BG107904A - Г...н...'и-...н '...'' за ид...н'и"и-иран... на но'и'...ли на компл...к'ни гръбна-ни мал"орма-ии при ...дър рога' доби'ък - Google Patents

Description

Настоящето изобретение се отнася най-общо до генетично заболяване, наблюдавано при говеда, наречено Комплексна Гръбначна Малформация (CVM). По-специално, изобретението се отнася до молекулни маркери за идентифициране на потенциални носители на CVM при говеда и за идентифициране на CVM генен локус и негови мутации, отговорни за комплексната гръбначна малформация при говеда.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Комплексната вертебрална малформация (CVM) е вродено нарушение на гръбнака, установено в бяла и черна млечна крава, порода Holstein-Friesian (HF). Заболяването е описано наскоро (Agerholm et al., 2000). В Дания, всички диагностицирани към днешния ден случаи (Октомври 17, 2000) са генетично свързани с елитното американско Holstein говедо Carlin-M Ivanhoe Bell. Съгласно последните данни, CVM се явно се унаследява като автономно рецесивно заболяване.

Заболяването се характеризира с вродена билатерална симетрична артрогрипоза на дисталните стави и малформации на правото черво, главно при цервико-торакалната връзка, комбинирано с редуцирано телесно тегло (Agerholm et al., 1994).

Освен това е установено следното: В много случаи цервикалната и/или торакалната част на правото черво изглежда скъсена. Умерена билатерална симетрична контракция на карпалните стави и силна контракция и супинация на фаланго-метакарпалната става са постоянно явление. Контракция и пронация на фаланго-метатарзалната става и слаба екстензия на тарзуса са също общо явление. В повечето случаи се наблюдава един неправилен курс на правото черво около цервико-торакалната връзка. Може да се наблюдава и сколиоза, както и да са налице лезии на правото черво. Неправилното разположение често се разпознава чрез инспекция и палпация на вентралния аспект на правото черво. Обаче, лезиите може да са минимални и ограничени до два или няколко прешлена. В такива случаи правото черво може да бъде с почти нормална дължина. Поради това, радиологично изследване на правото черво се препоръчва за изключване на гръбначни малформации при подозрителни случаи. Спиналната корда е с нормална дължина, разположена в канала на гръбначния стълб без задължително притискане. С помощта на радиологията са установени комплекс от гръбначни малформации, съдържащи полупрешлен, слети или с деформирана форма прешлени, сколиоза и анкиоза в различни степени. Това най-добре се демонстрира след отстраняване на дъгата на прешлена. В някои случаи са налице сърдечни малформации, най-вече като силен интервентрикуларен септален дефект и есцентрична хипертрофия на десния вентрикулум. Може да се наблюдават и малформации на големите съдове. В белите дробове е налице фетален ателектазис. Серохеморагичните течности са най-срещани в торакалната кухина. Наблюдавани са разнообразие от други малформации, но те не са постоянни или общоприети. Често се срещат лезии, дължащи се на дистосия.

w

Малформации са наблюдавани както в абортирани фетуси, така и в преждевременно родени животни и в мъртвородени животни на Tepmina. Случаи сред по-възрастни говеда все още не са наблюдавани. Най-общо, телесното тегло е редуцирано, а телесното тегло е по-ниско в преждевременно родените животни в сравнение с тези родени на термина.

В допълнение, наблюдава се повишена честота на абортите при крави, осеменени със семе на носители на заболяването бикове. Понастоящем причината за това е неизвестна.

Понастоящем, единственото средство за CVM диагностиката е патоанатомичната диагноза, основана на описаното по-горе наличие на Г билатерална симетрична артрогрипоза на дисталните стави и малформации на правото черво, главно при цервикоторакалната връзка, комбинирано с редуцирано телесно тегло. Обаче, симетричните контракции на частите на тялото са обща характеристика на гръбначните малформации при говеда. Поради това, съществуват различни диагностични проблеми, което затруднява диференцирането на CVM от други малформации.

Фактът, че генетичният дефект явно е разпространен от бика Carlin-M Ivanhoe Bell, който е бил използван интензивно по целия свят, прави икономически важно тестването на настоящи или потенциални бикове за разплод с оглед на това дали са носители на дефекта.

С оглед получаване на оценка за честотата на животните, потенциални носители на CVM в популацията Датски говеда, изобретателите са извлекли информация за родословията от Датската национална база за рогат добитък. По времето на извличането на данните (октомври 2000) са регистрирани 919,916 чистокръвни крави и телета, и 169,821 чистокръвни бика и мъжки телета. Bell е установен 707,915 пъти в родословията на кравите и телетата и 161,043 пъти в мъжките. На Таблици 1 и 2 по-долу е показан броят на срещаните Bell във всяко поколение от родословието.

Таблица 1: Срещани Bell в родословията на крави и телета Датски Holstein

Поколения NR	Честота	Процент	Кумулативна честота
2	21240	3.0	21244
3	202460	28.6	223704
4	321043	45.4	544747
5	133956	18.9	678703
6	27307	3.9	706010
7	1869	0.3	707879
8	36	0.0	707915

Таблица 2: Срещани Bell в родословията на бикове Датски Holstein

Поколение	Честота	Процент	Кумулативна честота
2	436	0.3	436
3	20144	12.5	20580
4	82394	51.2	102974
5	44545	27.7	147519
6	12455	7.7	159974
7	1040	0.6	161014
8	29	0.0	161043

Макар тези числа да включват също и някои двукратни и трикратни срещания на Bell в родословията, данните ясно показват, че по-голяма част от говедата Danish Holstein са потенциални носители на CVM. Очевидно проблема е огромен в глобален мащаб.

Така, налице е изключителна заявка от производителите на едър рогат добитък от генетичен тест, който да позволи идентифицирането на животните в различните породи, които са потенциални носители на CVM (т.е. преди установяване на клинични симптоми).

