KR20090046970A - 폴리클론항체 항-ｈｉｖ 산양 혈청의 치료제로의 용도 - Google Patents

폴리클론항체 항-ｈｉｖ 산양 혈청의 치료제로의 용도 Download PDF

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Abstract

HIV 항원 물질의 주입이후에 항-HLA 및 기타 항체가 산양 혈청에 존재하고, 상기 혈청은 HIV, 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 다른 신체이상에 대한 매우 놀라운 효과적인 치료를 위한 주약(basis)을 제공한다.

Description

폴리클론항체 항-ＨＩＶ 산양 혈청의 치료제로의 용도{Use of Polyclonal Anti-HIV Goat Serum as a Therapeutic Agent}
본 발명은 치료제, 배타적으로 제한되는 것은 아니나 구체적으로는 증진된 면역반응을 수반하는 질병 치료를 위한 치료제에 관한 것이다.
WO 제97/02839호는 바이러스 감염의 바이러스 억제, 치료 및 예방에 관한 것이다. 상기 발명은 하기의 단계를 포함하는, 바이러스 감염된 환자의 치료를 위한 중화항체(neutralizing antibody)의 생산방법을 제공한다.
a. 포유동물을 바이러스에 노출시켜 상기 포유동물이 상기 바이러스에 대한 중화항체를 생산하는 단계; 및
b. 상기 포유동물로부터 상기 중화항체를 수집하는 단계.
WO 제01/60156호는 중화항체 및 면역조절을 증진시키는 조성물(immunomodulatory enhancing composition)에 관한 것이다. 상기 발명은 항원에 특이적인 이종(heteologous) 항체; 및 항원을 포함하는 면역조절 조성물을 제공하며, 상기에서 이종 항체는 약학적 담체와 결합으로 상기 항원과 복합체를 형성하는 것을 특징으로 한다. 상기 발명의 실시예는 WO 제97/02839호의 실시예와 유사하고, 다시 HIV 바이러스와 산양(goat)에서 얻은 HIV 중화항체를 혼합함에 의하여 AAV2로 명명된 HIV 백신이 제조된다.
WO 제02/07760호는 치료제에 관한 것이다. 상기 발명은 하기의 단계를 포함하는, HIV 감염의 예방 또는 HIV에 감염된 개체의 치료방법을 제공한다.
(1) HIV에 산양 면역 시스템을 노출시키는 단계;
(2) HIV 감염이후에 산양으로부터 항체를 정제하는 단계; 및
(3) 상기 단계 2에서 제조한 항체로 개체를 치료하는 단계.
WO 제02/7760호의 항체 산물을 주제로 사용하는 예비 임상시험에서, HIV에 감염된 산양 혈청(serum)을 사용하여 HIV에 감염된 환자들을 성공적으로 치료하였다.
바람직하게는 상기 치료는 산양에서 유효 항체 수의 증진을 수반하는 단계, 상기 산양으로부터 혈액을 채취하는 단계, 상기 채취된 혈액의 HIV 중화능력을 입증하는 단계, 상기 혈액으로부터 고형물을 이전하는 단계, 과포화된 암모늄 설페이트(ammonium sulphoate) 또는 다른 적당한 침전제를 사용하여 상기 고형물을 침전 시키는 단계, 상기 침전물을 분리하는 단계, 적당한 수용성 매개체에 상기 침전물을 용해시키는 단계, 및 5 내지 50,000 달톤(dalton), 바람직하게는 7 내지 30,000 달톤, 보다 바람직하게는 8,500 내지 15,000 달톤, 특히 약 10,000 달톤의 차단(cut-off)으로 상기 용액을 투석(dialysis)하는 단계로 이루어진 방법에 의하여 제조될 수 있는 혈청 조성물을 이용한다. 상기 산양 면역방법은 근육내 투여(intramuscular adminstration)로 이루어질 수 있으나, 피하투여(subcutaneous adminstration) 또는 피내투여(intradermal adminstration)와 같은 기타 다른 표준적 기술이 또한 사용될 수 있다. 전체 잔류물(total residue)이 사용된다면, 상기 정제 과정은 또한 다른 통상적으로 사용되는 분별작용(fractionation action) 방법(예를 들면, 카프릴산(caprylic acid))에 의하여 완결될 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 치료는 통상적으로 하기의 방법에 의하여 제조된 산양 혈청을 이용한다.
본 발명은 HIV 항원 물질의 주입 이후 항-HLA 및 기타 항체가 산양 혈청에 존재한다는 것을 밝히고, 상기 혈청을 이용하여 HIV, 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 다른 신체이상에 대한 매우 놀라운 효과적인 치료를 위한 주약(basis)을 제공한다.
산양 혈청의 생산예
HIV-3b를 ㎖당 109 바이러스 입자의 농도로 근육내 주사를 사용하여, 통상의 상업적 상청액에 현탁된 HIV-3b 바이러스 여액을 근육내 주사에 의하여 산양에 접종하였다. 접종 전에 상기 바이러스를 30분 동안 60℃에서 가열시켜 사멸시켰다. 최초의 측정에 있어서, 적당한 간격 예를 들면 2주 이후에 혈액 시료를 채취하였다. 최적의 절차에 있어서, 4주 동안 매주 상기 바이러스를 상기 산양에 접종하고, 이어서 6주 동안 상기 산양으로부터 혈액을 채취하여 상기 시약을 제조하였다.
멸균기법을 사용하여 상기 산양으로부터 대략 400 ㏄의 혈액을 채취하였다. 주사 추출을 위한 부위를 면도하고, 베타딘(betadine)으로 준비하였다. 상기 동물로부터 대략 400 ㏄의 혈액을 채취하기 위하여, 18-게이지 주사를 사용하였다. 주목할 점은 상기 동물에게 어떠한 부당한 영향을 끼치지 않고도 상기 동물은 대략 400 ㏄의 혈액이 채취되는 것을 견뎌낼 수 있다는 것이다. 상기 동물은 결코 희생될 필요가 없다. 이어서, 상기 동물은 혈액량을 보충한 이후, 대략 10 내지 14일 뒤에 다시 혈액이 채취될 수 있다.
잠재적으로 유용한 항체가 존재함을 확인하였다. 일단, 상기 시약의 존재를 확인하고, 이어서 4-6주 사이에 상기 산양으로부터 혈액을 채취하고, 원심분리를 통하여 혈청을 분리하였다. 이어서, 300 ㎖의 혈청을 여과하여 커다란 응혈(clot) 및 부유성 고형물(particulate matter)을 제거하였다. 이어서, 과포화된 암모늄 설페이트(실온에서 45%의 용액)로 상기 혈청을 처리하여 항체 및 기타 물질을 침전시켰다. 그 결과로 생성된 용액을 5분 동안 5,000 rpm에서 원심분리하고, 그 뒤에 상청액을 제거하였다. 침전된 면역글로블린 항체(immunoglobulin)를 인산-완충 식염수(phosphate-buffered saline, 이하, 'PBS 완충액(buffer)'이라 칭함)에 재현탁시킴으로써, 용이하게 침전물을 재용해시켰다(Sambrook, et al., 'Molecular cloning, A Laboratory Manual', 1989).
이어서, 10,000 달톤의 분자량을 차단하는 멤브레인(membrane)을 이용하여 상기 용액을 투석하였다. 24시간 동안 4시간 간격으로 완충액을 교체하며, PBS 완 충액에서 투석을 수행하였다. 투석은 4℃에서 수행하였다.
24시간 동안의 투석이후에, 상기 투석백(dialysis bag) 내의 내용물을 멸균된 비이커(beaker)로 옮겼다. 상기 용액의 단위 부피당 질량 = ㎖당 10 ㎎이 되도록 조정하였다. 상기 희석은 PBS를 사용하여 수행하였다. 이어서, 그 결과로 생성된 용액을 0.2 ㎛의 여과기를 통하여 멸균된 용기로 여과시켰다. 여과 이후에, 상기 용액을 1 ㎖의 단일 투여량으로 분할하고, 사용 전까지 -22℃에 보관하였다.
이제 상기 시약은 즉시 사용가능하다.
상기 절차에 있어서, 예를 들면 암모늄 설페이트 농도의 변화 또는 상기 시약 변동에 의한 변화가 있을 수 있다. 유사하게, 상기 투석 차단은 반드시 10,000 달톤에서 이루어질 필요는 없다.
본 발명
상기 산양 혈청을 사용한 치료의 일부분으로서, 다른 유익한 결과가 있음을 주목할 필요가 있다. 예를 들면, 타입 I 당뇨병(diabetes)을 갖고 있는 HIV 환자에 있어서, 이들의 근원적 HIV 감염뿐만 아니라 당뇨병 증후군에 대한 상기 질환의 호전에 대해서도 주목하여야 한다. 어떠한 종류의 암 질환을 갖고 있는 HIV 환자 에 있어서, HIV 증후군뿐만 아니라 상기 암의 재발도 유의하여야 한다.
다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 일부 암 질환과 같은 다양한 신체 이상을 갖고 있는 환자뿐만 아니라 HIV로 감염된 환자에 있어서도 현저한 임상적 호전이 발견됨으로써, 이러한 모든 질환이 만성적 염증상태(chronic inflammatory state)와 잠재적으로 연결되어 있음을 의미한다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 산양 혈청의 활성이 항-HLA 활성의 존재로 잔존하고 있음을 관찰하였다.
놀랍게도, 본 발명자들은 HIV 면역된 산양이 실험실 조건(in vitro)에서 사용되는 고전적 활성화 분석의 하나인 혼합된 림프구(lymphocyte) 반응분석을 차단시키는(to switch off) 혈청을 생성함을 용이하게 입증할 수 있었다. 이것이 산양 혈청의 일부 선천적 특성일 수 있음을 고려한다면, 상기 주사되지 않은(non-injected) 산양 혈청은 상기 분석에서 어떠한 활성도 없음은 본 발명자에게 매우 인상적이었다.
또한, 본 발명자들은 상기 활성이 HLA 클래스 Ⅱ 항체에 대한 활성과 밀접하게 연관되어 있음을 입증하였다. 이것이 분자 의태(mimicry) 반응을 나타내는지, 또는 바이러스가 감염된 세포에서 발아(bud)하여 발산할 때 바이러스에 의해서 수 행되는 HLA 클래스 Ⅱ를 산양이 인지하는지 또는 상기 HLA(MHC 분자)가 바이러스로부터 분리되어 발산되지만 함께 분출(co-purified)하여 항체가 또한 상기 세포막 구성요소에 결합되는지 본 발명자들은 알지 못한다. 실제로, 상기 제조과정에서 케모카인(chemokine) 수용체 및 관련된 분자와 같은 다른 세포막 분자가 또한 제조시에 존재할 수 있고, 이것이 상기 바람직한 치료효과를 조절하는 항체반응을 유도할 수도 있음을 본 발명자들은 인식하고 있다. 그러나, 만일 상기 내용이 사실일지라도, 본 발명자들은 항-HLA 반응이 매우 우세하게 진행되고, 이것이 관찰된 상기 항-염증 반응을 유도하는데 있어서 현저하지만 반드시 단독으로 작용할 필요는 없다고 판단한다.
본 발명자들은 상이한 바이러스/세포 제조원으로 면역된 다른 산양으로부터의 혈청을 연구함으로써, 칵테일(cocktail; 혼합약제) 주입한 산양이 후일 백신 구조(design)에 있어서 매우 중요하다고 여겨질 수 있는 HIV 외피(envelope)의 많은 비밀(cryptic) 부위, 즉 활동하지 않는(silent) 부위를 인지하는 면역반응을 생성하였음을 입증할 수 있다.
본 발명은 한 측면에서, 증진된 면역반응을 수반하는 질환에 대한 사용을 위한 HLA 클래스 Ⅱ 항원을 인식하는 항체를 제공한다.
HLA에 대한 항체, 즉 혈청내 클래스 Ⅱ 및 클래스 Ⅰ의 고역가(high titre) 에 의하여, 가장 높은 항체량을 갖는 것은 혼합된 림프구 반응이 가장 효율적이 되도록 차단시키는 것이어서 임상 상황에서 최상의 효율성을 나타낼 것으로 여겨진다.
놀랍게도, 본 발명자들은 주요한 세포사멸(apoptosis) 리간드인 FAS에 대한 항체 농도가 대단히 높음을 관찰하였다. 실제로, 상기 항체는 MHC 클래스 Ⅱ 항체와 연관되었다. 이론적인 뒷받침이 분명한 것은 아니지만, 본 발명자들은 FAS에 대한 높은 항체 역가가 수 분내에 FAS 항원에 부착하는 항체의 즉각적인 세포사멸을 유도하여 세포가 죽을 수 있다는 가설을 세웠다. 이것이 유독한 케모카인의 저해를 유도할 수 있으며, 이것이 MS의 기능상실과 연관된다고 판단하였다.
