PL212567B1

PL212567B1 - Nanokapsulki przeznaczone do przenoszenia cytostatyków do miejsc wystepowania chorób inwazyjnych w organizmie pacjenta i sposób ich wytwarzania

Info

Publication number: PL212567B1
Application number: PL388093A
Authority: PL
Inventors: Maciej Siewinski; Katarzyna Małolepsza-Jarmołowska; Marek Bryjak; Wojciech Witkiewicz; Wojciech Mikulewicz; Tadeusz Trziszka; Ewa Kilar; Tadeusz Sebzda
Original assignee: Akademia Medyczna Im Piastow Slaskich We Wroclawiu
Priority date: 2009-05-21
Filing date: 2009-05-21
Publication date: 2012-10-31
Also published as: PL388093A1; WO2010134829A2; WO2010134829A3

Description

Przedmiotem wynalazku są nanokapsułki przeznaczone do przenoszenia cytostatyków do miejsc występowania chorób inwazyjnych w organizmie pacjenta i sposób ich wytwarzania. Dotyczy to leków przenoszonych do tkanek lub pojedynczych komórek lub guzów rakowych, a także do miejsc charakteryzujących się zmianami dystroficznymi, w celu odizolowania toksycznego leku przez okres jego przebywania w organizmie do momentu połączenia się z komórkami rakowymi.

Kluczowa strategia najnowszych kierunków terapii onkologicznych dotyczy ukierunkowania zwiększenia skuteczności niszczenia nowotworów przez znane leki, przy maksymalnej redukcji ich toksyczności w stosunku do zdrowych komórek i narządów pacjenta. Idealnym sposobem takiego kierunku terapii byłoby dostarczenie leku wybiórczo do komórki nowotworowej lub narządu, w którym rozwijają się patogenne procesy. Taką rolę przypisuje się terapii celowanej, której zadaniem jest rozpoznanie i dostarczenie do komórek rakowych konkretnego leku. Podstawą tego kierunku badań jest założenie, że przy użyciu specyficznie skonstruowanego przenośnika nawet toksycznego leku, można doprowadzać go do konkretnego miejsca w organizmie, unikając zarazem jego kontaktu ze zdrowymi tkankami i narządami. Lek zamknięty w kapsułce powinien dotrzeć do chorej tkanki i dopiero po związaniu się z chorymi komórkami rozpocząć swoje działanie.

Pierwszym, który zainicjował taki kierunek badań był Paul Ehrlich w 1906 roku (Ehrlich P. (1906): Collected Studies on Immunity. Reprinted. 2: 442-447. Wiley, New York.). Od tego czasu, pomimo intensywnych poszukiwań nie uzyskano jeszcze zadowalających wyników. Poznano dotychczas bardzo dużą liczbę związków dopuszczonych do badań klinicznych lub przed klinicznych. Okazały się one jednak zbyt toksyczne w stosunku do zdrowych komórek i narządów, co doprowadzało do poważnych uszkodzeń zdrowych komórek i tkanek. Mimo, że do chwili obecnej przebadanych zostało tysiące różnych preparatów, które w badaniach in vitro niszczą komórki rakowe, to musiały zostać wyeliminowane z dalszych badań klinicznych z powodu toksycznych działań ubocznych. Ocenia się, że tylko niespełna 1% zakwalifikowany zostaje do dalszych badań przed klinicznych.

Lek celowany powinien mieć jak najbardziej ograniczony kontakt ze zdrowymi komórkami i narządami, aby uniknąć efektu toksyczności. Założeniem jest, że aktywny lek celowany powinien działać tylko na komórki i tkanki nowotworowe. Istotną cechą takich form leków jest też wybiórcze blokowanie konkretnych szlaków metabolicznych decydujących o rozwoju nowotworu.

