ES2295331T3 - Agonistas de receptor nicotinico para el tratamiento de enfermedades inflamatorias pulmonares. - Google Patents

Abstract

Utilización de un agonista de receptor nicotínico seleccionado de entre nicotina, dimetilfenilpiperazinio (DMPP) y epibatidina en la preparación de un fármaco destinado al alivio o a prevención de la inflamación pulmonar en un animal, seleccionando dicha enfermedad inflamatoria pulmonar de entre el grupo constituido por: asma, fibrosis pulmonar intersticial (IPF), sarcoidosis, neumonitis por hipersensibilidad (HP), HP crónica y bronquiolitis obliterans con neumonitis organizada (BOOP).

Description

Agonistas de receptor nicotínico para el tratamiento de enfermedades inflamatorias pulmonares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades inflamatorias pulmonares mediante la utilización o la administración de agonistas de receptores nicotínicos.

Antecedentes de la invención

Aunque el ser humano respira más de un metro cúbico de aire cada hora, los mecanismos de defensa pulmonares habitualmente se enfrentan a grandes cantidades de partículas, antígenos, agentes infecciosos y gases tóxicos y humos que se encuentran presentes en el aire inhalado. La interacción de estas partículas con el sistema inmunológico y otros mecanismos de defensa pulmonar resulta en la generación de una respuesta inflamatoria controlada que habitualmente es protectora y beneficiosa. En general, este proceso se regula a sí mismo con el fin de preservar la integridad de las superficies epiteliales de las vías respiratorias y alveolares donde se produce el intercambio de gases. En algunos casos, sin embargo, la respuesta inflamatoria no puede regularse y se incrementa el potencial de daño de tejidos. Dependiendo del tipo de exposición ambiental, predisposición genética y una diversidad de factores no bien definidos, pueden reclutarse cantidades anormalmente grandes de células inflamatorias en diferentes sitios del sistema respiratorio, resultando en enfermedad o patología.

La respuesta inflamatoria frente a los estímulos inhalados o intrínsecos se caracteriza por un incremento no específico de la permeabilidad vascular, la liberación de mediadores inflamatorios y quimiotácticos, incluyendo histamina, eicosanoides, prostaglandinas, citoquinas y quimoquinas. Estos mediadores modulan la expresión y unión de las moléculas de adhesión de leucocitos-células endoteliales, permitiendo el reclutamiento de células inflamatorias presentes en la sangre.

Una reacción inflamatoria más específica implica el reconocimiento y la construcción de una respuesta inmunológica específica exacerbada frente a antígenos inhalados. Esta reacción se encuentra implicada en el desarrollo del asma, la neumonitis por hipersensibilidad (HP) y posiblemente la sarcoidosis. La desregulación de los mecanismos de reparación tras la lesión pulmonar puede contribuir a la fibrosis y a la pérdida de función en asma, fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y en HP crónica.

Hasta hoy se ha constatado que la incidencia de HP es mucho menor entre fumadores actuales que entre no fumadores (1-4). La sarcoidosis también es menos frecuente en fumadores que en no fumadores (5, 6). Todavía se desconoce cuáles son los mecanismos subyacentes a los efectos beneficiosos del tabaquismo de cigarrillos sobre el desarrollo de HP y de otras enfermedades inflamatorias, aunque podrían encontrarse asociados al efecto inmunomodulador de la nicotina. Existen observaciones clínicas de la aparición de novo de asma o de su exacerbación tras cesar el tabaquismo. Resulta difícil obtener evidencia de lo anterior y cualquier efecto protector de la nicotina en la prevención o el tratamiento del asma probablemente resulta superado por los efectos negativos del humo del tabaco, con sus miles de constituyentes.

También se ha constatado el efecto protector del tabaquismo en otras enfermedades, siendo la más estudiada la colitis ulcerosa, una enfermedad intestinal inflamatoria (7, 8). La nicotina se ha utilizado con éxito en el tratamiento de dicha enfermedad (9, 10). Otros estudios se han centrado en el posible valor terapéutico de la nicotina en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y de la enfermedad de Parkinson (11, 12).

Los receptores nicotínicos son pentámeros que constan de cinco subunidades polipéptido que actúan como canales iónicos dependientes de ligando. Cuando el ligando se une al receptor, se produce un cambio conformacional del polipéptido, abriendo el canal central que permite que el ión sodio se desplace desde el líquido extracelular hacia el interior del citoplasma. Se han identificado cuatro tipos de subunidad: \alpha, \beta, \gamma y \delta. El receptor puede consistir de cualquier combinación de estos cuatro tipos de subunidad (13). Unos estudios recientes han demostrado que los macrófagos alveolares (AM) pueden expresar la subunidad \alpha-7 (14), mientras que las células epiteliales bronquiales expresan las subunidades \alpha-3, \alpha-5 y \alpha-7 (15), y los linfocitos, las subunidades \alpha-2, \alpha-5, \alpha-7, \beta-2 y \beta-4 (14). Los fibroblastos (16) y células pulmonares residentes (AM, células dendríticas, células epiteliales, fibroblastos, etc.) y aquéllas reclutadas en enfermedades inflamatorias (linfocitos, células polimorfonucleares) expresan receptores nicotínicos.

La activación de los receptores nicotínicos en linfocitos afecta a la señalización intracelulares, conduciendo a la activación incompleta de la célula. De hecho, el tratamiento con nicotina regula positivamente la actividad de la proteína quinasa, que a su vez regula positivamente la actividad de la fosfolipasa A2 (PLA2). PLA2 es responsable del procesamiento del fosfoinositol-2-fosfato (PIP2) en inositol-3-fosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) (18, 19). La presencia continua de IP3 en la célula aparentemente resulta en la desensibilización de las reservas de calcio, conduciendo a su agotamiento (19). Esta observación podría explicar el hecho de que los linfocitos tratados con nicotina no liberan suficiente calcio en el citoplasma para activar factores transcripcionales, tales como NFk-B (20).