따라서 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 FAS에 대한 항체가 HIV, 다발성 경화증 및 기타 신체 이상의 치료에 중요할 수 있으며, 치료에 있어서 클래스 Ⅱ 및 클래스 Ⅰ에 대한 다른 항체와 함께 공동으로 유익한 기능을 가질 수 있음을 보고한다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 상기 치료가 용이한 질환에 대한 항-FAS 항체의 치료 용도를 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 또한 항-HLA 항체 및/또는 항-FAS 항체, 및 상기 조 성물을 이용한 치료방법을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 주요한 용도는 부적당하게 높은 수준의 HLA를 갖는 질환의 치료를 위한 항-HLA를 함유한 혈청에 관한 것이다. 상기 질환은 다발성 경화증, 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 일차 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 자가면역 간경변(cirrhosis autoimmune) 및 심장, 폐, 피부, 위장관(gastrointestinal tract), 신장(kidney), 뇌(brain), CNS에 관련된 바이러스 b 및 c 자가면역 신체 이상을 포함한다. 보다 일반적으로, 본 발명에 의하여 치료될 수 있는 신체 이상은 HIV, 염증 질환, 자가면역 질환, 축색돌기(axon) 또는 신경손상 또는 이와 관련된 손상 또는 암 및 기타 질환 또는 염증 증상을 갖는 신체 이상을 포함한다.
항-FAS가 존재하면, 아마 사이토카인(cytokine) 및 케모카인과 같은 손상 전달체(damaging messenger)를 배출하는 만성적으로 활성화된 세포와 관련된 질환에 특히 적합한 혈청이 된다. 상기 질환은 다발성 경화증, 만성적 염증 증상과 관련된 바이러스, 박테리아 및 열대성 암과 같은 만성적 감염뿐만 아니라 신경계의 모든 형태의 만성적 염증 신체 이상을 포함하고, 구체적으로는 폐, 이자(pancreas), 간, 창자(bowel), 림프절(lymph node), 피부 특히 편평세포(squamous cell) 및 기저세포(basal cell)의 암에 대한 것이 또한 뇌 및 척수의 원발성 종양 및 이차 종양에 유익할 수 있다.
외상(traumatic)의 손상된 신경을 갖는 사람들에 대한 신경 기능에 있어서 관찰되는 향상은 신경세포 성장인자 특성을 암시하고, 이것은 창상, 길랑바레 증후군(Guillain-barre)과 같은 감염후 손상, 악성 손상 등, 당뇨병과 관련된 신경병, 알콜 중독증, 금속 또는 기타 독소(toxin) 등에 의한 중독에 대하여 사용될 수 있다.
체모 및 피부 상태 및 색에 대해 관찰되는 유익한 혜택은 항-노화(anti-ageing)를 나타내는 항체 등에 대한 상기 관찰에 의하여 설명될 수 없는 다른 톡특한 성질을 암시하고, 상기 혈청에 의한 이차 암 활동이 감소된다는 보고는 이것이 FAS 활성과 직접적으로 관련된 항암 활성일수도 있으나 또한 아직 확인되지 아니한 다른 물질에 기인할 수도 있음을 암시한다.
한 측면에서, 상기 항체는 광견병(rabies)에 대해 백신화된 산양로부터 제조되는 것이 바람직하다.
변형으로, 본 발명은 말, 양 및 다른 적당한 동물로부터 생산된 항체로 확장된다. 상기 항체는 산양 항체에 대해 주어진 것과 유사한 방식으로 제조될 수 있고, 항-HLA 및/또는 항-FAS 활성에 대하여 측정될 수 있다. 추가적인 변형으로, 항체를 생성하기 위한 면역원(immunogen)으로 HIV 바이러스의 사용은 필요하지 않 고, 인간 백혈구 세포 또는 인간-유도 세포주-막 항원(cell-line membrane antigen)이 유효한 항체 제조를 위한 면역원으로 이용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명자들은 항체가 면역원에 의해 대체될 수 있으며, 다시 말해 치료 조성물은 HIV 물질 또는 백혈구 세포를 포함할 수 있음을 인식하고 있다.
가열 불활성화(heat inactivation)에 이은 또 다른 변형에 있어서, 바이러스 배양이 완료되었거나, 완료될 수 있으나 배양하는데 사용할 수 없었던 상청액 또한 적당한 항체반응을 생성할 수 있는 면역원으로 사용될 수 있다. HIV 또는 다른 바이러스의 실험실 조건(in vitro) 성장에 적합한 상청액 또는 기타 배지를 허용가능한 면역원을 생성하는데 사용할 수 있고, 이것은 유효한 항체반응을 생성할 것이다. HIV 111b를 배양하는데 사용될 수 있는 PMBC 또는 상기 암 불멸 세포주(cancer immortal cell line)와 같은 세포 배양 생장배지의 상청액이 실시예로 주어진다. 항체 제조를 위한 유효한 면역원을 생산하기 위하여, HIV 또는 다른 선택된 바이러스를 제안할 필요는 없다.
본 발명의 항체는 HLA 클래스 Ⅱ 항원 및 gp 120 항원의 레퍼토리(repertoire)를 인식하거나 FAS를 인식하는 폴리클론항체(polyclonal antibody)인 것이 바람직하다. 본 발명자의 발견으로 HLA 클래스 Ⅱ 항원이 바람직함을 암시한다.
면역원으로 선택된 하나의 항원, 바람직하게는 항원 칵테일을 사용함에 의하여, 적당한 항체가 배양될 수 있다. 일련의 다른 항원을 사용함에 의하여, 환자에게 보다 강한 반응을 유발시키는 항원의 공통적인 구조를 인식하는 항체의 제조가 가능하다. 본 발명자들은 하나의 선택된 HIV 분리주가 구조상에 있어서 작은 변화를 갖는 항원결정부(epitope)를 제공할 것이며, 전체 항체(pan-antibody)가 유발될 것이라는 가설을 제시한다.
따라서, 혈청을 제조하기 위하여, 본 발명자들은 T-세포 단독으로 사용하기 보다는 PBMC에서 주로 생성되는 다른 HIV 바이러스 칵테일을 이용하는 것을 선호한다. 상기 칵테일은 적절하게는 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 상기 바이러스를 포함한다. 상기 바이러스는 여액(lysate) 상태인 것이 바람직하다. 바람직한 여액의 실시예는 91US056, 92HT593, 92US723, 92US657, 92US660 및 92US714와 같은 HIV-1 분리주를 포함한다. 상기 칵테일은 상기 구체적인 분리주를 최소한 1, 2, 3, 4, 5 또는 모든 6개를 포함하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 콘카나발린 A(Concanavalin A)를 이용한 세포의 활성화는 특별한 이점을 부여하는데, 예를 들면 항-도파민(anti-dopamine) 활성의 보다 높은 수준은 Con A를 사용하여 달성될 수 있다. SHULA(활성화되지 않은)는 O.D. 값의 기저선 위로 항-도파민 R 수준의 유효한 상승을 유발시키지 못했다. 한편, HIV 3B(12마리 산양과 토끼의 평균)는 유효한 상승을 유발시켰다. 또한, 칵테일에서 상기 Con-A 활성화된 PBMC 세포 사이에 도파민 R 수준이 상승되었다.
그러나 또 다른 변형으로, HIV에 제한되는 것은 아니지만 HIV 바이러스의 실험실 조건(in vitro)의 성장에 적합한 상청액은, 예를 들면 HIV 111b를 성장시키기 위하여 사용되는 것은 불멸의 세포주와 같은 PBMC 또는 다른 배지 형태일 것이고, 통상적인 방식으로 사용되는 열처리로 HIV 바이러스를 죽인다면 상기 바이러스의 유입없이 자력으로 바이러스가 존재하지 않아도 유효한 항체 제조가 가능하다.
상기 항체는 또한 바람직한 세포 배양액 또는 다른 상청액 파편을 포함하거나 흉내내는 계통발생학적으로 무관한 원천으로부터 HIV 여액으로부터 분리된 펩티드, 합성 펩티드, 박테리아 융합단백질 및 단백질/펩티드를 포함하는 단백질을 사용하여 제조될 수 있다. 여액 상태로 항체가 제조될 수 있고 테스트될 수 있다.
현재의 이론으로 뒷받침되는 것은 아니지만, 본 발명의 항체는 상기 면역반응에 의존하는 HIV 또는 다른 신체 이상에 의하여 요구되는 것과 같은 종류의 세포 증식을 억제하는 작용을 하는 것으로 여겨진다. 따라서, 예를 들면, 본 발명은 다발성 경화증의 치료에 적용될 수 있다.
현재는 산양 혈청으로부터 항체의 항-HLA 및 항-FAS 활성의 중요성을 인식하게 되었으므로, 이제 상기 일련의 산양 혈청의 가능한 유용성을 측정하는 것이 가 능하게 된다. 단순한 측정에 의해서, 항-HLA 및/또는 항-FAS 활성의 존재를 측정할 수 있고, 환자에게 투여에 적합한 가능성 있는 혈청의 확인이 가능하다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 바람직하게는 최소한 몇 개의 HIV 분리주를 동물에게 투여하는 단계, 면역반응이 진행되도록 하는 단계, 상기 동물로부터 혈액을 채취하는 단계, 항-HLA 항체 및/또는 항-FAS 항체의 존재를 모니터링하는 단계, 및 인간의 치료에 적합한 항-HLA 및/또는 항-FAS 혈청을 제조하는 단계를 포함하는 혈청, 구체적으로는 산양 혈청의 제조방법을 제공한다.
대개 다양한 동물이 이용될 수 있고, 유효 혈청의 보다 나은 수율을 제공하는 상기 동물에 대해서 측정할 수 있다. 이어서, 상기 보다 효과적인 동물은 구체적으로는 본 발명에 적합한 동물의 후손을 제공하도록 교배될 수 있을 것이다.
항-HLA 항체, 구체적으로는 일련의 항-HLA 항체 및/또는 항-FAS 항체, 구체적으로는 일련의 항-FAS 항체의 존재를 보장하도록 대개 양질의 조절 절차를 채택할 수 있을 것이다. 상호관련된 연속적 배치(batch)를 수행함에 의하여, 표준화된 산물을 생성할 수 있다.
급격히 MLR을 저해할 수 있는 혈청 능력에 기초할 때, 상기 혈청은 강력한 항-염증제로서 작용할 수 있음이 암시된다. 이것은 효과적일 수 있는 수 많은 기전(mechanism)이 있으며, 많은 기전 중에서 HLA 인식의 저해가 가장 가능성 있는 것의 하나이다.
또 다른 작용기전은 가열 처리에 의하여 예방된다고 알려진 유일한 활성인 것처럼 보체(complement)가 상기 산양 혈장(plasma)의 활성과 연관된다는 사실에 기인할 수 있다. 보체는 환자의 약화된 변질된 기전을 활성화되게 할 수 있다. 예를 들면; 바이러스 및 종양 세포를 죽이도록 목표로 삼은 항체 및 상기 바이러스 및 종양세포를 죽이도록 지시된 세포 중재 항체(cell mediated antibody)는 모두 보체를 필요로하고, 보체가 결여되면 효과 또는 기전이 완전히 상실된다.
추가적으로, 본 발명은 각각의 특이 항체의 분리를 통상적인 혈청 추출기법에 의하여 적합하게 감염된 산양의 혈액으로부터 채취될 수 있는 활성 성분을 포함하는 조성물을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 각각의 항체를 제조하기 위하여, 과도한 정제 및 추출과정 없이, 감염된 산양의 혈액 혈청으로부터 활성 성분, 아마 항-HLA 항체 및/또는 FAS 항체가 함께 작동하는(co-opearting) 혼합물의 분리를 개시한다.
일반적으로, 인간이외의 숙주로부터 유도된 항체를 인간에게 주입하면, 반대로 적용(counter-indication)된다. 강한 면역반응은 통상적으로 외래 항체 자체에 대하여 발생한다. 그러나, 놀랍게도 산양 혈청 추출액을 사용하는 경우, 다른 외래 동물 단백질에서와 같은 예상된 면역반응이 유발되지 않음을 관찰하였다. 산양 혈청 추출액을 주사하는 경우, 면역억제(immunosuppressed) 환자 및 정상적 개체 모두 견디어낸다.
본 발명은 구체적으로는 HIV에 감염된 산양으로부터 채취된 항체 분자의 전체 개체군을 포함하는 혈청 추출액을 사용한다. 이론에 의하여 제한되는 것을 원하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 상기 접근 방법이 상당한 혜택을 제공한다고 확신한다. 상기 혈청 추출액으로 치료된 환자는 치료 몇 분 후에 현저한 호전을 나타내었다.
근육내 주사에 의하여, 사멸된 바이러스를 특별히 동정된 산양내로 주입하고, 배양하였으며, 그 이후에 하기의 절차에 따라 정량의 혈액을 채취하고 변형시켰다.
