PL207541B1 - Sposób wykrywania bydlęcego zespołu zniekształceń kręgosłupa (CVM) i zestaw diagnostyczny - Google Patents
Sposób wykrywania bydlęcego zespołu zniekształceń kręgosłupa (CVM) i zestaw diagnostycznyInfo
- Publication number
- PL207541B1 PL207541B1 PL362118A PL36211801A PL207541B1 PL 207541 B1 PL207541 B1 PL 207541B1 PL 362118 A PL362118 A PL 362118A PL 36211801 A PL36211801 A PL 36211801A PL 207541 B1 PL207541 B1 PL 207541B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- marker
- bovine
- genetic
- microsatellite
- Prior art date
Links
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 103
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 74
- 239000000969 carrier Substances 0.000 title abstract description 15
- 230000036244 malformation Effects 0.000 title abstract description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 13
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 80
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 42
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 37
- 101100309387 Bos taurus SLC35A3 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 19
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 15
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 claims description 10
- 208000033787 Rare developmental defect during embryogenesis Diseases 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 208000022734 developmental defect during embryogenesis Diseases 0.000 claims description 8
- 208000035853 malformation syndrome Diseases 0.000 claims description 8
- 206010058907 Spinal deformity Diseases 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 5
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 4
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims 1
- 102100033778 UDP-N-acetylglucosamine transporter Human genes 0.000 abstract description 17
- 108091006542 SLC35A3 Proteins 0.000 abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 55
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 46
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 44
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 38
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 38
- 244000309466 calf Species 0.000 description 26
- 244000309464 bull Species 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 11
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 10
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 6
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 5
- 101150083863 Slc35a3 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 4
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 3
- 101001138480 Homo sapiens Olfactory receptor 5AC2 Proteins 0.000 description 3
- 101100309389 Homo sapiens SLC35A3 gene Proteins 0.000 description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102100020806 Olfactory receptor 5AC2 Human genes 0.000 description 3
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000002023 somite Anatomy 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010086873 UDP-N-acetylglucosamine transporter Proteins 0.000 description 2
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- IOUNGFDUDUBFGX-UHFFFAOYSA-N n-(2-chlorophenyl)-2-[4-(2,4-dichlorophenyl)thiadiazol-5-yl]sulfanylacetamide Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1C1=C(SCC(=O)NC=2C(=CC=CC=2)Cl)SN=N1 IOUNGFDUDUBFGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 nucleotide sugars Chemical class 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 231100000272 reduced body weight Toxicity 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 206010039722 scoliosis Diseases 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- IYCZBJXFSZSHPN-DLOVCJGASA-N Ala-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O IYCZBJXFSZSHPN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N Ala-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N 0.000 description 1
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JJHBEVZAZXZREW-LFSVMHDDSA-N Ala-Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O JJHBEVZAZXZREW-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N Arg-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- DAPLJWATMAXPPZ-CIUDSAMLSA-N Asn-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DAPLJWATMAXPPZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PHJPKNUWWHRAOC-PEFMBERDSA-N Asn-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PHJPKNUWWHRAOC-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- BXUHCIXDSWRSBS-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BXUHCIXDSWRSBS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YVXRYLVELQYAEQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N YVXRYLVELQYAEQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VIRHEUMYXXLCBF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GPPIDDWYKJPRES-YDHLFZDLSA-N Asp-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GPPIDDWYKJPRES-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 206010003598 Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 1
- 208000029767 Congenital, Hereditary, and Neonatal Diseases and Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- IIMZHVKZBGSEKZ-SZMVWBNQSA-N Gln-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IIMZHVKZBGSEKZ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N Glu-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N Gly-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN)C(=O)O XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- CSMYMGFCEJWALV-WDSKDSINSA-N Gly-Ser-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O CSMYMGFCEJWALV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IZVICCORZOSGPT-JSGCOSHPSA-N Gly-Val-Tyr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IZVICCORZOSGPT-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- TWPSALMCEHCIOY-YTFOTSKYSA-N Ile-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N TWPSALMCEHCIOY-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- HPCFRQWLTRDGHT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HPCFRQWLTRDGHT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N Ile-Phe-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)NCC(O)=O UAELWXJFLZBKQS-WHOFXGATSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N Leu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- HVHRPWQEQHIQJF-AVGNSLFASA-N Leu-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HVHRPWQEQHIQJF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FKQPWMZLIIATBA-AJNGGQMLSA-N Leu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FKQPWMZLIIATBA-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CPONGMJGVIAWEH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N Leu-Met-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N Leu-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- VQHUBNVKFFLWRP-ULQDDVLXSA-N Leu-Tyr-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VQHUBNVKFFLWRP-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- XOEDPXDZJHBQIX-ULQDDVLXSA-N Leu-Val-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XOEDPXDZJHBQIX-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NNCDAORZCMPZPX-GUBZILKMSA-N Lys-Gln-Ser Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N NNCDAORZCMPZPX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- ZXFRGTAIIZHNHG-AJNGGQMLSA-N Lys-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N ZXFRGTAIIZHNHG-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BOJYMMBYBNOOGG-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BOJYMMBYBNOOGG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QRHWTCJBCLGYRB-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Cys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O QRHWTCJBCLGYRB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PJWDQHNOJIBMRY-JYJNAYRXSA-N Met-Arg-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PJWDQHNOJIBMRY-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- CIDICGYKRUTYLE-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CIDICGYKRUTYLE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CIIJWIAORKTXAH-FJXKBIBVSA-N Met-Thr-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O CIIJWIAORKTXAH-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 101000860173 Myxococcus xanthus C-factor Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010056664 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N Phe-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N Phe-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- XALFIVXGQUEGKV-JSGCOSHPSA-N Phe-Val-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 XALFIVXGQUEGKV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- XZBYTHCRAVAXQQ-DCAQKATOSA-N Pro-Met-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XZBYTHCRAVAXQQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N Pro-Thr-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 208000007123 Pulmonary Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N Ser-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GVMUJUPXFQFBBZ-GUBZILKMSA-N Ser-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GVMUJUPXFQFBBZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MECLEFZMPPOEAC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N Thr-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KRDSCBLRHORMRK-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- ZMYCLHFLHRVOEA-HEIBUPTGSA-N Thr-Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZMYCLHFLHRVOEA-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N Tyr-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- NSGZILIDHCIZAM-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N NSGZILIDHCIZAM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- LRHBBGDMBLFYGL-FHWLQOOXSA-N Tyr-Phe-Glu Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LRHBBGDMBLFYGL-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- YKBUNNNRNZZUID-UFYCRDLUSA-N Tyr-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YKBUNNNRNZZUID-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N Val-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- JFAWZADYPRMRCO-UBHSHLNASA-N Val-Ala-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JFAWZADYPRMRCO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- OXVPMZVGCAPFIG-BQFCYCMXSA-N Val-Gln-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N OXVPMZVGCAPFIG-BQFCYCMXSA-N 0.000 description 1
- FTKXYXACXYOHND-XUXIUFHCSA-N Val-Ile-Leu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FTKXYXACXYOHND-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- APQIVBCUIUDSMB-OSUNSFLBSA-N Val-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N APQIVBCUIUDSMB-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- BCBFMJYTNKDALA-UFYCRDLUSA-N Val-Phe-Phe Chemical compound N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O BCBFMJYTNKDALA-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- DLLRRUDLMSJTMB-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Met Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N DLLRRUDLMSJTMB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WFTKOJGOOUJLJV-VKOGCVSHSA-N Val-Trp-Ile Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])C(C)C)=CNC2=C1 WFTKOJGOOUJLJV-VKOGCVSHSA-N 0.000 description 1
- RLVTVHSDKHBFQP-ULQDDVLXSA-N Val-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=C(O)C=C1 RLVTVHSDKHBFQP-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001910 Ventricular Heart Septal Defects Diseases 0.000 description 1
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000025341 autosomal recessive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000459 calcaneus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000003977 dairy farming Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025801 glycyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000640 hair analysis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010047926 leucyl-lysyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 208000024335 physical disease Diseases 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 201000003130 ventricular septal defect Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000003857 wrist joint Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania bydlęcego zespołu zniekształceń kręgosłupa (CVM) i zestaw diagnostyczny.
Niniejszy wynalazek odnosi się generalnie do choroby genetycznej obserwowanej u bydła, określanej jako zespół zniekształceń kręgosłupa (CVM). Bardziej szczegółowo, wynalazek odnosi się do markerów molekularnych do identyfikacji potencjalnych bydlęcych nosicieli CVM i do identyfikacji lokus genu CVM i ich mutacji odpowiedzialnych za zespół wad wrodzonych kręgów u bydła.
Tło wynalazku
Zespół zniekształceń kręgosłupa (CVM) jest wrodzonym schorzeniem kręgów wykrywanym u czarno-biał ego holsztyno-fryzyjskiego bydła mlecznego. Choroba została ostatnio opisana (Agerholm i inni, 2000). W Danii, wszystkie przypadki zdiagnozowane do dzisiaj (17 października 2000) powiązano genetycznie z poprzednim elitarnym buhajem holsztyńskim z USA Carlin-M Ivanhoe Bell. Zgodnie z obecnymi danymi, okazuje się, że CVM jest dziedziczony jako choroba autosomalna recesywna.
Choroba charakteryzuje się wrodzonym, obustronnie symetrycznym przykurczem stawów dystalnych i wadą rozwojową kręgosłupa, głównie w połączeniu szyjno-piersiowym, wraz ze zmniejszonym ciężarem ciała (Agerholm i inni, 1994).
Zewnętrznie, istnieją następujące główne zmiany kliniczne: w wielu przypadkach część szyjna i/lub piersiowa kręgosłupa wydaje się być krótka. Średni, obustronnie symetryczny przykurcz stawów nadgarstkowych oraz ciężki przykurcz i supinacja stawu paliczkowo-śródręczowego (pęcinowego), są stałymi zmianami klinicznymi. Przykurcz i pronacja stawu paliczkowo-śródstopnego oraz lekkie wydłużenie stopy są także częstymi zmianami klinicznymi. W większości przypadków obserwuje się nieregularny przebieg kręgosłupa w okolicy połączenia szyjno-piersiowego. Można zaobserwować skoliozę, a zmiany chorobowe mogą występować w innych regionach kręgosłupa. Nieregularny przebieg jest często rozpoznawany przez badanie i obmacanie brzusznej strony kręgosłupa. Jednakże zmiany chorobowe mogą być minimalne i ograniczone do dwóch lub kilku kręgów. W takich przypadkach kręgosłup może być prawie normalnej długości. Zatem poleca się badanie radiologiczne kręgosłupa aby wykluczyć wady wrodzone kręgów w podejrzanych przypadkach. Rdzeń kręgowy jest normalnej wielkości, leży w kanale rdzenia bez wyraźnych ucisków. Przy użyciu radiologii, znajduje się zespół wad wrodzonych kręgów obejmujących kręgi połowicze, kręgi połączone i z wadami rozwojowymi, skoliozę i zdrętwienie różnego stopnia. Najlepiej demonstruje się to po usunięciu łuku kręgowego. W niektórych przypadkach występują wady wrodzone serca, w większości w postaci znacznego defektu przegrody międzykomorowej oraz hipertrofii odśrodkowej prawej komory. Mogą wystąpić wady wrodzone dużych naczyń. W płucach występuje niedodma płodowa. W jamie piersiowej występują w większości płyny surowiczo-krwotoczne. Zaobserwowano różne inne wady wrodzone, lecz nie są one stałymi, czy powszechnymi zmianami klinicznymi. Często występują uszkodzenia z powodu trudnego porodu.
Wady wrodzone obserwowano zarówno u płodów poronionych, przedwcześnie urodzonych cieląt jak i martwych cieląt urodzonych o czasie. Nie obserwowano jeszcze przypadków wśród starszych cieląt. Generalnie, ciężar ciała jest mniejszy i ciężar ciała jest niższy u cieląt urodzonych przedwcześnie niż u cieląt urodzonych o czasie.
Oprócz tego wydaje się, że u krów unasienianych nasieniem buhajów nosicieli występuje większa częstotliwość poronień. W obecnej chwili przyczyna jest nieznana.
Obecnie, jedynym dostępnym narzędziem do diagnozowania CVM jest diagnoza patoanatomiczna na podstawie opisywanego występowania obustronnie symetrycznego przykurczu stawów dystalnych i wad wrodzonych kręgosłupa, głównie przy połączeniu szyjno-piersiowym wraz ze zmniejszonym ciężarem ciała. Jednakże powszechne są symetryczne przykurcze kończyn oraz ogólne zmiany kliniczne wad wrodzonych kręgów u cieląt. Zatem istnieją problemy z diagnozą różnicową, ponieważ często trudno jest odróżnić CVM od innych wad wrodzonych.
