daño axonal o de nervio o de daño relacionado o cánceres y otras enfermedades o condiciones con un componente inflamatorio.

7. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el anticuerpo anti-HLA está presente con anticuerpo contra uno o más de FAS, receptor de dopamina, receptor de serotonina, receptor p75 de factor de crecimiento de nervio y la quimocina CXCL10 (IP10).