상기 혈청은 선택적으로 바람직한 항체 활성, 및 선택적으로 하나 이상의 항-융합 활성, AIDS 바이러스의 중화(neutralisation), 식균 작용(phagocytosis)을 증진시키는 능력 및 인체의 민감성을 테스트하였다.
선택한 산양에 HIV 바이러스를 주입한 후, 외래 단백질 항원에 접촉한 후의 면역반응을 초기 연구에 따라 관찰하였다. 이어서, 인체 사용을 위하여, 상기 추출된 혈청을 변형시켜 시약을 제조하였다.
본 발명의 절차에 따라 HIV가 주입된 동물에서 반응하여 생성되고, 변형되고 정제된 시약이 총체적인 AIDS 복합체를 역전시킴을 확인하였다.
이것이 실제로 달성되는 방법에 대한 설명은 복잡하지만, HIV 양성 또는 완전히 발병한 AIDS인 개체에 주입하였을 때, 하기의 결과를 가져온다:
1. 환자의 삶의 질에 있어서 거의 즉각적인 향상.
2. CD4 및 CD8 세포의 증식이 이루어지고, 이에 따라 CD4 및 CD8 세포수의 증가.
3. 일반적으로 0.5 로그의 증가를 가져오는 이론적인 영(zero)으로의 환자 바이러스 로드(load)의 감소.
4. P24 값의 영으로의 감소.
*비록 현재의 관찰로는 3년 및 그 이상 지속되는 것으로 얼마정도 상기 상태가 지속되는지 정확히는 알 수 없지만, 본질적으로는 이것은 환자의 면역시스템이 정상적으로 돌아가서 바이러스를 제거하는 것이 가능하다는 것을 의미한다.
대략 성에 관련됨이 없이 10세 이상의 200명의 사람들이 상기 약물로 성공적으로 치료되었으며, 이들 중 어느 누구도 어떠한 재발 또는 부작용으로 고통받는다 는 보고는 없었다.
치료는 1/10 내지 10 ㏄에서 변화하는 양으로 피하주사의 방법으로 주입되고, 림프계(lymphatic system)에 가능한 빠르게 약물이 전달되도록 고안하였다. 본 발명에 따르면, HIV 환자에 바람직한 투여는 대개 매주 또는 필요로 될 때마다 1 ㎖, 양 팔에 분할된 투여로 주입할 수 있다. 2 또는 3주 마다 투여가 통상적이지만, 3개월 마다의 투여도 가능하다. 암 환자에게는 매주 0.3 ㎖의 투여가 가장 바람직하다.
대부분의 경우에, 3개월 기간에 걸쳐 4주간에 1번씩 치료를 수행하였다. 상기 치료시의 일반적인 관찰 내용은 다음과 같다:
1. 완만 내지 심각한 우울증이 주사 후 60분 이내에 역전되었다.
2. 일반적으로 주사 후 2시간 이내에 환자는 식욕을 회복하고, 열심히 음식을 찾았다.
3. 최초 치료 후 대략 2주 이내에 환자는 체중이 증가하기 시작하였다.
4. 독립된 실험보고에 의하면, 최초 치료 후 4 내지 6주 이후에 바이러스 로드 및 P24 값이 현저히 감소하고, CD4 및 CD8 세포가 급격히 증가하였다.
5. 어떤 부작용도 관찰되지 않았다.
현재의 치료들과 달리 본 약물은 환자에게 엄격한 시간 또는 일과 관리를 요 구할 필요가 없고, 단순한 주사에 의존하여 매주 또는 매월 투여할 수 있다.
바람직하게는, 본 조성물은 정제될 수 있고, 완전하게는 단지 정제된 혈청 추출액으로만 구성된다. 추가적인 변형으로, 또한 특별히 제한되는 것은 아니지만 면역친화(immunaffinity) 크로마토그래피, 염침전(salt precipitatin), 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 적합한 또는 바람직하게는 이것들의 복합된 방법을 포함하는 통상적 또는 다른 적당한 절차에 의하여 복합체 혈청 또는 혈장 혼합액으로부터 질병-특이적 필요에 따라 항체는 전체적으로 정제되거나, 선택되고 그룹화될 수 있다.
본 발명의 항-HLA 항체, 및/또는 항-FAS 항체를 이용한 복합치료가 또한 고려될 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아닐 수 있다.
하기에서 설명되는 절차에 따라 생산된 산양 혈청 추출액은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 조건에서 바이러스 복제를 저해하는 조성물로 본 발명에 따라 제형화될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 또한 바이러스 질환과 같은 질병의 치료에 적합한 본 발명의 산양 시약을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 시약은 적당한 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합될 수 있다.
약학적 조성물의 예는 적당한 조성물로 이루어진 고형물(정제, 환약, 캡슐, 과립 등) 또는 경구, 국부 또는 비경구 투여를 포함하고, 이들은 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 비경구적으로 투여될 때, 멸균될 필요가 있을 수 있다.
환자가 고도면역(hyperimmune) 산양 혈청에 대한 알레르기 반응이 유발되는지를 확인하기 위하여, 대개 테스트 투여가 이용된다. 부종(oedema), 홍반(erythema) 및 가려움증(itching)으로 입증되는 중간반응이 있는지를 확인하기 위하여, 30분 정도 기다린 후에 피내주사를 한다. 상기 반응이 없다면, 이어서 즉각적인 민감 반응이 거의 즉시 일어날 것이라 가정할 수 있다. 그러나, 가능한 알레르기 반응 때문에 환자가 잠재적인 인명구조 치료를 받는 것을 포기해서는 안된다.
본 발명의 조성물의 투여는 정맥주입, 피하주사, 근육내주사, 경구 조제, 복막내 및 정맥투여와 같은 어떠한 적합한 방법에 의해서 이루어질 수 있다. 상기 정확환 투여량은 구체적 제형, 응용형태 및 구체적 위치, 치료될 환자 및 상태에 따라 변화할 수 있다. 나이, 체중, 성별, 식사, 투여시간, 배출율, 환자의 상태, 약물의 복합정도, 반응 민감도 및 질환의 심각성과 같은 다른 요소가 고려될 수 있다. 최대 허용되는 투여량내에서 계속적으로 또는 주기적으로 투여를 수행할 수 있다.
대부분의 다른 치료와 달리 상기 산물은 환자에게 엄격한 시간 또는 일과적 환약 복용 관리를 요구할 필요가 없고 단순한 주기적 주사의 투여에 의존한다. 2년 이상의 기간동안 치료되고 상기 프로젝트가 유지된 환자의 면역계는 안정되고 정상적인 작동수준으로 복귀된 것으로 보인다.
HIV 치료를 위하여, 상기 산물은 HIV에 의하여 원인이 된 염증을 완화하기 위하여 고안된 것으로, 대단히 유독한 화합물이 없이도 인간 면역계가 바이러스에 대하여 스스로 재작용하도록 해준다. 경쟁자들과 달리 상기 약물은 감염이 의심된 것에 대한 예방제(prophylactic)로서 또는 상기 질환의 초기에 보다 적은 투여량으로 사용될 수 있다.
종종 환자의 남은 인생을 위하여 매일 복용될 필요가 있는 현존하는 약과 달리, 통상적인 치료는 매주 또는 매월 의사에 의하여 투여되는 단순한 주사에 의하여 이루어진다. 통상의 치료 프로그램은 3개월 동안 지속되고, 6개월, 12개월 및 2년 또는 바이러스가 재발하는 경우 필요에 따라 예상되는 연장 절차로 이루어진다.
본 발명의 조성물은 복합 치료를 제공하기 위하여, 다른 약과 함께 사용될 수 있다. 다른 약은 동일한 조성물의 일부를 형성할 수 있거나 동시 투여를 위한 분리된 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 산양 이외의 종의 보호에의 용도를 위한 시약을 포함하는 보호 조성물의 생산을 위한 방법으로 확장될 수 있으며, 상기 방법은 비산양 항원(예를 들면, 바이러스 또는 외래 단백질)으로 산양을 면역시키는 단계, 및 상기 항원의 감염 이후에 상기 산양에서 생산된 혈청 추출액을 정제하는 단계를 포함한다. 이어서, 상기 시약은 면역원으로 사용되는 항원으로부터 비산양 동물을 보호하는데 사용될 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 약물로 인간 HIV 바이러스의 감염 이후에 산양의 혈청 추출액을 포함하는 조성물의 용도 및 HIV 및 AIDS를 포함하는 신체 이상의 치료를 위한 약물의 조제에 있어서 인간 HIV 바이러스로 감염 이후에 산양의 전체 항체군을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 다음의 하나 또는 모든 과정에 의하여 처리된다: 45%의 암모늄 설페이트로 침전시키는 단계, 24시간 동안 -70℃에 동결시키는 단계, 또는 미세여과(microfiltration) 단계.
본 발명의 항체 산물은 염증 성분을 갖는 질환의 치료에 관한 용도이고, HIV뿐만 아니라 당뇨병, 류마티스성 관절염, 신경염(neuritis), 다발성 골수종(multiple myeloma), 결정암 등등을 포함한다. 추가적인 예는 참고를 위하여, 구체적으로 (Baum, H. Molecular Mimicry in Immunology Today, 1996, February 17, 64-70)인 www..kcl.ac.uk/kis/schools/life_sciences/life_sci/baum.html인 웹사이트(website)에 기재된 H. 바움의 논문에 제시된다.
한 측면에서, 본 발명은 HIV를 갖지 않는 환자의 치료방법을 제공한다. 구체적으로는, 상기 치료방법은 비-HIV 환자의 당뇨병 또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
상기 치료를 받은 후, 1시간 이내에 보고된 향상된 기분과는 별도로 많은 MS 환자에서 보고되는 회복은 또한 신경 자극 및 가능한 재생에 관계될 수 있는 CNS에서의 수용체에 대한 활성을 기대하게 하였다. 본 발명자들은 수 많은 항원에 대한 활성을 다양한 혈청에 대하여 스크리닝하였고, 도파민 수용체, 세로토닌(serotonin) 수용체, 신경성장인자 수용체 p75(Nerve growth factor receptor P75) 및 케모카인 CXCL10(IP10)에 대한 활성을 관찰하였다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 도파민 수용체, 세로토닌 수용체, 신경성장인자 수용체 p75 및 케모카인 CXCL10(IP10)으로 확장된다. 하나 이상의 상기 항체 활성은 단독으로 또는 항-HLA 및/또는 항-FAS 활성과 복합하여 존재할 수 있다.
현재는 산양 혈청으로부터 항체의 도파민 수용체, 세로토닌 수용체, 신경성 장인자 수용체 p75 또는 케모카인 CXCL10에 대한 활성의 중요성을 인식하게 되었으므로, 이제 상기 일련의 산양 혈청의 가능한 유용성을 측정하는 것이 가능하게 된다. 단순한 측정에 의해서, 상기 활성의 존재를 측정할 수 있고 환자에게 투여에 적합한 가능성 있는 혈청의 확인이 가능하다. 구체적으로는, 하나 이상의 도파민 수용체, 세로토닌 수용체, 신경성장인자 수용체 p75 또는 케모카인 CXCL10에 대한 항체와 함께 항-FAS 및/또는 항-HLA 항체의 복합이 중요할 수 있으며, 따라서 산물에 전체 항체가 존재하도록, 다양한 항체 활성으로 상기 분석을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 대개 항-FAS 항체 및/또는 항-HLA 항체와 함께 하나 이상의 도파민 수용체, 세로토닌 수용체, 신경성장인자 수용체 p75 또는 케모카인 CXCL10에 대한 항체를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 사용한 치료방법을 제공한다.
변형으로, 본 발명은 말, 양 및 다른 적당한 동물로부터 생산된 항체로 확장된다. 상기 항체는 산양 항체에 대해 주어진 것과 유사한 방식으로 제조될 수 있고, 하나 이상의 HLA, FAS, 도파민 수용체, 세로토닌 수용체, 신경성장인자 수용체 p75 및/또는 케모카인 CXCL10에 대한 활성이 측정될 수 있다. 추가적인 변형으로, 항체를 생성하기 위한 면역원으로 HIV 바이러스의 사용은 필요하지 않고, 인간 백혈구 세포는 유효한 항체 제조를 위한 면역원으로 이용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명자들은 항체가 면역원에 의해 대체될 수 있으며, 다시 말해 치료 조성물은 HIV 물질 또는 백혈구 세포를 포함할 수 있음을 인식하고 있다.
보다 일반적으로, 유효한 항체는 인간에서 기원한 세포(또는 단백질 칵테일 혼합액)를 면역원으로 사용하여 제조될 수 있는 것으로 여겨진다. 이어서, 이들 인간 세포로부터 항체는 숙주 종에서 제조되고, 이것이 거꾸로 인간에게 사용되는 최종적인 항체 산물이다 . 단백질 칵테일 혼합물은 최초의 공여자(donor) 및 수용자(recipient) 사이의 극히 유사한 동일성을 가질 수 있다. 상기 동일성은 예를 들면 유인원 신경계 기원의 단백질 또는 세포의 개념이 인간에게 작용할 수 있도록 해준다. 밀접히 관련된 동물로부터 매우 보전된 단백질 칵테일은 주용한 관심대상이다.