Fakt roznoszenia defektu genetycznego przez buhaja Carlin-M Ivanhoe Bell, którego użytkowano intensywnie na całym świecie, powoduje, że możliwość testowania, czy aktualne i potencjalne buhaje hodowlane są nosicielami tego defektu, jest istotna z punktu widzenia ekonomicznego.
Aby uzyskać szacunek częstości zwierząt potencjalnych nosicieli CVM w duńskiej populacji bydła mlecznego, niniejsi wynalazcy wyodrębnili informacje o rodowodach z duńskiej narodowej bazy danych dla bydła mlecznego. Podczas wyodrębniania (październik 2000) zarejestrowano 919 916
PL 207 541 B1 krów i jałówek czystej krwi oraz 169 821 buhajów i cieląt płci męskiej czystej krwi. Buhaj Bell znajdował się 707 915 razy w rodowodach krów i jałówek i 161 043 razy w rodowodach samców. W tablicach 1 i 2 poniżej ukazana jest liczba wystąpień buhaja Bell w każ dym pokoleniu w rodowodach.
T a b l i c a 1
Występowanie buhaja Bell w rodowodach duńskich krów i jałówek rasy holsztyńskiej
| Pokolenie nr | Częstość | Procent | Częstość kumulacyjna |
| 2 | 21240 | 3,0 | 21244 |
| 3 | 202460 | 28,6 | 223704 |
| 4 | 321043 | 45,4 | 544747 |
| 5 | 133956 | 18,9 | 678703 |
| 6 | 27307 | 3,9 | 706010 |
| 7 | 1869 | 0,3 | 707879 |
| 8 | 36 | 0,0 | 707915 |
T a b l i c a 2
Występowanie buhaja Bell w rodowodach duńskich buhajów rasy holsztyńskiej
| Pokolenie nr | Częstość | Procent | Częstość kumulacyjna |
| 2 | 436 | 0,3 | 436 |
| 3 | 20144 | 12,5 | 20580 |
| 4 | 82394 | 51,2 | 102974 |
| 5 | 44545 | 27,7 | 147519 |
| 6 | 12455 | 7,7 | 159974 |
| 7 | 1040 | 0,6 | 161014 |
| 8 | 29 | 0,0 | 161043 |
Chociaż te liczby obejmują także podwójne i potrójne występowanie Bell w rodowodach, dane wyraźnie pokazują, że większość duńskiego bydła holsztyńskiego jest potencjalnym nosicielem CVM. Wyraźnie, problem jest rozległy na skalę globalną.
Tak więc, istnieje wielka potrzeba w hodowli bydła mlecznego, posiadania testu genetycznego, który pozwala na identyfikację bydła mlecznego różnych ras, które jest potencjalnym nosicielem CVM (np. przed wykrywalnym wystąpieniem objawów klinicznych).
Przed niniejszym wynalazkiem nie stosowano mapowania mikrosatelitarnego w odniesieniu do genu powodującego powyższy zespół wad wrodzonych kręgów, który to gen nie został wyizolowany ani scharakteryzowany. Tak więc, zgodnie z najlepszą wiedzą wynalazców, sposób diagnostyczny według wynalazku opisany bardziej szczegółowo dalej, nie był wcześniej sugerowany ani opisywany.
W związku z tym, niniejszy wynalazek, który obejmuje mapowanie lokusa choroby CVM, dostarczył testu DNA w oparciu o markery mikrosatelitarne, położone na bydlęcym chromosomie BTA3. Zdolność testu do określania statusu nosicielstwa zwierząt będących potomstwem buhaja Bell została potwierdzona, co stanie się widoczne w poniższych przykładach.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania bydlęcego zespołu zniekształceń kręgosłupa (CVM) u bydła mlecznego, polegający na tym, że w próbce materiału genetycznego identyfikuje się obecność co najmniej jednego markera genetycznego położonego na bydlęcym chromosomie BTA3, w regionie oflankowanym jak i obejmują cym polimorficzne markery mikrosatelitarne BM4129 i BMS1266, związanego z zespoł em wad wrodzonych krę gów u bydł a (CVM), przy czym co najmniej jeden marker genetyczny jest sprzężony z genem bydła SLC35A3, i sposób obejmuje wykrywanie w wymienionym materiale genetycznym, obecno ś ci lub nieobecnoś ci co najmniej jednego markera genetycznego sprzężonego z cechą chorobową zespołu wad wrodzonych kręgów u bydła.
Korzystnie co najmniej jeden marker genetyczny jest położony w regionie od około 59,5 centymorganów do około 67,9 centymorganów. Bardziej korzystnie co najmniej jeden marker genetyczny jest położony w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne markery mikrosatelitarne INRAA003 i BMS937.
PL 207 541 B1
Jeszcze bardziej korzystnie co najmniej jeden marker genetyczny jest położony w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne markery mikrosatelitarne INRAA003 i ILSTS029.
W kolejnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku co najmniej jednym markerem genetycznym korzystnie jest marker mikrosatelitarny INRAA003, ewentualnie marker
| mikrosatelitarny | BMS2790, | ewentualnie | marker |
| mikrosatelitarny | ILSTS029, | ewentualnie | marker |
| mikrosatelitarny | INRA123, | ewentualnie | marker |
| mikrosatelitarny | BM220, | ewentualnie | marker |
| mikrosatelitarny | HUJ246, | ewentualnie | marker |
| mikrosatelitarny | BMS862, | ewentualnie | marker |
| mikrosatelitarny | BMS937. |
W kolejnym korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku bydlę cy gen SLC35A3 koduje bydlęce białko SLC35A3 obejmujące sekwencję aminokwasową jaką ukazano w SEQ ID nr: 17.
W przypadku gdy co najmniej jeden marker genetyczny jest położony w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne markery mikrosatelitarne INRAA003 i ILSTS029 to bydlęce białko SLC35A3 jest kodowane przez sekwencję cDNA obejmującą sekwencję nukleotydową z SEQ ID nr: 18.
Bardziej korzystnie marker genetyczny jest polimorfizmem pojedynczego nukleotydu w pozycji równoważnej nukleotydowi 559 z SEQ ID nr: 18, a jeszcze bardziej korzystnie polimorfizm pojedynczego nukleotydu jest polimorfizmem G/T.
W także bardziej korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku wykrywanie polimorfizmu G/T jest przeprowadzane techniką wybraną z grupy obejmującej PCR specyficzną wobec allelu, minisekwencjonowanie, wydłużanie startera, pirosekwencjonowanie, PCR-RFLP, amplifikację specyficzną dla allelu typu „rolling circle oraz wydłużanie primera, po którym następuje spektrometria masowa MALDI-TOF.
W sposobie według wynalazku wymieniony co najmniej jeden marker genetyczny jest genetycznie powiązany z genem lub cechą chorobową wywołującą zespół wad wrodzonych kręgów u bydła przy lod score wynoszącym co najmniej 3,0, tak jak co najmniej 4,0, łącznie z co najmniej 5,0, tak jak co najmniej 6,0, łącznie z co najmniej 7,0, tak jak co najmniej 8,0, łącznie z co najmniej 9,0, tak jak co najmniej 10,0, łącznie z co najmniej 11,0, tak jak co najmniej 12,0.
Korzystnie co najmniej dwa markery genetyczne są stosowane w kombinacji.
Również korzystnie parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego INRAA003 jest SEQ ID nr: 1 i SEQ ID nr: 2.
Korzystne pary starterów są następujące:
Parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego BMS2790 jest SEQ ID nr: 3 i SEQ ID nr: 4,
Parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego ILSTS029 jest SEQ ID nr: 5 i SEQ ID nr: 6.
Parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego INRA123 jest SEQ ID nr: 7 i SEQ ID nr: 8.
Parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego BM220 jest SEQ ID nr: 9 i SEQ ID nr: 10.
Parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego HUJ246 jest SEQ ID nr: 11 i SEQ ID nr: 12.
Parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego BMS862 jest SEQ ID nr: 13 i SEQ ID nr: 14.
Parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego BMS937 jest SEQ ID nr: 15 i SEQ ID nr: 16.
Przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do stosowania w wykrywaniu obecności u bydł a mlecznego co najmniej jednego markera genetycznego zwią zanego z bydlę cym zespoł em zniekształceń kręgosłupa (CVM), zawierający co najmniej jedną sekwencję oligonukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID nr: 1, SEQ ID nr: 2, SEQ ID nr: 3, SEQ ID nr: 4, SEQ ID nr: 5, SEQ ID nr: 6, SEQ ID nr: 7, SEQ ID nr: 8, SEQ ID nr: 9, SEQ ID nr: 10, SEQ ID nr: 11, SEQ ID nr: 12, SEQ ID nr: 13, SEQ ID nr: 14, SEQ ID nr: 15, SEQ ID nr: 16, SEQ ID nr: 33, SEQ ID nr: 34, SEQ ID nr: 35, SEQ ID nr: 36, SEQ ID nr: 37, SEQ ID nr: 38.
Szczegółowy opis wynalazku
Głównym celem niniejszego wynalazku jest umożliwienie identyfikacji bydlęcego zespołu zniekształceń kręgosłupa (CVM) u bydła mlecznego. Osiąga się ten cel sposobem, który wykrywa obecność markera genetycznego związanego z bydlęcym CVM u bydła mlecznego. Konkretniej, marker
PL 207 541 B1 genetyczny może być bydlęcym genem SLC35A3 lub nawet konkretniej specyficznym polimorfizmem bydlęcego genu SLC35A3.
Jak stosuje się w niniejszym, określenie „bydła mleczne odnosi się do osobnika bydlęcego jakiejkolwiek rasy. Tak więc pod tym określeniem kryją się w zamierzeniu różne gatunki krów lub bydła, czy to samce, czy to samice, i zarówno zwierzęta dorosłe jak i nowonarodzone. Określenie nie precyzuje szczególnego wieku. Przykładem bydła mlecznego jest członek populacji holsztyno-fryzyjskiego.
Określenie „marker genetyczny odnosi się do zmiennej sekwencji nukleotydowej (polimorficznej), która występuje w bydlęcym genomowym DNA, na chromosomie, i którą można identyfikować specyficznymi oligonukleotydami. Taką zmienną sekwencję nukleotydową można wyróżnić np. przez amplifikację kwasu nukleinowego i obserwację różnicy wielkości lub sekwencji nukleotydów z powodu polimorfizmu. W użytecznych postaciach realizacji, takie markery genetyczne można identyfikować kilkoma technikami znanymi fachowcom i obejmują one genotypowanie mikrosatelit lub krótkich powtórzeń tandemowych (STR), polimorfizm długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP), wykrywanie miejsc delecji lub insercji oraz statystycznie amplifikowany polimorficzny DNA (RAPD), jak również genotypowanie pojedynczego polimorfizmu nukleotydowego (SNP) metodami obejmującymi reakcję łańcuchową polimerazy długości fragmentu restrykcyjnego, hybrydyzację oligomerową specyficzną dla allelu, próby ligacji specyficzne dla oligomeru, mini sekwencjonowanie, sekwencjonowanie bezpośrednie, próby 5'-egzonukleazy wykrywanej fluoresceiną i hybrydyzację z sondami PNA i LNA, i inne. Jednakże będzie oczywiste, że można stosować inne markery i techniki zgodnie z wynalazkiem.
Jak opisano powyżej, „zespół zniekształceń kręgosłupa u bydła (CVM) jest wrodzonym schorzeniem kręgów u bydła mlecznego. Obecnie, chorobę wykryto tylko u holsztyno-fryzyjskiego czarnobiałego bydła mlecznego; jednak uważa się, że dotknięte mogą być inne rasy bydła. Chorobę opisał ostatnio Agerholm i inni, 2000. W związku z tym, w niniejszym kontekście, CVM i chorobę zespołu wad wrodzonych kręgów u bydła należy rozumieć jako chorobę charakteryzującą się objawami klinicznymi opisanymi wcześniej w niniejszym, oraz jaką opisał i określił Agerholm i inni, 2000.
Sposób według wynalazku obejmuje dostarczenie bydlęcego materiału genetycznego. Taki materiał obejmuje materiał bydlęcego DNA, który można dostarczyć jakąkolwiek dogodną metodą lub środkiem. Materiał bydlęcego DNA może być np. wyekstrahowany, wyizolowany i oczyszczony z krwi (np. świeżej lub mrożonej), próbek tkankowych (np. śledziony, wymazów śluzówki policzkowej), próbek włosów zawierających komórki mieszkowe, oraz nasienia.
Jak opisano poprzednio, sposób według niniejszego wynalazku obejmuje dodatkowo etap wykrywania w materiale genetycznym obecności lub braku obecności markera genetycznego, który jest powiązany z cechą chorobową zespołu wad wrodzonych kręgów u bydła.
