PL207880B1 - Agoniści receptorów nikotynowych do zastosowania w leczeniu chorób zapalnych płuc - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie agonisty receptorów nikotynowych. Przez zastosowanie lub podawanie agonistów receptora nikotynowego możliwe jest leczenie chorób zapalnych układu oddechowego.

Chociaż wdychamy więcej niż jeden metr sześcienny powietrza na godzinę, mechanizmy obronne naszych płuc zwykle dają sobie radę z dużą ilością cząstek, antygenów i czynników zakaźnych, toksycznych gazów i dymów, które są obecne we wdychanym powietrzu. Wzajemne oddziaływanie tych cząstek z układem odpornościowym i innymi mechanizmami obronnymi płuc kończy się powstaniem kontrolowanej odpowiedzi zapalnej, która jest zwykle ochronna i korzystna. Na ogół ten proces reguluje się sam celem ochrony integralności dróg oddechowych i powierzchni nabłonka pęcherzyków płucnych, gdzie zachodzi wymiana gazowa. W pewnych przypadkach jednak odpowiedź zapalna nie może być kontrolowana i zwiększa się ryzyko uszkodzenia tkanek. Zależnie od typu środowiskowego narażenia, predyspozycji genetycznych i różnorodności czynników definiowanych jako chorobotwórcze, nieprawidłowo duża liczba komórek zapalnych może być rekrutowana w różnych miejscach układu oddechowego, powodując chorobę.

Odpowiedź zapalna na wdychane lub wewnętrzne bodźce charakteryzuje się niespecyficznym wzrostem przepuszczalności naczyń, uwalnianiem zapalnych i chemotaktycznych mediatorów włączając w to histaminę, eikosanoidy, prostaglandyny, cytokiny i chemokiny. Te mediatory modulują ekspresję i zaangażowanie leukocytamo-śródbłonkowych cząsteczek adhezyjnych pozwalających na rekrutację zapalnych komórek obecnych we krwi.

Dokładniej, reakcja zapalna obejmuje rozpoznanie i nasilenie zaostrzonej swoistej odpowiedzi odpornościowej na wdychane antygeny. Ta reakcja jest zaangażowana w rozwój astmy, nadreaktywności oskrzelowej (HP) i prawdopodobnie sarkoidozy. Zaburzenie mechanizmu naprawy występujące po uszkodzeniu płuca może się przyczynić do zwłóknienia i spadku wydolności w astmie, śródmiąższowym włókniejącym zapaleniu płuc, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP) i przewlekłym HP.

Opisano uprzednio, że częstość występowania HP jest dużo mniejsza wśród aktualnie palących niż wśród niepalących (1-4). Sarkoidoza również występuje rzadziej u palących niż u niepalących (5,6). Mechanizmy leżące u podłoża dobroczynnego wpływu palenia papierosów na rozwój HP i innych chorób zapalnych są nadal nieznane, ale mogą być związane z immunomodulującym działaniem nikotyny. Istnieją obserwacje kliniczne wystąpienia astmy de novo oraz pogorszenia po zaprzestaniu palenia. Jest to trudne do udowodnienia, a jakiekolwiek działania ochronne nikotyny w zapobieganiu i leczeniu astmy są niweczone przez szkodliwe działania dymu tytoniowego z jego tysiącami składników.

Ochronne działanie palenia opisywano także w innych chorobach, a najlepiej zbadane zostało we wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego, zapalnej chorobie jelita (7, 8). Nikotyna była z powodzeniem stosowana do leczenia tej choroby (9, 10). W innych badaniach poszukiwano możliwego terapeutycznego znaczenia nikotyny w leczeniu takich chorób, jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona (11, 12).

Receptory nikotynowe są pentamerami zbudowanymi z pięciu polipeptydowych podjednostek, które działają jak kanały jonowe bramkowane ligandem. Gdy Ugand wiąże się z receptorem, zachodzi zmiana konformacji polipeptydu otwierająca centralny kanał, która umożliwia przemieszczenie się jonów sodu z płynu zewnątrzkomórkowego do cytoplazmy. Zostały zidentyfikowane cztery typy podjednostek: α,β,γ,δ. Receptor może składać się z dowolnej kombinacji tych czterech typów podjednostek (13). Ostatnie badanie wykazało, że makrofagi pęcherzyków płucnych (AM) mogą wyrażać podjednostkę α-7 (14), podczas gdy komórki nabłonka oddechowego wyrażają podjednostki α-3, α-5, α-7 (15) a limfocyty podjednostek α-2, α-5, α-7, β-2 i β-4 (14). Fibroblasty (16) i komórki mięśni gładkich oddechowych (17) także wyrażają te receptory. Zatem rezydualne komórki płucne (AM, komórki dendrytyczne, komórki nabłonkowe, fibroblasty i inne) i komórki rekrutowane w chorobach zapalnych (limfocyty, granulocyty wielojądrzaste) wyrażają receptory nikotynowe.

Aktywacja receptora nikotynowego w limfocytach wpływa na sygnalizację wewnątrzkomórkową, prowadząc do niekompletnej aktywacji komórki. Rzeczywiście, leczenie nikotyną zwiększa aktywność kinazy białkowej, która z kolei zwiększa aktywność fosfolipazy A2 (PLA2). PLA2 jest odpowiedzialna za rozkład fosfoinozytolo-2-fosforanu (PIP2) na 3-fosforaninozytol [(IP3)] i diacyloglicerol (DAG) (18, 19). Ciągła obecność IP3 w komórce wydaje się prowadzić do spadku wrażliwości magazynów wapnia, prowadząc do ich zaniku (19). Ta obserwacja mogłaby wyjaśnić fakt, że limfocyty poddane wpływowi

PL 207 880 B1 nikotyny nie uwalniają wystarczającej ilości wapnia do cytoplazmy, aby aktywować takie czynniki transkrypcyjne jak NFK-B (20).

Nikotyna, główny farmakologiczny składnik dymu papierosowego jest jednym z najlepiej poznanych agonistów receptora nikotynowego (21). Ta naturalna substancja ma dobrze zdefiniowane właściwości przeciwzapalne i immunosupresyjne (22) i może mieć właściwości przeciwdziałające włóknieniu (23). Ekspozycja zwierząt na dym z papierosów z wysoką zawartością nikotyny ma działanie bardziej immunosupresyjne, niż z papierosów o niskiej zawartości nikotyny (24). Ponadto, traktowanie szczurów nikotyną hamuje swoistą odpowiedź na antygen, związaną z przeciwciałami i indukuje anergię limfocytów T (25). Chociaż liczba ich jest większa, AM od palących wykazują zmniejszoną zdolność do wydzielania cytokin zapalnych w odpowiedzi na endotoksyny (20, 25, 26) i wydaje się, że nikotyna jest składnikiem odpowiedzialnym za to hamowanie (26).

Jedno z badań wykazało również, że limfocyty krwi obwodowej osób palących wykazują wyższy poziom Uganda FAS (FASL) i że nikotyna zwiększa ekspresję FASL na limfocytach od osób niepalących, co wskazywałoby, że nikotyna może wpływać na apoptozę komórek (27). Nikotyna wykazała również hamujące działanie na proliferację i wytwarzanie substancji zewnątrzkomórkowej ludzkich fibroblastów dziąseł in vitro (23). Interesujące, że wpływ nikotyny powoduje regulację „w górę” ekspresji receptorów nikotynowych (28). Publikacja WO 01/15697 ujawnia zastosowanie nikotyny lub pochodnej nikotyny do leczenia obturacyjnej choroby płuc, rozedmy płucnej oraz wrodzonej dwustronnej nieprawidłowości oskrzeli.

Faktycznie agoniści nikotyny mogą powodować regulację „w dół” aktywacji limfocytów T i wykazano, że nikotyna wpływa na ekspresję cząsteczek ko-stymulujących CD28 i CTLA4 na limfocytach T (29).