또한, 최초의 세포를 공여한 사람의 HLA 유형과 수용자의 HLA 유형 사이에 관련이 있을 것이라 예측된다. 상기 관련은 관측되는 다양성의 일부를 설명해 주며, 환자에 적합한 제형을 선택할 때 고려될 수 있다.
추가적으로, 본 발명자들은 신경모세포(neural blastoma), 췌장 암종(pancreas carcinomas), 전립선(prostate) 및 편평세포암종(squamous cell carcinoma)로부터의 세포주를 포함한, 신체의 다른 부위로부터 활성화되거나 암세포주를 사용하는 것을 개시한다. 이들 다른 세포형 사이에 형성된 항체간의 미묘한 차이가 매우 다른 유형을 제공한다고 예상될 수 있고 매우 넓은 감각에서 특정 기관계(organ system)를 목표로 삼는 것을 도울 수 있다.
산양에 부여한 광견병 백신이 관찰된 치료 효과의 원인일 수 있다는 몇 가지 증거가 있다. 본 발명자들은 광견병 또는 다른 예방적 백신에서 관찰되지 않는, 3가지 다른 혈청(통상의 혈청)의 풀(pool)을 포함한 웨일스(Wales) 지역에서 얻은 산양 및 공여자 새끼산양으로부터 혈청을 스크리닝하였다. 상기 동물들에 어떤 활성을 나타내는 항체는 없었다.
그러나 또 다른 변형으로, 본 발명자들은 실험실 조건(in vitro)에서 세포의 증식 동안에 발산된 세포막 성분이 산양 또는 다른 종이 항체 반응을 지시할 수 있는 항원을 제공할 수 있다고 예측한다. 이것은 바이러스 감염의 결여시에도 일어날 수 있다.
본 발명은 증진된 면역반응을 수반하는 질환에 대한 사용을 위한 HLA 클래스 Ⅱ 항원을 인식하는 항체를 제공하며, 또한 상기 치료가 용이한 질환에 대한 항-FAS 항체의 치료 용도를 제공한다.
하기의 상세한 내용은 항체 생산을 제조하기 위한 본 발명자들의 현재의 절차를 나타낸다.
산양 혈청의 생산 실시예
여액화된 HIV 바이러스 칵테일을 산양에게 근육내 주사에 의하여 주입하고 프레운드 아쥬벤트(Freunds adjuvant)로 제형화하였다. 이에 앞서, 상기 바이러스를 30분 동안 60℃에서 가열시켜 사멸시켰다. 최초의 측정에 있어서, 적당한 간격 예를 들면 2주 이후에 혈액 시료를 채취하였다. 최적의 절차에 있어서, 4주 동안 매주 상기 바이러스를 산양에게 주입하고, 이어서 6주 동안 상기 동물로부터 혈액을 채취하여 상기 시료를 제조하였다.
멸균기법을 사용하여 상기 산양으로부터 대략 400 ㏄의 혈액을 채취하였다. 주사 추출을 위한 부위를 면도하고, 베타딘(betadine)으로 준비하였다. 상기 동물로부터 대략 400 ㏄의 혈액을 채취하기 위하여, 18-게이지 주사를 사용하였다. 주목할 점은 상기 동물에게 어떠한 부당한 영향을 끼치지 않고도 상기 동물은 대략 400 ㏄의 혈액이 추출되는 것을 견뎌낼 수 있다는 것이다. 상기 동물은 결코 희생될 필요가 없다. 이어서, 상기 동물은 혈액량을 보충한 이후, 대략 10 내지 14일 뒤에 다시 혈액이 채취될 수 있다.
바람직한 항체 활성을 갖고 있어 잠재적으로 유용한 항체가 존재함을 확인하였다. 일단, 상기 시약의 존재를 확인하고, 이어서 4-6주 사이에 상기 산양으로부터 혈액을 추출하였다.
이어서, 상기 시약을 생성하기 위하여 기본적인 혈액 산물을 원심분리를 통하여 혈청을 분리하였다. 이어서, 300 ㎖의 혈청을 여과하여 커다란 응혈 및 부유성 고형물을 제거하였다. 이어서, 과포화된 암모늄 설페이트(실온에서 45%의 용액)로 상기 혈청을 처리하여 항체 및 기타 물질을 침전시켰다. 그 결과로 생성된 용액을 5분 동안 5,000 rpm에서 원심분리하고, 그 뒤에 상청액을 제거하였다. 침전된 면역글로블린 항체를 인산-완충 식염수(이하, 'PBS 완충액'이라 칭함)에 재현탁시킴으로써, 용이하게 침전물을 재용해시켰다(Sambrook, et al., 'Molecular cloning, A Laboratory Manual', 1989).
이어서, 10,000 달톤의 분자량을 차단하는 멤브레인(membrane)을 이용하여 상기 용액을 투석하였다. 24시간 동안 4시간 간격으로 완충액을 교체하며, PBS 완충액에서 투석을 수행하였다. 투석은 4℃에서 수행하였다.
24시간 동안의 투석이후에, 상기 투석백 내의 내용물을 멸균된 비이커로 옮겼다. 상기 용액의 단위 부피당 질량 = ㎖당 10 ㎎이 되도록 조정하였다. 상기 희석은 PBS를 사용하여 수행하였다. 그 결과로 생성된 용액을 0.2 ㎛의 여과기를 통하여 멸균된 용기로 여과시켰다. 여과 이후에, 상기 용액을 1 ㎖의 단일 투여량으로 분할하고, 사용 전까지 -22℃에 보관하였다.
이제 상기 반응물은 즉시 사용가능하다.
혈장의 혈청으로의 전환:
물질:
시약 화학식 등급 물 리터당 필요로 되는 양
소듐 클로라이드(sodium chloride) NaCl USP/EP/BP 8.76 g
소듐 디하이드로젠 올도포스페이트(sodium dihydrogen orthophosphate) NaH2PO4 USP/EP/BP 0.2
디소듐 하이드로젠 올도포스페이트(di-sodium hydrogen orthophosphate) NaH2PO4 USP/EP/BP 1.55 g
덱스트란 설페이트(dextran sulphate) 나트륨염, 분자량 500,000 100 g
관개수(water-for-irrigation) N/A 박스터(Baxter) 1 리터
1 × 150 ㎖ 멸균된 듀란(duran) N/A N/A N/A
2 × 2 리터 멸균된 듀란 N/A N/A N/A
자석 교반기판 및 멸균된 자석 플리아(flea) N/A N/A N/A
1 × 사르토랩(Sartolab) 또는 미디사르트(midisart) 여과기 N/A 0.2 ㎛ N/A
6 × 1 ℓ 스테딤백(Stedim bag)
1 × 100 ㎖ 멸균백 N/A N/A N/A
100 ㎎/㎖의 덱스트란 설페이트(dextran sulphate) 용액의 제조
인산 완충액 식염수(PBS) 용액 1 리터를 제조하기 위하여 물 1 리터에 소듐 클로라이드(sodium chloride), 소듐 디하이드로젠 올도포스페이트(sodium dihydrogen orthophosphate) 및 디소듐 하이드로젠 올도포스페이트(di-sodium hydrogen orthophosphate)의 필요로 되는 양을 용해시켰다.
완전히 용해되었을 때, 10 g의 덱스트란 설페이트를 자석으로 교반시키면서 100 ㎖의 PBS에 천천히 흩뿌렸다. 완전한 용해를 위하여, 최소한 10분 이상 혼합 하였다. 멸균된 용기(예를 들면, 100 ㎖ 백)내로 0.2 ㎛ 여과기로 여과하고 즉시 사용될 필요가 없다면 실온에서 보관하였다. 이것을 덱스트란 설페이트 스톡 용액으로 사용하였다.
혈장의 혈청으로의 전환
1.0275의 전환율(즉, 1000 ㎖은 1027.5 g의 질량에 해당한다)을 사용하여 처리되도록 혈장의 필요로 되는 부피를 측정하였다,
각각의 1000 ㎖의 혈장에 10 ㎖의 덱스트란 설페이트 스톡 용액을 첨가하였다(1 ㎎/㎖의 최종농도).
30분 동안 실온에서 자석으로 교반하였다. 이것을 1 리터의 스테딤백(Stedim bag)에 옮겼다.
22℃에서 적어도 30분 이상 4000 - 4200 rpm(상대적 구심력 = 4910 g)에서 원심분리 하였다.
상기 상청액을 조심스럽게 1 ℓ 스테딤백에 흡입(aspiration)하였으며 침전물은 폐기하였다.
필요로 되는 수의 1 ℓ 스테딤백의 무게를 측정하였다.
상기 상청액을 0.2 ㎛를 통하여 1 ℓ 스테딤백으로 여과하였다. 각 백은 대략 500 ㎖의 여과된 상청액을 포함한다.
각 백에 혈청의 부피를 기록하였다. 각 백에 숫자를 기입하여 표시하였다.
상기 혈청이 즉각 공정처리 되지 않는다면, 7일까지 기간 동안은 4 - 8℃에서 냉장보관하고, 그 이상의 기간은 -20℃에서 냉동보관하였다.
36%(w/v)의 소듐 설페이트의 제조.
물질:
시약 화학식 등급 물 리터당 필요로 되는 양
무수(anhydrous) 소듐 설페이트 USP/EP/BP 360 g
관개수 N/A 박스터(Baxter) 1.5 리터
1 × 2 리터 멸균된 듀란 N/A N/A N/A
자석 교반기판 및 멸균된 자석 플리아 N/A N/A N/A
1 × 사르토랩 또는 미디사르트 여과기 N/A 0.2 ㎛ N/A
2 × 1 ℓ스테딤백 N/A N/A N/A
2 ℓ의 멸균된 듀란에 1.5 리터의 물(1 ㎖ = 1 그램으로 가정)을 측정하였다.
상기 듀란을 적어도 1 시간 이상 예열시킨 반응기 내에 놓아둠에 의하여 물을 30 - 35℃로 보온시켰다.
멸균된 자석 플리를 도입하여 자석 교반을 수행하였다.
360 g의 소듐 설페이트를 교반과 함께 천천히 첨가하였다.
염을 완전히 용해시켜 용액이 맑아질 때까지 교반을 지속하였다.
용액이 충분히 보온되지 않거나 냉각된다면, 상기 염이 다시 용액으로부터 결정화되기 시작할 것이다. 상기 염은 상기 용액을 50℃로 가열시킴에 의하여 재용해될 수 있다.
36%(w/v)의 소듐 설페이트 용액 1 리터를 0.2 ㎛를 통하여 1-리터 스테딤백으로 여과시켰다. 그리고 나서, 백에 라벨을 붙였다.
남아있는 500 ㎖을 분리된 스테딤백으로 여과시켰다. 추가적으로 여과에 의하여 500 ㎖의 주입을 위한 물을 첨가하도록 진행하고, 상기 백에 '18%(w/v)의 소듐 설페이트'라는 라벨을 붙였다.
소듐 설페이트를 사용하여 혈청으로부터 면역글로블린 항체의 침전
주의. 혈장은 소듐 설페이트로 처리에 앞서 덱스트란 설페이트 방법에 의하여 섬유를 제거하여야만 한다.
물질:
시약 화학식 등급 물 리터당 필요로 되는 양
여과된 혈청 1 리터
30%의 소듐 설페이트 용액 N/A 1.5 리터
18%의 소듐 설페이트 용액 N/A 1 리터
인산 완충액 식염수 N/A 2 리터
관개수 N/A 박스터(Baxter) N/A
심부 여과기(depth filter) N/A N/A N/A
0.2 ㎛ 여과기 N/A 0.2 ㎛ N/A
완전 여과(diafiltration)를 위한 스테딤백 N/A N/A N/A
배양기 세트를 사용하여 스테딤백 내에 여과된 혈청을 30 - 35℃로 보관시켰다. 2 × 5 ㎖ 시료를 취하였다.
혈청에 동일 부피의 보온된 36%의 소듐 설페이트 용액, 예를 들면 500 ㎖의 염용액: 500 ㎖의 혈청으로 백에 첨가하였다.
상기 백을 수작업으로 흔들거나 락커(rocker)판 위에 놓음에 의하여 상기 염:혈청 혼합물(크림형의 백색 용액)을 부드럽게 혼합시켰다. 30분 동안 혼합시켰다.
상기 백의 무게를 측정하고 균형을 유지시킨 뒤, 25-30℃에서 최소 30분 이상 4000 - 4200 rpm에서 원심분리 하였다.