Aby wykryć, czy marker genetyczny jest obecny w materiale genetycznym, można stosować standardowe metody dobrze znane fachowcom, np. przy użyciu amplifikacji kwasu nukleinowego. Aby określić, czy marker genetyczny jest genetycznie związany z cechą choroby zespołu wad wrodzonych kręgów można stosować metodę statystyczną „lod score. Lod score, która czasem jest przytaczana jako Zmax, wskazuje prawdopodobieństwo (logarytm ze stosunku prawdopodobieństwa), że lokus markera genetycznego i lokus specyficznego genu są powiązane w poszczególnej odległości. Lod score można obliczać przez stosowanie programu komputerowego, takiego jak program MLINK z pakietu LINKAGE (Lathrop i inni, 1985). Lod score większy od 3 jest uważany za istotny dowód powiązania między markerem genetycznym i cechą choroby zespołu wad wrodzonych kręgów albo lokusem genu.
W jednej postaci realizacji wynalazku, marker genetyczny jest położony na chromosomie bydlęcym BTA3. Region chromosomu bydlęcego BTA3 obejmujący markery genetyczne będące użytecznymi w sposobie według niniejszego wynalazku, jest zaznaczony w fig. 2.
W zwią zku z tym, markery genetyczne poł o ż one na chromosomie bydlę cym BTA3 w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne markery satelitarne BM4129 i BMS1266, mogą być użyteczne według niniejszego wynalazku.
W jednej konkretnej postaci realizacji, co najmniej jeden marker genetyczny jest położony w regionie od około 59,5 centymorganów do około 67,8 centymorganów na chromosomie bydlęcym BTA3.
W dodatkowej uż ytecznej postaci, co najmniej jeden marker genetyczny jest poł o ż ony na chromosomie bydlęcym BTA3 w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne mikrosatelitarne markery INRAA003 i BMS937.
PL 207 541 B1
W dodatkowej uż ytecznej postaci, co najmniej jeden marker genetyczny jest poł o ż ony na chromosomie bydlęcym BTA3 w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne mikrosatelitarne markery INRAA003 i ILSTS029.
W innej korzystnej postaci, co najmniej jeden marker genetyczny jest wybrany z grupy obejmującej markery mikrosatelitarne BM4129, INRAA003, BMS2790, ILSTS029, INRA123, BM220, HUJ246, BMS862, BMS937, BL1048, BMS2095 i BMS1266.
Jak opisano w przykładach, co najmniej jeden marker genetyczny może być powiązany z genem powodującym chorobę zespołu wad wrodzonych kręgów u bydła. Tak więc w jednej postaci realizacji, co najmniej jeden marker genetyczny jest położony na chromosomie bydlęcym BTA3 w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne markery mikrosatelitarne BM4129 i BMS1266 i genetycznie powiązane z cechą choroby CVM albo lokusem genu CVM przy lod score wynoszącym co najmniej 3,0, tak jak co najmniej 4,0, łącznie z co najmniej 5,0, tak jak co najmniej 6,0, łącznie z co najmniej 7,0, tak jak co najmniej 8,0, łącznie z co najmniej 9,0, tak jak co najmniej 10,0, łącznie z co najmniej 11,0, tak jak co najmniej 12,0.
Konkretną definicję i lokus powyższych polimorficznych markerów mikrosatelitarnych można znaleźć w mapie genetycznej USDA (Kappes i inni, 1997).
Oczywiste będzie, że aby wykryć u podmiotu bydlęcego obecność lub brak obecności markera genetycznego związanego z CVM, można stosować więcej niż jeden marker genetyczny zgodnie z wynalazkiem. A więc, co najmniej jeden marker może być kombinacją dwóch lub więcej markerów genetycznych, które stanowią informację, przez którą można zwiększyć dokładność testu.
W związku z tym, jak dodatkowo wymieniono przykł adowo poniż ej, w jednej uż ytecznej postaci realizacji, dwa lub więcej markerów mikrosatelitarnych INRAA003, BMS2790, ILSTS029, INRA123, BM220, HUJ246, BMS862, BMS937 można stosować w kombinacji.
Zgodnie z wynalazkiem, sekwencje nukleotydowe par starterów do amplifikacji powyższych markerów mikrosatelitarnych, są opisane w tablicy 4 poniżej.
Porównawcze mapy (Solinas-Toldo i inni, 1995) ukazują, że większość bydlęcego chromosomu BTA3 odpowiada części ludzkiego chromosomu 1 (HSA1). Mapowanie genetyczne lokusa CVN przedstawione w niniejszym umożliwi wykorzystanie dostępnych informacji o genach ludzkich i skoncentrowanie się na poszukiwaniach genu kandydata w stosunku do genów występujących na ludzkim chromosomie 1. Ograniczy to znacznie liczbę genów kandydujących i ułatwi poszukiwanie genu wywołującego CVM.
Markery genetyczne według niniejszego wynalazku można wykonać przy użyciu różnych metod znanych fachowcom. A więc, zrozumiałe będzie, że z wiedzą przedstawioną w niniejszym, sekwencje nukleotydowe powyżej opisanych polimorficznych markerów mikrosatelitarnych bydlęcego chromosomu BTA3 zidentyfikowano jako genetycznie powiązane z lokusem genu CVM, i można utworzyć dodatkowe markery ze znanych sekwencji lub wskazanego położenia na bydlęcym chromosomie BTA3 do stosowania w sposobie według niniejszego wynalazku.
Przykładowo, przy użyciu mapy zilustrowanej w fig. 2, region CVN chromosomu bydlęcego BTA3 można poddać mikrodysekcji, a fragmenty klonować do wektorów, aby wyizolować segmenty DNA, które można testować pod kątem wiązania z lokusem genu CVM. Alternatywnie, z użyciem sekwencji nukleotydowych podanych w tablicy 4, wyizolowane segmenty DNA można otrzymać z regionu CVM przez amplifikację kwasu nukleinowego (np. reakcję łańcuchową polimerazy) albo przez sekwencjonowanie nukleotydowe omawianego regionu chromosomu bydlęcego BTA3 („wędrówki po chromosomach).
Dodatkowo, powyżej opisana homologia między bydlęcym chromosomem BTA3 i ludzkim chromosomem 1 (HSA1) wskazuje, że każdy znacznik genu lub ekspresji sekwencji, jaki jest zmapowany w tym analogicznym regionie u człowieka, może być także zmapowany w regionie CVN bydlęcego chromosomu BTA3. A więc geny lub sekwencje zakonserwowane, które są zmapowane na ludzkim chromosomie HSA1, mogą być analizowane pod względem powiązania z lokusem genu CVM, przy użyciu rutynowych metod.
Genotypowanie opiera się o analizę genomowego DNA, który można dostarczyć przy użyciu standardowych metod ekstrakcji DNA, jakie opisano w niniejszym. Po wyizolowaniu i oczyszczeniu genomowego DNA, można stosować amplifikację kwasu nukleinowego (np. reakcję łańcuchową polimerazy), aby powielić region DNA odpowiadający każdemu markerowi genetycznemu stosowanemu
PL 207 541 B1 w analizie wykrywania u podmiotu bydlę cego obecności markera genetycznego związanego z CVM. W zwią zku z tym, zestaw diagnostyczny do stosowania w takiej postaci realizacji, obejmuje, w oddzielnym opakowaniu, co najmniej jedną sekwencję oligonukleotydową wybraną z grupy zawierającej SEQ ID nr: 1, SEQ ID nr: 2, SEQ ID nr: 3, SEQ ID nr: 4, SEQ ID nr: 5, SEQ ID nr: 6, SEQ ID nr: 7, SEQ ID nr: 8, SEQ ID nr: 9, SEQ ID nr: 10, SEQ ID nr: 11, SEQ ID nr: 12, SEQ ID nr: 13, SEQ ID nr: 14, SEQ ID nr: 15, SEQ ID nr: 16, SEQ ID nr: 33, SEQ ID nr: 34, SEQ ID nr: 35, SEQ ID nr: 36, SEQ ID nr: 37, SEQ ID nr: 38, oraz ich kombinacje.
Identyfikacja mutacji w genie SLC35A3 i diagnostycznym dla CVN u bydła
Po ustaleniu lokalizacji genu CVM w genomie, wyznaczonej przez polimorficzne markery mikrosatelitarne, przeprowadzono w niniejszym przeszukiwanie pod względem identyfikacji genu strukturalnego i mutacji sprawczej, którą można wykorzystać jako ostateczny marker genetyczny dla CVM.
Zidentyfikowano ludzki genom dzielący homologię sekwencji z regionem CVM, określany jako region między markerami INRA003 i ILSTS029. Marker BMS2790 jest położony w tym przedziale (fig. 1). Początkowo zidentyfikowano 5 różnych klonów z bydlęcej biblioteki BAC (RPCI-42, skonstruowanej i udostępnionej przez P. de Jonge i współpracowników), przy czym każdy zawierał jeden z markerów INRA003, ISLTS029 lub BMS2790. Przy uż yciu informacji o sekwencji otrzymanej z tych klonów BAC, zidentyfikowano pojedynczy region na ludzkim chromosomie 1, który zawierał region homologii z BAC zawierającymi marker, przy wykorzystaniu programu BLASTN na publicznych bazach danych sekwencji. Region ten obejmuje około 6 milionów par zasad i leży w pozycji w przybliżeniu 107,4-113,5 (fig. 3)(przeglądarka ENSEMBL, The Sanger Centre).
Izolacja i sekwencjonowanie cDNA SLC35A3
Na podstawie uszeregowania homologii genu SLC35A3 między homo sapiens i canis familiaris, zaplanowano 2 oligonukleotydy (SL1F i SL8R) do amplifikacji prawie całego cDNA bydlęcego SLC35A3, łącznie z kodonem startowym. Przeprowadzono PCR na cDNA wyizolowanym z próbek tkanki sercowej zebranych odpowiednio, od zwierzęcia dzikiego typu, nosiciela CVM i zwierzęcia chorego. Aby uzyskać sekwencję końca 3' genu, sekwencjonowano otrzymany fragment PCR i zaplanowano nowy oligonukleotyd (SL5F). Aby powielić koniec 3' SLC35A3, wykorzystano SL5F w kombinacji z oligonukleotydem (bSLCBVIR), zaplanowanym przy uż yciu opublikowanej sekwencji częściowego bydlęcego EST (Genbank, dbEST). Sekwencja cDNA (SEQ ID nr: 18), a otrzymana w wyniku translacji sekwencja peptydowa (SEQ ID nr: 17) bydlęcego SLC35A3, jest ukazana na fig. 4. Białko kodowane przez bydlęcy SLC35A3 zawiera 326 aminokwasów i dzieli homologię z rodziną wcześniej znanych białek biorących udział w transporcie cukrów nukleotydowych z cytozolu do światła aparatu Golgiego. Uszeregowanie opisane na fig. 5 ukazuje homologię z białkami SLC35A3 wcześniej opisanych u człowieka (Ishida i inni, 1999) i u psa (Guillen i inni, 1998).
Wykrywanie polimorfizmu w genie SLC35A3
Aby wykryć polimorfizmy w bydlęcym genie SLC35A3, przeprowadzono amplifikację PCR genu przy użyciu cDNA wyizolowanego z próbek tkanki sercowej zebranej odpowiednio, od nosiciela CVM i zwierzęcia chorego. Sekwencjonowanie fragmentu wyizolowanego od zwierzęcia dotkniętego chorobą ujawniło sekwencję identyczną do dzikiego typu z wyjątkiem tego, że zwierzę chore było homozygotą pod względem nukleotydu T w pozycji 559, w porównaniu ze zwierzęciem dzikiego typu, homozygotycznego pod względem G w odpowiadającej pozycji (patrz fig. 4). Sekwencjonowanie cDNA od zwierzęcia będącego nosicielem defektu CVM ukazało, że to zwierzę było heterozygotą mającą zarówno T jak i G w pozycji 559.
Wymiana G na T w pozycji 559 ma taki wpływ na otrzymaną sekwencję peptydową, że zmienia walinę w pozycji 180 na fenyloalaninę (patrz fig. 4).
Genotypowanie polimorfizmu SLC35A3 przez próbę na bazie sekwencjonowania DNA
Fig. 6 ukazuje wyniki otrzymane z sekwencjonowania fragmentu PCR amplifikowanego z genomowego DNA i zawierającego region (od 544 do 572 cDNA SLC35A3, pod względem numerowania, patrz fig. 4) obejmujący mutację G/T. Lewy i prawy panel ukazują sekwencjonowanie odpowiednio, zgodne i przeciwne. Górny rządek (oznaczony przez -/-) ukazuje wynik dzikiego typu, wskazujący G w pozycji polimorficznej, przy wykorzystaniu sekwencjonowania zgodnego, oraz C w podobnej pozycji na drugiej nici, wykorzystując sekwencjonowanie przeciwne (zaznaczone gwiazdkami). Niższy rządek +/+ ukazuje wyniki od cielęcia chorego, pokazujące T w pozycji polimorficznej przy użyciu sekwencjonowania zgodnego i A w podobnej pozycji na drugiej nici, przy użyciu sekwencjonowania przeciwnego (oznaczonego gwiazdkami). Heterozygota (+/-) jest ukazana w środkowym panelu i zgodnie z oczekiwaniami przedstawia mieszaninę sygnał u dzikiego typu i chorego, a wię c posiada zarówno sygnał T jak i G przy użyciu sekwencjonowania zgodnego i sygnał A oraz C na drugiej nici.