Ko-stymulujący szlak B7/CD28/CTLA4 gra kluczową rolę w regulacji aktywacji limfocytów T i homeostazie (30, 31). Zaangaż owane są dwie drogi przekazywania sygnał u. Pozytywny sygnał obejmuje połączenie cząsteczek B7 (CD80/CD86) z receptorami CD28 limfocytów T, którego wynikiem jest nasilenie odpowiedzi limfocytów T (proliferacja, aktywacja, ekspresja cytokin i przeżycie) (32). Negatywny sygnał obejmuje interakcje cząsteczki B7 z CTLA4 na aktywowanych limfocytach T, prowadzące do zmniejszenia odpowiedzi limfocytów T(33, 34). Równowaga pomiędzy sygnałami od CD28 i CTLA4 może zmieniać wynik aktywacji limfocytów T.

Poprzednio opisano, że w HP zachodzi regulacja „w górę” ekspresji cząsteczki B7 na AM u pacjentów z czynnym HP (35) i w mysim HP (36).

Wykazano, że blokada B7-CD28 ko-stymulującego szlaku u myszy zahamowała proces zapalny w płucach (36). Te wyniki wykazują także, że ekspresja cząsteczek B7 w AM jest niższa u palących niż u niepalących i że in vitro infekcja wirusem grypy może zwiększyć ekspresję B7 w zwykłych ludzkich AM, ale nie w AM od osób palących; nie wiadomo czy jest to zależne od nikotyny, czy od innych substancji obecnych w dymie papierosowym (35). Regulację „w górę” cząsteczki B7 także opisano w astmie (37, 38) i sarkoidozie (39).

Epibatydyna jest najsilniejszym dotychczas poznanym agonistą nikotynowym (40). Posiada ona właściwości przeciwzapalne i przeciwbólowe. W rzeczywistości jej potencjał przeciwbólowy jest dwieście razy silniejszy od morfiny (40). Ta cząsteczka jest także znana z hamowania proliferacji limfocytów in vitro (41). Wiązanie epibaty dyny do receptora jest nieswoiste (42). Niestety, epibatydyna wywołuje poważne toksyczne działania uboczne w układzie krążenia i w ośrodkowym układzie nerwowym, co powoduje, że jest nieprzydatna do zastosowania jako lek przeciwzapalny do leczenia chorób płuc (40).

Dimetylofenylopiperazynium (DMPP) jest nieswoistym syntetycznym agonistą nikotynowym (13). Jego siła wiązania do receptora jest w przybliżeniu taka sama jak nikotyny, w zależności od rodzaju komórek poddanych pobudzeniu (43).

Jego przewaga nad nikotyną i innymi agonistami nikotynowymi jest taka, że jego chemiczna konfiguracja zabezpiecza go przed przekroczeniem bariery krew-mózg, nie powodując uzależnienia ani innych działań ośrodkowych (13). Przeciwzapalne własności DMPP nie zostały dobrze opisane, jakkolwiek udowodniono, że przewlekłe leczenie in vivo może obniżyć liczbę leukocytów, zmniejszyć produkcję cytokin przez limfocyty śledziony i zmniejszyć aktywność komórek NK (natural killers) (44). Zbadano także wpływ DMPP na komórki mięśni gładkich dróg oddechowych. Gdy komórki są w kontakcie z agonistą przez dłuższy czas, DMPP ma początkowe krótkotrwałe działanie skurczowe, po którym występuje działanie rozkurczowe (45). To działanie bronchodylatacyjne samo w sobie nie nadaje potencjalnej użyteczności DMPP w leczeniu astmy, ponieważ silniejsze leki rozszerzające oskrzela są aktualnie dostępne na rynku (agoniści receptora β2). Jednak własności tego agonisty

PL 207 880 B1 receptora nikotynowego są ważne, ponieważ ten lek mógłby być bezpiecznie podawany pacjentom z astmą i POChP z uwagi na jego właściwości przeciwzapalne. Ponadto, nie ma dowodów, że DMPP ma jakiekolwiek działanie toksyczne na główne narządy takie jak serce, mózg, wątroba lub na płuca. Publikacja WO 00/23062 ujawnia, że DMPP jest agonistą receptora nikotynowego i wskazuje, że może on być stosowany jako czynnik hamujący zapalenie sam lub w kombinacji z innymi środkami przeciwzapalnymi.

Pomimo postępów w leczeniu chorób zapalnych, włączając w to choroby zapalne płuc, leczenie z zastosowaniem dostępnych leków i czynników, często powoduje niepożądane działania uboczne. Na przykład, zapalenie w POChP jest jawnie oporne na kortykosteroidy, w związku z czym zaistniała potrzeba opracowania nowych leków przeciwzapalnych do leczenia tego stanu (46).

Podobnie, mimo, że kortykosteroidy i inne leki immunosupresyjne były rutynowo stosowane do leczenia włóknienia płuc, wykazały one tylko niewielką skuteczność (47).

Zatem istnieje zapotrzebowanie na nowe i pewne metody leczenia chorób zapalnych, włączając w to choroby zapalne płuc, które złagodzą ich objawy bez powodowania skutków ubocznych.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie agonisty receptorów nikotynowych wybranego spośród nikotyny, dimetylofenylopiperazynium i epibatydyny do wytwarzania leku do łagodzenia lub zapobiegania u zwierzęcia chorobie zapalnej płuc wybranej z grupy składającej się z astmy, śródmiąższowego włóknienia płuc (IPF), sarkoidozy, alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych (HP), przewlekłego HP i zrostowego zapalenia oskrzelików z organizującym się zapaleniem płuc (BOOP).

Korzystnie agonistą receptora nikotynowego jest dimetylofenylopiperazynium, a chorobą zapalną płuc jest astma.

Również korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest w postaci farmaceutycznej do podawania doustnego, podjęzykowego, dootrzewnowego, dożylnego, wziewnego, dotchawiczego, donosowego, pozajelitowego, miejscowego, w bezpośredniej iniekcji, wlewie lub śródocznie.

Niniejszym opisano również nową metodę leczenia chorób zapalnych przez zastosowanie lub podawanie agonistów receptora nikotynowego.

Pomysł zastosowania nikotyny lub innych agonistów receptora nikotynowego do leczenia wyżej wymienionych zapalnych chorób płuc jest nowy. Pomimo istotnych przeciwzapalnych i immunosupresyjnych właściwości nikotyny i innych agonistów receptora nikotynowego, ich zastosowanie do leczenia wyżej wymienionych alergicznych i innych zapalnych chorób płuc nie zostało wcześniej ujawnione.

Nikotyna sama w sobie jest substancją bezpieczną, która jak się wydaje, nie ma długofalowych efektów ubocznych (48, 49). Choroby płuc, serca i tętnic związane z paleniem papierosów nie są spowodowane przez nikotynę, ale przez tysiące innych związków chemicznych obecnych we wdychanym dymie. Główny problem jest taki, że nikotyna przenika przez barierę krew-mózg wywołując uzależnienie. Są to główne przyczyny braku wcześniejszego zainteresowania agonistami nikotynowymi w leczeniu chorób płuc. Szkodliwe skutki palenia papierosów są oczywiste.

Chociaż nikotyna nie jest odpowiedzialna za toksyczne skutki palenia (49), takie skojarzenie pozostaje.

Niniejszym zaproponowano zatem zastosowanie agonistów receptora nikotynowego, takich jak DMPP, do leczenia zapalnych chorób płuc takich jak astma, włóknienie śródmiąższowe płuc (IPF), sarkoidoza, HP i zapalenie oskrzelików z organizującym się zapaleniem płuc (BOOP). Lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być podawany doustnie lub korzystniej dostarczany docelowo bezpośrednio do płuca przez rozpylenie w różnorodnych i korzystnych podłożach, które minimalizują jakiekolwiek skutki ogólnoustrojowe.