폐기물로부터 상기 상청액을 주의하여 흡입하였다. 침전물이 교란되지 않도록 주의하였다. 상청액의 1 × 5 ㎖의 시료를 취하였다.
침전물의 각 백에 18%(w/v)의 소듐 설페이트의 충분한 부피를 첨가하여 각 백의 질량이 1000 g 근처가 되도록 조제하였다.
최소한 10분 이상 수작업으로 또는 락커에 의하여 혼합함으로써 면역글로브린 항체 침전물로부터 함유된 알부민(albumin)을 세척하였다.
상기 백을 원심분리기로 옮기고 상기와 동일하게 원심분리를 반복하였다.
폐기물로부터 상기 상청액을 주의하여 흡입하였다. 침전물이 교란되지 않도록 주의하였다.
침전물의 각 백에 인산 완충액 식염수의 충분한 부피를 첨가하여 각 백의 질량이 1000 g 근처가 되도록 조제하였다.
최소한 10분 이상 수작업으로 또는 락커에 의하여 혼합하고 냉장고로 이전하여 상기 백을 하룻밤 동안 저장하였다.
저장으로부터 백을 제거하고 침전물이 재용해되도록 하였다.
0.2 ㎛를 통하여 적당한 크기의 완전 여과(diafiltration)백으로 여과시켰 다.
2 × 5 ㎖의 시료를 취하였다.
면역글로블린 용액의 대량 제형화.
최소한 하나 이상의 0.1 ㎡의 30,000 MWCO 멤브레인을 사용한 초여과(ultrafiltration, UF) 장치를 설치하였다.
최소한 30분 이상 0.5 M - 1 M의 소듐 하이드록시드(sodium hydroxide) 용액의 재순환을 통하여 상기 시스템을 소독하였다.
상기 시스템으로부터 소듐 하이드록시드 용액을 배수처리하고, 물의 pH가 중성이 될 때까지 관개수로 세정을 수행하였다.
면역글로블린 항체 용액을 포함하는 완전 여과백을 UF에 연결하였다.
연동식 펌프(peristaltic pump)를 경우하여 PBS(면역글로블린 항체 용액의 10×의 부피)를 포함하는 백을 완전 여과백에 연결하였다.
투석유물 라인(retentate line)을 완전 여과백에 연결하였다.
완전 여과 라인(diafiltrate line)을 폐기물 백에 연결하였다.
초여과 장치를 통하여 상기 산물이 천천히 진행하도록 수행하고, 펌프 스피드 및 밸브 조정을 사용하여 입구 및 출구 압력을 각각 입구는 2.0 bar로, 그리고 출구는 0.5 bar로 조정하였다.
면역글로블린 항체 용액을 50 g/ℓ 근처로 농축을 수행하였다. 출발 농도를 고려하고 제거된 액체의 양을 측정하여 이것을 계산하였다. 예를 들면:
출발 용액은 25 g/ℓ에서 2 리터이므로 50 g이다. 완전 여과에서 제거된 용액부피는 1 리터이다. 따라서, 농도는 50/1 = 50 g/ℓ이다.
완전 여과 유속을 측정하고 상기 유속과 동일한 PBS를 포함하는 백으로부터 펌프 스피드를 조정하였다.
10배의 완충액을 교체할 때까지 완전 여과를 계속 수행하였다, 즉 1 리터의 IgG 용액은 10 리터의 PBS를 필요로 한다.
농축된 완전 여과된 IgG 용액의 시스템을 완전 여과백으로 배수하였다. 백을 차단하고, 적어도 1 리터 이상의 PBS를 포함하는 PBS 백을 시스템에 직접 연결하였다.
PBS 세척 용액을 재순환시키고, 상기 세척액을 IgG 용액-함유 백으로 회수하였다.
0.2 ㎛를 통하여 대량으로 제형화된 IgG 용액을 미리-측정한 스테딤 백으로 여과를 수행하였다.
완결되었을 때, 여과된 용액의 1 ㎖의 시료를 취하여 단백질 농도를 측정하였다.
백의 무게를 측정하고 IgG 용액의 부피를 측정하였다.
단백질 농도 및 IgG 부피를 사용하여, 10 ㎎/㎖의 최종농도로 용액을 희석시키기 위하여 필요로 되는 PBS 부피를 계산하였다, 예를 들면:
IgG 부피 = 1300 ㎖. 단백질 농도 = 30 ㎎/㎖.
IgG의 총량 = 39000 ㎎.
필요로 되는 농도 = 10 ㎎/㎖의 최종농도.
따라서, 필요로 되는 최종부피 = 39000/10 =3900 ㎖이다. 현재 부피는 1300 ㎖이다. 따라서, 첨가되어야 할 PBS의 부피는 3900 -1300 = 2600 ㎖이다.
PBS를 대량으로 제형화된 IgG 용액을 포함하는 백으로 여과하여 10 ㎎/㎖로 최종 필요로 되는 부피를 달성하였다.
상기 시약은 즉시 사용가능하고 1주까지는 냉장 저장될 수 있으나, 그 이상의 저장이 요구되는 경우에는 -20℃에서 냉동 저장할 수 있다.
소듐 설페이트의 농도를 변화시키거나 시약을 변화시킴에 의하여 실시예에서와 같이, 상기 절차에 있어서 변형이 이루어질 수 있다. 유사하게, 투석 크기제한은 10,000 달톤에서 이루어질 필요는 없다.
활성 모드
서론
비공개의 관찰에 의하면, HIV 면역된 산양으로부터의 혈청이 수혈된 AIDS 환자는 몇 가지 경우에서 분명히 급격한 호전된 것으로 보여지므로, 본 발명자들은 가능성 있는 기전을 살펴보았다. 상기 산양에게 HIV를 주입하여 이루어지는 면역반응이 대단히 특이적이라 생각되지만, 이러한 기초사실이 다발성 경화증 및 암과 같은 몇 가지 경우에 환자에게 관찰되는 상태의 호전을 설명할 수는 없다.
본 연구의 과학적 기반
비록 댈그레쉬(Dalgleish) 및 그의 동료들은 몇 년 전에 HIV의 유입 입구로서 CD4 수용체를 관찰하였지만, AIDS로 감염 전파의 진전에 따라 감소되게 측정되는 CD4 세포를 HIV가 사멸시킨다는 고전적인 해석은 더 이상 발병원인에 대한 적합한 설명은 아니었다. 이러한 해석과 잘 일치하지 않는 주요한 관찰은 다음을 포함한다:
(1) 감염으로부터 AIDS 시작되기까지의 장기간(대략 10년).
(2) 거의 모든 침팬지 및 HIV 감염된 사람의 대략 5%는 발병이 일어나지 않는다. 상기 침팬지는 인간과 동일한 수용체와 보조수용체를 갖고 있으므로, CD4 수가 감소되지 않은 감염된 침팬지에서 상기 바이러스를 쉽게 관찰할 수 있다.
이러한 관찰에 기초하여, 연구자들은 감염시에 질병이 진행되는 개체와 그렇지 아니한 개체사이의 차이를 규정짓고자 노력하였다. 질병의 주요한 예상인자는 최초의 감염에 이은 면역 활성화의 정도 및 면역이 지속되는 수준이다. 다시 말하면, 면역 활성화가 높을수록 상기 질병에 대한 잠복기가 짧아진다. 미약한 활성화 정도가 AIDS의 발생에 앞서 장기간의 잠복기를 유도할 수 있고, 바이러스 복제가 있는 경우에조차 면역 활성화의 부재가 침팬지 및 발병이 안되는 드문 인간에서의 특징이다.
상기 문맥에서 '면역 활성화(immune activation)'라는 용어는 전체 면역 활성화, 즉 면역 시스템의 모든 측면이 활성화된 것으로, 이것은 B-세포뿐 아니라 T- 세포의 모든 하위세포(subset)를 포함하는 것을 나타냄을 유의할 필요가 있다. 전체-면역 활성화는 단지 3 종류의 확인된 원인이 있다.
이것의 첫 번째는 HIV가 명확히 나타내는 항원의 과변이(hyper-variability)이지만, 상기 과변이는 발병이 진행하지 않는 감염된 사람과 침팬지에게도 관찰된다.
두 번째 가능성은 항원 특이적 기전을 우회하고, 완전한 면역 시스템의 활성화의 원인이 되는 슈퍼항원(super antigen)이다. 10여년 전에 최초의 열정에도 불구하고, 상기 발견을 설명하는 HIV와 관련된 슈퍼항원에 대한 개념을 확인할 수 없었다. 웨스트비(Westby) 및 대글레쉬(Dalgleish)는 슈퍼-항원의 가능성을 제안하는 T-세포 레퍼토리의 변이는 완전히 CD4 개체군의 감소의 결과이고, 상기 차이는 불특정한 CD4 파괴에 의하여 설명될 수 있다고 제시하였다.
단지 다른 설명은 신체가 외래세포 또는 기관을 발견하고 이에 대한 만성적 반응이 개시된다는 것이다. 임상적으로 이것은 종종 이식이후, 구체적으로는 골수(bone marrow)이식 이후에 일어나고, 만성 이식대 숙주(graft versus host, GVH) 질환으로 알려져 있다. 이러한 시나리오에서조차, 몇몇 외래 세포의 생존은 전체 면역계의 활성화를 유도하기에 충분하고, HIV 감염된 환자에서 나타나는 것과 유사한 공격적 자가-면역 반응을 유도한다. 상기 질환의 임상적 특징은 AIDS와 놀라울 정도로 유사하므로 상기 바이러스의 발견에 앞서, 선도적인 미국 면역학자인 NIH(USA)의 진 쉐어러(Gene Shearer)는 상기 질환이 혈액 수혈 또는 성적 접촉에 따라 전염된 외래 세포에 의하여 유도될 수 있다고 제안하였다. 그 후 몇 개월 뒤에, 상기 바이러스 및 인자 Ⅷ(factor Ⅷ; 세포외 산물)에 의한 전파의 발견으로 인하여, 상기 관찰 중요성이 무시되었다.
전체 활성화에 대한 또 다른 설명이 없었으므로, 대글레쉬와 하베쇼(Habeshaw)는 상기 바이러스가 HLA 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ(이것이 자신 및 본 항원을 결정하는 분자이다)를 흉내낼 수 있는 증거를 찾고자 하였다. GP120의 몇 가지 서열이 HLA에 대한 작은 동일성을 갖는다는 것이 이미 발표되었지만, 본 발명자들은 HLA 클래스 Ⅰ 및 HLA 클래스 Ⅱ에 대한 구조적 유사성으로 특징되는 HIV 외피(GP120)의 주요한 부위를 확인할 수 있었다. 엘리자베스 하운셀(Elizabeth Hounsell; MRC)은 구조가 상세히 알려진 HLA 분자의 뒤면에 GP120의 모형을 만들 수 있었다. 이들 분자와 서열에 기초하여, 하베쇼 및 하운셀은 HLA-B8에 감염된 사람은 상기 바이러스를 "이질적인 것(foreign)"으로 인식할 수 있으며, 또한 HLA-B27에 감염된 사함은 상기 바이러스를 "자신(self)"로 인식할 수 있다고 예측하였다. MRC에 의하여 UK에서 수행된 전체-HIV HLA 마커 연구에서 의미있는 단지 HLA 차이로 인하여, HLA-8B에 감염된 사람은 개체군의 나머지 보다 훨씬 더 빠른 속도로 질병이 전파되고, 장기간 동안 전파되지 않는 사람 또는 극히 느리게 전파되는 사람들은 HLA-B27에 감염된 사람들이라는 것은 이제는 공인된 사실이다.
이어지는 연구에 의하여, 하기의 결과가 확인되었다:
(1) 외래 세포(즉, 다른 HLA 유형)에 감염에 반응하여 활성화된 킬러 T-세포(killer T-cell)는 또한 HIV 감염된 자신의 세포를 죽일 것이다.
(2) GP120(본 발명자들은 이것이 자신을 결정하는 HLA 분자와 구조적 동일성을 갖는다고 확신한다)으로 알려진 HIV 바이러스의 외피는 HLA에 매우 유사한 경향으로 펩티드에 결합할 수 있다. 아울러, GP120을 흉내내는 펩티드 및 HLA에 의해 활성화된 T-세포는 또한 상기 펩티드를 갖는 GP120과 반응하지만 상기 펩티드가 없는 GP120과는 반응하지 않음으로써, 펩티드에 결합할 수 있는 능력이 확인에 있어 대단히 중요하고, 따라서 민감한 개체에 만성적 면역 활성의 원인이 되는 능력임을 암시한다.
(3) 보다 최근에 본 발명자들은 펩티드가 HLA에 결합하는 부위가 GP120에 존재하고, 친절하게도 보스톤의 다나 파베르(Dana Faber)의 소도로스키(Sodroski) 교수에 의하여 수행된 바와 같이, 만일 상기 분자의 이 부위가 제거된다면 상기 펩티드는 더 이상 결합할 수 없을 것이라는 입증하였다.