Преди настоящето изобретение, не е било прилагано микросателитно маркиране на гена, причиняващ посочения комплекс гръбначни малформации, които не са били изолирани или охарактеризирани. Така, диагностичният метод съгласно изобретението, описан в повече подробности по-долу, по-рано не е бил предлаган или описван.

Съответно, настоящето изобретение, което включва картиране на локуса на заболяването за CVM, предлага ДНК тест, основан на микросателитни маркери на говеждата хромозома ВТАЗ. Потвърдена е способността на теста да дефинира статуса на носител на животни, произхождащи от Bell , което става очевидно от примерите по-долу.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

В неговия най-широк аспект, настоящето изобретение предлага метод за откриване присъствието на генетичен маркер в обект говедо, свързан с комплексна гръбначна малформация (CVM), включващ етапите на осигуряване на говежди генетичен материал и установяване в генетичния материал наличие или липса на най-малко един генетичен маркер, който е свързан с характерните особености на заболяването комплексна гръбначна малформация при говедата или със специфичен нуклеотиден полиморфизъм, който причинява заболяването комплексна гръбначна малформация.

В следващ аспект, изобретението се отнася до диагностичен кит за използване при установяване присъствието на най-малко един генетичен маркер в обект говедо, който е свързан с комплексна гръбначна малформация при говедата (CVM), включващ най-малко една олигонуклеотидна последователност, избрана от групата, състояща се от SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:34, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:36, SEQ ID N0:37 и SEQ ID N0:38 и комбинации от тях. Освен това, изобретението се отнася до диагностичен метод, включващ диагностичен кит за установяване на G/Т полиморфизъм в говеждия ген SLC35A3, причина за (CVM) при едрия рогат добитък.

ПРИМЕРНО ИЗПЪЛНЕНИЕ И ПРИЛОЖЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

По-подробно изобретението е пояснено с примерно изпълнение, илюстрирано на приложените фигури, където:

-Фиг.1 показва поколението, използвано за намиране местоположението на локуса и халотипа на говеждата комплексна гръбначна малформация на пет микросателитни маркера върху говеждата хромозома 3. Най-вероятните CVM хаплотипове са с плътни букви. Запълнените черни квадрати представляват поразените телета. Двойните линии обозначават инбредната бримка. N се отнася за броя животни. Генотиповете на тринадесетте различни майки за улеснение не са представени.

-Фиг.2 показва генетичната карта на говежда хромозома 3. Броя на страните се отнася до генетичните разстояния, дадени в сентиМоргани (сМ) по продължение на хромозомата. Показане локуса на е най-вероятното разположение на говеждата комплексна гръбначна малформация (CVM).

-Фиг.З показва относителното разстояние в сМ между 3-те микросателитни маркера ILSTS029, BMS2790 и INRA003 (показано на линията, обозначаваща Conting маркера върху говеждата хромозома 3) върху говеждата хромозома 3 както е дадена в US Meat Animal Research Center (Kappes et al., 1997). BACs съдържащи тези 3 маркера са изолирани както чрез хибридизация в репликативни филтри с висока плътност (ILSTS029 и INRA003), или чрез PCR скрининг на RPCI-42 говежда ВАС библиотека (BMS2790). Идентифицираните ВАС са показани в черни ивици и са означени с номер на паничката/номер на ямката. Тези ВАС са подложени на секвениране в краищата с помощта на SP6 и Т7 праймери или за секвениране с помощта на праймери, удължени от микросателита. Получените в резултат последователности се съпоставят с човешката хромозома 1 с помощта на Ensemble Server в центъра на Sanger. Регистрираните номера от проведеното търсене са показани като номера под човешката хромозома 1 и относителните разстояния между съвпаденията са дадени в MB. Избраните гени в участъка са показани в карета.

-Фиг.4 показва сДНК последователността и транслацията на SLC35A3 гена (SEQ ID N0:18) и кодираната amino киселинна последователност (SEQ ID N0:17). Полиморфният нуклеотид в позиция 559 и повлияните валин-180 е означен с уплътнени букви.

-Фиг.5 показва сравнение на дедуцираната amino киселинна последователност на кравешка SLC35A3 с човешка (АВ021981) (Ishida et al.

1999) и кучешка (AF057365) (Guillen et al., 1998) последователности. Точките показват остатъци, които съвпадат последователността на Bos Taurus. Чертичките показват празноти, които са въведени за оптимизиране на деспирализацията.

Фиг.6 показва резултатите, получени от секвенирането на участъка (от нуклеотид 544 до 572 на SLC35A3, виж Фиг.4) които показват G/Т полиморфизма в позиция 559 при определяне на CVM статуса чрез секвениране. Левият и десен панели показват право и обратно секвениране, съответно. Горната редица (-/-) показва секвенирането на дивият животински тип, средната редица показва секвенирането на носителя (хетерозиготен) и най-ниската редица показва съгласуването на поразеното животно.

Фиг.7 е картина, показваща алел-специфичните PCR продукти от два диви типа, два носителя и две болни животни. Анотация: WT: див тип, С: носител, S: болно, neg: негативна контрола, М: маркер. Стрелките показват алелспецифичните PCR продукти: С: 220 Ьр, А: 98 bp, Т: 340 Ьр и G: 288 Ьр.

Един първи обект на настоящето изобретение е възможността да се позволи идентифицирането в едър рогат добитък на говежда комплексна гръбначна малформация (CVM). Това се постига чрез метод, който установява наличието на генетичен маркер, свързан с говеждия CVM в обект говедо. Поспециално, генетичният маркер може да бъде говеждия SLC35A3 ген или дори специфични полиморфизми в говеждия SLC35A3 ген.