PL 207 541 B1
Wszystkie cielęta dotknięte CVN są homozygotami pod względem allelu T
Przeprowadzono genotypowanie 39 cieląt dotkniętych CVM, przez sekwencjonowanie produktu PCR amplifikowanego z genomowego DNA (patrz fig. 6 i przykład 6). Wszystkie te zwierzęta były homozygotami pod względem allelu T, potwierdzając początkowe wyniki.
Allel T nie występuje u zwierząt niespokrewnionych z buhajem Bell
Ponieważ cielęta dotknięte CVM były przytaczane tylko w rodowodach zawierających szeroko używanego buhaja BELL, prześledzono, czy allel T występował u zwierząt niespokrewnionych z BELL. Wykorzystując duń ską bazę danych byd ł a mlecznego, zidentyfikowano i przebadano 496 zwierząt rasy holsztyńskiej bez BELL w rodowodzie. Genotypowanie tych zwierząt przeprowadzono przez sekwencjonowanie produktu PCR amplifikowanego z genomowego DNA (patrz fig. 6 i przykład 6). Żadne z tych zwierząt nie posiadało allelu T sugerując, że ten allel występuje wyłącznie w linii zwierząt blisko spokrewnionych z BELL.
Przez sekwencjonowanie genotypowano także ponad 326 niespokrewnionych (co najmniej przez trzy pokolenia) zwierząt 12 różnych ras. Wszystkie te zwierzęta były homozygotyczne pod względem allelu dzikiego typu (allel G) ponownie demonstrując brak allelu związanego z CVN (allel T) w ogólnej populacji bydł a mlecznego.
Genotypowanie polimorfizmu SLC35A3 przez próbę PCR specyficzną dla allelu (AS-PCR)
Aby skutecznie przeprowadzić genotypowanie G/T, opracowano próbę PCR specyficzną dla allelu przy użyciu BIOLASE Diamond DNA Polymerase od Bioline. Ta polimeraza wymaga perfekcyjnego dopasowania końca 3' startera do matrycy, a niedopasowanie w tej pozycji spowoduje brak (lub bardzo słabą) amplifikacji. W ten sposób można odróżnić dziki typ, nosiciela lub chore zwierzę, identyfikując obecność lub brak obecności produktów PCR specyficznych dla allelu (fig. 7). Lewa część fig. 7 ukazuje produkty PCR specyficzne dla allelu nici kodującej. Jak oczekiwano, zwierzęta dzikiego typu wykazują amplifikację ze starterem specyficznym dla G, lecz nie ukazują ze starterem specyficznym dla T. Nosiciele wykazują amplifikację ze starterami specyficznymi zarówno wobec G jak i T, podczas gdy zwierzęta chore wykazują amplifikację tylko startera specyficznego wobec T. Prawa część ukazuje produkty PCR specyficzne dla allelu nici niekodującej i jak oczekiwano, wzory są takie same jak dla nici kodującej. Zwierzęta dzikiego typu są homozygotami pod względem C, nosiciele są heterozygotami C/A, a zwierzęta chore są homozygotami pod względem A.
Z powyż ej opisanych wyników stosowania pozycyjnego podejś cia genu kandydują cego, zidentyfikowano gen bydlęcy, który jest homologiczny z ludzkim genem SLC35A3 kodującym transporter UDP-N-acetyloglukozaminy. W tym genie zidentyfikowano polimorfizm G/T, który zmienia sekwencję aminokwasową białka. Wszystkie analizowane dotknięte chorobą cielęta (39) są homozygotyczne pod względem allelu T (T/T) i wszyscy znani nosiciele (108) są heterozygotami pod względem polimorfizmu (G/T). Analiza ponad 500 zwierząt rasy holsztyńskiej, wybranych jako niespokrewnione z buhajem Bell, nie zdołała zidentyfikować żadnego zwierzęcia niosącego allel T. Analizie poddano ponad 1500 zwierząt mających buhaja Bell w rodowodzie bez znalezienia jakiegokolwiek niedotkniętego chorobą zwierzęcia będącego homozygotą pod względem allelu T. Ponadto, analizowano więcej niż 300 sztuk bydła mlecznego z 12 różnych ras bez wykrycia allelu T u któregokolwiek z tych zwierząt. Podsumowując, odkrycia opisane w niniejszym zgłoszeniu pokazują, że allel T występuje w pojedynczej kopii u zwierząt, które są nosicielami CVM i w dwóch kopiach u zwierząt dotkniętych chorobą CVM. Wykrycie allelu T w pozycji 559 (numerowanie z fig. 4) jest zatem wskaźnikiem diagnostycznym dla CVN i idealnym do wykrywania nosicieli defektu CVM.
Ponieważ polimorfizm G/T zidentyfikowano jako powodujący CVM, każdy marker genetyczny sprzężony ściśle z tym polimorfizmem może być wskaźnikiem diagnostycznym dla CVM w populacji bydlęcej. W związku z tym, niniejszy wynalazek opisuje sposób identyfikacji podmiotów bydlęcych albo dotkniętych CVM albo będących nosicielami CVM, przez określenie obecności polimorfizmu G/T w pozycji 559 bydlę cego genu SLC35A3, albo poś rednio przez analizowanie jakiegokolwiek markera genetycznego, takiego jak mikrosatelity opisywane w niniejszym, sprzężone z bydlęcym genem SLC35A3, albo bezpośrednio przez analizowanie sekwencji bydlęcego genu SLC35A3 np. jak opisano powyżej i bardziej szczegółowo w przykładach.
W zakres niniejszego wynalazku wchodzi zatem sposób wykrywania i/lub oceny iloś ciowej obecności markera genetycznego związanego z bydlęcym CVM u bydła mlecznego, aby móc zidentyfikować osobniki bydła mlecznego dotknięte CVM lub nosicieli CVM. Etapy sposobu obejmują:
a) dostarczenie materiału genetycznego
PL 207 541 B1 oraz b) wykrywanie w wymienionym materiale genetycznym, obecności lub braku co najmniej jednego markera genetycznego, który jest powiązany z cechą choroby zespołu wad wrodzonych kręgów bydła.
Co najmniej jeden marker genetyczny jest powiązany z genem powodującym chorobę CVN bydła, przy czym wymieniony gen identyfikuje się w niniejszym jako bydlęcy gen SLC35A3, który koduje bydlęce białko SLC35A3 obejmujące sekwencję aminokwasową jaką ukazano w SEQ ID nr: 17.
Konkretniej, niniejszy wynalazek odnosi się do sposobu wykrywania CVN bydła mlecznego, przy czym markerem genetycznym jest polimorfizm pojedynczego nukleotydu w pozycji równoważnej nukleotydowi 559 z SEQ ID nr: 18, przy czym wymieniony polimorfizm pojedynczego nukleotydu jest polimorfizmem G/T.
Niniejsze zgłoszenie opisuje ponadto skuteczny test do genotypowania niniejszego polimorfizmu przy użyciu PCR specyficznej wobec allelu. Jest to jedna z wielu metod genotypowania SNP, inne metody, które można wykorzystać obejmują, lecz bez ograniczenia, minisekwencjonowanie, wydłużanie startera, pirsekwencjonowanie, PCR-RFLP, specyficzną dla allelu amplifikację typu „rolling circle, wydłużanie startera, po którym następuje spektrometria masowa MALDI-TOF jak również wiele innych metod enzymatycznych i na bazie hybrydyzacji.
Fenotyp przypominający CVM istnieje, jak zademonstrowano, u myszy zmutowanych pod względem genu „lunatic fringe (Evrad i inni, 1998). Podobnie jak cielęta dotknięte CVM, myszy homozygotyczne pod względem zerowej mutacji „lunatic fringe wykazują zmienioną segmentację i wzór somitów, mają skróconą oś ciał a, połączenia kręgowe i żebrowe i nie w pełni wykształ cone kręgi (Evrad i inni, 1998). Fringe jak się wydaje, bierze udział w definicji granicznego tworzenia i wzoru somitów przez modulację aktywności receptorów Notch (Klein i Arias, 1998; Moloney i inni,
2000; Brnckner i inni, 2000). W aktywności modulującej Notch, jak się wydaje, pośredniczy aktywność N-acetyloglukozaminylotransferazowa Fringe, która w aparacie Golgiego inicjuje wydłużanie połączonych z O reszt fukozy przyczepionych do powtórzeń sekwencji podobnej do EGF Notch (Moloney i inni, 2000; Bmckner i inni, 2000).
Ponadto, ponieważ bydlęcy gen SLC35A3 jest homologiczny z ludzkim genem SLC35A3, jest oczywiste, zgodnie z informacjami zawartymi w niniejszym, analizowanie sekwencji kodującej ludzkiego genu SLC35A3 pod względem mutacji sprawczych i diagnostycznych przy studiowaniu ludzkich wad rozwojowych, zwłaszcza obejmujących segmentację i wzór somitów.
Wpływ mutacji w położonym w aparacie Golgiego transporterze N-acetyloglukozaminylowym (SLC35A3) mającym wpływ na transport N-acetyloglukozaminy z cytozolu do światła aparatu Golgiego, prawdopodobnie pozbawiłaby rodzinę białek Fringe ich substratu. Miałoby to wpływ na zdolność Fringe do modulowania aktywności Notch, a przez to powodowało wadę segmentacji podobnie jak CVM. Wydaje się zatem bardzo prawdopodobne, że mutacja w SLC35A3, oprócz tego, że jest wskaźnikiem diagnostycznym dla CVM, jest także mutacją powodującą szeroko rozpowszechniony defekt genetyczny.
Wynalazek jest opisany bardziej szczegółowo w następujących przykładach:
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1
Mapowanie genetyczne zespołu wad wrodzonych kręgów (CVM)
Przykład ten ilustruje lokalizację lokusa genu CVM na bydlęcym chromosomie BTA3. Dodatkowo, ta postać realizacji opisuje identyfikację markerów powiązanych z lokusem genu CVM, a więc charakteryzację regionu CVM bydlęcego chromosomu BTA3.
Aby zmapować lokus odpowiedzialny za CVM, pobrano próbki od zwierząt biorących udział w badaniu hodowlanym. W skrócie, do badania hodowlanego wybrano około 300 krów i jałówek pochodzących od buhaja T Burma i unasienionych nasieniem od buhaja KOL Nixon. Wybrano trzydzieści cieląt chorych, na podstawie badania pośmiertnego, jak opisano u Agerholma i innych, 2000. Te 13 cieląt jak również ich rodzice, całkowita ilość 28 zwierząt, wykorzystano w początkowym skaningu genomu. Cielęta były oddzielone o 4 pokolenia w stosunku do ich wspólnego przodka, buhaja czystej krwi Carlin-M Ivanhoe Bell.
Przeprowadzono skaning genomu, pokrywający wszystkie 29 autosomów, przy użyciu wielkiego zbioru markerów mikrosatelitarnych wybranych z mapy genomowej USDA (Kappes i inni, 1997). Markery wybrano z parami odległości wynoszącymi między 10, a 20 cM. W obszarach wątpliwych z powodu małej ilości informacji ze strony markera, wprowadzano nowe markery i poddawano genotypowaniu. Wykorzystano całkowitą ilość 194 markerów. Przeprowadzono podwójne reakcje PCR w objętości 5 μΐ w automacie ABI 877 PCR (Applied Biosystems), zawierającej 12 ng genomowego DNA,
PL 207 541 B1
1x bufor PCR, 0,4 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), 20 pmoli każdego startera oraz 2,0 mM MgCl2. Wszystkie markery uruchomiono w tych samych korzystnych warunkach PCR: inkubacja w temperaturze 94°C przez 12 minut aby aktywować enzym, 35 cykli w temperaturze 94°C, 30 sekund; Ta, 45 sekund; 72°C, 20 sekund, zakończenie z ostatecznym wydłużaniem w temperaturze 72°C przez 10 minut. Przez pierwsze dziesięć cykli Ta zmniejszano temperaturę od 67°C do 58°C, jeden stopień na każdy cykl, a pozostałe 25 cykli Ta przebiegało w stałej temperaturze 58°C. Produkty PCR zlano i uruchomiono 5-9 różnych markerów w każdym torze na ABI 377 (Applied Biosystems) i ż ele analizowano za pomocą dołączonego oprogramowania. Allele przypisano za pomocą programu Gentyper (wersja 2.1, Applied Biosystems).