Przykładem leków celowanych są leki zamknięte w nanokapsułkach. Pewna ilość substancji o znanej skuteczności działania przeciwko konkretnym nowotworom umieszczona zostaje w nanokapsułce zbudowanej z substancji, która ulega w organizmie powolnej samodegradacji w organizmie pacjenta, utrzymując stężenie leku na stałym poziomie. Do badań klinicznych dopuszczono dotychczas mikrokapsułki zbudowane najczęściej z liposomów, krzemu, gumy guar, siarczanu chondroityny, pektyny, skrobi i amylozy, dekstranu, inuliny, chitozanów i innych. Ulegają one w organizmie autogennej biodegradacji powodując uwolnienie zamkniętych w nich leków (Baker PJ. (2008): Perspectives on chronić Lyme disease. Am J Med. 21, 562-564).

Sposób ten znalazł już zastosowanie przy wprowadzaniu do organizmu antybiotyków, a ostatnio prowadzi się próby nad podawaniem insuliny. Utrzymuje się w ten sposób przedłużone uwalnianie substancji leczniczej w organizmie ograniczając częstotliwości jej podawania (Yang H, Landis-Piwowar KR, Chen D, Milacic V, Dou QP. (2008): Natural compounds with proteasome inhibitory activity for cancer prevention and treatment. Curr Protein Pept Sci. 9, 227-39).

Terapia celowana jest terminem bardzo ogólnym, który nie precyzuje budowy leku ani jego punktu przyłączenia. Najważniejszymi kierunkami są obecnie dwie podstawowe grupy leków, w których wykorzystano przeciwciała monoklonalne oraz drobnocząsteczkowe inhibitory kinaz tyrozynowych. Do innych należy między innymi bortezomib - dwupeptyd hamujący aktywność proteasomów oraz oligonukleotydy antysensowe, hamujące ekspresję określonych onkogenów na zasadzie komplementarnego wiązania swoistych sekwencji DNA (1 Okamoto OK, Perez JF. (2008) : Targeting cancer stem cells with monoclonal antibodies: a new perspective in cancer therapy and diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 8, 387-93).

Dużą zaletą odkryć ostatnich lat okazały się nanocząsteczki biokompatybilne zawierające tabularne pory, które są łatwe do modyfikacji. Mają one możliwość przyłączania ligandu przeciwko wybranemu specyficznemu receptorowi komórki nowotworowej, co pozwala stosowanym nanocząsteczkom stać się rozpoznanym przez komórki nowotworowe. Obecnie możliwe jest już wprowadzanie do organizmu pacjenta przeciwnowotworowych leków przy użyciu polimerów sprzężonych z poliglikolem

PL 212 567 B1 etylenowym lub w albuminach lub w liposomach. W ostatnich latach rozpoczęto opracowywać sposób dostarczania leków przeciwnowotworowych do komórek rakowych przy użyciu nanocząsteczek krzemowych z wbudowanymi w nie cytostatykami, które mają średnicę około 100 nm i zawierają tysiące porów o średnicy około 3 nm. Porowate nanocząsteczki stały się nowym kierunkiem celowanej terapii, w celu uniknięcia problemu dostarczania do nowotworu leków o niskiej rozpuszczalności w roztworach wodnych.

W ciągu wielu lat wprowadzono w medycynie dużą ilość nowych leków hamujących nowotwory, jednak nie stwierdzono zbyt radykalnego postępu w leczeniu nowotworów. Badania starają się obecnie ukierunkowywać na przedłużenie życia chorych, co nie jest związanie z wyleczeniem nowotworu, ale ustabilizowaniem procesu rozwoju choroby.

Z badań własnych łączących ideę P. Erliha z uzyskanymi wynikami, stanowiącymi ponadto uzupełnienie dotychczasowych badań, przedstawionych w wybranych międzynarodowych ośrodkach naukowych, wynika możliwość wykorzystania specyficzności oddziaływania pomiędzy inhibitorami cysteinowych peptydaz izolowanymi z różnych źródeł w stosunku do katepsyn B i L, których nadekspresja pojawia się głównie w miejscach rozwoju nowotworu. Od lat trwają poszukiwania specyficznych inhibitorów tych enzymów, które kontrolowałyby ich aktywność w kluczowych procesach związanych z rozwojem nowotworów oraz, które nie byłyby toksyczne w stosunku do komórek prawidłowych.