Както е използван тук, тергп1път “обект говедо” се отнася до едър рогат добитък от която и да е порода. Така, всеки от различните видове крави или говеда, независимо дали са женски или мъжки, възрастни или новородени са включени в този Tepmin. Един пример за такъв обект е член на популацията от едър рогат добитък Holstein-Friesian.

Терминът “генетичен маркер” се отнася до различни нуклеотидни последователности (полиморфни), които присъстват в говежда геномна ДНК върху хромозомата и която се идентифицира със специфични олигонуклеотиди. Такава вариабилна нуклеотидна последователност е напр. ясно отличима чрез амплификация с нуклеинови киселини и наблюдение на разлика в размера или последователност от нуклеотиди, дължаща се на полиморфизма. В полезни варианти на изпълнение, такива генетични маркери могат да бъдат идентифицирани чрез различни техники, известни на специалиста в областта, и включват типизиране на микросателити или къси тандемни повторения (STR), полиморфизъм дължащ се на рестрикция дължината на фрагментите (RFLP), установяване местата на делеция или инсерция и полиморфна ДНК, резултат от случайна амплификация (RAPD), както и типизирането на единичен нуклеотиден полиморфизъм (SNP) по методи включващи рестрикционна-фрагментарнодължинна-полимеразна верижна реакция, алел-специфична олигомерна хибридизация, олигомер-специфични лигационни изпитвания, гтпписеквениране, директно секвениране, изпитвания за флуоресцентно установяване на 5’екзонуклеаза и хибридизация с РНК и LNA сонди и други. Обаче, следва да се знае, че и други генетични маркери и техники могат да бъдат приложени в съответствие с изобретението.

Както е описано по-горе, “комплексна гръбначна малформация при говеда (CVM) е унаследено гръбначно заболяване. Понастоящем, заболяването е установено само в черни и бели млечни крави порода Holstein Friesian (HF); обаче, констатирано е че и други породи говеда могат да бъдат поразени. Заболяването е описано наскоро от Agerholm et al., 2000. Съответно, в контекста на настоящето, CVM и характеристика на заболяването комплексна гръбначна малформация следва да се схваща като заболяване, водещо до клиничните симптоми, описани по-горе, както е докладвано и определено от Agerholm et al., 2000.

Методът, съгласно изобретението, включва снабдяването с генетичен материал от говедо. Такъв материал включва ДНК материал от говедо, който може да бъде осигурен по който и да е конвенционален метод или средства. Говеждият ДНК материал може например да бъде екстрахиран, изолиран и пречистен от кръв (напр., прясна или замразена), тьканни проби (напр., спленоцити, букални намазки), проби от косми, съдържащи фоликулярни клетки и семе.

Както е описано по-рано, методът от настоящето изобретение по-нататък включва етап на установяване в генетичния материал наличието или липсата на генетичен маркер, който е свързан с характерните особености на комплексна гръбначна малформация при говедата.

С оглед установяване дали генетичният маркер присъства в генетичния материал, могат да бъдат прилагани стандартни методи, добре известни на специалиста в областта, например чрез използването на нуклеиново киселинна амплификация. За определяне дали генетичния маркер е генетично свързан с характеристиките на заболяването комплексна гръбначна малформация, може да се приложи lod отношението. Понякога то се отнася като Z_max, което означава вероятността (логаритъма на отношението от вероятността) локуса на генетичния маркер и локуса на специфичния ген да са свързани на определено разстояние. Отношението lod може, напр. да бъде изчислено чрез прилагане на компютърна програма като MLINK програмата на пакета LINKAGE (Lathrop et al., 1985). Lod отношение, което е по-голямо от 3.0 се счита за значимо доказателство за свързването между генетичния маркер и характерните особености на заболяването комплексна гръбначна малформация или генен локус.

В един от вариантите на изобретението, генетичният маркер е локализиран върху говеждата хромозома ВТАЗ. Участъка на говеждата хромозома ВТАЗ, съдържаща генетичните маркери, които са полезни в метода от настоящето изобретение е обозначен на фиг.2.

Съответно, генетични маркери, локализирани върху говеждата хромозома ВТАЗ в участъка, фланкиран от и включващ полиморфните микросателитни маркери ВМ4129 и BMS1266, могат да бъдат използвани съгласно настоящето изобретение. В един специфичен вариант на изпълнение, най-малко един генетичен маркер е локализиран в участъка от около 59.5 сМ до около 67.9 сМ върху говеждата хромозома ВТАЗ.

В следващ полезен вариант на изпълнение, този най-малко един генетичен маркер е локализиран върху говеждата хромозома ВТАЗ в участъка, фланкиран от и включващ полиморфните микросателитни маркери INRAA003 и BMS937.

В следващ аспект, този най-малко един генетичен маркер е локализиран върху говеждата хромозома ВТАЗ в участъка, фланкиран от и включващ полиморфните микросателитни маркери INRAA003 и ILSTS029.

В друг преимуществен вариант на изпълнение, този най-малко един генетичен маркер е избран от групата, състояща се от микросателитни маркери ВМ4129, INRAA003, BMS2790, ILSTS029, INRA123, ВМ220, HUJ246, BMS862, BMS937, BL1048, MBS2095 и BMS1266.

Както е описано в примерите, този най-малко един генетичен маркер може да бъде присъединен към ген, причиняващ болестта по говедата комплексна гръбначна малформация, Така, в един вариант на изпълнение, този най-малко един генетичен маркер е локализиран върху говеждата хромозома ВТАЗ в участъка, фланкиран от и включващ полиморфните микросателитни маркери

ВМ4129 и BMS1266 и генетично свързан с характеристиката CVM или генният локус за CVM при lod отношение най-малко 3.0, най-малко 4.0, включително най-малко 5.0, най-малко 6.0, включително най-малко 7.0 като най-малко 8.0, включително най-малко 9.0 като най-малко 10.0, включително 11.0, като наймалко 12.0.