Dla trzech markerów obliczono dwupunktowe lod score, przy użyciu programu MLINK z pakietu LINKAGE (Lathrop i inni, 1985). Z powodu struktury rodowodu (fig. 1) z wielokrotnymi pętlami inbredowymi, rodowód podzielono na trzynaście małych rodzin, przy czym jedna rodzina dla każdego dotkniętego chorobą cielęcia obejmowała ojca (KOL Nixon), matkę oraz dziadka z linii żeńskiej (T Burma). Założono, że choroba była dziedziczona recesywnie z pełną penetracją genotypu.
Znaleziono istotne powiązanie dla wszystkich trzech markerów. Najwyższy lod score (Z) zauważono dla BMS2790 i ILSTS029 przy Z = 10,35 przy θ = 0. Ponadto, sąsiedni marker INRA003 był także istotnie powiązany z lokusem CVM (tablica 3).
T a b l i c a 3
Dwupunktowe lod score (Z) i frakcje rekombinacji (θ) z analizy powiązania lokusa CVN i 3 markerów bydlęcego chromosomu
| Marker | Frakcja rekombinacji (θ) | Lod score (Z) |
| BMS2790 | 0,00 | 10,35 |
| INRA003 | 0,03 | 6,44 |
| ILSTS029 | 0,00 | 10,35 |
Powyższe wyniki umiejscawiają lokus CVN na BTA3 (fig. 2) zgodnie z mapą genetyczną USDA (Kappes i inni, 1997).
Jedenaście cieląt było homozygotycznych pod względem przedziału określonego przez INRA 003, BMS2790, ILSTS029, BMS862 i HUJ246, podczas gdy BMS2790 i ILSTS029 same były homozygotyczne u wszystkich trzynastu cieląt, jak opisano w fig. 1. Można było skonstruować haplotypy tych markerów, pozwalające na wywnioskowane najbardziej prawdopodobnego haplotypu CVM (fig. 1). Haplotypy są określane przez wielkość alleli markerowych, które są ponumerowane od 1 do N, przy czym 1 określa najkrótszy allel amplifikowanego markera, a N określa najdłuższy allel. Właściwa długość alleli związanych z CVN u buhaja Bell jest następująca:
INRA003 (allel nr 3): 176 par zasad
BMS2790 (allel nr 3): 118 par zasad
ILSTS029 (allel nr 2): 164 pary zasad
BMS862 (allel nr 1): 130 par zasad
HUJ246 (allel nr 3): 262 pary zasad
Właściwa długość alleli będzie zależeć od starterów użytych przy amplifikacji markera, a długość fragmentu ukazanego powyżej opiera się o wykorzystanie starterów opisanych w tablicy 4.
Ponadto, do badania wprowadzono siedemnaście dodatkowych chorych cieląt, będących próbami jako część duńskiego programu nadzorującego wady genetyczne. Wszystkie chore zwierzęta miały czystej krwi buhaja Bell jako wspólnego przodka. DNA wyekstrahowano z próbek krwi lub nasienia, przy użyciu standardowych procedur.
cieląt i ich matki poddano genotypowaniu z 8 markerami INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937 i HUJ246 obejmującymi region BTA3 od około 59,5 cM do 67,9 cM, a ponieważ założono, że gen CVN u dodatkowych 17 cieląt, tak jak w początkowym badaniu hodowlanym, pochodzi od wspólnego przodka buhaja Bell, oczekiwano, że istnieje podobny region identyczności potomstwa (IBD) u wszystkich chorych cieląt. Okazało się także, że: u 17 z 17 cieląt segment chromosomu określany przez INRA003 i BMS2790 był homozygotyczny, dzieląc te same allele co zwierzęta z badania hodowlanego. U dwóch z dziewiętnastu zwierząt, heterozygotyczność obserwowano w lokus ILSTS029 i BMS862 tłumaczoną pojedynczą rekombinacją między BMS2790 i ILSTS029. Tak więc, na podstawie łącznych wyników genotypingu, odkryliśmy, że wada genetyczna CVN
PL 207 541 B1 jest najprawdopodobniej umiejscowiona w przedziale wynoszącym poniżej 6 centymorganów, oflankowanym przez markery INRA003 i ILSTS029, jak zilustrowano w fig. 2 i oznaczonym „region CVM.
Sekwencje starterów dla stosowanych 8 markerów INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937 i HUJ246, są opisane w tablicy 4 poniżej.
T a b l i c a 4
| Marker genetyczny | Sekwencja starterów | SEQ ID nr |
| INRA003 | F:CTG GAG GTG TGT GAG CCC CAT TTA R:CTA AGA GTC GAA GGT GTG ACT AGG | SEQ ID nr:1 SEQ ID nr:2 |
| BMS2790 | F: AAG ACA AGG ACT TTC AGC CC R: AAA GAG TCG GAC ATT ACT GAG C | SEQ ID nr:3 SEQ ID nr:4 |
| ILSTS029 | F: TGT TTT GAT GGA ACA CAG CC R: TGG ATT TAG ACC AGG GTT GG | SEQ ID nr:5 SEQ ID nr:6 |
| INRA123 | F: TCT AGA GGA TCC CCG CTG AC R: AGA GAG CAA CTC CAC TGT GC | SEQ ID nr:7 SEQ ID nr:8 |
| BM220 | F: TTT TCT ACT GCC CAA CAA AGT G R: TAG GTA CCA TAG CCT AGC CAA G | SEQ ID nr:9 SEQ ID nr:10 |
| HUJ246 | F: ACT CCA GTT TTC TTT CCT GGG R: TGC CAT GTA GTA GCT GTG TGC | SEQ ID nr:11 SEQ ID nr:12 |
| BMS862 | F:TAT AAT GCC CTC TAG ATC CAC TCA R:ATG GAA AAA TAA GAT GTG GTA TGT | SEQ ID nr:13 SEQ ID nr:14 |
| BMS937 | F: GTA GCC ATG GAG ACT GGA CTG R: CAT TAT CCC CTG TCA CAC ACC | SEQ ID nr:15 SEQ ID nr:16 |
P r z y k ł a d 2
Test diagnostyczny dla identyfikacji nosicieli CVM: Ustanowiono test diagnostyczny dla określania bydlęcych nosicieli CVN przez określenie, czy potomstwo buhaja Bell było nosicielami haplotypu związanego z chorobą.
Test oparto o 8 markerów mikrosatelitarnych INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937 i HUJ246 i polegał na rozpoznaniu alleli lub haplotypu specyficznych dla choroby (patrz fig. 1) u zwierząt po buhaju Bell.
Zwierzęta określano więc jako nosicieli, jeśli dziedziczyły allele związane z chorobą w regionie definiowanym przez markery INRA003, BMS2790, ILSTS003 i BM220 od buhaja Bell lub zwierząt po buhaju Bell. Jeśli zwierzęta nie dziedziczyły haplotypu związanego z chorobą po buhaju Bell lub potomstwie buhaja Bell, były określane jako niebędące nosicielami. W przypadkach, gdy haplotyp buhaja Bell był podzielony przez rekombinację, zwierzęta oznaczano jako nieokreślone. Tylko cztery dodatkowe markery wykorzystywano wtedy gdy zawartość informacji w markerach testowych była mniejsza z powodu niemożności odróżnienia dziedziczenia w linii żeńskiej od linii męskiej.
Jak wszystkie diagnostyczne testy genetyczne na bazie powiązanych markerów DNA, test CVM jest obarczony wadą, że nie można wykryć podwójnej rekombinacji (jedno zdarzenie po każdej stronie genu wywołującego, między genem i flankującymi markerami). W niniejszym przypadku, zdarzenie to będzie niezwykle rzadkie z powodu ścisłego powiązania między markerami i genem CVM, i pewność testu jest szacowana na ponad 99%.
P r z y k ł a d 3
Preparowanie tkanki i izolacja RNA oraz synteza cDNA:
Około 5 gramów tkanki sercowej wypreparowano z martwo urodzonych cieląt, w ciągu 3 godzin po porodzie, natychmiast zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C. Do izolacji RNA wykorzystano 250 mg tkanki. RNA izolowano przy użyciu RNA Isolation Kit od Stratagene (nr katalogowy 200345).
cDNA syntetyzowano przez wymieszanie 2,5 μg całego RNA z 1 μΐ oiigo(dT)12-18 (500 μg/ml), 1 μl 10 mM mieszanki dNTP i H2O, uzyskując końcową objętość wynoszącą 12 pi. Otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 65°C przez 5 minut, ochłodzono na lodzie i krótko wirowano. Po dodaniu
PL 207 541 B1 μ l 5x buforu pierwszej nici, 2 μ l 0,1 M DTT i 1 μ l H2O zawartoś ci wymieszano i inkubowano w temperaturze 42°C przez 2 minuty, po których dodano 1 μ! (200 U) Superscript II (GibcoBRL® Lifetechnologies) i inkubację kontynuowano w temperaturze 42°C przez 1,5 godziny. Reakcję inaktywowano w temperaturze 70°C przez 15 minut. Aby usunąć RNA, cDNA inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 minut z 1 U RNazy (Roche Molecular Biochemicals).
P r z y k ł a d 4
Sekwencjonowanie SLC35A3:
Na podstawie uszeregowania homologii genu SLC35A3 między homo sapiens i canis familiaris, zaplanowano 2 oligonukleotydy (SLIF i SL8R) do amplifikacji prawie całego cDNA bydlęcego SLC35A3, łącznie z kodonem startowym. Aby otrzymać koniec 3' genu, uzyskany fragment PCR sekwencjonowano i zaplanowano nowy oligonukleotyd (SL5F). Aby amplifikować koniec 3' SLC35A3, wykorzystano SL5F w połączeniu z oligonukleotydem (bSLCBVIR), na podstawie opublikowanej sekwencji bydlęcego EST.
Dla obu zbiorów starterów stosowano te same warunki PCR.
Reakcje PCR przeprowadzono w GeneAmp® System 9700 (Applied Biosystems) w końcowej objętości wynoszącej 10 μ^ zawierającej 1 μ! 10x buforu reakcyjnego NH4, 0,5 μ! 50 mM MgCl2, 0,8 dNTP (2,5 mM każdy), 5,65 μ! H2O, 1 μ! startera zgodnego i przeciwnego (5 pmoli każdy) oraz 0,05 μ! 5 U^l polimerazy BIOTAQ DNA (Bioline).
Ustawienia reakcji PCR obejmowały początkowy etap aktywacji cieplnej w temperaturze 95°C przez 2 minuty, po którym następowało 10 cykli denaturacji przez 30 sekund w temperaturze 95°C, wygrzewania w temperaturze 62°C przez 30 sekund (stopniowe obniżanie po 0,5°C) i wydłużanie przez 20 sekund w temperaturze 72°C, plus dodatkowe 30 cykli z etapem denaturacji przez 30 sekund w temperaturze 95°C, wygrzewanie w temperaturze 57°C przez 30 sekund i etap wydłużania w temperaturze 72°C przez 30 sekund.
Wykorzystano następujące startery do amplifikacji pełnego cDNA SLC35A3:
SLIF: 5'-GGA GGC AAA TGA AGA TAA AAC-3' (SEQ ID nr: 19) SL8R: 5'-GTA TGC TTT AGT GGG ATT-3' (SEQ ID nr: 20) SL5F: 5'-GAG TTG GTT TTG TAC AGT GG-3' (SEQ ID nr: 21) bSLCBYIR: 5'-ACT GGC TAC TAT GTA GGA CAG GA-3' (SEQ ID nr: 22)
Otrzymano pełną sekwencję cDNA przez stosowanie tych starterów w czterech oddzielnych cyklach reakcji sekwencjonowania z użyciem oczyszczonych produktów PCR jako matrycy. Produkty PCR oczyszczano przy użyciu SPIN-X® (Corning Incorporated) z 0,8% żelu agarozowego Seakem.
Cykle reakcji sekwencjonowania przeprowadzono w GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) i obejmowały etap początkowy w temperaturze 96°C przez 2 minuty, po którym następowało 99 cykli w temperaturze 96°C przez 10 sekund, 55°C przez 5 sekund i 60°C przez 4 minuty. Produkty sekwencjonowania wytrącono dwiema objętościami etanolu i 1/10 objętości 3 M NaAc (pH 5,5), przemyto 70% etanolem, ponownie zawieszono w 5 μl buforu do ładowania i uruchomiono na 4% akrylamidowych żelach sekwencjonujących z wykorzystaniem automatycznego sekwenatora ABI377.
Sekwencja cDNA bydlęcego SLC35A3 jest ukazana w fig. 4 (SEQ ID nr:18).