Z polskiego patentu znany jest sposób otrzymywania inhibitorów tiolowych proteinaz z moczu. Są one autogenne i nietoksyczne w stosunku do organizmu pacjenta. Koniecznością jest pozyskiwanie tych inhibitorów indywidualnie dla każdego pacjenta. Okazało się, że hamują one enzymy cysteinowe peptydazy we krwi chorych na nowotwory, a wyniki pozwoliły wykazać ich skuteczność hamowania katepsyn B i L we krwi pacjentów, co pozwoliło na zgłoszenie propozycji nowej terapii przy użyciu inhibitorów autogennych (Siewiński M. (1993): Autologous cysteine peptidase inhibitors as potential anticancer drugs. Anti - Cancer Drugs 4, 97- 99).

Kolejnym źródłem pozyskiwania inhibitorów okazały się łożyska i wody płodowe ludzi lub zwierząt. Z patentu polskiego nr 190404 znany jest środek farmaceutyczny działający przeciwko nowotworom, mikroorganizmom chorobotwórczym i chorobom inwazyjnym. Niezależnym kierunkiem poszukiwań źródła pozyskiwania inhibitorów okazały się białka jaj. Przełomowym okazały się wyniki badań zespołu japońskiego którzy wykazali wysokie podobieństwo w ich budowie genetycznej do podobnych inhibitorów obecnych w organizmie człowieka (Saitoh E., Isemura S., Sanada K. (1988): Cystatin superfamily. Evidence that family II cystatin genes are evolutionary related to family III cystatin genes. Biol Chem. Hoppe-Seyler 369, 191 - 1978).

W polskim patencie nr 174636 opisano izolację cystatyny z białka jaj prostą metodą, wydajną, tanią, co pozwoliło pozyskiwać cystatyny w dużych ilościach i wykorzystywać je w badaniach przed klinicznych. Stwierdzono, że inhibitory z białka jaj oraz łożyska hamowały in vivo aktywność katepsyn B i L we krwi zwierząt ze wszczepionym ludzkim nowotworem. Okazało się ponadto, że poliklonalne przeciwciała, dla których antygenem były kompleksy inhibitory cysternowych peptydaz pozyskiwane z białka jaj lub łożyska oraz katepsyny B specyficznie łączyły się z analogicznymi kompleksami.

Jak wiadomo nanokapsułki powstają w reakcjach, w których tworzą się micele. Micele są to cząstki występujące w trwałych emulsjach. Tworzą je związki chemiczne o własnościach amfifilowych. Są one kulistymi tworami zawierającymi od kilkudziesięciu do kilkuset cząsteczek. Cząsteczki amfifilowe charakteryzują się zwykle wydłużonym kształtem, przy czym jeden ich koniec ma własności polarne a drugi apolarne. W rozpuszczalnikach polarny koniec każdej cząsteczki poszukuje polarnego środowiska, na skutek czego samorzutnie ustawia się na zewnątrz miceli. Drugi, apolarny koniec, chowa się we wnętrzu miceli, wskutek czego ma kontakt z apolarnymi końcami innych cząsteczek i jest jednocześnie odseparowany od rozpuszczalnika. W przypadku, gdy emulsja tworzy się w rozpuszczalniku apolarnym struktura miceli jest dokładnie odwrotna - polarne końce cząsteczek znajdują się w jej wnętrzu, zaś apolarne na zewnątrz. Na granicy miceli i rozpuszczalnika zachodzi zjawisko solwatacji, co powoduje, że micela składa się z kłębka cząsteczek substancji rozpuszczonej i cienkiej otoczki cząsteczek rozpuszczalnika na stałe związanej z micela.