상기 관찰의 놀라운 점은 이론적으로는 상기 시스템의 면역 활성화는 차단될 수 있으며 따라서 상기 질환이 더 이상 진행되지 않을 수 있음을 나타낸다. 이러한 관점에서 2가지 주요한 관찰이 있었으며, 이중의 하나는 상기 과학의 결과와 같은 골수 상실로 인하여 AZT를 더 이상 복용할 수 없는 환자가 두드러진 부작용 없 이 장기간 동안 복용할 수 없는 고전적 헤비 히팅 항-염증제(classic heavy hitting anti-inflammatory agent)인 스테로이드를 복용하는 임상적 연구에 관한 것이었다. 본 발명자들은 스테로이드를 갖고 GUH 질환과 대단히 유사한 고전적 특징을 갖는 중병의 환자에 있어서 놀라운 호전을 목격할 수 있었으며, 이러한 효과를 나타내기 위하여 필요한 투여는 장기간 동안에 매우 높지만 실질적으로 비례하지 않음을 입증할 수 있었다. 보다 최근에 듀크(Duke) 대학(USA)의 한 연구진은 최근에 상기 바이러스의 로드(load)가 자가면역(만성적 이식 숙주 질환의 고전적 특징)으로 간주되는 증상으로 고생하는 HIV에 관한 스테로이드 투여된 환자에서 감소한다는 것을 입증하였다. 짧게 말하면, 구체적으로 HLA 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 유도된 기전에 작용하는 항-염증제는 HIV 감염에 대하여 유익할 수 있다는 것이 과학적 기본이 되었다.
분석 및 결과
산양 혈청이 어떤 염증 특성을 갖는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 다른 유전적 배경을 갖는 2 다른 개체의 세포를 혼합함에 의하여 형성된 반응에 상기 산양 혈청을 첨가하였다. 놀랍게도 이것이 상기 반응을 저해하는데 대단히 효과적이었다. 수많은 분자 항체를 사용하여, 본 발명자들은 산양 반응에 가까웠던 유일한 항체가 항 HLA 클래스 Ⅱ였음을 확인할 수 있었다. 항-클래스 Ⅰ 항체는 단지 상기 반응을 부분적으로만 감소시켰다. 가장 흥미로운 것은 대부분의 과학계에서 백신에 대한 주요한 목표로 판단된 HIV V3 루프(loop)에 대한 항체가 실제로는 이 러한 전체 활성화에 가장 저조했다는 점이다. 이러한 발견은 상기 바이러스에 대한 면역 반응이 실제로는 상기 바이러스의 "제거(take off)"를 성장 및 격려시키며, 이 부위를 목표로 한 백신이 그렇게 비효과적인 이유를 설명할 수 있는 면역 활성화 이론과 잘 부합할 수 있다.
산양에 대하여 마술적인 성질을 종종 설명할 수 있고, 다른 동물로부터 형질이 특이적 분석에서 예기지 못한 활성을 가질 수 있다는 것을 명심하고서, 본 발명자들은 전혀 활성을 갖지 못하는 백신화 되지 못한 산양 혈청을 제조하였다. 이어서, 본 발명자들은 다른 백신 절차에 따라 다른 산양으로부터 추가적인 혈청을 제조하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 상기 혈청이 단지 HIV 외피 및 HLA 클래스 Ⅱ를 단지 나타냄을 확인할 수 있었다. 실제로, HLA과 상당한 동일성을 갖는다고 알려진 바이러스의 작은 비율도 상기 혈청에서 관찰되지 않는다.
그러므로, GP120에서 보존된 HLA 부위의 레퍼토리가 칵테일 주입된 산양의 혈청에 의하여 활발히 인식된다는 점에서, 본 발명자들은 대단히 놀랍게도 칵테일 주입과 상기 하나의 분리주의 주입 사이의 주요한 차이를 목격하였다.
상기 데이터의 해석은 HIV 주입된 산양은 다른 분리주를 사용하여 확대될 수 있는 반응에 유사한 강한 항-MHC 클래스 Ⅱ를 생산하는 사실로 요약될 수 있다. 이러한 분석이 도출될 수 있는 가능한 해석은 다음과 같다:
(1) 상기 HIV 외피는 HLA 클래스 Ⅱ에 너무나 유사하므로, 이것이 완전히 다른 HLA 레퍼토리를 갖는 산양 면역계에 의하여 인식된다.
(2) 두 번째 가능성은 면역원, 즉 상기 바이러스 제조에 있어서 바이러스가 발아하는 세포의 표면에 위치한 HLA가 포착되고 면역반응이 바이러스가 아닌 보조-연관된 HLA에서 일어난다는 것이다.
(3) 세 번째 설명은 상기 두 설명의 결합과 관련된다. 제조될 때, 발아하는 바이러스가 HLA와 융합하고, 상기 결합이 산양 혈청에 의하여 매우 강하게 나타나는 것이 가능하다. 최근의 보고에 의하면, 상기 바이러스가 HLA를 갖는 세포를 통하여 발아하여 막(membrane) 내로 상기 HLA를 삽입하지 않는다면, 상기 바이러스는 감염성이 없게 된다는 것이다. 이것은 몇몇 HLA는 세포 유입 기전을 활성화시키는 숙주 세포로부터 유도되어야 함을 의미한다.
이하에서 본 발명자들은 HIV 제조로 주입된 산양이 HLA 클래스 Ⅱ 분자에 대한 강한 항체 반응을 나타냄을 입증하였다. 관련된 세포가 HLA 클래스 Ⅱ를 과발현하기 때문에, 수많은 질환이 완전히 파괴적인 염증 증상을 유발한다고 알려져 있다. 비록 많은 유형의 자가면역 질환에서 이러한 성질이 공통되지만, 가장 잘 알려진 실시예의 하나는 다발성 경화증의 경우이다. 그러므로, 산양의 면역 반응은 이러한 분자의 내성을 파괴하고, 이러한 과정은 강한 항-염증 과정이 임상적 호전과 관련되어 생체내(in vivo)에서 일어날 수 있다. 이것이 장기간에 걸친 높은 투여의 스테로이드 사용의 경우에 일어난다면, 산양 혈청의 만성적 투여에 의하여, 현저한 부작용이 없는 분명한 장점이 될 것이다.
강한 항-HLA 클래스 Ⅱ인 항-HIV 반응은 항-AIDS 백신의 절실한 요구와 같이 바이러스 연계를 제공하는 것이 당연하고, 본 발명자들의 의도는 이러한 반응을 절단하여 가능한 HIV 백신을 제조하는 것이다.
HIV-1로 면역된 산양 혈청 및 항-염증 성질
서론
HIV-3B 바이러스 여액 또는 6가지의 다른 HIV-1 분리주의 NIH 바이러스 칵테일로 면역된 동물로부터의 산양 혈청을 제공하다. 상기 혈청의 일부는 좋은 효과를 나타낸 실험적 치료요법의 일부로서 앞서와 같이 사용될 수 있으나, 이것이 작용하는 기전은 알려져 있지 않다. 작용기전을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 HIV-1 gpl20, HLA-DR1 및 HLA와 서열 동일성을 갖는 바이러스 표면 당단백질(glycoprotein)의 다른 부위로부터 선택된 펩티드에 대한 ELISA 플레이트 위에 상기 혈청을 스크리닝하였다.
물질 및 방법
혈청 및 항체
출혈과 관련된 정보 및 면역화 날짜에 따라 수많은 HIV-3B 바이러스 여액 면역된 산양(1999년 9월 14일, 1999년 9월 21일 및 다시 2000년 9월 29일 및 2000년 11월 7일에 면역된 동물 #0125, #0126, #0127, #0128, #0129)으로부터의 시료로 환자의 치료를 위하여 사용된 최초의 HIV-3B 면역된 산양 혈청의 시료를 제공하였다. ELISA를 위하여, 본 발명자들은 단순히 보다 후기(2000년 11월 30일 및 2000년 12월 1일)에 생산된 출혈로부터 취해진 혈청 시료를 단순하게 선택하여 스크리닝하였다. 동물 #378을 다음과 같은 HIV 분리주(92HT593, 92US657, 92US660, 92US714, 92US723, 91US056)로 구성되는 NIH 바이러스 칵테일로 면역시켰다. 면역화는 11월 7일 및 28일에 수행하였다. 2001년 1월 25일에 생산 출혈로부터 취해진 혈청을 ELISA 스크리닝을 위하여 사용하였다. 또한 대조군 산양 혈청을 제공하였다. 상기 혈청과 함께, 본 발명자들은 ELISA와 혼합 림프구 반응 연구에 항-인간 HLA-DR 및 항-인간 HLA-DR, DP 및 DQ(파마닌젠(Pharmingen)) 및 MLR 연구 동안에 하베이 홀므즈(Harvey Holmes) 박사(영국, 포터스 바(Potter's Bar), 국립 생물 표준 및 조절연구소(National Institute for Biological Standards and Control)의 MRC AIDS 반응물 프로그램)를 통하여 J. 라만(Laman) 박사로부터 제공받은 HIV-i ⅡJb의 V3 영역(IRIQRGPGR)에 특이적인 마우스 항-gp 120 IgG(EVA3047)를 포함시켰다.
펩티드 및 단백질
재조합 HIV-i ⅢB gpl20을 중국 햄스터 난소세포(Chinese hamster ovary cell)에서 생산하고, MRC AIDS 시약 프로그램에서 하베이 홀므즈 박사를 통한 J. 라이나(Raina) 박사에 의하여 제공받았다. 펩티드 결합 실험 동안에 사용된 재조합 HLA-DR1은 돈 C. 윌리(Don C. Wiley) 교수에 의하여 제공된 단백질과 동일하였 다. 상기 연구에서 사용된 HIV-1 펩티드는 표 1에 목록화 된다. 펩티드 ARP7022, ARP710, ARP740-23, -28, -42, -44, -45, -46 및 -47은 MRC AIDS 시약 프로그램의 하베이 홀므즈 박사로부터 제공받았다. 대조군 펩티드 P12는 HIV-1 gpl20의 CS 부위의 무질서한 서열을 나타내고, 영국, 런던, 버크벡 대학(Birkbeck College), 생물 및 화학 과학학교(School of Biological and Chemical Sciences)의 E.F. 헌셀(Hounsell) 교수에 의하여 제공되었다. 펩티드는 사용전까지 -20℃에서 분활되어 보관하였다.
ELISA
ELISA를 브라운 등(Brown, et al., J. Immunological Methods, 1997, 200: 79-88)에 의하여 설명된 프로토콜과 유사한 프로토콜에 따라서 수행하였다. 펩티드 및 단백질을 각각 16 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖에서 0.05M의 pH 9.6 탄산염/중탄산염(carbonate/bicarbonate)의 결합 완충액과 혼합하고, 40℃에서 하룻밤 동안 임뮤론(Immulon) 4 LIBX 고결합 미세적정판(high binding Microtiter plate)(Dynex Technologies, INC. 14340 Sullyfield Circle, Chantilly, VA 20151-1683, USA) 위에 반복하여 코팅하였다. PBS에서 5 ㎎/㎖의 카제인을 사용하여 웰을 블로킹하고 40℃에서 하룻밤 동안 두었다. 산양 혈청을 PBS/0.25% 카제인에서 1/500 및 1/1000배로 희석하고, 정제된 항체는 각각 1/1000 및 1/3000배로 희석하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 웰을 웰워시 4 기계(Wellwash 4 machine; Denley)를 사용하여 PBS/0.05% 트윈(Tween 20)을 사용하여 3번 세척하였다.
고형화된 산양 항체를 PBS/0.25% 카제인/0.01% 트윈 20에서 1/1000로 희석된 퍼옥시다제(peroxidase) 연결된 마우스 단일클론 항-산양/양 IgG 클론 GT-34(SIGMA)를 사용하여 검출하고, 항-HLA 항체를 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 산양 항-마우스 IgG 퍼옥시다제 연결체(SIGMA)를 사용하여 검출하였다. 또 한번의 세척에 이어서, 신선하게 제조된 O-페닐린디아민 디하이드로클로라이드(O-phenylenediamine dihydrochloride) 기질(OPD; SIGMA)을 암실 조건의 실온의 웰에서 반응시키고 15분 뒤에 웰당 50 ㎕의 2.5M의 H2SO4의 첨가에 의하여 반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 기록기(Microplate Reader)를 사용하여 492 ㎚에서 OD값을 측정하였다.
표 1. 분석 동안에 사용된 펩티드
ARP7022: (DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC)
대부분의 유럽 및 아프리카 HIV 양성 혈청에 의하여 인지되는 HIV gp41(593-616)의 보존된 부위로부터의 24 잔기 펩티드. 대조군 펩티드.