P r z y k ł a d 5
Identyfikacja BAC zawierających markery mikrosatelitarne
Hybrydyzacja na filtrze:
Filtry poddano wstępnej hybrydyzacji w roztworze hybrydyzacyjnym (6xSSC (52,6 g NaCl, 26,46 g cytrynianu sodu na litr), 5x Denhardt (2 g fikol typ 400, Pharmacia), 5 g poliwinylopirolidonu, g albuminy surowicy bydlęcej (frakcja V, Sigma), 0,5% SDS i 50 μg/ml SS-DNA) w temperaturze 65°C przez 3 godziny z wirowaniem. Następnie z filtrami inkubowano 100 μl oligonukleotydu wyznakowanego na końcu 5', przez 16 godzin w temperaturze 65°C. Aby wyznakować koniec, połączono 5 pmoli oligonukleotydu z 5 μl (50 μ^) gamma-32P-ATP (aktywność specyficzna > 5000 Ci/mmol), 2 μl 10x buforu kinazowego, 11 μl H2O i 1 μl (10 U) kinazy polinukleotydowej T4 (New England Biolabs Inc.), i mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 1,5 godziny, po których następowało 5 minutowe gotowanie do temperatury inaktywującej enzym. Wyznakowaną sondę wytrącono mieszaniną NaAc/etanol stosując standardowe procedury i po przemyciu w 70% etanolu sondę ponownie rozpuszczono w 100 μl H2O. Po hybrydyzacji filtry przemyto raz roztworem do przemywania I (2xSSC, 0,2% SDS) i dwukrotnie w temperaturze 65°C roztworem do przemywania II (0,1xSSC, 0,5% SDS) i zetknięto z błoną Kodak BIOMAX™ MS na 2 dni w temperaturze -80°C.
Do identyfikacji klonów BAC pozytywnych pod względem ILSTS029 i INRA003 użyto następujących oligonukleotydów wyznakowanych na końcu 5':
PL 207 541 B1
Oligonukleotyd ILSTS029:
5'-CAC ACC GCT GTA CAG GAA AAA GTG TGC CAA CCC TGG TCT AAA TCC AAA ATC CAT TAT CTT CCA AGT ACA T-3' (SEQ ID nr: 23)
Oligonukleotyd INRA003:
5'-CGT CCC CTA TGC GCT TAC TAC ATA CAC TCAAAT GGA AAT GGG AAA ACT GGA GGT GTG TGA GCC CCA TTT A-3' (SEQ ID nr: 24)
Przesiew za pomocą PCR bydlęcej bibliotek BAC:
Sporządzono zbiory BAC z bibliotek BAC i przesiano za pomocą PCR. Reakcje PCR przeprowadzono w GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) w końcowej objętości wynoszącej 10 μ|, zawierającej 1 μΐ 10x buforu reakcyjnego NH4, 0,5 μΐ 50 mM MgCl2, 0,8 μΐ dNTP (2,5 mM każdy), 5,65 μl H2O, 1 μl startera zgodnego i przeciwnego (5 pmoli każdy) i 0,05 μl 5 U^l polimerazy BIOTAQ DNA (Bioline).
Do identyfikacji klonów BAC zawierających BMS2790 za pomocą PCR wykorzystano następujące startery:
BMS2790F: 5'-AAG ACA AGG ACT TTC AGC CC-3'(SEQ ID nr: 25)
BMS2790R:5'-AAA GAG TCG GAC ATT ACT GAG C-3'(SEQ ID nr: 26)
Korzystna reakcja PCR obejmowała początkowy etap aktywacji cieplnej w temperaturze 95°C przez 2 minuty, po którym następowało 10 cykli denaturacji przez 30 sekund w temperaturze 95°C, wygrzewanie w temperaturze 70°C przez 30 sekund (stopniowe obniżanie o 0,5°C) i wydłużanie przez 20 sekund w temperaturze 72°C, plus dodatkowe 30 cykli z etapem denaturacji w temperaturze 95°C przez 30 sekund, wygrzewania w temperaturze 65°C przez 30 sekund i wydłużania w temperaturze 72°C przez 20 sekund.
Izolacja i sekwencjonowanie DNA BAC:
Wytworzono DNA BAC zgodnie z Qiagens Large Construct Kit i wykorzystano około 1 μg DNA BAC jako matrycę w cyklach sekwencjonowania przeprowadzonym z użyciem BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Apllied Biosystems). Cykliczne reakcje sekwencjonowania przeprowadzono w końcowej objętości wynoszącej 6 μl zawierającej 1 μl mieszaniny Big Dye™ Terminator, 1 μl startera (5 pmoli), 1 μl buforu reakcyjnego i 2 μl H2O. Cykle reakcji sekwencjonowania przeprowadzono w GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) i obejmowały początkowy etap w temperaturze 96°c przez 2 minuty, po którym następowało 130 cykli w temperaturze 96°C przez 10 sekund, 55°C przez 5 sekund i 60°C przez 4 minuty. Produkty sekwencjonowania wytrącono dwiema objętościami etanolu i 1/10 objętości 3 M NaAc (pH 5,5), przemyto 70% etanolem, ponownie zawieszono w 2 μl buforu do ładowania i uruchomiono na 4% akrylamidowych żelach sekwencjonujących przy u ż yciu automatycznego sekwenatora ABI377.
Startery sekwencjonowania:
T7: 5'-TTA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3' (SEQ ID nr: 27)
SP6: 5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3' (SEQ ID nr: 28)
INRA003F: 5'-CTG GAG GTG TGT GAG CCC CAT TTA-3'(SEQ ID nr: 29)
INRA003R: 5'-CTA AGA GTC GAA GGT GTG ACT AGG-3' (SEQ ID nr: 30)
P r z y k ł a d 6
Określanie statusu CVN przez sekwencjonowanie:
Przeprowadzono reakcje PCR (2 μl oczyszczona matryca/próbka genomowego DNA, 2 μl 10x buforu PCR, 2 μl 25 mM MgCl2, 3,3 Ul 0,2 mM każdego dNTP (Ultrapure dNTP, 270-2033-01; Amersham Pharmacia Biotech), 6 pmoli startera (zgodny: CBFEX1, 5'-GGC CCT CAG ATT CTC-3' (SEQ ID nr:31); przeciwny: CBTEXR, 5'-GTT GCC TGT TTC TTA-3' (SEQ ID nr:32), 0,165 U polimerazy Taq (Biotaq, M95801B; Bioline), dH2O do całkowitej ilości), pozbawione tłuszczu w 96-studzienkowych płytkach, przy użyciu Primus HT (MWG Biotech AG). Warunki cyklingu: temperatura 95°C 120 sekund, 35x [95°C 60 sekund, 72°C 110 sekund]. Oczyszczania poreakcyjnego dokonano przez filtrację w żelu (Millipore Filtration System) z użyciem Sephadex G-50 Superfine (17-0041-01, Amersham Pharmacia Biotech) przeprowadzoną zgodnie z zaleceniami producenta, przy użyciu 50 μl dH2O do końcowego wymywania próbki. Zgodne i przeciwne reakcje sekwencjonowania przeprowadzono z użyciem tych samych starterów jakie użyto do tworzenia produktu PCR (2 μl produktu PCR, 8 μl mieszaniny sekwencjonującej, 0,6 μl 6 pmoli startera (patrz powyżej), dH2O i 20 μl DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (US81095). Po termocyklingu (30x [95°C 20 sekund, 55°C 15 sekund, 60°C 70 sekund]) próbki oczyszczono przez filtrację w żelu zasadniczo jak opisano powyżej i analizowano na MegaBACE1000 (Amersham Pharmacia Biotech) przy użyciu matrycy długiego od14
PL 207 541 B1 czytu LPA i następujących warunków sekwencjonowania: 90 sekund wstrzykiwanie pod napięciem 3 kV i 35 minut czasu przebiegu pod napięciem 9 kV.
P r z y k ł a d 7
Próba PCR specyficzna dla allelu:
Zaplanowano startery z sekwencji cDNA oraz zaplanowano cztery startery specyficzne dla allelu, tak aby posiadały zasadę 3' w pozycji mutacji.
Sekwencje starterów:
T_fwd: 5'-CAG TGG CCC TCA GAT TCT CAA GAG CTT AAT TCT AAG GAA CTT TCA GCT GGC TCA CAA TTT GTA GGT CTC ATG GCA T-3' (SEQ ID nr:33)
G_fwd: 5'-CAC AAT TTG TAG GTC TCA TGG CAG-3' (SEQ ID nr:34)
A_rev: 5'-GCC ACT GGA AAA ACA TGC TGT GAG AAA-3' (SEQ ID nr: 35)
C_rev_link*: aat gct act act agg agt aga att gat gcc acc ttt tca gct cgc gcc cca aat gaa aat ata gct aaa cag gtt att gac cat ttg ega aat gta tct aat ggt caa act ttt ttC TGG AAA AAC ATG CTG TGA
GAA C-3' (SEQ ID nr: 36)
Fwd: 5'-GGC CTT CAG ATT CTC AAG-3' (SEQ ID nr: 37)
Rev: 5'-CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG-3' (SEQ ID nr: 38)
Starter C_rev_link zawiera sekwencję linkerową od faga M13 (ukazaną małymi literami). Linker ten dodano aby uzyskać dłuższy produkt PCR i aby umożliwić uzyskanie multipleksu starterów C i A w jednej reakcji PCR. Zasada 3' w pozycji mutacji jest ukazana czcionką pogrubioną, startery C i G są specyficzne dla allelu dzikiego typu, podczas gdy startery specyficzne dla T i A są specyficzne dla mutacji.
Pary starterów:
Multipleks specyficzny dla C i A: Fwd + A_rev + C_rev_link (niższa nić)
Reakcja specyficzna dla T: T_fwd + Rev (górna nić)
Reakcja specyficzna dla G: G_fwd + Rev (górna nić)
Warunki AS-PCR:
Każdą reakcję PCR przeprowadzono w objętości wynoszącej 10 μΐ zawierającej 20-100 ng genomowego DNA, 0,025 jednostek/μΐ polimerazy BIOLASE Diamond DNA, 0,75 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 0,25 pmola/μΐ startera (0,125 pmoli/μΐ dwóch przeciwnych starterów w multipleksie) w 1x buforze NH4 (Bioline). PCR przeprowadzono w GeneAmp® PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) w następujących warunkach: temperatura 95°C przez 4 minuty, 35 cykli w temperaturze 94°C przez 30 sekund, 62°C (56°C dla reakcji T i G) przy nachyleniu 80% przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund, po których następuje końcowe wydłużanie w temperaturze 72°C przez 7 minut i przechowywanie w temperaturze 4°C. Po PCR następowała elektroforeza w 2% żelu agarozowym pod napięciem 200 V przez 30 minut.
Wyniki analizy PCR specyficznej dla allelu dwóch dzikich typów, dwóch nosicieli i dwóch zwierząt chorych, są ukazane w fig. 7.
Opisy rysunków
Fig. 1 ukazuje rodowód wykorzystany do umiejscowienia lokusa zespołu wad wrodzonych kręgów u bydła oraz haplotypów pięciu markerów mikrosatelitarnych na bydlęcym chromosomie 3. Najprawdopodobniejsze haplotypy CVN są zaznaczone czcionką pogrubioną. Pełne, czarne kwadraty reprezentują chore cielęta. Podwójne linie między rozpłodnikiem i matkami wskazują pętlę inbredową. N oznacza liczbę zwierząt. Genotypy trzynastu różnych matek nie są ukazane dla uproszczenia.
Fig. 2 ukazuje mapę genetyczną bydlęcego chromosomu 3. Liczby na bokach oznaczają odległości genetyczne w centymorganach (cM) wzdłuż chromosomu. Zaznaczono najbardziej prawdopodobne położenie lokusa zespołu wad wrodzonych kręgów u bydła.
Fig. 3 ukazuje względną odległość w cM między 3 markerami mikrosatelitarnymi ILSTS029, BMS2790 i INRA003 (pokazanych na linii oznaczonej „Markery styczne na chromosomie bydlęcym 3) na chromosomie bydlęcym 3, jak opisano w U.S. Meat Animal Research Center (Kappes i inni, 1997). BAC zawierające te 3 markery wyizolowano albo przez hybrydyzację na filtry o wysokiej gęstości (ILSTS029 i INRA003) albo przez przesiew PCR bydlęcej biblioteki BAC RPCI-42 (BMS2790). Zidentyfikowane BAC ukazano w czarnych słupkach i opisano numerem płytki/numerem studzienki. Te BAC poddano sekwencjonowaniu końca przy użyciu starterów SP6 i T7 albo sekwencjonowaniu przy użyciu starterów rozciągających się poza mikrosatelitę. Otrzymane sekwencje zderzono z ludzkim chromosomem 1 przy użyciu Ensemble Server w Sanger Centre. Numery dostępu z badania zderzenia są ukazane jako liczby pod ludzkim chromosomem 1, a względna odległość między uderzeniami jest podana w MB. Wybrane geny w regionie są ukazane w ramkach.