Zarówno właściwości przeciwzapalne i immunosupresyjne jak i minimalne skutki uboczne agonistów receptora nikotynowego, czynią te leki najodpowiedniejszymi do zastosowania medycznego w leczeniu różnorodnych chorób płuc, charakteryzujących się oskrzelowym lub śródmiąższowym procesem zapalnym, takich jak astma, POChP, IPF, sarkoidoza, HP i BOOP.

Krótki opis figur

Figura 1: Całkowita liczba komórek i liczba poszczególnych typów komórek uzyskane w BAL. Całkowita liczba komórek uległa wyraźnemu zmniejszeniu u myszy traktowanych nikotyną głównie z powodu zmniejszenia populacji limfocytów.

Figura 2: Ekspresja mRNA dla IFN-γ w izolowanych komórkach jednojądrzastych płuc. Obserwowano znaczące hamowanie mRNA dla IFN-γ.

PL 207 880 B1

Figura 3: Ekspresja mRNA dla TNF-α, którą indukowano przez 24 godzinną stymulację LPS. Rezultaty wyrażono jako % ekspresji, przy czym 100% zostało przypisane do grupy samego LPS. Intensywność prążka uzyskano dzieląc intensywność prążka TNF-α przez intensywność prążka β-aktyny. Traktowanie stymulowanych komórek różnymi dawkami nikotyny i DMPP, od 40 do 160 μM, indukowało spadek ekspresji mRNA dla TNF-α. Największy skutek uzyskano przy 40 μM stężeniu nikotyny (98% redukcję ekspresji), podczas gdy wszystkie dawki DMPP spowodowały 60 do 50% redukcji ekspresji.

Figura 4: Ekspresja mRNA dla TNF-α, którą indukowano przez 24-godzirmą stymulację SR.

Wyniki przedstawiono jak opisano na Fig. 5. Traktowanie stymulowanych komórek różnymi dawkami (80 i 160 μM dla nikotyny i 40 do 160 μM dla DMPP) wywoływało obniżenie ekspresji mRNA dla TNF -α. Tylko dawka 160 μM nikotyny miała wpływ na ekspresję mRNA, podczas gdy dawki 40 i 80 μM DMPP wywoływały zmniejszenie ekspresji mRNA dla TNF-α do 60%.

Figura 5: Ekspresja mRNA dla ll-10, którą wywołano 24-godzinną stymulacją przez LPS.

Wyniki przedstawiono jak opisano na Fig. 5. Traktowanie komórek stymulowanych różnymi dawkami (40 do 160 μM zarówno nikotyny jak i DMPP) wywołało obniżenie ekspresji mRNA dla 11-10. Największy spadek ekspresji (87% redukcja) miał miejsce przy 40 μM nikotyny. DMPP wywoływał 55 do 40% redukcję ekspresji dla wszystkich trzech dawek.

Figura 6: Ekspresja mRNA dla lL-10, którą indukowano 24-godzinną stymulacją SR.

Traktowanie stymulowanych komórek różnymi dawkami (80 i 160 μM dla nikotyny i 40 do 80 μM dla DMPP) wywołało obniżenie ekspresji mRNA dla 11-10. Największy spadek ekspresji mRNA przy traktowaniu nikotyną pojawił się przy 160 μM (60% spadek ekspresji) i przy 80 μM (90% spadek ekspresji) przy traktowaniu DMPP.

Figura 7: Ekspresja mRNA dla IFN-γ, którą indukowano w komórkach RAW 264.7 przez 24godzinną stymulację LPS. Wyniki przedstawiono jak opisano na Fig. 5.

Traktowanie stymulowanych komórek różnymi dawkami DMPP wywołało zmniejszenie ekspresji mRNA dla IFN-γ. Największy spadek ekspresji (80% redukcja) miał miejsce przy 40 μM DMPP.

Figura 8: a) Ekspresję CD 80 indukowano albo LPS (38%) albo antygenem SR (35%). Traktowanie nikotyną (40 μM przez 48 godz.) zmniejszało ekspresję do 20% w komórkach stymulowanych LPS i do 26%) w komórkach stymulowanych SR.

b) Ekspresję CD 80 indukowano albo z LPS (38%) albo z antygenem SR (35%). Traktowanie DMPP (40 μM przez 48 godz.) obniżało ekspresję do 17% w komórkach stymulowanych LPS i do 20% w komórkach stymulowanych SR.

Figura 9: Ekspresję mRNA dla IFN-γ na limfocytach T izolowanych z popłuczyn BAL od pacjentów z HP. Traktowanie DMPP obniżało ekspresję IFN-γ w tych komórkach.

Figura 10: Ekspresja CD 86 we wszystkich komórkach z popłuczyn BAL, które przeprowadzono u zdrowych pacjentów. Ekspresja Cd 86 obniżyła się w komórkach traktowanych o 50% w porównaniu z komórkami nietraktowanymi.

Figura 11: Komórki otrzymane z BAL-u myszy traktowanych DMPP, nikotyną i epibatydyną.

Traktowanie nikotyną i epibatydyna miało znacząco hamujący wpływ na zapalenie indukowane przez SR po 24 godzinach.

Figura 12: Znacząco hamujący wpływ DMPP na zapalenie płuc stwierdzono, gdy zwiększono liczbę zwierząt.

Figura 13: Poziomy TNF w płynie otrzymanym z BAL od myszy traktowanych DMPP. DMPP znacząco obniżyło poziomy TNF w BALF.

Figura 14: Wpływ podawania dootrzewnowego wzrastających dawek DMPP na całkowitą masę komórek uzyskanych za pomocą BAL od myszy chorych na astmę. Liczba komórek była znacznie większa u myszy poddanych prowokacji OVA i nietraktowanych DMPP. Traktowanie DMPP znacząco obniżyło liczbę komórek przy dawkach 0,5 i 2,0 mg/kg.

Figura 15: Ilości poszczególnych komórek w zależności od dawki. Myszy prowokowane OVA (OVA OVA) posiadały większą ilość eozynofili i limfocytów w ich BAL w porównaniu z grupą kontrolną (sal sal). Traktowanie DMPP znacząco zmniejszyło obecność eozynofili i limfocytów w popłuczynach z BAL we wszystkich grupach(n=8; p< 0,05).

Figura 16: Wpływ drugiej dawki DMPP podawanego dootrzewnowe na całkowitą zawartość komórek w BAL myszy z astmą. Liczba komórek była znacznie wyższa u myszy poddanych prowokacji OVA i nie traktowanych DMPP. Traktowanie DMPP znacznie zmniejszyło całkowitą liczbę komórek przy dawkach 0,1 i 0,5 mg/kg.

PL 207 880 B1

Figura 17: Ilości poszczególnych komórek w zależności od drugiej dawki. Traktowanie DMPP znacząco zmniejszyło liczbę eozynofili i limfocytów przy dawkach 0,1 i 0,5 mg/kg. Dawka 0,5 mg/kg była najbardziej skuteczna pod względem działania przeciwzapalnego DMPP.

Figura 18: Poziomy IL-5 w popłuczynach uzyskanych z BAL myszy grupy kontrolnej, chorych na astmę i traktowanych DMPP. Prowokacja OVA powoduje wzrost poziomu II-5 w BAL, podczas gdy traktowanie DMPP miało znacząco hamujący wpływ na poziom II-5 w grupie myszy traktowanych dawką 0,5 mg/kg.

Figura 19: Opór płuc po prowokacji metacholiną myszy zdrowych, chorych na astmę i chorych na astmę traktowanych DMPP podanym donosowo w dawce 0,5 mg/kg. Wydaje się, że DMPP redukuje % zwiększenia oporu płuc w porównaniu do myszy z astmą.