ARP710: (VKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR)
gpl20/41 절단부위를 유도하는 HIV gp120(486-508)의 보전된 C-말단(CS) 도 메인으로부터 유도된 23 잔기 펩티드. HLA와 구조적 동일성을 포함한다.
ARP740/23: (RPVVSTQLLLNGSLAEEEVV)
gpl20(252-271)의 C2 부위로부터 유도된 20 잔기 펩티드. HLA DR4 β-사슬과 서열 동일성을 포함한다.
ARP740/28: (NTRKRIRIQRGPGRAFVTIG) (302-321) V3 루프HIV-1 gp120으로부터 유도된 20 잔기 펩티드.
ARP740/42: (GQIRCSSNITGLLLTRDGGNS) (438-458) DR-β1 사슬과 동일성을 포함한다.
ARP740/44: (NNESEIFRLGGGDMRDNWRS) (459-478) HLA-A2와 서열 동일성을 포함한다.
ARP740/45: (GQDMRDMWRSELYKYKVVKI) (469-488) M38에 의하여 인식되는 서열, HLA-C 및 C5 부위와 상호-작용하는 항체.
ARP740/46: (ELYKYKVVKIEPLGVAPTKA) (469-478) gpl20의 C5 말단으로부터 유도된 20 잔기 펩티드. C-말단에서 처음 3 잔기의 동일성을 포함한다.
ARP740/47: (EPLGVAPTKAKRRVVQREKR) (479-498) gpl20의 C5 부위로부터 유도된 20 잔기 펩티드. HLA와 구조적 유사성을 포함한다.
P12. (RAKTVERKVERRK)
E. 헌셀에 의하여 제공된 HIV gpl20의 CS 도메인의 뒤섞인 서열. WV 양성 혈청에 의하여 인지되지 않는다. 대조군 서열.
혼합된 림프구 반응 저해 분석.
*혈액 공여자
런던, 투팅(Tootng), 사우스 테임즈 혈액 수혈소(South Thames Blood transfusion service)의 리즈 벅크랜드(Liz Buckland)를 통한 공여자의 동의하에 HLA 클래스 Ⅱ 미스매치된(mismatched) 혈액 시료를 제공받았다.
PBMC 제조
신선하게 추출된 정맥혈을 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution; SIGMA)에서 희석하고, 주의하여 히도파크(Histopaque; SIGMA)에 오버레이(overlay)하고 20℃에서 25분 동안 800 g에서 원심분리 하였다. 파스테르 피펫(Paster pipette)을 사용하여 밀도 경계면으로부터 PBMC를 수확하고, HBSS에서 3번 세척한 뒤, 벡크만 쿨터 계산기(Beckman Coulter counter)를 사용하여 계측하였다.
혼합된 림프구 저해분석
주어진 MLR을 위하여, 2 HLA 클래스 Ⅱ 미스매치된 개체로부터의 PBMC를 10%의 가열 불활성된 인간 AB 혈청(SIGMA), 4 nM의 L-글루타민, 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)(SIGMA)을 포함하는 RPMI 1640 배지에 현탁하고 자극(stimulator) 또는 반응(responder) 세포로 명명하였다. 웰당 1× 세포에서 자극물 및 웰 당 1× 내지 10× 세포에서 반응물의 3배수에서 세포를 플레이트하여 10:1의 반응물 - 자극물 비율을 형성시켰다. 산양 혈청 및 다양한 항체에 의하여 추출된 세포 증식에의 어떠한 저해 효과를 측정하기 위하여, 3 ㎕의 비희석된 산양 혈청 또는 1 ㎕의 정제된 항체를 혼합된 세포 배양액을 포함하는 웰에 첨가하고 6일 동안 5% CO2의 37℃에서 배양하였다. 세포 수확에 앞서, 배양 5일 18시간 째에 배양액에 1 μCi의 3중수소 메틸티미딘(tritiated methylthymidine, 3H-Thd; Amersham)을 펄스 첨가하였다. 유리섬유 여과기매트(glass fibre filter mat) 위에 톰텍 하베스터 96 머쉬 Ⅲ 세포 수확기(Tomtec Harvester 96 Mach Ⅲ cell harvester)를 사용하여 세포를 수확하고, 왈락 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계측기(Wallac 1450 microbeta liquid scintillation counter)를 사용하여 3H-Thd 삽입을 측정하였다. 분당 평균 카운트(mean counts per minute, cpm)로 그 결과를 나타내었다.
*결과
산양 혈청에 존재하는 항-HLA 클래스 Ⅱ 항체
본 발명자들은 많은 것이 HLA에 서열 및 구조적 동일성을 갖고 있는 HIV-1 gpl20에 대하여 다른 산양 혈청이 다른 부위로부터 취해진 HIV-1 gpl20 펩티드를 인식할 수 있는 정도를 연구하였다(표 1). 본 발명자들은 또한 이들 분석에서 용해 가능한 HIV-1 gpl20 및 HLA-DR1를 포함시켰다. 상기 결과를 도 1 내지 도 9로 나타내었다. Bg는 배경 수준을 나타낸다. 0.1 이상의 OD를 예비-면역 혈청으로 나타낸 어떤 항원에 대한 반응성의 결여로 주어진 양성 결과로 간주하였다.
다른 혈청은 변화된 결과를 가져오지만, 일반적으로 HLA-DR1과 반응하는 경향으로 나타났다. 예비-면역 혈청은 스크리닝된 펩티드 또는 단백질의 어느 것과도 반응하지 않았으며, #0125 및 #0126은 어떠한 커다란 반응성을 나타내지 못했다. 그러나, 모든 다른 혈청은 HLA-DR1에 대한 높은 수준의 반응성, 구체적으로는 #0127 및 #0128이 매우 높은 반응성을 가짐을 입증하였다. HLA-DR1에 대한 상기 반응성은 명확성을 위하여, 항-인간 HLA-DR 및 항-인간 HLA DR, DQ 및 DP와 함께 도 9에서 비교된다.
항-HLA 활성은 상기 바이러스가 면역에 앞서 배양된 바로 그 세포로부터 HLA 분자에 대한 반응성을 가장 유사하게 나타낸다는 이유로 흥미롭다. HIV는 gpl20을 발현하는 것보다 그것의 외피에서 보다 많은 HLA 분자, 구체적으로는 세포에서 상향 조절되는 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 따라 끌려나오는 경향이 있으므로, 복합된 항-gp 120 및 항-HLA 클래스 Ⅱ 활성은 HIV에 대한 좋은 보호 반응을 나타내는 것일 수 있다. 어떤 혈청, 구체적으로는 #0127 및 #0128의 경우에 강한 "알로(allo)"-반응이 그것의 표면에 클래스 Ⅱ 분자의 고-수준을 운반하는 바이러스로의 면역을 통한 상기 산양에서 유도되었다.
HIH 바이러스 칵테일로 면역된 산양으로부터 혈청 #0378은 상기 혈청이 HIV에 대한 보다 나은 전체를 수행할 수 있는 것을 제안하는 본래의 항-LILV-3B 산양 혈청의 그것과 대략적으로 동일한 항-HLA DR1 수준을 갖는 복수의 HIV-i 펩티드에 대한 최소의 전체 라운드 크로스-반응성(cross-reacivity)을 입증하였다. 상기 혈청은 HLA와 동일성을 갖는 다양한 HIV-1 펩티드와 매우 잘 반응한다. 상기 혈청의 어느 것도 뒤섞인 대조군 서열 P12와 반응하지 않음으로써 상기 반응성이 LIIV 펩티드에 특이적임을 입증하였다. 혈청 #0127 및 #0128은 HIV-i gpl20에 결합하는 관점에서 최상의 혈청을 나타내는 반면에 항-HLA DR 활성의 매우 높은 양을 포함하고 있다.
산양 혈청에 의한 MLR 저해
도 10 및 도 11의 MLR을 갖고서 본 발명자들은 무질서한 미스매치된 개체로 부터의 세포를 사용하였다. 비록 이것들은 반드시 가장 커다란 증식을 생산하지는 않았지만(배지가 문제되는 시기에), 그 경향성은 산양 혈청(각 경우에 사용된 본래의 HIV-3B 면역된 혈청)에 의한 MLR 동안에 증식의 저해를 입증하는 것으로 나타났다. 이어서, 본 발명자들은 보다 나은 증식을 생산하는 HLA-클래스 Ⅱ 미스매치된 세포(도 12)를 사용하기 시작하였다. 항-HLA DR 항체를 갖고서 산양 혈청은 세포 증식을 완벽히 저해하는데 성공하고, 항-염증 활성을 갖는 것처럼 보일 수 있다.
본 발명자들이 ELISA 결과의 관찰로부터 판단하건대, 가장 가능성 있는 것은 항-HLA DR 항체가 상기 저해 효과의 원인이라는 것이다. 본 발명자들은 넓은 범위의 항체가 항-HLA DR 단독만큼 효과적으로 거의 어느 곳에서나 증식을 억제하지 못하는 것과 같이 전체적으로 항-클래스 Ⅱ 보다는 항-HLA DR의 역할을 강조한다. 이것이 발생할 수 있는 이유는 신비하지만, HLA-DR이 염증 활성에 관계된 주요한 클래스 Ⅱ 항원을 나타내고, 이것에 대한 항체는 증식을 억제하는 세포 내에 신호를 가져올 수 있다. 그러므로, 상기 산양 혈청은 세포 증식을 억제하는 항-염증제로서 작용하는 것처럼 보인다. 이것은 바이러스-유도 세포 활성인 바이러스 증식에 본질적인 HIV-1 감염의 경우의 양성 결과를 예측할 수 있다. 비록 표면에서 이것은 반대로-생산적(counter-productive)일 수 있지만, 온화한 면역억제제의 도입은 바이러스 증식을 저해하도록 작용할 수 있으며, 관련된 레트로바이러스 HTLV-1 또는 HTLV-2와는 달리 HIV와 같은 대조군 질환은 증식을 위한 세포 활성에 완전히 의존하도록 함으로써 세포를 불멸되도록 하지 않으며, 암의 원인이 되지 않는다.
현재까지, 바이러스가 감염된 세포를 활성화시키기 위하여 상대적으로 잘못-장비된 것처럼 보이는 바이러스가 어떻게 질환의 원으로 작용할 수 있는 방식을 유도하는 어떠한 알려진 T-세포 슈퍼항원도 HIV에서 확인되지 않았다. 본 발명자들은 바이러스 유도된 알로활성(alloactivation)이 그 근원이고, 바이러스 관련된 HLA 분자 또는 HIV 및 HLA 사이에 보여진 분자 흉내와 관련되어 있다는 이론을 연구 중에 있다. 상기 산양 혈청은 아마 이러한 전체-활성을 제한함에 의하여 단순히 환자의 상태 호전에 기여할지 모른다. 유사한 관찰이 바이러스 복제에 있어서, HLA 클래스 Ⅱ 분자, 구체적으로는 HLA-DR의 중요성을 입증한 사이푸딘 M 등에 의한 논문에 제시되었다(Saifuddin, M. et al., Clin. Exp. Immunology, 200, 221: 324-331). 그들은 HLA 클래스 Ⅱ 분자가 클래스 Ⅱ 발현하는 세포에서 바이러스 발현을 억제함을 강조하였고, HIV-1 전사의 증진에 있어서, 유도성 MHC 클래스 Ⅱ 트랜스활성화제(CIITA)의 관여를 제안하였다. 본 발명자들은 효과적으로 산양 혈청의 경우에 이들 효과를 관찰할 수 있었다. 증가된 증식의 원인이 되며, 따라서 사물의 전체 계획에 있어서 반대로-생산적일 수 있는 항-V3 루프 항체와 비교하여 이것을 취하였다. gpl20의 가장 가변적인 V3 루프 지역은 바이러스 탈출 돌연변이를 가능하게 할 뿐만 아니라 활성화의 추가적인 라운드를 위한 면역 시스템을 위한 유인장치(decoy)로 작용한다. 불행히도 상기 지역의 앞선 점령은 최종적으로는 바이러스에게 이로우며 활성이 보다 유용할 수 있는 보다 보존된 지역으로부터 떨어진 면역 반응을 유지시킨다.
정말로 항-염증 효과가 상기 혈청 활성의 주요한 모드라면, 이어서 과-활성화된 세포 증식이 질환 증후군, 예를 들면 다발성 경화증의 근원에 있는 다양한 다른 조건에 유용할 수 있다. 추가적인 실험을 위하여, 항-HLA 및 gpl20 활성의 정도를 확인하기 위하여, 상기 혈청에 대한 ELISA를 반복하는 것이 중요하다. 이러한 경우에, 본 발명자들은 HLA-DR1 뿐만 아니라 HLA 항원에 대한 동일성을 갖고 있는 많은 HIV 펩티드와 효과적으로 반응하는 NIH 바이러스 칵테일로 면역된 동물로부터의 혈청 #0378에 커다란 관심이 있다.