PL 207 541 B1
Fig. 4 ukazuje sekwencję cDNA i translację genu SLC35A3 (SEQ ID nr: 18) oraz zakodowaną sekwencję aminokwasową (SEQ ID nr: 17). Nukleotyd polimorficzny w pozycji 559 oraz uszkodzona walina-180 jest zaznaczona czcionką pogrubioną.
Fig. 5 ukazuje porównanie wnioskowanej sekwencji aminokwasowej krowiego SLC35A3 z sekwencją ludzką (AB021981)(Ishida i inni, 1999) oraz psią (AF057365) (Guillen i inni 1998). Kropki wskazują reszty, które pasują do sekwencji Bos taurus. Kreski wskazują przerwy, które wprowadzono w celu optymalizacji uszeregowania.
Fig. 6 ukazuje wyniki otrzymane z sekwencjonowania regionu (od nukleotydu 544 do 572 SLC35A3, patrz fig. 4) ukazującego polimorfizm G/T w pozycji 559 przy określaniu statusu CVN przez sekwencjonowanie. Górny rządek (-/-) ukazuje sekwencjonowanie zwierzęcia dzikiego typu, środkowy rządek ukazuje sekwencjonowanie nosiciela (heterozygoty), a dolny rządek ukazuje sekwencjonowanie zwierzęcia chorego.
Fig. 7 jest obrazem ukazującym produkty PCR specyficznej dla allelu od dwóch zwierząt dzikiego typu, dwóch nosicieli i dwóch chorych. Opisy: WT: typ dziki, C: nosiciel, S: chory, neg: kontrola negatywna, M: marker (drabinka wielkości). Strzałki ukazują produkty PCR specyficzne dla allelu: C: 220 bp. A: 98 bp, T: 340 bp i G: 288 bp.
Odniesienia
1. Agerholm JS, Bendixen, C, Andersen 0., Ambjerg, J. (2000) LK meddelelser październik, 2000.
2. Barendse W, Vaiman D, Kemp SJ, Sugimoto Y, Armitage SM, Williams JL, Sun HS, Eggen A, Agaba M, Aleyasin SA, Band M, Bishop MD, Buitkamp J, Byrne K, Collins F, Cooper L, Coppettiers W, Denys B, Drinkwater RD, Easterday K, Elduque C, Ennis S, Erhardt G, Li L, Lil L (1997) A mediumdensity genetic linkage map of the bovine genome. Mamm Genome 8, 21-28.
3. BrOckner, K., Perez, L., Clausen, H., & Cohen, S., (2000) Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions Nature 406, str. 411-415.
4. Evrad, Y. A., Lun, Y-, Aulehla, A,. Gan, L., & Johnson, R. L. (1998) Lunatic fringe is an essential mediator of somite segmentation and patterning. Nature 394, str. 377-381.
5. Guillen, E., Abeijon, C, & Hirschberg, C.B. (1998) Mammalian Golgi apparatus UDP-N-acetylglucosamine transporter: Molecular cloning by phenotypte correction of a yeast mutant. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 95, str. 7888-7892.
6. Ishida, M., Yoshioka, S., Chiba, Y., Takeuchi, M., & Kawakita, M. (1999) Molecular cloning and functional expression of the human golgi UDP-N-acetylglucosamine transporter. J. Biochem. 126, str. 68-77.
7. Kappes SM, Keele JW, Stone RT, McGraw RA, Sonstegard TS, Smith TP, Lopez-Corrates NL, Beattie CW (1997) A second-generation linkage map of the bovine genome. Genome Res 7, 235-249.
8. Klein, T., & Arias, M. (1998) Interactions among Delta, Serrate and Fringe modulate Notch activity during drosophila wing development. Development 125, str. 2951-2962.
9. Lathrop GM, Lalouel JM, Julier C, Ott J (1985) Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination. Am J Hum Genet 37, 482-498
10. Moloney, D.J., Panin, V. M., Johnston, S. H., Chen, J., Shao, L., Wilson, Y., Stanley, P., Irvine, K. D., Haltiwanger, R. S., & Vogt, T. F. (2000) Fringe is a glycosyltransferase that modifies Notch. Nature 406, str 369-375.
11. Solinas-Toldo S, Lengauer C, Fries R (1995) Comparative genome map of human and cattle Genomics 27. 489-496.
Lista sekwencji <110> Ministeriet for Fodevarer-, Landbrug og Fiskeri Danmarks Jordbrugsforskning
Forskningscenter Foulum
Postbox 50
DK-8830 Tjele
Dania
De danske Kvaegavlerforeninger
Udkaersvej 15
Skejby
DK-8200 Arhus N
Dania <120> Testy genetyczne dla identyfikacji nosicieli zespołu wad wrodzonych kręgów u bydła <130> 25652 <160> 38 <170> FastSEQ dla Windows, wersja 4.0
PL 207 541 B1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Starter DNA <400> 1 ctggaggtgt gtgagcccca ttta 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 2 ctaagagtcg aaggtgtgac tagg 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 3 aagacaagga ctttcagccc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 4 aaagagtcgg acattactga gc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 5 tgttttgatg gaacacagcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 6 tggatttaga ccagggttgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 7 tctagaggat ccccgctgac 20 <210> 8
PL 207 541 B1 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 8 agagagcaac tccactcgtgc 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 9 ttttctactg cccaacaaag tg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 10 taggtaccat agcctagcca ag 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 11 actccagttt tctttcctgg g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 12 tgccatgtag tagctgtgtg c 21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 13 tataatgccc tctagatcca ctca 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 14 atggaaaaat aagatgtggt atgtg 25 <210> 15
PL 207 541 B1 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 15 gtagccatgg agactggact g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 16 cattatcccc tgtcacacac c 21 <210> 17 <211> 326 <212> PRT <213> bydlęce białko SLC35A3 <220>
<223> Starter DNA <400> 17
Met Ser Ala Asn Leu Lys Tyr Leu Ser Leu Gly Ile Leu Val Phe Gin 1 5 10 15
Thr Thr Ser Leu Val Leu Thr Met Arg Tyr Ser Arg Thr Leu Lys Glu 20 25 30
Glu Gly Pro Arg Tyr Leu Ser Ser Thr Ala Val Val Val Ala Glu Leu 35 40 45
Leu Lys Ile Met Ala Cys Ile Leu Leu Val Tyr Lys Asp Ser Lys Cys 50 55 60
Ser Leu Arg Ala Leu Asn Arg Ile Leu His Asp Glu Ile Leu Asn Lys
70 75 80
Pro Met Glu Thr Leu Lys Leu Ala Ile Pro Ser Gly Ile Tyr Thr Leu 85 90 95
Gin Asn Asn Leu Leu Tyr Val Ala Leu Ser Asn Leu Asp Ala Ala Thr 100 105 110
Tyr Gin Val Thr Tyr Gin Leu Lys Ile Leu Thr Thr Ala Leu Phe Ser 115 120 125
Val Ser Met Leu Ser Lys Lys Leu Gly Val Tyr Gln Trp Leu Ser Leu 130 135 140
Val Ile Leu Met Thr Gly Val Ala Phe Val Gln Trp Pro Ser Asp Ser 145 150 155 160 Gin Glu Leu Asn Ser Lys Glu Leu Ser Ala Gly Ser Gln Phe Val Gly
165 170 175
Leu Met Ala Val Leu Thr Ala Cys Phe Ser Ser Gly Phe Ala Gly Val 180 85 190
Tyr Phe Glu Lys Ile Leu Lys Glu Thr Lys Gln Ser Val Trp Ile Arg 95 200 205
Asn Ile Gln Leu Gly Phe Phe Gly Ser Ile Phe Gly Leu Met Gly Val 210 215 220
Tyr Val Tyr Asp Gly Glu Leu Val Ser Lys Asn Gly Phe Phe Gin Gly 225 230 235 240
Tyr Asn Arg Leu Thr Trp Ile Val Val Val Leu Gin Ala Leu Gly Gly
245 250 255
Leu Val Ile Ala Ala Val Ile Lys Tyr Ala Asp Asn Ile Leu Lys Gly 260 265 270
PL 207 541 B1
Phe Ala Thr Ser Leu Ser Ile Ile Leu Ser Thr Leu Ile Ser Tyr Phe 275 280 285
Trp Leu Gin Asp Phe Val Pro Thr Ser Val Phe Phe Leu Gly Ala Ile 290 295 300
Leu Val Ile Thr Ala Thr Phe Leu Tyr Gly Tyr Asp Pro Lys Pro Ala 305 310 315 320
Gly Asn Pro Thr Lys Ala
325 <210> 18 <211> 1217 <212> DNA <213> bydlęcy cDNA SLC35A3 <220>
<223> Starter DNA <400> 18
| caggcaaatg | aagataaaac | aatgtcagcc | aacctaaaat | acctttcttt | aggaattttg | 60 |
| gtctttcaga | ctaccagttt | ggttctgacg | atgcgttatt | ctaggacatt | aaaagaagag | 120 |
| gggcctcgtt | atctgtcatc | tacagctgtg | gttgttgctg | aacttttgaa | gataatggcc | 180 |
| tgcattttat | tagtctacaa | agatagcaaa | tgtagtctaa | gagcactgaa | tcgaatacta | 240 |
| catgatgaaa | ttcttaataa | acctatggaa | acgcttaaac | ttgctattcc | atcagggata | 300 |
| tatactcttc | agaataattt | actctatgtg | gcactgtcaa | atctcgatgc | agctacttatc | 360 |
| caggtcacat | atcagttgaa | aattcttaca | actgcactat | tttctgtgtc | aatgcttagt | 420 |
| aaaaaattag | gtgtgtacca | gtggctctcc | ctagtaattt | tgatgacagg | agttgctttt | 480 |
| gtacagtggc | cctcagattc | tcaagagctt | aattctaagg | aactttcagc | tggctcacaa | 540 |
| tttgtaggtc | tcatggcagt | tctcacagca | tgtttttcca | gtggctttgc | tggggtttac | 600 |
| tttgagaaaa | tcttaaaaga | aaccaaacaa | tcagtgtgga | taagaaacat | tcaacttggt | 660 |
| ttctttggga | gtatatttgg | attaatgggt | gtatatgttt | atgatggaga | actggtatca | 720 |
| aagaatgggt | tttttcaggg | atataaccga | ctgacctgga | tagttgttgt | tcttcaggca | 780 |
| ctgggaggcc | ttgtaatagc | tgctgttatt | aagtatgcgg | ataacatttt | gaaaggattt | 840 |
| gcaacctctt | tgtccataat | attatcaaca | ctaatatctt | atttttggct | acaagatttt | 900 |
| gtaccaacca | gtgtcttttt | ccttggagcc | atccttgtaa | taacagctac | tttcctatat | 960 |
| ggttatgatc | ccaaacctgc | aggaaatccc | actaaagcat | agtggtaact | tacctggttt | 1020 |
| ttcacagtgg | tgcactggga | atctcaacat | taatgctgca | cagaggactt | ctacagattc | 1080 |
| taagagaaaa | tcatcatgct | gaatctgatc | atgatgttca | aatggcccga | aaatataaaa | 1140 |
| gtttaaggat | aaaatataca | tatatgtaac | aaaatgccta | ttgcatctaa | aaatcaaaac | 1200 |
| ttgaacattt | ccaggga | 1217 |
<210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 19 ggaggcaaat gaagataaaa c 21 <210> 20
PL 207 541 B1 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 20 ctatgcttta gtgggatt 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 21 gagttgcttt tgtacagtgg 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 22 actggctact atctagcaca gga 23 <210> 23 <211> 70 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 23 cacaccgctg tacaggaaaa agtgtgccaa ccctggtcta aatccaaaat ccattatctt 60 ccaagtacat 70 <210> 24 <211> 70 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 24 cgtcccctat gcgcttacta catacactca aatggaaatg ggaaaactgg aggtgtgtga 60 gccccattta 70 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 25 aagacaagga ctttcagccc 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 26
PL 207 541 B1 aaagagtcgg acattactga gc 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 27 ttatacgact cactataggg 27 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 28 atttaggtga cactatag 18 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 29 ctggaggtgt gtgagcccca ttta 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 30 ctaagagtcg aaggtgtgac tagg 24 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 31 ggccctcaga ttctc 15 <210> 32 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 32 gttgaatgtt tctta 15 <210> 33 <211> 76 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 33
PL 207 541 B1 cagtggccct cagattctca agagcttaat tctaaggaac tttcagctgg ctcacaattt 60 gtaggtctca tggcat 76 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 34 cacaatttgt aggtctcatg gcag 24 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> Starter DNA <400> 35 gccactggaa aaacatgctg tgagaaa 27 <210> 36 <211> 139 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 36 aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60 atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac ttttttctgg 120 aaaaacatgc tgtgagaac 139 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 37 ggccctcaga ttctcaagag c 21 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter DNA <400> 38 cgatgaaaaa ggaaccaaaa ggg 23
Claims (28)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrywania bydlęcego zespołu zniekształceń kręgosłupa (CVM) u bydła mlecznego, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego identyfikuje się obecność co najmniej jednego markera genetycznego położonego na bydlęcym chromosomie BTA3, w regionie oflankowanym jak i obejmującym polimorficzne markery mikrosatelitarne BM4129 i BMS1266, związanego z bydlęcym zespołem zniekształceń kręgosłupa (CVM), przy czym te markery genetyczne są sprzężone z genem SLC35A3 bydła i sposób obejmuje wykrywanie w wymienionym materiale genetycznym, obecności lub nieobecności co najmniej jednego markera genetycznego sprzężonego z bydlęcym zespołem zniekształceń kręgosłupa.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jeden marker genetyczny jest położony w regionie od około 59,5 centymorganów do około 67,9 centymorganów.PL 207 541 B1
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że co najmniej jeden marker genetyczny jest położony w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne markery mikrosatelitarne INRAA003 i BMS937.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że co najmniej jeden marker genetyczny jest położony w regionie oflankowanym i obejmującym polimorficzne markery mikrosatelitarne INRAA003 i ILSTS029.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jednym markerem genetycznym jest marker mikrosatelitarny INRAA003.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jednym markerem genetycznym jest marker mikrosatelitarny BMS2790.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jednym markerem genetycznym jest marker mikrosatelitarny ILSTS029.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jednym markerem genetycznym jest marker mikrosatelitarny INRA123.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jednym markerem genetycznym jest marker mikrosatelitarny BM220.