Figura 20: Obliczono dawkę substancji prowokującej powodującą 200% zwiększenie oporu płuc (PC 200). DMPP znacząco zredukował PC 200 wśród myszy poddanych jego działaniu, w porównaniu do myszy chorych na astmę (p=0,04; n=6).

Figura 21: Ekspresję mRNA dla II-4 indukowano przez 24 godzinną stymulację LPS.

Wyniki przedstawiono jak opisano na Fig. 5. Komórki traktowano różnymi dawkami DMPP (40 do 160 μΜ dla obu substancji, nikotyny i DMPP). Traktowanie nikotyną wywoływało spadek ekspresji mRNA dla 11-4 (do 90%) redukcji ekspresji w grupie 40 μM). Traktowanie DMPP całkowicie zablokowało ekspresję mRNA dla II-4 w komórkach stymulowanych LPS, przy wszystkich dawkach.

Figura 22: Skutek wpływu DMPP na migrację eozynofili z krwi. DMPP indukuje zależne od dawki hamowanie przechodzenia eozynofili przez sztuczną błonę podstawną.

Figura 23: Wpływ mekamylaminy, antagonisty nikotynowego, na hamujący wpływ DMPP na migrację eozynofili z krwi.

Mekamylamina znosi działanie DMPP sugerując, że aktywacja receptora nikotynowego jest niezbędna dla wywołania hamującego skutku DMPP.

Figura 24: Wpływ innych agonistów nikotynowych na migrację eozynofili z krwi obwodowej. Nikotyna, epibatydyna i cytozyna zmniejszają migrację eozynofili z krwi.

Figura 25: Wpływ DMPP na ekspresję mRNA dla kolagenu 1A na przykładzie ludzkich fibroblastów ze zdrowego płuca. DMPP hamuje ekspresję mRNA dla kolagenu 1A w sposób zależny od dawki.

Figura 26: Wpływ nikotyny na ekspresję mRNA dla kolagenu 1A, na przykładzie ludzkich fibroblastów płuc. Nikotyna hamuje ekspresję mRNA dla kolagenu 1A w dawkach 1 i 10 μM, chociaż wyższe dawki nie miały hamującego wpływu.

Figura 27: Wpływ epibatydyny, innego agonisty nikotynowego, na ekspresję mRNA dla kolagenu 1A na przykładzie ludzkich fibroblastów płuca. Epibatydyna także wywiera hamujący wpływ na ekspresję mRNA dla kolagenu 1A.

Opis korzystnych wykonań

Obecność receptorów nikotynowych na komórkach płucnych i zapalnych opisano wcześniej. Jednakże nowość niniejszego wynalazku wynika z obserwacji, że agoniści receptora nikotynowego wybrani spośród nikotyny, dimetylofenylopiperazynium i epibatydyny, jak się okazało, są skuteczni w leczeniu chorób zapalnych płuc i w związanym z tym stwierdzeniu właściwości przeciwzapalnych i immunosupresyjnych agonistów nikotynowych, ściśle związanych z mechanizmami zaangażowanymi w patogenezę takich zapalnych chorób płuc jak astma, HP, sarkoidoza, BOOP i IPF. Przykładem tego jest wpływ dymu papierosowego na ekspresję cząsteczek ko-stymulujących B7.

Zastosowano dwa modele zwierzęce do zbadania skutków działania antagonistów nikotynowych w zapalnych chorobach płuc: model HP i model astmy.

W obu tych modelach, działania agonistów receptora nikotynowego (zarówno selektywnych jak i nieselektywnych) zbadano w warunkach fizjologii i zapalenia płuc. Badania in vitro prowadzono stosując izolowane komórki zapalne od zwierząt laboratoryjnych lub od pacjentów, jak również handlowo dostępne linie komórkowe, próbując zrozumieć mechanizmy, przez które agoniści receptora nikotynowego hamują zapalenie.

Początkowo doświadczenia przeprowadzano z nieswoistymi agonistami, tj. agonistami, wiążącymi się do wszystkich podjednostek receptora nikotynowego (nikotyna, dimetylofenylopiperazynium (DMPP) i epibatydyna) (13, 42). Agonistę swoistego dla podjednostki Ae4, cytyzynę (42) badano także dla wykazania czy swoista stymulacja może także powodować działanie przeciwzapalne.

Dla celów niniejszego wynalazku, termin „zwierzę” oznacza ludzi, naczelne, zwierzęta domowe (takie jak konie, krowy, świnie, kozy, owce, koty, psy, świnki morskie, myszy itd.) i inne ssaki. Ogólnie, termin ten stosuje się do wskazania żywych organizmów o dobrze rozwiniętym układzie naczyniowym.

PL 207 880 B1

Dla celów niniejszego wynalazku agonistami lub czynnikami są cząsteczki lub związki, które wiążą się do receptora nikotynowego i modulują jego funkcję. Korzystne czynniki są specyficzne dla receptora i nie przenikają przez barierę krew-mózg, tak jak DMPP. Przydatne czynniki można znaleźć w wielu klasach związków chemicznych, choć typowo bę dą to związki organiczne i korzystnie drobnocząsteczkowe związki organiczne. Drobnocząsteczkowe związki organiczne mają ciężar cząsteczkowy większy niż 150 i mniejszy niż około 4500, korzystnie mniej niż około 1500, jeszcze korzystniej mniej niż około 500. Przykładowe klasy obejmują peptydy, cukry, steroidy, związki heterocykliczne, policykliczne, podstawione związki aromatyczne i podobne.

Wybrane związki mogą zostać zmodyfikowane w celu poprawy ich skuteczności, stabilności, zgodności farmaceutycznej itp. Identyfikację strukturalną czynnika można wykorzystać do rozpoznawania, wytwarzania lub sprawdzania dodatkowych czynników. Na przykład, gdy zidentyfikuje się czynniki peptydowe, można je w różny sposób modyfikować, jak opisano powyżej, np. w celu poprawy ich stabilności. Inne metody stabilizacji mogą obejmować pułapkowanie, na przykład w liposomach itp. Czynniki wiążące przygotowuje się w dowolny, korzystny sposób znany specjaliście.

Dla celów terapeutycznych czynniki wpływające na działanie receptora nikotynowego można podawać w każdy, dogodny sposób. Drobnocząsteczkowe związki organiczne są korzystnie podawane doustnie; inne kompozycje i czynniki są dogodniej podawane pozajelitowo, korzystnie w farmaceutycznie lub fizjologicznie akceptowanych nośnikach np. soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, lub podobnych. Typowo, kompozycje są dodawane do płynów fizjologicznych takich jak krew lub płyn stawowy.

Przykładowo, wiele takich substancji terapeutycznych nadaje się do bezpośredniej iniekcji lub infuzji, podania miejscowego dotchawiczego/donosowego np. w aerozolu, dogałkowego lub w/na wszczepach (takich jak kolagen, pompy osmotyczne, przeszczepy obejmujące odpowiednio transformowane komórki, itp.) z terapeutycznymi peptydami. Ogólnie podawana ilość powinna być określona doświadczalnie, typowo w zakresie od około 10 do 1000 μg/kg wagi ciała przyjmującego. Dla czynników peptydowych stężenie powinno ogólnie mieścić się w zakresie od około 50 do 500 μg/ml w podanej dawce. Mogą być włączone inne substancje pomocnicze, takie jak substancje stabilizujące, bakteriobójcze, itd. Te dodatkowe substancje powinny być obecne w ilościach typowych.

Agoniści nikotynowi nie zastępowaliby wszystkich leków, które są aktualnie stosowane do leczenia zapalnych chorób płuc i zwężenia dróg oddechowych, które często współistnieje z tymi chorobami. Leki rozszerzające oskrzela pozostają użyteczne do natychmiastowego odwrócenia skurczu oskrzela. Jednakże bronchodylatory nie wpływają bezpośrednio na przyczynę zapalenia.