Z publikacji : C. Yanthier, B. Cabane, D. Labarre : How to concentrate nanoparticles and avoid aggregation, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 69 (2008) 466-475 znany jest sposób sporządzania nanosfer poliisobutylcjanoakrylatu przez redukcję zasadniczej polimerowej emulsji monomerów dekstranu. Polega on na dodaniu 0,5 ml isobutylocjanoakrylatu podczas silnego magnetycznego mieszania do 10 ml 0,2 molowego kwasu azotowego zawierającego 0,1375 g dekstranu 66,900 i 16 milimoli ceru IV. Roztwór kwasu azotowego był usuwany z azotem podczas

PL 212 567 B1 minut przed dodanie monomeru i utrzymywany w 40 stopniach C. Po jednej godzinie polimeryzacji zawiesina nanocząsteczek była schładzana do 20 stopni w lodowej łaźni. Nanosfery i nanokapsułki z poli(epsilon-kaprolaktonu) były sporządzane techniką nanoprecypitacji. Nanosfery były uzyskiwane przez nanoprecypitację 200 mg poli(epsilon-kaprolaktonu) rozpuszczonego w 20 ml acetonu w 40 ml wody, zawierającej 500 mg Pluronic F 68. Do uzyskania nanokapsułek 0,2 ml Miglyol 812 było dodane do acetonowego roztworu poli(epsilon-kaprolaktonu) (20 ml, 200 mg/ml). Aceton i część wody były odparowywane z zawiesiny uzyskanej po nanoprecypitacji przez odparowywanie pod próżnią do uzyskania finalnej objętości 20 ml. Dla rozmaitych eksperymentów zawiesina nanocząsteczek była dalej oczyszczana trzy razy przez dializy w przeciwprądzie wody za pomocą Spectra Por Cellulose - estrowej membrany dializacyjnej MWCO 100,000 w celu usunięcia ewentualnych pozostałości dekstranu lub Pluronic F 68. Powstały oczyszczone zawiesiny nanocząsteczek przeznaczone do wykorzystania jako nośniki leków.

Z publikacji : Lifeng Qi, Zirong Xu, Xia Jiang, Yau Li and Minqi Wang : Cytotoxic activities of chitosan nanoparticles and copper-loaded nanoparticles, Bioorganic & medicinal Chemistry Letters 15 (2005 ) 1397 - 1399 znany jest sposób sporządzania nanosfer chitozanowych. Chitozanowe nanocząsteczki i miedź dwuwartościowa preparowane są na bazie jonowego żelowania chitozanu z trójfosforanowymi anionami i sorpcji jonu miedzi. Nanocząsteczki były filtrowane przez membranę o porach 0,45 ąm i autoklawowano w celu usunięcia pozostałości przed zastosowaniem w kulturach komórkowych. Nanocząsteczki były stabilne w warunkach autoklawowania. Powstałe nanocząsteczki wykazują cytotoksyczną aktywność.

Wynalazek dotyczy nanokapsułek przeznaczonych do przenoszenia cytostatyków do miejsc występowania chorób inwazyjnych w organizmie pacjenta, o wnętrzu wypełnionym wodnym roztworem cytostatyku.

Istota wynalazku polega na tym, że nanokapsułki stanowią utwardzone micele o wymiarach 20-250 nm i po włóczkach utworzonych z dekstranów, związków krzemowych lub chitozanu, które są otoczone warstwą inhibitora cysteinowych peptydaz, otrzymywanego z różnych źródeł takich jak mocz pacjentów chorych na nowotwór, zoperowane tkanki rakowe, wody puchlinowe towarzyszące nowotworom, z łożysk i wód płodowych ludzi lub zwierząt, a także z białka jaj, o jednostce aktywności o czystości od 50 do 100 jednostek w 1 mg białka, przy czym stosunek masowy inhibitora cysternowych peptydaz do nanokapsułek wynosi od 10 do 30 jednostek w przeliczeniu na 1 gram złoża nanokapsułek.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania nanokapsułek przeznaczonych do przenoszenia cytostatyków do miejsc występowania chorób inwazyjnych w organizmie pacjenta, o wnętrzu wypełnionym wodnym roztworem cytostatyku o dobranym stężeniu, z wykorzystaniem zjawiska tworzenia się miceli na granicy faz związków chemicznych o własnościach amfifilowych.