La nicotina, el componente farmacológico principal del humo de cigarrillo, es uno de los agonistas de receptor nicotínico mejor conocidos (21). Esta sustancia natural presenta propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras bien definidas (22) y podría presentar propiedades antifibróticas (23). La exposición de animales al humo de cigarrillos con niveles elevados de nicotina resulta más inmunosupresor que la exposición a cigarrillos bajos en nicotina (24). Además, el tratamiento de ratas con nicotina inhibe la respuesta específica de anticuerpos contra antígenos e induce la anergia de las células T (25). Aunque se hallan incrementados en número, los AM de los fumadores muestran una capacidad menor de secretar citoquinas inflamatorias en respuesta a endotoxinas (20, 25, 26) y la nicotina aparentemente es el componente responsable de esta inhibición (26). Un estudio también ha demostrado que los linfocitos sanguíneos periféricos de fumadores expresan niveles más elevados de ligando FAS (FASL) y que la nicotina incrementa la expresión de FASL en linfocitos procedentes de no fumadores, indicando que la nicotina podría afectar a la apoptosis celulares (27). También se ha demostrado que la nicotina presenta un efecto inhibidor de la proliferación y producción de matriz extracelular de fibroblastos gingivales humanos in vitro (23). Resulta interés que el tratamiento con nicotina aparentemente regula positivamente la expresión de los receptores nicotínicos (28). La patente WO nº 01/15697 da a conocer la utilización de nicotina o de un derivado de la misma para el tratamiento de una enfermedad pulmonar obstructiva, tal como el enfisema pulmonar o la anomalía bilateral bronquial congénita.

Los agonistas nicotínicos pueden regular negativamente la activación de las células T, en efecto se ha demostrado que la nicotina afecta a la expresión de las células T de las moléculas coestimuladoras CD28 y CTLA4 (29).

La ruta de coestimulación B7/CD28/CTLA4 desempeña un papel regulador clave en la activación y homeostasis de las células T (30, 31). Se encuentran implicadas dos rutas de señalización. Una señal positiva implica la unión de moléculas de B7 (CD80/CD86) a los receptores CD28 de las células T, que resulta en la potenciación de las respuestas de las células T (proliferación, activación, expresión y supervivencia de las citoquinas) (32). Una señal negativa implica interacciones de B7 con CTLA4 en células T activadas, llevando a la modulación negativa de las respuestas de las células T (33, 34). El equilibrio entre las señales derivadas de CD28 y de CTLA4 puede alterar el resultado de la activación de las células T.

En la HP anteriormente se había constatado una regulación positiva de la expresión de la molécula B7 sobre los AM en pacientes con HP activa (35) y en HP murina (36). También se demostró que un bloqueo de la ruta de coestimulación B7-CD28 en ratones inhibe la inflamación pulmonar (36). Estos resultados también demostraron que la expresión de las moléculas B7 sobre los AM es menor en fumadores que en no fumadores y que una infección in vitro por virus influenza puede regular positivamente la expresión de B7 en AM humanas normales pero no en AM de fumadores; se desconoce si lo anterior se debe a la nicotina o a otras sustancias presentes en el humo del tabaco (35). También se ha informado de una regulación positiva de las moléculas B7 en el asma (37, 38) y la sarcoidosis (39).

La epibatidina es el agonista nicotínica más potente que se conoce en la actualidad (40). Presenta propiedades antiinflamatorias y analgésicas. De hecho, su potencial analgésico es doscientas veces superior al de la morfina (40). Dicha molécula también es conocido que inhibe la proliferación de los linfocitos in vitro (41). La unión de la epibatidina al receptor es no específica (42).

El dimetilfenilpiperazinio (DMPP) es un agonista nicotínico sintético que es no específico (13). Su potencia para el receptor es aproximadamente igual a la de la nicotina, dependiendo del tipo de células implicadas en la estimulación (43). La ventaja del mismo sobre la nicotina y sobre otros agonistas nicotínicos es que su configuración química impide que cruce la barrera hematocefálica, no causando de esta manera adicción ni otros efectos en el sistema nervioso central (13). Las propiedades antiinflamatorias del DMPP no se encuentran bien descritas. Sin embargo, se ha demostrado que un tratamiento in vivo crónico podría reducir el número de glóbulos blancos, reducir la producción de citoquinas por parte de los esplenocitos y reducir la actividad de las células asesinas naturales (44). También se ha estudiado el efecto del DMPP sobre las células de músculo liso de las vías respiratorias. El DMPP presenta un efecto inicial breve de contracción seguido de un efecto relajante cuando las células se encuentran en contacto con el agonista durante un periodo de tiempo más prolongado (45). Este efecto broncodilatador no convertiría en sí mismo al DMPP en un tratamiento potencialmente útil del asma, debido a que en la actualidad se encuentran disponibles en el mercado broncodilatadores más potentes (agonistas B2). Sin embargo, las propiedades de este agonista de receptor nicotínico resultan importantes debido a que este fármaco ha podido administrarse con seguridad a asmáticos y a pacientes de COPD debido a sus propiedades antiinflamatorias. Además, no existe evidencia de que DMPP presenta ningún efecto tóxico sobre los órganos principales, tales como el corazón, el cerebro, el hígado o los pulmones.