Kortykosteroidy są silnymi lekami przeciwzapalnymi. Ich ogólnoustrojowe zastosowanie w każdym przypadku powoduje poważne skutki uboczne, które uniemożliwiają ich długotrwałe zastosowanie. Wdychane słabo wchłaniane steroidy są pomocne w leczeniu zapalenia dróg oddechowych. W niskich dawkach leki te wywołują niewiele skutków ubocznych lub nie powodują ich wcale.

Jednakże wyższe dawki zwiększają ryzyko kandydozy jamy ustnej, porażenia strun głosowych, zaćmy i osteoporozy. Wdychane steroidy nie wywierają wpływu na śródmiąższową tkankę płucną i nie mają właściwości hamujących włóknienie (57).

Więcej niedawno poznanych leków, jak przeciwleukotrienowe, jest użytecznych dla niektórych astmatyków (58), ale nie wykazują one działania w POChP i innych chorobach płuc.

Leki te mają właściwości przeciwzapalne ograniczone do składowych zapalenia wywołanych przez leukotrieny (59). Leczenie śródmiąższowych chorób płuc takich jak IPF, sarkoidoza, HP i BOOP zasadniczo opiera się na ogólnoustrojowym zastosowaniu kortykosteroidów. Leczenie takie jest skuteczne w kontrolowaniu niektórych zapaleń, ale niestety wywołuje poważne skutki uboczne i nie cofa właściwych zmian włóknistych.

Czynniki immunosupresyjne takie jak cyklofosfamid i azatiopryna są czasami wypróbowywane w niektórych IPF, ale ich znaczenia terapeutyczne są nieudowodnione i w większości bardzo ograniczone (60). W gruncie rzeczy, włóknienie płuc jest zwykle postępujące i niepoddające się leczeniu, i większość pacjentów z IPF ginie w tym stanie (61).

Agoniści nikotynowi mogą być przydatni jako leki oszczędzające lub zastępujące steroid. Leki te mogłyby być pomocne w kontrolowaniu zarówno zapalenia dróg oddechowych jak i śródmiąższu płuc przez celowe dostarczanie ich do fagocytów płuc. Jedną z głównych zalet agonistów nikotynowych w porównaniu z kortykosteroidami, oprócz mniejszej ilości działań ubocznych, jest fakt, że ci agoniści wywierają bezpośredni wpływ na fibroblasty i mogą dlatego ochraniać przed lub cofać włóknienie w drogach oddechowych i w płucach, a kortykosteroidy nie mają takiego działania. Włóknienie

PL 207 880 B1 śródmiąższowe jest cechą charakterystyczną dla IPF, jest głównym następstwem HP i sarkoidozy a włóknienie dróg oddechowych jest powszechnie spotykane w przewlekłej astmie (57).

Inne substancje są aktywnie badane jako potencjalnie nowe środki lecznicze w zapalnych chorobach płuc. Wiele cytokin jest konkretnie branych pod uwagę (np. II-5, II-13, II-16...)(62). Przyjmuje się, że z powodu złożoności szlaku zaangażowanego w zapalenie, mało prawdopodobne jest aby jakaś konkretna cytokina lub inny mediator zapalny miały znaczący wpływ na leczenie tych chorób płuc. Agoniści receptora nikotynowego, w odróżnieniu od kortykosteroidów, mają przewagę w postaci nakierowania na szerokie spektrum odpowiedzi zapalnej. Na tym opiera się możliwość ich zastosowania w leczeniu zapalnych chorób płuc.

PRZYKŁADY

I. ZAPALENIE TYPU NADWRAŻLIWOŚCI

Wpływ agonistów nikotynowych na przewlekle stymulowaną nadreaktywność oskrzelową (HP) u myszy.

P r z y k ł a d 1:

Badanie HP in vivo

Hipoteza jest taka, że stymulacja receptorów nikotynowych nikotyną obniża odpowiedź odpornościową na antygeny HP przez supresję cytokin zapalnych i hamowanie antygenowo swoistej aktywacji komórkowej.

Model ten został wybrany, ponieważ jak wspomniano poprzednio, występowanie HP jest niższe u palą cych niż u niepalących i ponieważ model ten został dobrze opisany. HP był o wywoł ywane przez podawanie antygenu Saccharopolyspora rectivirgula (SR), antygenu będącego przyczyną płuca farmera (51), postaci HP. Myszy były równocześnie traktowane dootrzewnowo (IP) nikotyną, w dawkach w zakresie od 0,5 do 2,0 mg/kg, dwa razy dziennie. Podawanie nikotyny znaczą co zmniejszał o cał kowitą ilość komórek znajdowaną w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL) tych myszy. Populacją najbardziej dotkniętą traktowaniem nikotyną były limfocyty (Fig. 1). Izolowano makrofagi płucne i limfocyty i stymulowano je rekombinowaną II-2 anty-CD3+. Mierzono wytwarzanie przez te komórki mRNA dla IFN-γ, cytokiny uważanej za zaangażowaną w rozwój HP i innych zapalnych chorób płuc (52). Komórki od zwierząt traktowanych nikotyną wykazywały istotnie niższą ekspresję mRNA dla IFN-γ, w porównaniu z komórkami od zwierząt nietraktowanych nikotyną (Fig. 2).

P r z y k ł a d 2:

Badania in vitro pokazujące wpływ agonistów nikotynowych na ekspresję cytokin.

Do dalszego wyjaśnienia mechanizmów zaangażowanych w hamujący wpływ nikotyny w modelu in vivo, zastosowano linię makrofagów pęcherzykowych.

Wpływ traktowania nikotyną lub DMPP komórek AMJ2-C11 był badany przez pomiar ekspresji mRNA dla TNF -α, II-10 za pomocą RT-PCR. Te cytokiny są zaangażowane w rozwój zapalnych chorób płuc takich jak HP, astma i sarkoidoza (52-55). Traktowanie nikotyną i DMPP wykazało znaczący spadek w ekspresji mRNA dla TNF (aż do 98% redukcji ekspresji w stymulowanych LPS i traktowanych 40 μM nikotyny), ale nie w sposób zależny od dawki (Fig. 3). Podobne wyniki obserwowano w komórkach stymulowanych SR (Fig. 4). Ta niezależna od dawki odpowiedź może być wyjaśniona przez zmniejszenie wrażliwości receptora nikotynowego spowodowanej dużą ilością agonisty w podłożu. Ekspresja mRNA dla II-10 była również zaburzona przez traktowanie nikotyną i DMPP. Największe obniżenie nastąpiło przy dawce 40 μM nikotyny (stymulowane LPS; 88% redukcji ekspresji mRNA; Fig. 5) i przy dawce 80 μM DMPP (stymulowane SR; 87%o redukcji ekspresji mRNA; Fig. 6). I tu też, działanie nie było zależne od dawki.

Do badania wpływu DMPP na ekspresję IFN-γ mierzoną za pomocą RT-PCR, zastosowano inną linię komórkową makrofagów (RAW 264.7.ATCC), ponieważ komórki AMJ2-C11 nie wykazują ekspresji mRNA dla IFN-γ (dane nieprzedstawione). Komórki stymulowano 50 μg/ml antygenu SR i inkubowano z DMPP w dawce w zakresie 40 do 160 μM. Traktowanie DMPP zmniejszało ekspresję IFN-γ w tych komórkach, aż do 75%o przy dawce 40 μM (Fig. 7). I znów działanie nie było zależne od dawki.

P r z y k ł a d 3:

Wpływy agonistów nikotynowych na ekspresję cząsteczki kostymulatora in vitro.

Wpływy nikotyny i DMPP na ekspresję cząsteczki B7 (CD80) badano in vitro. Komórki AMJ2-C11 (pęcherzykowe makrofagi myszy, z ATCC) inkubowano z 40 μM nikotyny lub DMPP i stymulowano LPS (0,1 μg/ml) lub antygenem SR (50 μg/ml) przez 48 godzin. Procent ekspresji CD80 w komórkach traktowanych tymi substancjami był o połowę mniejszy od ekspresji stwierdzonej w komórkach nietraktowanych nikotyną i DMPP, stymulowanych LPS i SR (Fig. 8(a) i (b)).