Istota wynalazku polega na tym, że nanokapsułki otrzymuje się przez solubilizację wodnego roztworu substancji leczniczej w słabo polarnym rozpuszczalniku, szczególnie w roztworze micelarnym Tween 80, a po uzyskaniu w ten sposób miceli, w których jest inkorporowana substancja lecznicza, tworzy się powłoczki, dodając do fazy zewnętrznej substancję, z której ma ona powstać, najkorzystniej chitozan, dekstran lub związki krzemowe, po czym dodaje się substancję oleistą, zwłaszcza olej arachidowy, co tworzy wraz z substancją powlekającą palisadę gromadzącą się na granicy faz w postaci woda/olej. Następnie emulsję nanokapsułek rozpuszcza się w 0,2 m kwasie azotowym lub 0,2 m kwasie octowym oraz stosując metodę nanoprecypitacji wytrąca się nanokapsułki związkami zasadowymi, szczególnie wodorotlenkiem sodowym. Wytworzone nanokapsułki o wymiarach 20-250 nm utwardza się substancją powlekającą w postaci roztworu, stosując octanoftalan celulozy. Otrzymane nanokapsułki łączy się metodą immobilizacji z inhibitorem cysteinowych peptydaz o dobranej jednostce aktywności, otrzymywanym z różnych źródeł.

Korzystne jest wiązanie inhibitora do powierzchni nanosfer metodą immobilizacji kowalencyjnej poprzez aktywowanie powierzchniowych grup funkcyjnych aktywatorami dwufunkcyjnymi, zwłaszcza dialdehydem, disulfonem lub dikarboimidem, a następnie sprzęganie z białkiem przez grupy aminowe, karboksylowe lub hydroksylowe i końcowe odmywanie dużymi objętościami buforu w celu usunięcia nieprzereagowanych protein.

Nanokapsułki według wynalazku, zawierające cytostatyki, pozwalają na dostarczenie oraz przyłączenie ich do komórek rakowych w organizmie chorych na nowotwory. Uzyskane to zostało dzięki temu, że inhibitory cysteinowych peptydaz w wyniku powinowactwa enzym-inhibitor są szybko doprowadzone do miejsc o wysokiej nadekspresji enzymów proteolitycznych, którymi są miejsca rozwoju

PL 212 567 B1 nowotworu. Podany w nanokapsułce cytostatyk, odizolowany przez nietoksyczny i dobrze przez organizm chorego tolerowany inhibitor cysteinowych peptydaz, chroni organizm przed toksycznością leku w trakcie doprowadzania nanokapsułek do komórek rakowych i dopiero po degradacji kapsułki następuje wydzielenie leku, którego agresja skierowana zostanie wyłącznie w stosunku do nowotworu.

Przełomem okazały się wyniki przeprowadzonych badań własnych opisujące specyficzność wiązania się znakowanych cystatyn z białka jaj z komórkami nowotworowymi in vitro oraz w rozwijającym się nowotworem ludzkim, po wszczepieniu do organizmu zwierząt. Określono możliwość wiązania

125 egzogennej cystatyny przez komórki nowotworowe. Wykazano też rozkład znakowanej ¹²⁵I cystatyny w raku płaskonabłonkowym rosnącym w powłokach myszy SCID oraz w jej narządach wewnętrznych. Ilość związanego inhibitora zależała od czasu inkubacji i od ilości inkubowanych komórek. Preinkubacja z nieznakowanym inhibitorem spowodowała zmniejszenie wiązania znakowanego inhibitora. W badaniach immunohistochemicznych inkubacja skrawków raka krtani z egzogennym inhibitorem doprowadziła do wzrostu liczby komórek nowotworowych z dodatnią reakcją na inhibitor. W badaniach in vivo podana dożylnie radioaktywna cystatyna łączyła się z narządami wewnętrznymi i z komórkami nowotworowymi. Badanie scyntygraficzne uwidoczniło obrysy rozwijającego się nowotworu. W wyniku przeprowadzonych badań wykazano, że endopeptydaza cysteinowa raka wiąże egzogenną cystatynę, po przeszczepieniu histologicznie zróżnicowanego raka płaskonabłonkowego uzyskano jednolity charakter rosnącego guza, radioaktywność znakowanej cystatyny stwierdzono w tkance nowotworowej, jak i narządach wewnętrznych, a wiązanie radioaktywnej cystatyny przez komórki raka krtani pozwoliło na jego obrazowanie. Badanie wykonano na siedmiu myszach uzyskując podobne obrazy scyntygraficzne.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1.