A pesar de los avances en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias, incluyendo las enfermedades inflamatorias pulmonares, el tratamiento con los fármacos o agentes disponibles con frecuencia resulta en efectos secundarios no deseables. Por ejemplo, la inflamación de la COPD aparentemente es resistente a los corticoesteroides y en consecuencia se ha reconocido la necesidad de desarrollar nuevos fármacos antiinflamatorios para tratar esta condición (46).

De manera similar, aunque se han utilizado rutinariamente corticoesteroides y otra medicación inmunosupresora para tratar la fibrosis pulmonar, han demostrado una eficacia sólo marginal (47).

De esta manera, existe una necesidad de nuevas composiciones farmacéuticas fiables para tratar las enfermedades inflamatorias pulmonares de una manera que alivie los síntomas de las mismas sin causar efectos secundarios.

Sumario de la invención

Según la presente invención, se proporciona la utilización de un agonista de receptores nicotínicos seleccionados de entre nicotina, dimetilfenilpiperazinio (DMPP) y epibatidina en la preparación de un fármaco para el alivio o la prevención de la inflamación pulmonar en un animal, seleccionando dicha enfermedad pulmonar inflamatoria de entre el grupo que consiste de: asma, fibrosis pulmonar intersticial (IPF), sarcoidosis, neumonitis por hipersensibilidad (HP), HP crónica y bronquiolitis obliterans con neumonitis organizada (BOOP).

Es nueva la idea de utilizar nicotina o los demás agonistas de receptor nicotínico según la reivindicación 1 para tratar las enfermedades inflamatorias pulmonares según la reivindicación 1. A pesar de las impresionantes propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras de la nicotina y de otros agonistas de receptores nicotínicos, la utilidad de los mismos en el tratamiento de las enfermedades alérgicas y de otras enfermedades inflamatorias pulmonares según la reivindicación 1 no se ha dado a conocer con anterioridad. La nicotina misma es una sustancia segura que aparentemente no presenta ningún efecto secundario a largo plazo (48, 49). Las enfermedades pulmonares, cardíacas y arteriales relacionadas con el humo no están causadas por la nicotina sino por los miles de otros compuestos químicos presentes en el humo inhalado. El problema principal es que la nicotina cruza la barrera hematocefálica, induciendo adicción. Éstas son razones importantes para la falta de interés hasta el momento en los agonistas nicotínicos para el tratamiento de las enfermedades pulmonares. Los efectos perjudiciales del tabaquismo de cigarrillos resultan evidentes. Aunque la nicotina no es responsable de los efectos tóxicos del tabaquismo de cigarrillos (49), la asociación perdura.

De esta manera, la presente invención propone utilizar los agonistas de los receptores nicotínicos según la reivindicación 1, tales como DMPP, para tratar enfermedades inflamatorias pulmonares, tales como asma, fibrosis pulmonar intersticial (IPF), sarcoidosis, HP y bronquiolitis obliterans con neumonitis organizada (BOOP). El fármaco podría administrarse oralmente, o preferentemente mediante administración dirigida directamente en el pulmón mediante aerosolización con diferentes vehículos preferentes, minimizando de esta manera cualquier efecto sistémico.

Las propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras, así como los efectos secundarios mínimos de los agonistas de receptor nicotínico permiten que estos fármacos resulten idóneos para la utilización médica en el tratamiento de una gran diversidad de enfermedades pulmonares que se caracterizan por inflamación bronquial o intersticial, seleccionadas de entre asma, IPF, sarcoidosis, HP y BOOP.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: recuentos celulares totales y diferenciales de células del BAL. Se produjo una marcada inhibición de los recuentos celulares totales en ratones tratados con nicotina debido principalmente a una reducción de la población de linfocitos.

Figura 2: expresión de ARNm de IFN-\gamma en células mononucleares pulmonares aisladas. Se observó una inhibición significativa del ARNm de IFN-\gamma.

Figura 3: la expresión de ARNm de TNF-\alpha resultó inducida por una estimulación de 24 horas de componentes lipolisacáridos de paredes celulares Gram-negativas (LPS). Los resultados se expresan en forma de % de expresión, atribuyendo 100% al grupo de LPS solo. Se obtuvo la intensidad de la banda dividiendo la intensidad de la banda de TNF-\alpha por la de la \beta-actina. El tratamiento de las células estimuladas con diferentes dosis (40 a 160 \muM para la nicotina y el DMPP) indujo una caída de la expresión de ARNm de TNF-\alpha. El mayor efecto se obtuvo con la concentración de 40 \muM de nicotina (una reducción de la expresión de 98%), mientras que todas las dosis de DMPP causaron una reducción de 60% a 50% de la expresión.

Figura 4: se indujo la expresión de ARNm de TNF-\alpha mediante una estimulación de 24 horas de Saccharopolyspora rectivirgula (SR). Los resultados se expresan tal como se describe en la fig. 3. El tratamiento de células estimuladas con diferentes dosis (80 a 160 \muM para la nicotina, y 40 a 160 \muM para el DMPP) indujo una regulación negativa de la expresión de ARNm de TNF-\alpha. Únicamente la dosis de 160 \muM de nicotina presentó un efecto sobre la expresión de ARNm, mientras que las dosis de 40 \muM y de 80 \muM indujeron hasta 60% de reducción de la expresión de ARNm de TNF-\alpha.

Figura 5: se indujo la expresión de ARNm de IL-10 mediante la estimulación durante 24 h con LPS. Los resultados se expresan tal como se describe en la fig. 3. El tratamiento de las células estimuladas con diferentes dosis (40 a 160 \muM tanto para nicotina como DMPP) indujo una regulación negativa de la expresión de ARNm de IL-10. La mayor caída de expresión (una reducción de 87%) se produjo con nicotina 40 \muM. El DMPP indujo una reducción de 55% a 40% de la expresión a las tres dosis.