PL 207 880 B1

P r z y k ł a d 4

Badania na ludzkich komórkach z BAL (AM i limfocytach).

Ponieważ jednym z celów było leczenie pacjentów DMPP lub podobnymi lekami, działanie tych leków sprawdzono na ludzkich limfocytach uzyskanych od pacjentów z HP. BAL wykonywano u pacjentów z HP. Limfocyty izolowano od pozostałych komórek BAL, stymulowano PHA i inkubowano z DMPP. Zależ ność dawka DMPP-odpowiedź badano na podstawie wytwarzania mRNA (ocenianego przez RT-PCR) dla cytokiny IFN-γ (Fig. 9).

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe przeprowadzono na zdrowych pacjentach i izolowano makrofagi pęcherzykowe. Komórki stymulowane SR i traktowane DMPP lub nikotyną wykazały jeszcze raz o połowę mniejszą ekspresję CD 86 niż komórki nietraktowane tymi substancjami (Fig. 10).

P r z y k ł a d 5:

Badanie wpływu innych agonistów nikotynowych na ostre zapalenie po krótkotrwałym indukowaniu SR.

Donosowe wkroplenie antygenów Saccharopolyspora rectivirgula (SR), czynnika wywołującego płuco farmera, u myszy indukuje widoczną zapalną odpowiedź w płucu. Neutrofile są pierwszymi komórkami zapalnymi rekrutowanymi w miejscu zapalenia. Traktowanie myszy DMPP (0,5 mg/kg), nikotyną (0,5 mg/kg) i epibatydyna (2 μg/kg) miało wyraźny hamujący wpływ na zapalenie indukowane SR (Fig. 11). Agonistów nikotynowych podawano donosowo w 50 μl objętości co 6 godzin, a myszy zabijano 24 godziny po wkropleniu SR.

Znaczący hamujący wpływ obserwowano z nikotyną i epibatydyna, ale nie z DMPP. Jednakże po zwiększeniu liczby myszy traktowanych i nietraktowanych DMPP do 15, zaobserwowano znaczące zahamowanie w porównaniu do grupy nietraktowanej (Fig. 12).

Poziomy TNF (prozapalnej cytokiny) są niższe w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych myszy traktowanych DMPP (Fig. 13) wskazując, że zmniejszenie zapalenia może wynikać z niższego stężenia TNF.

II. ZAPALENIE TYPU ASTMY

P r z y k ł a d 6:

Model astmy in vivo.

Podobne eksperymenty przeprowadzono uczulając myszy białkiem jaja. DMPP rzekomo obniża zarówno odpowiedź zapalną jak i nadwrażliwość na wdychane alergeny i metacholinę.

Myszy z grupy BALB/C uczulano przez dootrzewnowe iniekcje z 20 μg białka OVA (białko jaja kurzego; SIGMA-ALDRICH) zemulgowanego z 2 mg wodorotlenku glinu w PBS. Po 4 tygodniach, dawki prowokacyjne 1,5%/50 μl OVA podawano donosowo. Prowokację przeprowadzano codziennie przez 3 kolejne dni i potem oceniano myszy pod względem alergicznego zapalenia płuc 24 godziny po ostatniej ekspozycji na aerozol. Grupy myszy traktowano różnymi stężeniami DMPP podczas okresu prowokacyjnego. Przeprowadzono płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) i odwirowano płyn przy 400 g, aby oddzielić komórki od płynu (Fig. 14, 15, 16 i 17).

Supernatanty zastosowano do określenia płucnych poziomów II-5. Oceniono całkowita liczbę komórek w BAL oraz ich rozdział na poszczególne typy (Fig. 18).

Eksperyment powtórzono z optymalną dawką DMPP dla oszacowania odpowiedzi dróg oddechowych. Pomiar AHR

Nadreaktywność dróg oddechowych (AHR), w odpowiedzi na metacholinę mierzono u myszy znieczulonych z wykonaną tracheotomią, wentylowanych z zastosowaniem komputerowo sterowanego respiratora Flexivent.

Wzrastające dawki metacholiny (0-32,5 mg/kg) podawano do żyły szyjnej (Fig. 19, 20).

P r z y k ł a d 7:

Wpływ traktowania agonistą na ekspresję mRNA dla Il-4.

Zbadano również wpływ traktowania agonistą na ekspresję mRNA dla II-4, cytokiny dobrze znanej z zaangażowania w rozwój astmy (53). Nikotyna zmniejszała ekspresję mRNA dla II-4 do 92% przy dawce 40 μM (Fig. 9). DMPP całkowicie blokowało ekspresję mRNA dla II-4 (Fig. 21).

Jak zademonstrowano uprzednio, nie stwierdzano ekspresji mRNA dla II-4 przy stymulacji komórek antygenem SR (dane nieprzedstawione).

P r z y k ł a d 8:

Działanie różnych agonistów na migrację eozynofili z krwi.

Dla dalszych badań nad wpływem agonistów nikotynowych na zmniejszanie nasilenia zapalenia w astmie, zbadaliśmy działanie różnych agonistów na migrację eozynofili z krwi.

PL 207 880 B1

Naciek z eozynofili i innych komórek zapalnych w tkankach płuc jest ważną cechą astmy, powodującą zapalenie dróg oddechowych i ich nadreaktywność. Przejście komórek zapalnych z krążenia do płuc obejmuje migrację przez śródbłonek naczyń, błonę podstawną i składniki substancji pozakomórkowej.

Komórki zapalne przechodzą przez błonę podstawną wytwarzając proteinazy. W tych wstępnych doświadczeniach in vitro, badaliśmy wpływ różnych agonistów nikotynowych na migrację oczyszczonych z krwi eozynofili przez sztuczną błonę podstawną (kamera chemotaktyczna pokryta Matrigel®). DMPP wywołuje zależne od dawki zahamowanie migracji eozynofili przez błonę (Fig. 22), podczas gdy działanie to jest znoszone przez antagonistę - mekamylaminę (MEC) (Fig. 23). To hamujące działanie ponadto potwierdzono z innymi agonistami nikotynowymi, włączając w to nikotynę, epibatydynę i cytozynę (Fig. 24). Wyniki przedstawiono jako procent zahamowania (potraktowanych agonistą komórek) w porównaniu do warunków kontrolnych - bez agonisty.

Te wyniki sugerują, że agoniści nikotynowi zmniejszają syntezę lub aktywację proteinaz, które degradują składniki błony podstawnej, w ten sposób hamując migrację eozynofili do błony śluzowej płuc.

P r z y k ł a d 9:

Wpływ agonistów nikotynowych na wytwarzanie kolagenu.

Astma charakteryzuje się zmianami struktury dróg oddechowych, włączając w to podnabłonkowe odkładanie kolagenu, które może powodować przewlekłość tej choroby. Zachwianie równowagi pomiędzy wytwarzaniem a degradacją kolagenu przez fibroblasty może być zaangażowane w ten proces (56). We wstępnych eksperymentach badaliśmy wpływ agonistów nikotynowych na syntezę kolagenu A1, wytwarzanego w pierwotnie prawidłowych fibroblastach. Ekspresję genu dla kolagenu A1 określano za pomocą RT-PCR.

Wyniki przedstawiają procentową ekspresję genu w komórkach traktowanych agonistą, w porównaniu do komórek nietraktowanych.

DMPP hamuje syntezę kolagenu A1 w sposób zależny od dawki (Fig. 25). Nikotyna ma słaby wpływ hamujący przy dawce 1 i 10 μΜ, podczas gdy wyższe stężenia nie mają wpływu (Fig. 26), prawdopodobnie z powodu spadku wrażliwości receptorów. Niższe dawki mogą być konieczne do osiągnięcia zahamowania i zastaną zbadane. Wpływ hamujący obserwowano również przy epibatydynie (Fig. 27).