Skład leku :

Cytostatyk o dobranym stężeniu, np. Cisplatine lub Taxol w ilości podawanej rutynowo w jednej iniekcji

Inhibitor cysteinowych peptydaz o jednostce aktywności 1000/10 mg białka 0,01 g

Dekstran 0,25 g

0,2 m r-r kwasu azotowego 50,0 g

Woda oczyszczona 40,75 g

Inhibitor cysteinowych peptydaz uzyskano poprzez wyizolowanie z moczu pacjentów. Lek przeznaczony jest do podawania dożylnego pacjentom chorym na wszystkie nowotwory złośliwe, z wyłączeniem raków mózgu.

Jednostka przeznaczona do iniekcji ma pojemność 1 lub 2 ml.

P r z y k ł a d 2.

Skład leku :

Inhibitor cysteinowych peptydaz o jednostce aktywności 2000/20 mg białka 0,02 g

Chitozan 0,5 g

Kwas octowy 60,0 g

0,2 m r-r wodorotlenku sodowego 20,0 g

Woda oczyszczona 10,0 g

Inhibitor cysteinowych peptydaz uzyskuje się ze zoperowanych tkanek rakowych pacjentów lub wód puchlinowych towarzyszących nowotworom. Dla każdego pacjenta inhibitory przygotowywane są indywidualnie z przeznaczeniem do podawania dożylnego.

Jednostka przeznaczona do iniekcji ma pojemność 2 ml.

P r z y k ł a d 3.

Skład leku :

Cytostatyk o dobranym stężeniu np. Cisplatine lub Taxol w ilości podawanej rutynowo w jednej iniekcji

Inhibitor cysteinowych peptydaz o jednostce aktywności 3000 730 mg białka 0,03 g Dwutlenek krzemu 0,3 g

PL 212 567 B1

Kwas octowy 60,0 g

Woda oczyszczona 30,0 g

Inhibitor cysteinowych peptydaz uzyskuje się z białka jaj.

Lek przeznaczony jest do podawania dożylnego pacjentom chorym na wszystkie nowotwory złośliwe, z wyłączeniem raków mózgu.

Jednostka przeznaczona do iniekcji ma pojemność 1 ml.

P r z y k ł a d 4.