Figura 6: se indujo la expresión de ARNm de IL-10 mediante una estimulación de 24 horas con SR. El tratamiento de las células estimuladas con diferentes dosis (80 y 160 \muM para la nicotina y 40 a 80 \muM para el DMPP) indujo una regulación negativa de la expresión de ARNm de IL-10. La mayor caída de la expresión de ARNm con el tratamiento de nicotina se produjo a la concentración de 160 \muM (caída de expresión del 60%) y a una concentración de 80 \muM (caída de expresión del 90%) con el tratamiento de DMPP.

Figura 7: se indujo la expresión de ARNm de IFN-\gamma en células RAW 264.7 mediante una estimulación de 24 h con LPS. Los resultados se expresan tal como se describe en la fig. 3. El tratamiento de las células estimuladas con diferentes dosis de DMPP indujo una reducción de la expresión de ARNm de IFN-\gamma. La mayor caída de expresión (una reducción de 80%) se produjo con DMPP 40 \muM.

Figura 8: a) se indujo la expresión de CD80 con LPS (38%) o con antígeno SR (35%). El tratamiento con nicotina (40 \muM durante 48 horas) redujo la expresión al 20% en células estimuladas con LPS y 26% en células estimuladas con SR, b) se indujo la expresión de CD80 con LPS (38%) o con antígeno SR (35%). El tratamiento con DMPP (40 \muM durante 48 horas) redujo la expresión a 17% en células estimuladas con LPS y 20% en células estimuladas con SR.

Figura 9: expresión de ARNm de IFN-\gamma en linfocitos T aislados a partir de BAL de pacientes de HP. El tratamiento con DMPP redujo la expresión de IFN-\gamma en estas células.

Figura 10: se llevó a cabo la expresión de CD86 en células totales del BAL de un sujeto normal. Las células tratadas con DMPP expresaron 50% menos CD86 que las células no tratadas.

Figura 11: células del BAL de ratones tratados con DMPP, con nicotina y con epibatidina. Los tratamientos de nicotina y de epibatidina presentaron un efecto de inhibición significativo sobre la inflamación inducida por SR tras 24 horas.

Figura 12: se observó un efecto de inhibición significativo del DMPP sobre la inflamación pulmonar al incrementar el número de animales.

Figura 13: niveles de TNF en líquido BAL (BALF) procedente de ratones tratados con DMPP. El DMPP redujo significativamente los niveles de TNF del BALF.

Figura 14: efecto del tratamiento intraperitoneal con dosis crecientes de DMPP sobre la acumulación total de células en el BAL de ratones asmáticos. El número de células se encontraba muy elevado en ratones no tratados expuestos a OVA. El tratamiento de DMPP redujo significativamente los recuentos celulares a las dosis de 0,5 y 2,0 mg/kg.

Figura 15: recuentos diferenciales para la respuesta de dosis. Los ratones retados con OVA (OVA OVA) presentaron más eosinófilos y linfocitos en el BAL de los mismos en comparación con el grupo de control (sal sal). El tratamiento de DMPP redujo significativamente la presencia tanto de eosinófilos como de linfocitos en BAL en todos los grupos (n=8, p<0,05).

Figura 16: segunda respuesta de dosis para el tratamiento IP de DMPP sobre la acumulación total de células en BAL de ratones asmáticos. El número de células se encontraba muy elevado en ratones no tratados retados con OVA. El tratamiento de DMPP redujo significativamente las células totales a las dosis de 0,1 y 0,5 mg/kg.

Figura 17: recuentos diferenciales de la segunda respuesta de dosis. El tratamiento con DMPP redujo significativamente los recuentos de eosinófilos y de linfocitos en las dosis de 0,1 y 0,5 mg/kg, siendo 0,5 mg/kg la dosis más efectiva para el efecto antiinflamatorio de DMPP.

Figura 18: los niveles de IL-5 en BAL procedente de ratones controles, asmáticos y tratados. Los retos con OVA incrementaron los niveles de IL-5 en BAL, mientras que el tratamiento de DMPP presentó un efecto de inhibición significativo sobre los niveles de IL-5 en el grupo tratado con 0,5 mg/kg.

Figura 19: resistencia pulmonar tras retos con metacolina de ratones normales, asmáticos y asmáticos tratados con 0,5 mg/kg de DMPP intranasal. DMPP redujo el % de incremento de resistencia pulmonar en comparación con los ratones asmáticos.

Figura 20: se calculó la dosis de reto de provocación de 200% de incremento de resistencia pulmonar (PC200). DMPP redujo significativamente la PC200 en ratones tratados en comparación con ratones asmáticos (p=0,04; n=6).

Figura 21: se indujo la expresión de ARNm de IL-4 mediante una estimulación de 24 h con LPS. Los resultados se expresan tal como se describe en la fig. 3. Las células se trataron con diferentes dosis (40 a 160 \muM tanto para la nicotina como para el DMPP). El tratamiento de nicotina redujo la expresión en el grupo de 40 \muM). El tratamiento de DMPP bloqueo por completo la expresión de ARNm de IL-4 en las células estimuladas con LPS, a todas las dosis.

Figura 22: efecto del DMPP sobre la transmigración de eosinófilos sanguíneos. El DMPP indujo una inhibición relacionada con la dosis de la transmigración de eosinófilos a través de una membrana basal artificial.

Figura 23: efecto de la mecamilamina, un antagonista nicotínico, sobre el efecto de inhibición del DMPP sobre la transmigración de los eosinófilos sanguíneos. La mecamilamina revierte el efecto del DMPP, sugiriendo que la activación del receptor nicotínico resulta necesaria para el efecto inhibidor del DMPP.