Literatura

1. Cormier, Y., J. Belanger, and P. Durand. 1985. Factors influencing the development of serum precipitins to farmer's lung antigen in Quebec dairy farmers. Thorax 40(2): 138-42.

2. Cormier, Y., L. Gagnon, F. Berube-Geriest, and M. Foumier. 1988. Sequential bronchoalveolar lavage in experimental extrinsic allergic alveolitis. The influence of cigarette smoking. Am Rev Respir Dis 137(5):1104-9.

3. Cormier, Y., E. Israel-Assayag, G. Bedard, and C. Duchaine. 1998. Hypersensitivity pneumonitis in peat moss processing plant workers. Am J Respir Crit Care Med 158(2):412-7.

4. Gariepy, L., Y. Cormier, M. Laviolette, and A. Tardif 1989. redictive value of bronchoalveolar lavage cells and serum precipitins in asymptomatic dairy farmers. Am Rev Respir Dis 140(5):1386-9.

5. Lawrence, E. C, T. B. Fox, R. B. Teague, K. Bloom, and R. K. Wilson. 1986. Cigarette smoking and bronchoalveolar T cell populations in sarcoidosis. Ann N Y Acad Sci 465:657-64.

6. Valeyre, D., P. Soler, C. Clerici, J. Pre, J. P. Battesti, R. Georges, and A. J. Hance. 1988. Smoking and pulmonary sarcoidosis: effect of cigarette smoking on prevalence, clinical manifestations, alveolitis, and evolution of the disease. Thorax 43(7):516-24.

7. Rubin, D. T., and S. B. Hanauer. 2000. Smoking and inflammatory bowel disease. Eur J Gastroenterol Hepatol 12(8):855-62.

8. Thomas, G. A., J. Rhodes, J. T. Green, and C. Richardson. 2000. Role of smoking in inflammatory bowel disease: implications for therapy. Postgrad Med J 76(895):273-9.

9. Guslandi, M. 1999. Nicotine treatment for ulcerative colitis. Br J Clin Pharmacol 48(4):481-4.

10. Guslandi, M. 1999. Long-term effects of a single course of nicotine treatment in acute ulcerative colitis: remission maintenance in a 12-month follow-up study. Int J Colorectal Dis 14(4-5):261-2.

11. Rezvani, A. H., and E. D. Levin. 2001. Cognitive effects of nicotine. Biol Psychiatry 49(3):258-67.

12. Kelton, M. C, H. J. Kahn, C. L. Conrath, and P. A. Newhouse. 2000. The effects of nicotine on Parkinson's disease. Brain Cogn 43(1-3):274-82.

PL 207 880 B1

13. Bertram, K.G.1998. Basic and clinical pharmacology. Editions Appelton and Lange. Stanford, Connecticut.

14. Sekhon, H. S., Y. Jia, R. Raab, A. Kuryatov, J. F. Pankow, J. A. Whitsett, J. Lindstrom, and E. R. Spindel. 1999. Prenatal nicotine increases pulmonary alpha7 nicotinic receptor expression and alters fetal lung development in monkeys. J Clin Invest 103(5):637-47.

15. Maus, A. D., E. F. Pereira, P. I. Karachunski, R. M. Horton, D. Navaneetham, K. Macklin, W. S. Cortes, E. X. Albuquerque, and B. M. Conti-Fine. 1998. Human and rodent bronchial epithelial cells express functional nicotinic acetylcholine receptors. Mol Pharmacol 54(5):779-88.

16. Shriver, S. P., H. A. Bourdeau, C. T. Gubish, D. L. Tirpak, A. L. Davis, J. D. Luketich, and

J. M. Siegfried. 2000. Sex-specific expression of gastrin-releasing peptide receptor: relationship to smoking history and risk of lung cancer. J Natl Cancer Inst 92(l):24-33.

17. Ferguson, D. G., M. A. Haxhiu, A. J. To, B. Erokwu, and I. A. Dreshaj. 2000. The alpha3 subtype of the nicotinic acetylcholine receptor is expressed in airway-related neurons of the nucleus tractus solitarius, but is not essential for reflex bronchoconstriction in ferrets. Neurosci Lett 287(2):141-5.

18. Singh, S. P., R. Kalra, P. Puttfarcken, A. Kozak, J. Tesfaigzi, and M. L. Sopori. 2000. Acute and chronic nicotine exposures modulate the immune system through different pathways. Toxicol Appl Pharmacol 164(l):65-72.

19. Kalra, R., S. P. Singh, S. M. Savage, G. L. Finch, and M. L. Sopori. 2000. Effects of cigarette smoke on immune response: chronic exposure to cigarette smoke impairs antigen-mediated signaling in T cells and depletes IP3-sensitive Ca(2+) stores. J Pharmacol Exp Ther293(l):166-71.

20. Sugano, N., K. Shimada, K. Ito, and S. Murai. 1998. Nicotine inhibits the production of inflammatory mediators in U937 cells through modulation of nuclear factor-kappaB activation. Biochem Biophys Res Commun 252(1):25-8.

21. Yates, S. L., M. Bencherif, E. N. Fluhler, and P. M. Lippiello. 1995. Up-regulation of nicotinic acetylcholine receptors following chronic exposure of rats to mainstream cigarette smoke or alpha 4 beta 2 receptors to nicotine. Biochem Pharmacol 50(12):2001-8.

22. Sopori, M. L., and W. Kozak. 1998. Immunomodulatory effects of cigarette smoke. J Neuroimmunol 83(1-2):148-56.

23. Lahmouzi, J., F. Simain-Sato, M. P. Defresne, M. C. De Pauw, E. Heinen, T. Grisar, J. J. Legros, and R. Legrand. 2000. Effect of nicotine on rat gingival fibroblasts in vitro. Connect Tissue

Res 41(1):69-80.

24. Geng, Y., S. M. Savage, S. Razanai-Boroujerdi, and M. L. Sopori. 1996. Effects of nicotine on the immune response. II. Chronic nicotine treatment induces T cell anergy. J Immunol 156(7):23

84-90.

25. McCrea, K. A., J. E. Ensor, K. Nall, E. R. Bleecker, and J. D. Hasday. 1994. Altered cytokine regulation in the lungs of cigarette smokers. Am J Respir Crit Care Med 150(3):696-703.

26. Ohta, T., N. Yamashita, M. Maruyama, E. Sugiyama, and M. Kobayashi. 1998. Cigarette smoking decreases interleukin-8 secretion by human alveolar macrophages. Respir Med 92(7):922-7.

27. Suzuki, N., S. Wakisaka, Y. Takeba, S. Mihara, and T. Sakane. 1999. Effects of cigarette smoking on Fas/Fas ligand expression of human lymphocytes. Cell Immunol 192(1):48-53.

28. Zia, S., A. Ndoye, V. T. Nguyen, and S. A. Grando. 1997. Nicotine enhances expression of the alpha 3, alpha 4, alpha 5, and alpha 7 nicotinic receptors modulating calcium metabolism and regulating adhesion and motility of respiratory epithelial cells. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 97(3):243-62.

29. Zhang, S., and T. M. Petro. 1996. The effect of nicotine on murine CD4 T cell responses. Int J Immunopharmacol 18(8-9):467-78.

30. Bugeon, L., and M. J. Dallman. 2000. Costimulation of T cells. Am J Respir Crit Care Med

162(4 Pt 2):S 164-8.

31. Green, J. M. 2000. The B7/CD28/CTLA4 T-cell activation pathway. Implications for inflammatory lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol 22(3):261-4.

32. Lenschow, D. J., T. L. Walunas, and J. A. Bluestone. 1996. CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu Rev Immunol 14:233-58.