Przykład ten podaje sposób wytwarzania nanokapsułek zawieszonych w wodzie oczyszczonej, przeznaczonych do podawania w iniekcjach i dotyczy trzech stężeń inhibitora cysteinowych peptydaz, najniższego, średniego i najwyższego stężenia, podanych w przykładach 1, 2 i 3. Na samym początku tworzy się micele, wykorzystując zjawisko ich powstawania na granicy faz związków chemicznych o własnościach amfifilowych. Wodny roztwór substancji leczniczej, której rodzaj i stężenie dobiera się stosownie do podlegającej terapii choroby nowotworowej, poddaje się solubilizacji w roztworze micelarnym Tween 80. Uzyskuje się w ten sposób micele zawierające wodny roztwór substancji leczniczej w fazie organicznej. W celu wytworzenia powłoczki do fazy zewnętrznej dodaje się dekstran, chitozan lub dwutlenek krzemu, w ilościach jak są one wymienione w składach leku podanych odpowiednio w przykładach od 1 do 3. Następnie dodaje się substancję oleistą w postaci oleju arachidowego, co tworzy wraz z substancją powlekającą palisadę gromadzącą się na granicy faz w postaci woda/olej. Otrzymaną emulsję nanokapsułek rozpuszcza się w 0,2 m kwasie azotowym dla składu podanego w przykładzie 1 i w 0,2 m kwasie octowym dla składów podanych w przykładach 2 i 3, ogrzewając ją przez 15 minut do temperatury 40 stopni C. Z kolei stosując metodę nanoprecypitacji wytrąca się nanokapsułki wodorotlenkiem sodowym, i utwardza sieje roztworem octanoftalanu celulozy. Utwardzone micele to nanokapsułki o wymiarach 20-250 nm. Następnie łączy sieje z uprzednio dobranym, dla każdego przykładowego składu od 1 do 3, inhibitorem cysteinowych peptydaz metodą immobilizacji kowalencyjnej poprzez aktywowanie powierzchniowych grup funkcyjnych aktywatorami dwufunkcyjnymi, zwłaszcza dialdehydem, disulfonem lub dikarboimidem, a następnie sprzęganie z białkiem przez grupy aminowe, karboksylowe lub hydroksylowe i końcowe odmywanie dużymi objętościami buforu w celu usunięcia nieprzereagowanych protein.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nanokapsułki przeznaczone do przenoszenia cytostatyków do miejsc występowania chorób inwazyjnych w organizmie pacjenta, o wnętrzu wypełnionym wodnym roztworem leku o dobranym stężeniu, znamienne tym, że stanowią utwardzone micele o wymiarach 20-250 nm i powłoczkach utworzonych z dekstranów, związków krzemowych lub chitozanu, które są otoczone warstwą inhibitora cysteinowych peptydaz, otrzymywanego z różnych źródeł takich jak mocz pacjentów chorych na nowotwór, zoperowane tkanki rakowe, wody puchlinowe towarzyszące nowotworom, z łożysk i wód płodowych ludzi lub zwierząt, a także z białka jaj, o jednostce aktywności o czystości od 50 do 100 jednostek w 1 mg białka, przy czym stosunek masowy inhibitora cysteinowych peptydaz do nanokapsułek wynosi od 10 do 30 jednostek w przeliczeniu na 1 gram złoża nanokapsułek.
2. Sposób wytwarzania nanokapsułek przeznaczonych do przenoszenia cytostatyków do miejsc występowania chorób inwazyjnych w organizmie pacjenta, o wnętrzu wypełnionym wodnym roztworem leku o dobranym stężeniu z wykorzystaniem zjawiska tworzenia się miceli na granicy faz związków chemicznych o własnościach amfifilowych, znamienny tym, że nanokapsułki otrzymuje się przez solubilizację wodnego roztworu substancji leczniczej w słabo polarnym rozpuszczalniku, szczególnie w roztworze micelarnym Tween 80, a po uzyskaniu w ten sposób miceli, w których jest inkorporowana substancja lecznicza, tworzy się powłoczki, dodając do fazy zewnętrznej substancję, z której ma ona powstać, najkorzystniej chitozan, dekstran lub związki krzemowe, po czym dodaje się substancję oleistą, zwłaszcza olej arachidowy, co tworzy wraz z substancją powlekającą palisadę gromadzącą się na granicy faz w postaci woda/olej, a następnie emulsję nanokapsułek rozpuszcza się w 0,2 m kwasie azotowym lub 0,2 m kwasie octowym oraz stosując metodę nanoprecytypitacji wytrąca się nanokapsułki związkami zasadowymi, szczególnie wodorotlenkiem sodowym, zaś wytworzone nanokapsułki o wymiarach 20-250 nm utwardza się substancją powlekającą w postaci roztworu, stosując octanoftalan celulozy, a otrzymane nanokapsułki łączy się metodą immobilizacji z inhibitorem cysteinowych peptydaz o dobranej jednostce aktywności, otrzymywanym z różnych źródeł.

PL 212 567 B1
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wiązanie inhibitora cysteinowych peptydaz do powierzchni nanosfer prowadzi się metodą immobilizacji kowalencyjnej poprzez aktywowanie powierzchniowych grup funkcyjnych aktywatorami dwufunkcyjnymi, zwłaszcza dialdehydem, disulfonem lub dikarboimidem, a następnie sprzęganie z białkiem przez grupy aminowe, karboksylowe lub hydroksylowe i końcowe odmywanie dużymi objętościami buforu.