Figura 24: efecto de otros agonistas nicotínicos sobre la transmigración de los eosinófilos sanguíneos. La nicotina, la epibatidina y la citosina reducen todos la transmigración de los eosinófilos sanguíneos.

Figura 25: efecto del DMPP sobre la expresión del ARNm del colágeno 1A de fibroblastos pulmonares humanos normales. El DMPP inhibe la expresión del ARNm del colágeno 1A de una manera dependiente de la dosis.

Figura 26: efecto de la nicotina sobre la expresión del ARNm del colágeno 1A de los fibroblastos pulmonares humanos. La nicotina inhibe la expresión del ARNm del colágeno 1A a las concentraciones de 1 \muM y 10 \muM, mientras que las dosis superiores no presentaron ningún efecto inhibidor.

Figura 27: efecto de la epibatidina, otro agonista nicotínico, sobre la expresión del ARNm del colágeno 1A de los fibroblastos pulmonares humanos. La epibatidina también presenta un efecto de inhibición sobre la expresión del ARNm del colágeno 1A.

Descripción de las formas de realización preferidas

La presencia de receptores nicotínicos sobre las células inflamatorias y pulmonares ha sido descrita con anterioridad. Sin embargo, la novedad de la presente invención reside en la observación de que los agonistas de receptor nicotínico seleccionados de entre nicotina, dimetilfenilpiperazinio y epibatidina aparentemente resultan útiles en el tratamiento de las enfermedades pulmonares inflamatorias según la reivindicación 1, y en el descubrimiento relacionado de las propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras de los agonistas nicotínicos dirigidos específicamente contra mecanismos implicados en la patogénesis de dichas enfermedades pulmonares inflamatorias seleccionadas de entre asma, HP, sarcoidosis, BOOP e IPF. Un ejemplo de lo anterior es el efecto del humo del tabaco sobre la expresión de las moléculas B7 coestimuladoras.

Se utilizaron dos modelos animales para estudiar los efectos de los antagonistas nicotínicos en las enfermedades pulmonares inflamatorias: un modelo de HP y un modelo de asma. En ambos modelos, se estudiaron los efectos de los agonistas de receptor nicotínico (tanto selectivos como no selectivos) sobre la fisiología pulmonar y la inflamación. Se llevaron a cabo estudios in vitro utilizando células inflamatorias aisladas procedentes de estudios animales o de pacientes, así como de líneas celulares disponibles comercialmente, en un intento de comprender los mecanismos mediante los que los agonistas nicotínicos regulan negativamente la inflamación.

Inicialmente se llevaron a cabo experimentos con agonistas no específicos, es decir, agonistas que se unen a todas las subunidades de receptor nicotínico (nicotina, dimetilfenilpiperazinio (DMPP) y epibatidina) (13, 42). También se sometió a ensayo un agonista específico de la subunidad \beta4, el compuesto de referencia, citisina (42), con el fin de comprobar si una estimulación específica también podía presentar efectos antiinflamatorios.

Para los fines de la presente solicitud, el término "animal" se refiere a seres humanos, primates, animales domésticos (tales como caballos, vacas, cerdos, cabras, ovejas, gatos, perros, cobayas, ratones, etc.) y otros mamíferos. Generalmente, dicho término se utiliza para indicar seres vivos que presentan sistemas vasculares altamente desarrollados.

Para los fines de la presente invención, los agonistas o agentes son moléculas o compuestos que se unen y modulan la función del receptor nicotínico seleccionado de entre nicotina, dimetilfenilpiperazinio y epibatidina.

Para los fines de la presente invención, agonistas o agentes son moléculas o compuestos que se unen y modulan la función del receptor nicotínico seleccionado de entre nicotina, dimetilfenilpierazinio y epibatidina. Los agentes preferentes son específicos de receptores y no cruzan la barrera hematocefálica, tal como el DMPP.

Pueden modificarse agentes seleccionados con el fin de incrementar la eficacia, estabilidad y compatibilidad farmacéutica. Un procedimiento de estabilización puede incluir la encapsulación, por ejemplo, en liposomas. Los agentes de unión de la invención se preparan de cualquier manera conveniente conocida por los expertos en la materia.

Para los usos terapéuticos, pueden administrarse mediante cualquier medio conveniente agentes que afectan a la función de los receptores nicotínicos. Las moléculas orgánicas pequeñas preferentemente se administran por vía oral; otras composiciones y agentes preferentemente se administran por vía parenteral, convenientemente en un portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato. Típicamente las composiciones se añaden a un líquido fisiológico retenido, tal como sangre o líquido sinovial.

A título de ejemplo, muchas de dichas terapéuticas pueden hacer uso de la inyección directa o la infusión, o la administración tópica, intratecal/nasal, por ejemplo mediante aerosol, intraocularmente o dentro/sobre implantes (tales como colágeno, bombas osmóticas, injertos que comprenden células apropiadamente transformadas, etc., con péptidos terapéuticos). Generalmente, la cantidad administrada se determina empíricamente, típicamente en el intervalo de entre 10 y 1.000 \mug/kg del receptor. Para los agentes péptido, la concentración generalmente se encontrará comprendida entre 50 y 500 \mug/ml en la dosis administrada. Pueden incluirse otros aditivos, tales como estabilizantes y bactericidas. Dichos aditivos se encontrarán presentes en cantidades convencionales.