Специфичното определяне и локуса на горните полиморфни микросателитни маркери може да бъде намерено в USDA генетичната карта (Kappes et al., 1997).

Следва да се оцени, че с оглед откриване наличието или отсъствието на генетичен маркер, асоцииран с CVM, в съответствие с изобретението могат да бъдат прилагани повече от един генетични маркери, които са показани за информация, при което точността на теста може да се повиши.

Съответно, както е показано на примерите по-долу, в един предпочитан вариант на изпълнение, два или повече от микросателитните маркери INRAA003, BMS2790, ILSTS029, INRA123, ВМ220, HUJ246, BMS862, BMS937 могат да бъдат използвани в комбинация.

В съответствие с изобретението, нуклеотидните последователности на праймерните двойки за амплификация на посочените микросателитни маркери са описани на таблица 4 по-долу.

Сравнителните карти (Solinas-Toldo et al., 1995) показват, че по-голямата част от говеждата хромозома ВТАЗ съответства на част от човешката хромозома 1 (HSA1). Генетичната карта на CVM локуса, представена тук, прави възможно използването на информация, достъпна за човешките гени и концентрирането на проучването за кандидат гена спрямо гените, представени в човешката хромозома 1. Това много ще ограничи броя на кандидат гените и ще улесни сърча за причиняващите CVM гени.

Генетичните маркери от настоящето изобретение могат да бъдат съставени с помощта на различни методологии, известни на специалистите в областта. Така, следва да се разбира, че със знанията представени тук, нуклеотидните последователности от описаните по-горе полиморфни микросателитни маркери на говеждата хромозома ВТАЗ са идентифицирани като генетично свързани кам CVM генния локус, като освен това от известните последователности или означените локализации върху говеждата хромозома ВТАЗ могат да бъдат генерирани допълнителни маркери за използване в метода от настоящето изобретение.

Например, с помощта на картата, илюстрирана на фиг.2, CVM участъка от говеждата хромозома ВТАЗ може да бъде подложена на микродисекция, и фрагментите да бъдат клонирани във вектори за изолиране на ДНК сегменти, които могат да бъдат тествани за свързване с CVM генния локус. Обратно, с нуклеотидните последователности, предложени на Таблица 4, от CVM участъка могат да бъдат получени изолирани ДНК сегменти чрез нуклеиново киселинна амплификация (например, полимеразна верижна реакция) или чрез нукпеотидно секвениране на релевантния участък на говеждата хромозома ВТАЗ (“хромозомна разходка”).

Съответно, описаната по-горе хомоложност между говеждата хромозома ВТАЗ и човешката хромозома 1 (HSA1) показва, че който и да е ген или експресирана Бвенционна опашка, която е картирана в този аналогичен участък в човешка хромозома, може също да бъде картирана за CVM участъка от говеждата хромозома ВТАЗ. Така, гените или консервативните последователности, които са картирани за човешката хромозома HSA1, може да бъде анализирана за свързване към CVM генния локус с помощта на рутинни методи.

Генотипирането е основано на анализа на геномната ДНК, която може да бъде осигурена чрез използване на стандартни ДНК екстракционни методи, както са описани тук. Когато геномната ДНК е изолирана и пречистена, може да се използва нуклеиново киселинна амплификация (напр. полимеразна верижна реакция) за амплифициране участъка на ДНК, съответстваща на всеки генетичен маркер за използване в анализа за откриване наличието на говежди субект на генетичен маркер, изолиран с CVM. Съответно, един диагностичен кит за използване в такъв вариант на изпълнение включва, в отделна опаковка, наймалко една олигонуклеотидна последователност, избрана от групата, състояща се от SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:34, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:36, SEQ ID N0:37 и SEQ ID N0:38, и комбинации от тях.

Идентифициране на мутация в говеждия SLC35A3 ген, причина и обект за диагностика за С УМ в едър рогат добитък

След като вече е установена геномната локализация на CVM гена, може да се проведе търсене за идентифициране на структурния ген и се предизвиква мутация, която се използва като ултимативен генетичен маркер CVM.

Идентифицира се човешкият геном, споделящ ввенционна хомология с CVM участъка, дефиниран като участъка между маркерите INRA003 и ILSTS029. Маркера BMS2790 е локализиран в този интервал (фиг.1). Отначало, 5 различни клона от говежда ВАС библиотека (RPCI-42), конструирана и достъпна със съдействието на Р. De Jonge и сътрудници) се идентифицират, като всеки от тях поражда един от маркерите INRA003, ILSTS029 или BMS2790. Използвайки секвенционната информация, получена от тези ВАС клонове, с помощта на програмата BLASTN на основата на обществени ввенционни бази данни, се идентифицира единичен участък от човешката хромозома 1, която съдържа участък на хомология с маркур-съдържащите ВАС, Този участък обхваща приблизително 6 милиона бази двойки и се локализира в апроксимална позиция 107.4-113.5 (фиг.З) (ENSEMBL viewer, The Sanger Centre).

Изолиране и секвениране на SLC35A3 сДНК

На базата на хомоложно съгласуване на гена SLC35A3 между homo sapiens и canis familiaris, са конструирани 2 олигоса (SL1F и SL8R за амплификация на почти цялата сДНК за говеждия SLC35A3 ген, включително старт кодона. PCR се провежда върху сДНК, изолирана от сърдечни тъканни проби, събрани от диви животни, CVM носител, и поразено животно, съответно. За получаване на последователност от 3’-края на гена, полученият PCR фрагмент се секвенира и се конструира нов олиго фрагмент (SL5F). За амплифициране на 3’-края на SLC35A3, SL5F се използва в комбинация с един олиго (bSLCBVIR), създаден с помощта на публикувана последователност на частичен говежди EST (генна банка dbEST). СДНК последователността (SEQ ID NO: 18) и транслираната пептидна последователност (SEQ ID NO: 17) на говежда SLC35A3 е показана на фиг.4. Протеина, кодиран от говежди SLC35A3 съдържа 326 amino киселини и споделя хомологията на семейство от по-рано известни протеини, включени в транспорта на нуклеотидните захари от цитозола в лумена на Голджиевия апарат. Съгласуването на фиг.5 показва хомологията на SLC35A3 протеини, описани по-рано за хора (Ishida et al., 1999) и кучета (Guillen et al. 1998).