33. Walunas, T. L., and J. A. Bluestone. 1998. CTLA-4 regulates tolerance induction and T cell differentiation in vivo. J Immunol 160(8):3855-60.

PL 207 880 B1

34. Walunas, T. L., D. J. Lenschow, C. Y. Bakker, P. S. Linsley, G. J. Freeman, J. M. Green,

C. B. Thompson, and J. A. Bluestone. 1994. CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity 1(5):405-13.

35. Israel-Assayag, E., A. Dakhama, S. Lavigne, M. Laviolette, and Y. Cormier. 1999. Expression of costimulatory molecules on alveolar macrophages in hypersensitivity pneumonitis. Am J Respir Crit Care Med 159(6): 1830-4.

36. Israel-Assayag, E., M. Foumier, and Y. Cormier. 1999. Blockade of T cell costimulation by CTLA4-Ig inhibits lung inflammation in murine hypersensitivity pneumonitis. J Immunol 163(12):6794-9.

37. Larche, M., S. J. Till, B. M. Haselden, J. North, J. Barkans, C. J. Corrigan, A. B. Kay, and

D. S. Robinson. 1998. Costimulation through CD86 is involved in airway antigenpresenting cell and T cell responses to allergen in atopic asthmatics. J Immunol 161(11):6375-82.

38. Mathur, M., K. Herrmann, Y. Qin, F. Gulmen, X. Li, R. Krimins, J. Weinstock, D. Elliott, J. A. Bluestone, and P. Padrid. 1999. CD28 interactions with either CD80 or CD86 are sufficient to induce allergic airway inflammation in mice. Am J Respir Cell Mol Biol 21 (4):498-509.

39. Nicod, L. P., and P. Isler. 1997. Alveolar macrophages in sarcoidosis coexpress high levels of CD86 (B7.2), CD40, and CD30L. Am J Respir Cell Mol Biol 17(1):91-6.

40. Kesingland, A. C, C. T. Gentry, M. S. Panesar, M. A. Bowes, J. M. Vernier, R. Cube,

K. Walker, and L. Urban. 2000. Analgesic profile of the nicotinic acetylcholine receptor agonists, (+)epibatidine and ABT-594 in models of persistent inflammatory and neuropathic pain. Pain 86(1-2):113-8.

41. Mellon, R. D., and B. M. Bayer. 1999. The effects of morphine, nicotine and epibatidine on lymphocyte activity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses. J Pharmacol Exp Ther 288(2):635-42.

42. Yokotani, K., M. Wang, S. Okada, Y. Murakami, and M. Hirata. 2000. Characterization of nicotinic acetylcholine receptor-mediated noradrenaline release from the isolated rat stomach. Eur J Pharmacol 402(3):223-9.

43. Yost, C. S., and B. D. Winegar. 1997. Potency of agonists and competitive antagonists on adult- and fetal- type nicotinic acetylcholine receptors. Cell Mol Neurobiol 17(l):35-50.

44. Fecho, K., K. A. Maslonek, L. A. Dykstra, and D. T. Lysle. 1993. Alterations of immune status induced by the sympathetic nervous system: immunomodulatory effects of DMPP alone and in combination with morphine. Brain Behav Immun 7(3):253-70.

45. Thompson, D. C, R. J. Altiere, and L. Diamond. 1990. Nicotinic agonist modulation of feline bronchomotor tone. Clin Exp Pharmacol Physiol 17(2):83-97.

46. Bames PJ. 2001. Future Advances in COPD Therapy. Respiration 68(5):441-8.

47. Lasky JA and Ortiz, LA. 2001. Antifibrotic therapy for the treatment of pulmonary fibrosis. Am J Med Sci 322(4):213-21.

48. Baron, JA. 1996. Beneficial effects of nicotine and cigarette smoking: the real, the possible and the spurious. Br Med Bull 52(1):58-73.

49. Waldum, H. L., O. G. Nilsen, T. Nilsen, H. Rorvik, V. Syversen, A. K. Sanvik, O. A. Haugen, S. H. Torp, and E. Brenna. 1996. Long-term effects of inhaled nicotine. Life Sci 58(16):1339-46.

50. Warren, C. P. 1977. Extrinsic allergic alveolitis: a disease commoner in non-smokers. Thorax 32(5):567-9.

51. Cormier, Y., G. M. Tremblay, M. Foumier, and E. Israel-Assayag. 1994. Long-term viral enhancement of lung response to Saccharopolyspora rectivirgula. Am J Respir Crit Care Med 149 (2 Pt 1):490-4.

52. Gudmundsson, G., and G. W. Hunninghake. 1997. Interferon-gamma is necessary for the expression of hypersensitivity pneumonitis. J Clin Invest 99(10):2386-90.

53. Denis, M., M. Bedard, M. Laviolette, and Y. Cormier. 1993. A study of monokine release and natural killer activity in the bronchoalveolar lavage of subjects with farmer's lung. Am Rev Respir Dis 147(4):934-9.

54. Wahlstrom, J., K. Katchar, H. Wigzell, O. Olerup, A. Eklund, and J. Grunewald. 2001. Analysis of intracellular cytokines in cd4(+) and cd8(+) lung and blood t cells in sarcoidosis. Am J Respir Crit Care Med 163(1):115-21.

55. Cohn, L., C. Herrick, N. Niu, R. Homer, and K. Bottomly. 2001. IL-4 promotes airway eosinophilia by suppressing IFN-gamma production: defining a novel role for IFN-gamma in the regulation of allergic airway inflammation. J Immunol 166(4):2760-7.

PL 207 880 B1

56. Laliberte R., Rouabhia M, Bosse M, Chakir J. 2001 Decreased capacity of asthmatic bronchial fibroblasts to degrade collagen. Matrix Biol Jan; 19(8):743-53.

57. Boulet, L. P., H. Turcotte, M. Laviolette, F. Naud, M. C. Bernier, S. Martel, and J. Chakir. 2000. Airway hyperresponsiveness, inflammation, and subepithelial collagen deposition in recently diagnosed versus long-standing mild asthma. Influence of inhaled corticosteroids. Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 1):1308-13.

58. Dempsey, O. J. 2000. Leukotriene receptor antagonist therapy. Postgrad Med J

76(902):767-73.

59. Busse, W. W. 1998. Leukotrienes and inflammation. Am J Respir Crit Care Med 157(6 Pt 2): :S210-3; discussion S247- 8.

60. Zisman, D. A.,.J. P. Lynch, G. B. Toews, E. A. Kazerooni, A. Flint, and F. J. Martinez. 2000. Cyclophosphamide in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis: a prospective study in patients who failed to respond to corticosteroids. Chest 117(6): 1619-26.

61. Redington, A. E. 2000. Fibrosis and airway remodelling. Clin Exp Allergy 30 Suppl 1:42-5.

62. Frew, A.J., and Plummeridge MJ. 2001. Alternative agents in asthma. J Allergy Clin Immunol 108(1):3-10.

Claims (4)

1. Zastosowanie agonisty receptorów nikotynowych wybranego spośród nikotyny, dimetylofenylopiperazynium i epibatydyny do wytwarzania leku do łagodzenia lub zapobiegania u zwierzęcia chorobie zapalnej płuc wybranej z grupy składającej się z astmy, śródmiąższowego włóknienia płuc (IPF), sarkoidozy, alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych (HP), przewlekłego HP i zrostowego zapalenia oskrzelików z organizującym się zapaleniem płuc (BOOP).

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że agonistą receptora nikotynowego jest dimetylofenylopiperazynium.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 lub 2, znamienne tym, że chorobą zapalną płuc jest astma.

4. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że lek jest w postaci farmaceutycznej do podawania doustnego, podjęzykowego, dootrzewnowego, dożylnego, wziewnego, dotchawiczego, donosowego, pozajelitowego, miejscowego, w bezpośredniej iniekcji, wlewie lub śródocznie.