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Los agonistas nicotínicos según la reivindicación 1 no sustituyen todos los fármacos utilizados en la actualidad para tratar las enfermedades inflamatorias pulmonares y la obstrucción de vías respiratorias frecuentemente asociada a estas enfermedades. Los broncodilatadores siguen resultando útiles para la liberación inmediata de los broncoespasmos. Sin embargo, los broncodilatadores no presentan ningún efecto sobre la causa subyacente de la inflamación.

Los corticoesteroides son potentes fármacos antiinflamatorios. La utilización sistémica de los mismos causa efectos secundarios mayores que impiden su utilización de largo plazo siempre que ello resulte posible. Los esteroides inhalados pobremente absorbidos resultan útiles para tratar la inflamación de las vías respiratorias. A dosis reducidas, estos fármacos presentan pocos o ningún efecto secundario. Sin embargo, las dosis más elevadas incrementan los riesgos de candidiasis oral, parálisis de las cuerdas vocales, cataratas y osteoporosis. Los esteroides inhalados no presentan ningún efecto sobre los espacios intersticiales pulmonares y no presentan propiedades antifibróticas (57).

Algunos fármacos más recientes, tales como los antileucotrienos, resultan útiles en algunos asmáticos (58) pero no presentan ningún efecto en la COPD ni en otras enfermedades pulmonares. Dichos fármacos presentan propiedades antiinflamatorias limitadas a los componentes de la inflamación causados por los leucotrienos (59). El tratamiento de las enfermedades pulmonares intersticiales, tales como la IPF, la sarcoidosis, la HP y la BOOP principalmente se basa en la utilización de corticoesteroides sistémicos. Dicho tratamiento resulta efectivo en el control de parte de la inflamación, pero por desgracia induce efectos secundarios graves y no revierte los cambios fibróticos subyacentes. Algunos agentes inmunosupresores, tales como la ciclofosfamida y la azatioprina en ocasiones se utilizan en IPF severa, pero sus valores terapéuticos no han sido demostrados y en el mejor de los casos resultan muy limitados (60). En esencia, la fibrosis pulmonar es habitualmente progresiva e intratable, muriendo la mayoría de los pacientes de IPF debido a esta condición (61).

Los agonistas nicotínicos según la reivindicación 1 pueden resultar útiles como fármaco reductor de la dosis utilizada de esteroides o de sustitución de esteroides. Dirigiendo la administración de dichos agonistas nicotínicos a los fagocitos pulmonares, estos fármacos podrían resultar útiles en el control de la inflamación tanto de las vías respiratorias como intersticial. Una ventaja importante de dichos agonistas nicotínicos respecto a los corticoesteroides, además de presentar menos efectos secundarios, es el hecho de que estos agonistas presentan un efecto directo sobre los fibroblastos y por lo tanto podrían prevenir o revertir la fibrosis en las vías respiratorias y en los pulmones, sobre la que no actúan los corticoesteroides. La fibrosis intersticial es el síntoma distintivo si la IPF, una secuela principal de la HP y la sarcoidosis, y la fibrosis de las vías respiratorias es una observación predominante en el asma crónico (57).

Se están estudiando activamente otras sustancias como potenciales nuevos tratamientos para las enfermedades inflamatorias pulmonares. Los tratamientos se centran específicamente en muchas citoquinas (por ejemplo IL-5, IL-13, IL-16, etc.) (62). Se cree que, debido a la complejidad de las rutas implicadas en la inflamación, es improbable que ninguna citoquina específica u otro mediador inflamatorio específico presente un impacto significativo sobre el tratamiento de estas enfermedades pulmonares. Los agonistas de receptores nicotínicos, de manera similar a los corticoesteroides, presentan la ventaja de tratar específicamente un amplio espectro de la respuesta nicotínicos inflamatoria. En lo anterior se encuentra su potencial en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias pulmonares según la reivindicación 1.

Ejemplos I - Inflamación similar a la hipersensibilidad

Efecto de los agonistas sobre la neumonitis por hipersensibilidad (HP) inducida a largo plazo en ratones.

Ejemplo 1 Estudios in vivo sobre la HP

La hipótesis es que la estimulación de los receptores nicotínicos con nicotina regula negativamente la respuesta inmunológica a los antígenos de la HP mediante la supresión de citoquinas inflamatorias y la inhibición de la activación celular mediada por antígenos.

Dicho modelo se seleccionó debido a que, tal como se ha indicado anteriormente, la incidencia de la HP es menor en fumadores que en no fumadores (50) y debido a que este modelo se encuentra bien descrito. Se indujo la HP mediante la administración de antígeno de Saccharopolyspora rectivirgula (SR), el agente causativo de la neumopatía de los granjeros (51), una forma de HP. Se trataron ratones simultáneamente con nicotina intraperitoneal (IP), con dosis comprendidas entre 0,5 y 2,0 mg/kg dos veces al día. La administración de nicotina redujo significativamente el número de células totales observadas en el lavado broncoalveolar (BAL) de estos ratones. La población más afectada por el tratamiento de nicotina fue la de linfocitos (fig. 1). Se aislaron macrófagos y linfocitos pulmonares, y se estimularon con IL-2 recombinante anti-CD3+. Se midió la producción de ARNm de IFN-\gamma por estas células, una citoquina que es conocido que se encuentra implicada en el desarrollo de la HP y de otras enfermedades inflamatorias pulmonares (52). Las células de animales tratados con nicotina mostraron una reducción significativamente inferior de ARNm de IFN-\gamma que las células de animales no tratados (fig. 2).

Ejemplo 2 Estudios in vitro que muestran el efecto de agonistas nicotínicos sobre la expresión de citoquinas

Con el fin de clarificar adicionalmente los mecanismos implicados en el efecto supresor de la nicotina en el modelo in vivo, se utilizó una línea celular de macrófagos alveolares.