Установяване на полиморфизъм в гена SLC35A3

За установяване на потенциални полиморфизми в говеждия SLC35A3 ген, се провежда PCR амплификация на гена с помощта на сДНК, изолирана от сърдечни тъканни проби, събрани от носител на CVM и едно поразено животно, съответно. Съгласуването на фрагмента, изолиран от поразено животно показва последователност, идентична на дивия тип, с изключение за поразеното животно, което е хомозиготно за нуклеотид Т в нуклеотидна позиция 559, сравнено с дивото животно, което е хомозиготно за G в съответната позиция (виж фиг.4). Съгласуването на сДНК от едно животно, което носи СУМ-дефекта показва, че това животно е хетерозиготно с Т и G в позиция 559.

Промяната на G в Т в позиция 559 повлиява последователността на получения пептид с промяна на валина в позиция 180 до фенилаланин (фиг.4).

Типизиране на SLC35A3 полиморфизма чрез изпитване, основано на ДНК секвениране

Фиг.6 показва резултатите, получени от съгласуване на PCR фрагмент, амплифициран от геномна ДНК и включващ участъка (от 544 до 572 от SLC35A3 сДНк, за номерирането виж фиг.4), който съдържа G/Т мутацията. Левият и десен панели показват право и обратно съгласуване, съответно. Горната стрелка (отбелязана с -/-) показва дивият тип резултат, показващ G в полиморфичната позиция с помощта на възходящо съгласуване и С в аналогична позиция в другата верига с помощта на обратно съгласуване (отбелязано със звездички). Горната стрелка +/+ показва резултатите от едно поразено теле, демонстриращо Т в полиморфната позиция с помощта на възходящо съгласуване и А в аналогична позиция в другата верига с помощта на обратно съгласуване (отбелязано от звездички). Хетерозиготността (+/I) е показан в средния панел и очаквано се проявява като смес от дивия тип и повлияния сигнал, като по този начин има както Т, така и G сигнал с помощта на възходящо съгласуване и един А и един С сигнал в другата верига.

Всички телета, поразени от CVM са хомозиготни за Т-алела

Генотипизирането на 39 телета, поразени от CVM се провежда чрез съгласуване на PCR продукт, амплифициран от геномна ДНК (виж Фиг.6 и Пример 6). Всички животни са хомозиготни за Т-алела, потвърждаващ изходните резултати.

Т-алела не се установява в животни, неродствени на Bell

Доколкото телета, поразени от CVM са докладвани само за поколения, съдържащи широко използваният бик Bell, изследвано е дали Т-алела присъства в животни, неродствени на Bell. С помощта на преимуществата, които дава базата данни за Датски едър рогат добитък, са идентифицирани и са взети проби от 496 животни от порода Holstein без Bell. Генотипизирането на тези животни се провежда чрез секвениране на PCR продукт, амплифициран от геномна ДНК (виж Фиг.6 и Пример 6). Нито едно от тези животни не съдържа Талела, което предполага, че този алел е установен изключително в линията от животни, тясно родствени на Bell.

Чрез секвениране са генотипизирани повече от 326 неродствени (наймалко за последните три поколения) животни от 12 различни породи. Всички тези животни са хомозиготни за дивия тип алел (G-алел), което отново демонстрира липсата на CVM-свързан алел (Т-алел) в общата популация на едър рогат добитък.

Типизиране на SLC35A3 полиморфизма чрез едно алел-специфично PCR изпитване (AS-PCR)

С оглед ефективно типизиране на G/Т полиморфизма, се осъществява едно алел-специфично PCR изпитване с помощта на BIOLASE Diamond DNA полимераза от Bioline. Тази полимераза изисква едно перфектно съвпадение на З’края на праймера спрямо матрицата, и несъвпадението в тази позиция ще доведе в липса (или много слаба) на амплификация. По този начин, става възможно да се отличат дивият тип, носителя или болното животно чрез идентифициране присъствието или отсъствието на алел-специфични PCR продукти (Фиг.7). Лявата част от Фиг.7 показва алел-специфичните PCR продукти от кодиращата верига. Както се очаква, дивите животни показват амплификация с G-специфичния праймер, но и не с Т-специфичния праймер. Носителите показват амплификация както на G, така и на Т-специфичните праймери, докато болните животни показват само амплификация при Тспецифичния праймер. Дясната част показва алел-специфичните PCR продукти от не-кодиращата верига, и както се очаква, образците са еднакви с кодиращата верига. Дивият тип животни са хомозиготно С, носителите са хетерозиготни С/А, и болните животни са хомозиготно А.