추가적인 실험
이하의 데이터는 본 발명자들이 관습적인 치료법이 더 이상 적당하지 않은 다발성 경화증 및 AIDS로 고생하는 지원자에 대한 치료의 형태로 사용되었던 산양 혈청에서 항-HLA 항체를 확인한 앞서 언급된 실험과 유사한 실험으로부터 얻어진 것이다. 본 발명자들의 연구는 치료 이후에 이들 환자의 회복에서 산양 혈청의 작용의 제안된 항-염증 기전의 연구와 관련된다. 이것은 항-HLA 항체가 주목된 앞서서 제안된 것이다. 그러나, 본 발명자들은 FAS 수용체를 발현하는 세포에 몇 시간 내에 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 능력이 주어졌고, 이제 산양 혈청에 존재하는 항-FAS 항체의 역할을 첨부한다.
FAS/APO-1(CD95)은 확실히 활성적인 림프구에 대량으로 존재하고, 세포가 FAS-리간드 또는 항-FAS 항체와 상호연결을 뒤따르는 자살하도록 유도하는 신호를 보낸다. 상기 분자의 역할은 감염된 세포를 죽이는 세포독성 면역 반응에서뿐만 아니라 숙주에 해로울 수 있는 세포의 계속적인 증식을 막기 위하여, 항원이 사라진 이후에 면역 반응을 하향 조절하는데도 극히 중요하다. 그러므로, 상기 경로는 균형된 면역반응을 유지시키는 데 핵심이 된다.
HIV 감염의 경우에, 상기 면역 시스템은 이러한 과정을 위한 활성화된 세포를 필요로 하는 것처럼 바이러스 증식을 위한 풍부한 공간을 부여하는데 있어서 비정상적으로 활동적인 것처럼 보인다. 다발성 경화증 환자에 있어서, 대단히 활성화된 세포가 혈액 뇌 장벽을 가로지르고, 프라크(plaque) 형성과 신경 기능의 상실을 유발하는 수초(myelin sheath) 손상을 책임진다.
산양 혈청에 존재하는 항-HLA 항체(최소한 항-HLA DR)의 활성을 통하여 중재되는 항-염증 기전은 환자의 회복 뒤의 기전일 수 있다. 본 발명자들은 이제 항-FAS 항체가 변화하는 정도로 산양 혈청에 존재함을 발견하였고, 다발성 경화증 및 AIDS 환자에 활성 모드를 위한 이러한 제안된 항-염증 기전에 있어서 항-HLA 및 항-FAS 항체의 역할을 결합할 것을 제안한다. 본 발명자들은 상기 항체가 가장 높은 활동의 세포를 목표로 하여 이들의 죽음을 유발시키는 반면에 항-HLA 항체는 어떤 면역활성을 약화시킨다고 제안한다. 어어서, 급격히 감소된 사이토카인과 케모카인의 생성이 이어지고, 다발성 경화증에 있어서 수초(myelin)의 면역 공격의 종결 또는 활성화된 세포의 결여 및 바이러스를 방출중이거나 방출하려하는 세포의 죽음이 주어진 HIV 감염된 환자의 경우에 있어서 감소된 바이러스 로드를 가져올 수 있다.
실험적 연구
본 발명자들은 혼합된 림프구 반응(MLR)으로 첨가될 때, 반응물로부터 산양 혈청이 세포에 손상을 주고 있는 지를 항-FAS 항체 주어진 관찰에 살펴보기 시작하였다. MLR은 림프구 증식 및 증가된 전환(turnover)을 가져오는 비-특이적 경향으로 반응하는 다른 HLA 유형을 갖는 2 다른 사람으로부터의 림프구 결과이다. 본 발명자들은 이것이 자가면역 반응이 모두 HLA 클래스 2 분자 위에 자가-펩티드의 부적당한 발현을 겨냥하는 항-염증 항체를 시험하는 좋은 시스템이라고 판단한다.
도 13 내지 도 16은 혈청과 함께 및 혈청 없이 몇 가지 최근의 MLR로부터 취해진 사진이다.
도 13은 72시간 이후에 혼합된 림프구 반응의 사진이다.
도 14는 72시간 동안 이어진 예비-면역 혈청과 혼합된 MLR이다.
모든 경우에, MLR 자체를 갖는 그것으로부터 현저한 변화는 없다. 사실, 예비-면역 혈청은 MLR을 증진시킨다.
도 15는 혈청 #0125가 첨가된 MLR이다. 상기 혈청은 낮거나 무시할만한 HLA 및/또는 FAS 항체가 존재한다는 점에서 면역에 반응성이 없는 산양부터 생성되었고, 이것은 본 발명자들이 반응물에서 항-HLA DR을 확인한 이전의 ELISA 결과와 일치하였다.
도 16은 매우 좋은 반응물이라고 판명된 혈청 #0127이 첨가된 MLR이다. MLR에 있어서 많은 PBMC의 현저한 세포 파괴가 있다. 이러한 결과는 치료를 위하여, 현재 사용중인 혈청 제조에 따른 모든 강한 반응물과 유사하다.
본 발명자들은 MLR의 경우에서와 같이, 가장 활성인 세포의 파괴를 유도할 수 있는 항체를 찾고자 결심하였다. 그러므로, 본 발명자들은 FAS 수용체를 교차결합할 수 있으며 세포사멸이 일어나는데 필요한 신호를 유도할 수 있는 FAS에 대한 항체의 존재를 살펴보았다. 결과적으로, 본 발명자들은 최소의 반응물인 산양 혈청에서 상기 항체의 존재를 입증하고 항-HLA 항체로 앞서의 결과를 보완하는 FAS에 대한 ELISA를 수행하였다.
본 발명자들의 앞서의 데이터에 따라 상기 결과는 세포 파괴로 인한 감소된 세포 증식을 가져오는 본 발명자들이 MLR 결과에서 살펴본 것과 매우 잘 일치하였다.
최근의 ELISA 결과로부터, 본 발명자들은 관습적인 치료가 더 이상 적당하지 않은 다발성 경화증(MS) 및 AIDS로 고생하는 지원자에 대한 치료의 형태로 사용되 었던 산양 혈청 내에 추가적으로 가능한 활성 성분을 확인하고자 착수하였다.
예비-면역 혈청의 1/1000 희석에서 ELISA 스크리닝으로부터 결과는 낮다. 상기 스크린된 항원은 오발부민(ovalbumin), HLA-DR1(DR1), Fas, 신경성장인자 수용체 p75(NGFr), 세레토닌(seretonin) 수용체(Ser R), 도파민(dopamin) 수용체(Dop R), CXCL 10 및 인터페론-감마에 의하여 유도된 모노카인(monokine)(MIG)이다.
도파민 수용체에 대한 항체는 혈청에서 고농도로 존재함은 이미 분명한 반면에 다른 항원의 어떤 것에 대한 반응성은 없다. 그러나, 치료를 위하여 앞서서 사용된 본래의 3B 혈청에 많은 이들 항원의 활성이 존재하고 HIV Ⅲb로 면역된 산양로부터 생산된 혈청 0127은 NGFr, 도파민 수용체 및 CXCL 10에 대한 활성을 포함하여 T-세포주에서 생산되었다.
본 발명자들이 앞서 제안한 바와 같이, HLA 및 FAS에 대한 활성은 다시 분명하고, 항-염증 기전과 일치된다. 이러한 항목을 유지하면서, 본 발명자들은 이제 CXCL10 및 신경성장인자 수용체 p75(NGF R p75)에 대한 활성을 추가할 수 있다. CXCL 10에 대한 항-혈청은 최근에 감소된 CD+ T-세포 및 CNS의 대식세포(macrophage) 침입을 통하여 다발성 경화증의 쥐(murine) 모델에서 질병의 심각성을 현저히 감소시키고 TH1 사이토카인 IFN-γ의 발현을 감소시키고 수초 재형성(remyelination)을 증가시킴에 의하여, 유익함을 입증하였다. 이것은 염증 상처 의 국부 세포가 수용체 CXCL3를 경유하여 염증 TH1 세포에 결합하고 유도하는 CXCL 10을 흔하게 생산함을 주는 점에서 흥미롭다. 그러므로, 상기 케모카인의 무력화 또는 산양 혈청의 항체에 의한 그것의 수용체의 차단은 본 발명자들이 산양 혈청을 위하여 제안한 작용의 항-염증 기전의 일부일 수 있다.
어째든, 낮은 친화력의 신경성장인자 수용체 NGF R p75에 대한 항체는 BGF가 수용체에 도달하는 것을 차단함을 통하여 HIV 감염된 단핵구(monocyte) 및 대식세포에서 세포 죽음과 연관되며, 이것은 다시 다른 항-염증 기전을 나타낸다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 T-세포 단독으로 보다 PBMC에서 주로 생산된 6가지의 다른 HIV 바이러스의 칵테일을 갖는 산양 면역을 통하여 생산된 혈청 #0378에 존재하는 상기 수용체에 대한 항체의 가장 높은 수준을 발견하였다. 상기 활성은 1/4000 희석에서조차 매우 높게 유지된다.
그러므로, 본 발명자들은 양 질환의 경우에 혈청을 위하여 제안된 작용의 항-염증 기전을 유지하면서 상기 항원에 대한 상기 활성을 첨가하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 치료와 관련된 상태 호전(well being)의 원인이 되는 것으로 도파민 및 세로토닌 수용체에 대한 활성을 추가한다.
본 발명자들은 상기 산양으로부터 예비-면역 혈청과 함께 HIV로 최근에 백신화된 많은 새로운 산양(707-718)을 스크리닝하였다. 이들 중 어느 것도 상기에서 나타낸 본래의 예비-면역 혈청과 같은 도파민 수용체에 대한 항체를 나타내지 않지만, 상기 산양의 일부는 광견병 백신을 접종하지 않은 웨일즈(Wales) 지역의 산양과 비교에 의하여 평균적으로 상기 항체의 보다 높은 수준을 갖는다. 본래의 예비-면역 시료에 존재하는 보다 높은 수준은 강한 반응에 의하여 이어지는 지난 몇 번의 환경 인자의 접촉에 기인할 수 있다.
또 다른 면역원
추가적인 변형으로, 항체를 발생시키는 면역원으로 HIV 바이러스의 사용은 필요하지 아니하고, 인간 백혈구 세포를 효과적인 항체 제조를 줄 수 있는 면역원으로 이용하였다. 도 30은 HIV 칵테일 및 SHULA로 명명된 인간 백혈구 세포로 면역된 산양으로부터 혈청에 관한 개략도를 제공한다.
본 발명은 부적당하게 높은 수준의 HLA를 갖는 질환의 치료를 위한 항-HLA를 함유한 혈청을 제공함으로써, 다발성 경화증, 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 일차 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 자가면역 간경변(cirrhosis autoimmune) 및 심장, 폐, 피부, 위장관(gastrointestinal tract), 신장(kidney), 뇌(brain), CNS에 관련된 바이러스 b 및 c 자가면역 신체 이상을 치료할 수 있으며, 보다 광범위하게는 HIV, 염증 질환, 자가면역 질환, 축색돌기(axon) 또는 신경손상 또는 이와 관련된 손상 또는 암 및 기타 질환 또는 염증 증상을 갖는 신체 이상을 치료할 수 있다.
도 1 내지 9는 항-HLA 클래스 Ⅱ 항체의 존재의 측정에 관한 것이고;
도 10 내지 16은 MLR 연구에 관한 것이고;
도 17 내지 19는 항-FAS 항체의 존재의 측정에 관한 것이고;
도 20 내지 29는 추가적인 항체의 존재의 측정에 관한 것이고; 및
도 30은 다른 면역원으로 면역된 산양의 혈청에 관한 유형 분석을 제공한다.

Claims (14)

  1. 산양, 말 또는 양의 항-HLA 항체를 함유하며, 상기 항-HLA 항체는 HIV에 의한 감염으로 증진되는 것을 특징으로 하는, 염증 질환, 자가면역 질환, 축색돌기 손상, 신경 손상, 암 또는 염증성분과 관련된 증상의 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항-HLA 항체는 산양(goat) 항-HLA 항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 (polyclonal) 항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체는 항-HLA 및 항-HIV 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 항-HLA 항체는 FAS, 도파민 수용체, 세로토닌 수용체, 신경성장인자 수용체 p75 및 케모카인 CXCL10(IP10)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 질환은 다발성 경화증인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 질환은 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 질환은 신경염인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제 6항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, HIV의 실험실 조건(in vitro) 성장에 적합한 배지로 산양을 감염시켜 제조될 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, HIV의 실험실 조건(in vitro) 성장에 적합한 배지로 산양을 감염시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 배지는 세포 배양 생장 배지의 상청액인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 세포 배양 생장 배지는 PBMC 생장 배지인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제 6항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포주 막 항원으로 산양을 감염시켜 제조될 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 인간 세포주로 산양을 감염시켜 제조될 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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