Se sometió a ensayo el efecto del tratamiento de nicotina o de DMPP en células AMJ2-C11 sobre la expresión de ARNm de TNF-\alpha y de IL-10 mediante RT-PCR. Estas citoquinas se encuentran implicadas en el desarrollo de enfermedades inflamatorias pulmonares, tales como HP, asma y sarcoidosis (52 a 55). Los tratamientos de nicotina y de DMPP mostraron una gran reducción de la expresión de ARNm de TNF (una reducción de hasta 98% de la expresión en células estimuladas con el componente lipopolisacárido (LPS) de paredes celulares Gram-negativas y tratadas con nicotina 40 \muM), pero no de una manera dependiente de la dosis (fig. 3). Se observaron resultados similares en células estimuladas con SR (fig. 4). Dicha respuesta no dependiente de la dosis puede explicarse por la desensibilización de receptores nicotínicos debido a una gran cantidad de agonista en el medio. La expresión de ARNm de IL-10 también resultó afectada negativamente por el tratamiento de nicotina y de DMPP. La mejor regulación negativa se produjo a una dosis de 40 \muM de nicotina (estimuladas con LPS; reducción de la expresión de ARNm de 88%; fig. 5) y a una dosis de 80 \muM de DMPP (estimuladas con SR; reducción de la expresión de ARNm de 87%; fig. 6). Nuevamente el efecto no fue dependiente de la dosis.

Se utilizó otra línea de macrófagos (RAW 264.7, ATCC) para someter a ensayo el efecto del DMPP sobre la expresión de IFN-\gamma mediante RT-PCR, debido a que las células AMJ2-C11 aparentemente no expresaban ARNm de IFN-\gamma (datos no mostrados). Se estimularon células con 50 \mug/ml de antígeno SR y se incubaron con DMPP a dosis comprendidas entre 40 y 160 \muM. El tratamiento con DMPP redujo la expresión de IFN-\gamma en estas células hasta en 75% con la dosis de 40 \muM (fig. 7). Nuevamente el efecto aparentemente no era dependiente de la dosis.

Ejemplo 3 Efectos in vitro de agonistas nicotínicos sobre la expresión de moléculas coestimuladoras

Se sometieron a ensayo in vitro los efectos de la nicotina y del DMPP sobre la expresión de la molécula B7 (CD80). Se incubaron células AMJ2-C11 (macrófagos alveolares de ratón, procedentes de la ATCC) con nicotina o DMPP 40 \muM y se estimularon con LPS (0,1 \mug/ml) o antígeno de SR (50 \mug/ml) durante 48 horas. El porcentaje de expresión de CD80 en células tratadas era aproximadamente la mitad de la expresión observada en células no tratadas estimuladas con LPS y SR (figs. 8(a) y (b)).

Ejemplo 4 Estudios sobre las células del BAL humano (AM y linfocitos)

Debido a que un objetivo era tratar pacientes con DMPP o fármacos similares, se verificó el efecto del fármaco sobre linfocitos de pacientes con HP. Se obtuvo BAL de pacientes con HP. Se aislaron los linfocitos del resto de células del BAL, se estimularon con PHA y se incubaron con DMPP. Se sometió a ensayo la dosis-respuesta del DMPP sobre la producción de ARNm de citoquina (mediante RT-PCR) para IFN-\gamma (fig. 9).

Se llevó a cabo un lavado broncoalveolar en un sujeto normal y se aislaron macrófagos alveolares. Las células estimuladas con SR y tratadas con nicotina o con DMPP nuevamente mostraron aproximadamente la mitad de la expresión de CD86 en células no tratadas (fig. 10).

Ejemplo 5 Investigación del efecto de otros agonistas nicotínicos sobre la inflamación aguda de corto plazo inducida por SR

La instilación intranasal de antígenos de Saccharopolyspora rectivirgula (SR), el agente causativo de la neumopatía de los granjeros, en ratones, induce una respuesta inflamatoria prominente en los pulmones. Los neutrófilos son las primeras células inflamatorias que aparecen en el sitio de inflamación. El tratamiento de los ratones con DMPP (0,5 mg/kg), nicotina (0,5 mg/kg) y epibatidina (2 \mug/kg) presentó un efecto de inhibición marcado sobre la inflamación inducida por SR (fig. 11). Se administraron intranasalmente agonistas nicotínicos en un volumen de 50 \mul cada 6 horas y se sacrificaron los ratones 24 horas después de la instilación de SR.

Se observó un efecto de inhibición significativo con la nicotina y con la epibatidina pero no con el DMPP. Sin embargo, tras incrementar el número de ratones tratados o no tratados con DMPP a 15, se observó una inhibición significativa en comparación con el grupo no tratado (fig. 12).

Los niveles de TNF (una citoquina proinflamatoria) son inferiores en el lavado broncoalveolar de ratones tratados con DMPP (fig. 13), indicando que la regulación negativa de la inflamación podría resultar de una menor concentración de TNF.

II. Inflamación similar al asma Ejemplo 6 Modelo in vivo de asma

Se llevaron a cabo experimentos similares en ratones sensibilizados con ovoalbúmina. El DMPP supuestamente reduce tanto la respuesta inflamatoria como la hiperreactividad a los alérgenos inhalados y a la metacolina.