- 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jednym markerem genetycznym jest marker mikrosatelitarny HUJ246.
- 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jednym markerem genetycznym jest marker mikrosatelitarny BMS862.
- 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jednym markerem genetycznym jest marker mikrosatelitarny BMS937.
- 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bydlęcy gen SLC35A3 koduje bydlęce białko SLC35A3 obejmujące sekwencję aminokwasową jaką ukazano w SEQ ID nr: 17.
- 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że bydlęce białko SLC35A3 jest kodowane przez sekwencję cDNA obejmującą sekwencję nukleotydową z SEQ ID nr: 18.
- 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że marker genetyczny jest polimorfizmem pojedynczego nukleotydu w pozycji równoważnej nukleotydowi 559 z SEQ ID nr: 18.
- 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że polimorfizm pojedynczego nukleotydu jest polimorfizmem G/T.
- 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wykrywanie polimorfizmu G/T jest przeprowadzane techniką wybraną z grupy obejmującej PCR specyficzną wobec allelu, minisekwencjonowanie, wydłużanie startera, pirosekwencjonowanie, PCR-RFLP, amplifikację specyficzną dla allelu typu „rolling circle oraz wydłużanie primera, po którym następuje spektrometria masowa MALDI-TOF.
- 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony co najmniej jeden marker genetyczny jest genetycznie powiązany z genem lub cechą chorobową wywołującą zespół wad wrodzonych kręgów u bydła przy lod score wynoszącym co najmniej 3,0, tak jak co najmniej 4,0, łącznie z co najmniej 5,0, tak jak co najmniej 6,0, łącznie z co najmniej 7,0, tak jak co najmniej 8,0, łącznie z co najmniej 9,0, tak jak co najmniej 10,0, łącznie z co najmniej 11,0, tak jak co najmniej 12,0.
- 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej dwa markery genetyczne są stosowane w kombinacji.
- 20. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego INRAA003 jest SEQ ID nr: 1 i SEQ ID nr: 2.
- 21. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego BMS2790 jest SEQ ID nr: 3 i SEQ ID nr: 4.
- 22. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego ILSTS029 jest SEQ ID nr: 5 i SEQ ID nr: 6.
- 23. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego INRA123 jest SEQ ID nr: 7 i SEQ ID nr: 8.
- 24. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego BM220 jest SEQ ID nr: 9 i SEQ ID nr: 10.
- 25. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego HUJ246 jest SEQ ID nr: 11 i SEQ ID nr: 12.
- 26. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego BMS862 jest SEQ ID nr: 13 i SEQ ID nr: 14.PL 207 541 B1
- 27. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że parą starterów do amplifikacji markera mikrosatelitarnego BMS937 jest SEQ ID nr: 15 i SEQ ID nr: 16.
- 28. Zestaw diagnostyczny do stosowania w wykrywaniu obecności u bydła mlecznego co najmniej jednego markera genetycznego związanego z bydlęcym zespołem zniekształceń kręgosłupa (CVM), zawierający co najmniej jedną sekwencję oligonukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID nr: 1, SEQ ID nr: 2, SEQ ID nr: 3, SEQ ID nr: 4, SEQ ID nr: 5, SEQ ID nr: 6, SEQ ID nr: 7, SEQ ID nr: 8, SEQ ID nr: 9, SEQ ID nr: 10, SEQ ID nr: 11, SEQ ID nr: 12, SEQ ID nr: 13, SEQ ID nr: 14, SEQ ID nr: 15, SEQ ID nr: 16, SEQ ID nr: 33, SEQ ID nr: 34, SEQ ID nr: 35, SEQ ID nr: 36, SEQ ID nr: 37, SEQ ID nr: 38.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200001717 | 2000-11-16 | ||
| DKPA200100765 | 2001-05-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL362118A1 PL362118A1 (pl) | 2004-10-18 |
| PL207541B1 true PL207541B1 (pl) | 2010-12-31 |
Family
ID=26068911
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL362118A PL207541B1 (pl) | 2000-11-16 | 2001-11-15 | Sposób wykrywania bydlęcego zespołu zniekształceń kręgosłupa (CVM) i zestaw diagnostyczny |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7094544B2 (pl) |
| EP (1) | EP1334210B1 (pl) |
| JP (1) | JP4130125B2 (pl) |
| CN (1) | CN100406572C (pl) |
| AR (1) | AR031412A1 (pl) |
| AT (1) | ATE317915T1 (pl) |
| AU (2) | AU2002223498B2 (pl) |
| BG (1) | BG107904A (pl) |
| BR (1) | BR0115439B1 (pl) |
| CA (1) | CA2429275C (pl) |
| CZ (1) | CZ304453B6 (pl) |
| DE (1) | DE60117297T2 (pl) |
| DK (1) | DK1334210T3 (pl) |
| EE (1) | EE05634B1 (pl) |
| ES (1) | ES2258568T3 (pl) |
| HK (1) | HK1058214A1 (pl) |
| HU (1) | HUP0302661A3 (pl) |
| IL (2) | IL155898A0 (pl) |
| NO (1) | NO20032216L (pl) |
| NZ (1) | NZ526386A (pl) |
| PL (1) | PL207541B1 (pl) |
| PT (1) | PT1334210E (pl) |
| RU (1) | RU2276690C2 (pl) |
| SI (1) | SI1334210T1 (pl) |
| SK (1) | SK5972003A3 (pl) |
| WO (1) | WO2002040709A2 (pl) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2429275C (en) * | 2000-11-16 | 2006-04-11 | Christian Bendixen | Genetic test for the identification of carriers of complex vertebral malformations in cattle |
| DE10236711A1 (de) * | 2002-08-09 | 2004-02-26 | Universität Hohenheim | Polymorphe Mikrosatellitenloci in Genen für die Prädiagnostik |
| CN104131063A (zh) | 2002-12-31 | 2014-11-05 | 比浪海威公司 | 用于推断牛的性状的组合物、方法和系统 |
| CN101415842A (zh) * | 2006-02-06 | 2009-04-22 | 奥胡斯大学 | 牛乳房炎抗性的qtl |
| JP2011223940A (ja) * | 2010-04-21 | 2011-11-10 | Asahi Breweries Ltd | 偽陰性を排除するｐｃｒ検査方法およびそれに使用するプライマー |
| CN102002526B (zh) * | 2010-11-16 | 2012-12-12 | 中国农业大学 | 用于检测牛slc35a3基因v180f突变的引物和探针 |
| RU2577990C1 (ru) * | 2015-02-11 | 2016-03-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АгроВет" | Набор последовательности праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики двух мутантных аллелей, вызывающих cvm и blad у крупного рогатого скота |
| RU2581026C2 (ru) * | 2015-04-30 | 2016-04-10 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) | Набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции эндогенного внутреннего контроля при исследованиях биологического материала крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме "реального времени" |
| RU2667124C2 (ru) * | 2017-02-20 | 2018-09-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Брянский государственный аграрный университет" | Способ проведения пцр-пдрф-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену rps3a |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5811233A (en) * | 1994-05-20 | 1998-09-22 | Board Of Regents, Univ. Of Texas System | Compositions and uses thereof in the diagnosis of psoriasis |
| CA2429275C (en) * | 2000-11-16 | 2006-04-11 | Christian Bendixen | Genetic test for the identification of carriers of complex vertebral malformations in cattle |
-
2001
- 2001-11-15 CA CA002429275A patent/CA2429275C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-15 PL PL362118A patent/PL207541B1/pl unknown
- 2001-11-15 BR BRPI0115439-7A patent/BR0115439B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-11-15 EE EEP200300233A patent/EE05634B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-11-15 CN CNB018217168A patent/CN100406572C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-11-15 DK DK01996624T patent/DK1334210T3/da active
- 2001-11-15 AT AT01996624T patent/ATE317915T1/de active
- 2001-11-15 RU RU2003115422/13A patent/RU2276690C2/ru active
- 2001-11-15 SI SI200130523T patent/SI1334210T1/sl unknown
- 2001-11-15 EP EP01996624A patent/EP1334210B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-15 ES ES01996624T patent/ES2258568T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-15 HU HU0302661A patent/HUP0302661A3/hu unknown
- 2001-11-15 AU AU2002223498A patent/AU2002223498B2/en not_active Expired
- 2001-11-15 CZ CZ2003-1664A patent/CZ304453B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-11-15 AU AU2349802A patent/AU2349802A/xx active Pending
- 2001-11-15 US US10/416,941 patent/US7094544B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-15 IL IL15589801A patent/IL155898A0/xx unknown
- 2001-11-15 PT PT01996624T patent/PT1334210E/pt unknown
- 2001-11-15 WO PCT/DK2001/000756 patent/WO2002040709A2/en active IP Right Grant
- 2001-11-15 JP JP2002543020A patent/JP4130125B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-11-15 SK SK597-2003A patent/SK5972003A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2001-11-15 DE DE60117297T patent/DE60117297T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-15 NZ NZ526386A patent/NZ526386A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 AR ARP010105358A patent/AR031412A1/es unknown
-
2003
- 2003-05-13 IL IL155898A patent/IL155898A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-05-15 NO NO20032216A patent/NO20032216L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-06-13 BG BG107904A patent/BG107904A/bg unknown
-
2004
- 2004-02-12 HK HK04100944A patent/HK1058214A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-07-05 US US11/480,511 patent/US20060240471A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-10-01 US US12/571,772 patent/US8715925B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-04-01 US US14/231,888 patent/US20140242585A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8715925B2 (en) | Genetic test for the identification of carriers of complex vertebral malformations in cattle | |
| US7888021B2 (en) | Methods and compositions for genetically detecting improved milk production traits in cattle | |
| JP2008513036A (ja) | マルチプレックスｐｃｒによるｒｈｄ及びａｂｏの遺伝子型決定 | |
| US7655403B2 (en) | CHD7 gene polymorphisms are associated with susceptibility to idiopathic scoliosis | |
| AU2002223498A1 (en) | Genetic test for the identification of carriers of complex vertebral malformations in cattle | |
| US8021845B2 (en) | Probes for detecting obesity gene | |
| Simonet et al. | Sequence analysis of the alpha 1 Na+, K (+)-ATPase gene in the Dahl salt-sensitive rat. | |
| US20150247195A1 (en) | Detecting a brachyspina mutation | |
| ZA200304404B (en) | Genetic test for the identification of carriers of complex vertebral malformations in cattle. | |
| US20030170679A1 (en) | Single nucleotide polymorphisms in GH-1 | |
| US9157119B2 (en) | Methods for diagnosing skin diseases | |
| Everts et al. | Isolation of DNA markers informative in purebred dog families by genomic representational difference analysis (gRDA) | |
| Class et al. | Patent application title: SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS ASSOCIATED WITH BULL FERTILITY Inventors: Hasan Khatib (Fitchburg, WI, US) Hasan Khatib (Fitchburg, WI, US) | |
| JP2004537310A (ja) | インスリン遺伝子の５’隣接領域のアリル異型に基づく肥満の危険性を評価する方法 | |
| JP2012100557A (ja) | 新規遺伝子およびｆｏｎｇ遺伝子座の一塩基多型に基づく骨粗鬆症の検査方法 |