От описаните по-горе резултати за използване на позиционален генен подход, идентифициран е говежди ген, който е хомоложен на човешкия ген

SLC35A3, кодиращ иОР-М-ацетилглюкозат1пов транспортер. В рамките на този ген е идентифициран G/Т полиморфизъм, който променя аггнпокиселинната последователност на протеина. Всички анализирани поразени телета (39) са хомозиготни за Т-алела (Т/Т), а всички известни носители (108) са хетерозиготни за полиморфизма (G/Т). Анализът на повече от 500 животни от порода Holstein, избрани като неродствени на Bell, не можа да идентифицира нито едно животно, носещо Т-алела. Повече от 1500 животни са анализирани, притежаващи Bell в поколението без да бъде намерено нито едно непоразено животно, което да е хомозиготно за Т-алела. Нещо повече, анализирани са повече от 300 животни, избрани от 12 различни породи, при които не е установен Т-алел в което и да е от тези животни. Взети заедно, тези резултати описани в настоящата заявка за изобретение показват, че Т-алела присъства като единично копие в животни, които са носители на CVM и в две копия в животни, поразени от CVM. Поради това, установяването на Т-алел в позиция 559 (номериране от Фиг.4) е диагностично за CVM и е идеален за установяване на носители на CVM дефекта.

След като G/Т полиморфизма е идентифициран като причина за CVM, всеки генетичен маркер тясно свързан с този полиморфизъм може да бъде диагностичен за CVM в говежда популация. Съответно, настоящето изобретение описва метод за идентифициране на субекти говеда, както поразени от CVM или носители на CVM чрез определяне присъствието на G/Т полиморфизъм в позиция 559 от говеждия SLC35A3 ген, така и индиректно чрез анализ на които и да са генетични маркери, като микросателитите, описани тук, куплирани към говеждия SLC35A3 ген или директно чрез анализ на последователността на говеждия SLC35A3 ген, напр. както е описано по-горе и в повече детайли в примерите.

В обхвата на настоящето изобретение поради това е включен метод за откриване и/или количествено определяне присъствието на генетичен маркер, свързан с говежди CVM, така че да бъде възможно идентифицирането на поразени от CVM животни или носителите на CVM. Етапите на метода включват:

а) осигуряване на говежди генетичен материал, и

б) установяване, в такъв генетичен материал, наличието или отсъствието на най-малко един генетичен маркер, който е свързан с характерните белези на болестта по говедата комплексна гръбначна малформация.

Най-малко един генетичен маркер е свързан към ген, причиняващ болестта говежда CVM, като този ген е идентифициран като говежди SLC35A3 ген, който кодира говеждия SLC35A3 протеин, включващ една amino киселинна последователност както е показана на SEQ ID NO: 17.

По-специално, настоящето изобретение се отнася до метод за установяване на говежда CVM, където генетичният маркер е единичен нуклеотиден полиморфизъм в позиция, еквивалентна на нуклеотид 559 от SEQ ID NO: 18, като посочения полиморфизъм представлява G/Т полиморфизъм.

Настоящето изобретение по-нататък описва едно ефективно изпитване за генотипизиране на наличния полиморфизъм с помощта на алел-специфична PCR. Това е само един от методите за типизиране на SNPs, като другите методи, които могат да бъдат използвани включват, но не се ограничават до, т1пи-секвениране, праймерна екстензия, пиро-секвениране, PCR-RFLP, алелспецифична кръгова амплификация, праймерна екстензия, последвана от MALDI-TOF масова спектрометрия, както и широк кръг от други ензимни и основани на хибридизацията методи.

Фенотипно сходна CVM е показано, че съществува в мишки, мутирали в гена lunatic fringe (Evrad et al., 1998). Подобно на телета, поразени от CVM, мишка хомозиготна за нулева мутация в lunatic fringe проявява една променена соматична сегментация и получаване на образци, със съкратена телесна ос, вертебрални и ребрени фузии и непълно формиран гръбнак (Evrad et al., 1998). Гена lunatic fringe изглежда че участва в определянето на граничното формиране и получаването на соматични проби чрез модулиране на активността на ноч-рецептори (Klein and Arias, 1998; Moloney et al., 2000, Bruckner et al., 2000). Ноч-модулиращата активност изглежда е медиирана от една М-ацетилглюкозат1Пил-трансферазна активност на Fringe, която в апарата на Голджи инициира елонгирането на О-свързаните фукозни остатъци към EGFподобните ввенционни повторения на Noch (Moloney et al., 2000; Bruckner et al., 2000).

По-нататък, тъй като говеждият SLC35A3 ген е хомоложен на човешкия SLC35A3 ген, задължително е, с информацията дадена тук, да се анализира кодиращата последователност на човешкия SLC35A3 ген за причинните и диагностични мутации при изследване на човешките дефекти на развитието, поспециално включващите соматично сегментиране и изготвяне на образци.

Ефектът на мутация в локализиран в апарата на Голджи Nацетилглюкозапъпил транспортер (SLC35A3), който повлиява прехвърлянето на N-ацетилглюкозатша от цитозила в лумена на Голджи се очаква да отдели семейството протеини Fringe от техния субстрат. Това ще повлияе способността на Fringe да модулира Noch активността и по този начин да причини сегментационен дефект като CVM. Поради това изглежда, че мутацията в SLC35A3, освен че е диагностична за CVM, е мутация, причиняваща широко разпространен диагностичен дефект.

По-нататък изобретението се илюстрира подробно със следните примери:

Пример 1: Генетична карта на комплексната гръбначна малформация (CVM)

Този пример илюстрира локализацията на CVM генния локус при говеждата хромозома ВТАЗ. В допълнение, този вариант на изпълнение описва идентификацията на маркери, свързани към CVM генния локус, и по този начин характеризирането на CVM участъка от говеждата хромозома ВТАЗ.

С оглед катиране на локуса, отговорен за CVM, се получават проби от животни, участващи в селекционно изследване. Накратко, приблизително 300 крави и телета, прозхождащи от бик Т Burma и осеменени със семе от бика KOL Nixon са избрани за селекционното изследване. Тринадесет поразени телета са избрани на базата на постмортално изследване, както е описано от Agerholm et al., 2000. Тези 13 телета, както и техните родители, общо 28 животни, са използвани за изходното геномно сканиране. Телетата се разпределят на 4 поколения спрямо техния общ родител, чистокръвният бик Cariin-M Ivanhoe Bell.