Se sensibilizaron grupos de ratones Balb/c mediante inyección intraperitoneal de 20 \mug de proteína OVA (albúmina de huevo de pollo; Sigma-Aldrich) emulsionada en 2 mg de hidróxido de aluminio en PBS. Tras 4 semanas, se administraron intranasalmente dosis de reto de OVA al 1,5%/50 \mul. El reto se llevó a cabo diariamente durante 3 días consecutivos y después los ratones se evaluaron para inflamación alérgica de los pulmones 24 horas después de la última exposición al aerosol. Se trataron grupos de ratones con diversas concentraciones de DMPP durante el periodo de reto. Se llevó a cabo el lavado broncoalveolar (BAL) y el líquido se centrifugó a 400xg para separar las células del líquido (figs. 14, 15, 16 y 17).

Se utilizaron los sobrenadantes para determinar los niveles pulmonares de IL-5. Se evaluó el número total de células del BAL y los recuentos celulares diferenciales (fig. 18).

Se repitió el experimento con la dosis óptima de DMPP para evaluar la respuesta de las vías respiratorias.

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Medición de la AHR

Se midió la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) en ratones anestesiados, traqueotomizados y ventilados utilizando un ventilador controlado por ordenador (FlexiVENT).

Se administraron dosis crecientes de metacolina (0 mg/kg-32,5 mg/kg) a través de la vena yugular (figs. 19, 20).

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Ejemplo 7 Efecto del tratamiento de agonistas sobre la expresión de ARNm de IL-4

También se sometió a ensayo el efecto del tratamiento de agonistas sobre la expresión de ARNm de IL-4, una citoquina que es bien conocido que se encuentra implicada en el desarrollo del asma (53). La nicotina redujo la expresión de ARNm de IL-4 inducida por LPS en hasta el 92%, mientras que DMPP 40 \muM bloqueó por completo la expresión de ARNm de IL-4 (fig. 21). Tal como se ha demostrado anteriormente, la expresión de ARNm de IL-4 era nula al estimular las células con antígeno de SR (datos no mostrados).

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Ejemplo 8 Acción de diversos agonistas sobre la transmigración de eosinófilos

Con el fin de investigar adicionalmente el efecto de los agonistas nicotínicos sobre la regulación negativa de la inflamación en el asma, los presentes solicitantes sometieron a ensayo la acción de diversos agonistas sobre la transmigración de los eosinófilos.

La infiltración de los eosinófilos y de otras células inflamatorias en los tejidos pulmonares es una característica importantes del asma y la causa de la inflamación y de la hiperreactividad. El paso de células inflamatorias de la circulación a los pulmones implica la migración a través del endotelio vascular, la membrana basal y componentes de la matriz extracelular. Las células inflamatorias cruzan la membrana basal mediante la producción de proteinasas. En estos experimentos preliminares in vitro, los presentes solicitantes investigaron los efectos de diversos agonistas nicotínicos sobre la migración de eosinófilos sanguíneos purificados a través de una membrana basal artificial (cámara de quimiotaxis recubierta de Matrigel®). El DMPP induce una inhibición dosis-dependiente de la transmigración de eosinófilos (fig. 22), mientras que este efecto puede resultar revertido por el antagonista mecamilamina (MEC) (fig. 23). Este efecto de inhibición resulta adicionalmente confirmado por otros agonistas nicotínicos, incluyendo la nicotina, la epibatidina y el compuesto de referencia (fig. 24). Los resultados se expresan en forma de porcentaje de inhibición (células tratadas con agonista) en comparación con la condición de control sin los agonistas.

Dichos resultados sugieren que los agonistas nicotínicos regulan negativamente la síntesis o la activación de las proteinasas que degradan los componentes de la membrana basal, inhibiendo de esta manera la migración de los eosinófilos hacia el interior de la mucosa pulmonar.

Ejemplo 9 Efecto de los agonistas nicotínicos sobre la producción de colágeno

El asma se caracteriza por cambios estructurales de las vías respiratorias, incluyendo la deposición subepitelial de colágeno, que puede ser una causa para la cronicidad de la enfermedad. Podría encontrarse implicado en dicho proceso un desequilibrio entre la síntesis de colágeno y la degradación del mismo por los fibroblastos (56). En experimentos preliminares, los presentes solicitantes investigaron los efectos de los agonistas nicotínicos sobre la síntesis del colágeno A1 producido por los fibroblastos primarios normales. Se evaluó la expresión del gen del colágeno A1 mediante RT-PCR.

Los resultados se expresan en forma de porcentaje de expresión génica en células tratadas con agonistas en comparación con células no tratadas.

El DMPP inhibe la expresión génica de colágeno A1 de una manera dependiente de la dosis (fig. 25). La nicotina presenta un ligero efecto de inhibición a la concentración de 1 \muM y 10 \muM, mientras que las concentraciones más elevadas no presentaron ningún efecto (fig. 26), probablemente debido a una desensibilización de los receptores. Podrían resultar necesarias dosis menores para conseguir una inhibición y se someten a ensayo. También se observa un efecto de inhibición con la epibatidina (fig. 27).

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Claims (5)

1. Utilización de un agonista de receptor nicotínico seleccionado de entre nicotina, dimetilfenilpiperazinio (DMPP) y epibatidina en la preparación de un fármaco destinado al alivio o a prevención de la inflamación pulmonar en un animal, seleccionando dicha enfermedad inflamatoria pulmonar de entre el grupo constituido por: asma, fibrosis pulmonar intersticial (IPF), sarcoidosis, neumonitis por hipersensibilidad (HP), HP crónica y bronquiolitis obliterans con neumonitis organizada (BOOP).

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha enfermedad inflamatoria pulmonar es el asma.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el agonista es el dimetilfenilpiperazinio (DMPP).

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende asimismo otros agentes capaces de aliviar o de prevenir las enfermedades inflamatorias.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho fármaco se encuentra en una forma farmacéutica para la administración oral, inyección directa o infusión, tópica o intratraqueal/nasal.