Геномното сканиране се осъществява, покривайки всички 29 автозоми, с помощта на комплекс от микросателитни маркери, взети от USDA геномната карта (Kappes et al., 1997). Маркерите са избрани с разстояние, подобно на двойките от 10 и 20 сМ. В съмнителни участъци, дължащи се на ниска маркерна информативност, нови маркери са включени и типизирани. Общо са използвани 194 маркери. Провеждат се PCR реакции в дуплекси в обем от 5 μΙ в един ΑΒΙ 877 PCR робот (Applied Biosystems), съдържащ 12 ng геномна ДНК, 1х PCR буфер, 0.4 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), 20 pmol от всеки праймер и 2.0 mM MgCh- Всички маркери се пропускат при еднакви PCR условия: инкубация при 94°С за 12 min за активиране на ензима, 35 цикли при 94°С, 30 s; Та, 45 s; 72 °C, 20 s, завършвайки с финална екстензия при 72°С за 10 min. Първите 10 цикъла Та нараства от 65°С до 58°С , един градус за всеки цикъл, и останалите 25 цикъла Та се фиксират при 58°С . PCR продуктите се отливат и 5 до 9 различни маркери се пропускат във всяка линия на ABI 377 (Applied Biosystems) и теловете се анализират с подходящ софтуер. Апелите се определат с Генотипната програма (Версия 2.1, Applied Biosystems).

За три маркера се изчисляват двуточкова степен на логаритмуване с помощта на MLINK програмата на пакета LINKAGE (Lathrop et al., 1985). Благодарение на структурата на поколението (Фиг.1) с множество инбредни бримки, то е разделено на тринадесет малки семейства, едно от всяко поразено теле включващоз51ге (Koi Nixon), майката и майчиния предшественик (Т Burma). Заболяването се счита рецесивно унаследено с пълно проникване на генотипа.

Значително свързване е установено за всичките три маркера. Найголямата степен на логаритмуване Z е наблюдавана с BMS2790 и ILS029 със Z«10.35 при θ=0. Нещо повече, най-близкият маркер INRA003 е също значително свързан с CVM локуса (Таблица 3).

Таблица 3

Двуточкови степени на логаритмуване (Ζ) и рекомбинантни фракции (Θ) от анализа на свързване на CVM локуса и маркерите на говеждата хромозома 3.

Маркер	Рекомбинантна фракция (Θ)	Степен на логаритмуване (Ζ)
BMS2790	0.00	10.35
INRA003	0.03	6.44
ILSTS029	0.00	10.35

Резулатите по-горе показват CVM локуса за ВТАЗ (Фиг.2) съгласно генетичната карта USDA (Kappes et al., 1997).

Единадесет телета са хомозиготни за интервалите, определени чрез 1NRA003, BMS2790, ILSTS029, BMS862 и HUJ246, докато BMS2790 и ILSTS029 самостоятелно са хомозиготни във всички тринадесет телета както е показано на Фиг.1. Възможно е да се конструират хаплотипове на тези маркери, което позволява да бъдат предположени възможно най-сходния хаплотип (Фиг.1). Хаплотиповете са определени по размера на маркерните алели, които са номерирани от 1 до η, където 1 определя най-късия алел от амплифицирания маркер и η дефинира най-дългия алел. Актуалната дължина на апелите, свързани с CVM в Bell е както следва:

INRA003 (алел номер 3): 176 двойки бази BMS2790 (алел номер 3): 118 двойки бази ILSTS029 (алел номер 2): 164 двойки бази BMS862 (алел номер 1): 130 двойки бази HUJ246 (алел номер 3): 262 двойки бази

Актуалната дължина на апелите е в зависимост от праймерите, използвани за амплифициране на маркера и дължината на фрагментите, показани по-горе е основана на използването на праймерите, описани на

По-нататък, в изследването се включват седемнадесет допълнително поразени телета, от които е взета проба като част от Датската програма за генетични дефекти. Всички поразени от заболяването животни имат Bell от чистопороден бик като прародител. ДНК се екстрахира от кръвни проби или семе с помощта на стандартни процедури.

Седемнадесетте телета и техните майки се подлагат на генотипизиране с 8-те маркера INRA003, BMS2790, ILSTS029, ВМ220, INRA123, BMS862, BMS937 и HUJ246, покриващи участъка върху ВТАЗ от приблизително 59.5 сМ до 67.9 сМ, и доколкото CVM гена в допълнителни 17 телета, като изходното селекционно изследване, се предполага че произхожда от общ родител бика Bell, се очаква да съществува сходен участък на идентичност по произход (IBD) във всички поразени телета. Това показва, че: в 17 от 17 телета хромозомния сегмент, дефиниран от INRA003 и BMS2790 има хомозиготност, споделяща същите алели като животните от селекционното изследване. В две от 19-те животни се наблюдава хетерозиготност в ILSTS029 и BMS862 локуса, което се обяснява с единични рекомбинационни събития между BMS2790 и ILSTS029. Така, на основата на комбинираните резултати от генотипизирането бе установено, че CVM генетичният дефект е локализиран най-вече в интервал помалък от 6 см, фланкиран от маркерите INRA003 и ILSTS029, както е показано на Фиг.2 и означен “CVM участък”.

Последователностите на праймерите за приложените 8 маркера INRA003, BMS2790, ILSTS029, ВМ220, INRA123, BMS862, BMS937 и HUJ246 са показани на Таблица 4 по-долу.

Таблица 4

Генетичен маркер	Последователност на праймерите	SEQ ID NO
INRA003	F: CTG GAG GTG TGT GAG ССС CAT ТТА R: СТА AGA GTC GAA GGT GTG ACT AGG	SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2
BMS2790	F: AAG АСА AGG ACT TTC AGC CC R: AAA GAG TCG GAC ATT ACT GAG C	SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO; 4
ILSTS029	F: TGT TTT GAT GGA ACA CAG CC R: TGG ATT TAG ACC AGG GTT GG	SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
INRA123	F: TCT AGA GGA TCC CCG CTG AC R: AGA GAG CAA CTC CAC TGT GC	SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
ВМ220	F: TTT TCT ACT GCC CAA CAA AGT G R: TAG GTA CCA TAG CCT AGC CAA G	SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
HUJ246	F: ACT CCA GTT TTC TTT CCT GGG R: TGC CAT GTA GTA GCT GTG TGC	SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12
BMS862	F: TAT AAT GCC CTC TAG ATC CAC TCA R: ATG GAA AAA TAA GAT GTG GTA TGT G	SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14
BMS937	F: GTA GCC ATG GAG ACT GGA CTG R: CAT TAT CCC CTG TCA CAC ACC	SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16

Пример 2: Диагностичен тест за идентифициране на носители на CVM

Диагностичен тест за определяне носителите на CVM в говеда се установява чрез определяне на това дали поколения от Bell са носители на свързаният със заболяването халотип.

Тестът се основава на 8-те микросателитни маркери INRA003, BMS2790, ILSTS029, ВМ220, INRA123, BMS862, BMS937 и HUJ246 и се опира на разпознаването на специфичните за заболяването алели ил хаплотип (Фиг.1) в животни, произхождащи от Bell.

Поради това животните се определят като носители ако имат унаследени свързани със заболяването алели в участъка, определен от маркерите INRA003, BMS2790, ILSTS029 и ВМ220 от Bell или от животни, произхождащи от Bell. Ако животните не са наследили свързания със заболяването хаплотип от Bell или от животни, произхождащи от Bell, те се определят като не-носители. В случаите когато хаплотипа Bell е отстранен чрез рекомбинация, животните се означават като неопределими. Четирите допълнителни маркера се използват само когато съдържанието на информацията в тест маркерите се понижава благодарение на неспособността за отличаване между майчината и бащина наследственост.

Като всички диагностични генетични тестове, основани на свързани ДНК маркери, CVM теста страда от недостатъка, че двойното рекомбинантно събитие (едно събитие от всяка страна на причиняващия ген, между гена и фланкиращите маркери) не може да бъде открито. В настоящия случай, това събитие ще бъде изключително рядко благодарение на тясната връзка между маркерите и CVM гена и надеждността на теста се установява като по-висока от 99%.

Пример 3: Тъканна дисекция и изолиране на РНК и сДНК синтеза

Приблизително 5 грама сърдечна тъкан се дисецира от мъртвородени телета в рамките на 3 h от доставянето, незабавно се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80°С. РНК се изолира с помощта на кит за изолиране на РНК от Stratagene (cat. 200345).

СДНК се синтезира чрез смесване на 2.5 цд тотална РНК с 1μΙ олиго (dT)i2 .18 (500 μg/ml), 1 μΙ 10 mM dNTP и Н₂О за получаване на краен обем от 12 μΙ. Получената в резултат смес се нагрява при 65°С за 5 min, охлажда се върху лед и се центрофугира за кратко време. След добавянето на 4 μΙ 5х буфер с първата верига, 2 μΙ 0.1 DTT и 1 μΙ Н₂О, съдържанието се смесва и инкубира при 42°С за 2 min, след което се добавя 1 μΙ (200U) Superscript II (GibcoBRL® Lifetechnologies) и инкубацията се оставя да продължи при 42°С за 1.5 h. Реакцията се инкубира при 70°С за 20 min с 1 U РНаза Н (Roche Molecular Biochemicals).

Пример 4: Секвениране на SLC35A3:

На базата на хомоложност на гена SLC35A3 между homo sapiens и canis familiaris, 2 олигоса (SL1F и SL8R) са определени за амплификация на почти пълната сДНК за говежди SLC35A3, включително старт кодона. За получаване на 3’ края на гена, получения PCR фрагмент се секвенира и се конструират нови олигоси (SL5F). За амплифициране на 3’ края на SLC35A3, SL5F се използва в комбинация с един олиго (bSLCBVIR), основан на публикувана последователност за говежди EST.

Същите PCR условия се прилагат за двата праймерни комплекта.

PCR реакциите се осъществяват в GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) в краен обем от 10 μΙ, състоящ се от 1 μΙ 10χΝΗ₄ реакционен буфер, Г 0.5 μΙ от 50 mM MgCI₂, 0.8 μΙ dNTPs (2.5 тМ от всеки), 5.65 μΙ Н₂О, 1 μΙ обратен и прав праймер (5 рмо! от всеки) и 0.05 μΙ от 5 U/μΙ BIOTAQ ДНК полимераза (Bioline).

PCR реакцията се състои в един начален етап на термична активация при 95° С за 30 SHfln (0. 5° С понижение) и удължение за 20 вунди при 72° С, плюс допълнителни 30 цикъла с денатурационен етап при 72° С за 30 вунди.

За амплифициране на пълната SLC35A3 сДНК се използват следните праймери:

SL1F: 5-GGA GGC AAA TGA AGA ТАА ААС-3’ (SEQ ID N0: 19)

SL8R: 5’-СТА TGC ТТТ AGT GGG АТТЗ-* (SEQ ID NO: 20)

SL5F: 5’-GAG TTG CTT TTG TAC AGT GG-3’ (SEQ ID NO: 21) bSLCBVIR: 5’ ACT GGC TAC TAT CTA GCA CAG GA-3’ (SEQ ID NO: 22)

Пълната сДНК последователност се получава чрез прилагане на тези праймери в четири отделни цикли на реакции за секвениране с помощта на пречистени PCR продукти като матрица. PCR продуктите се пречистват с помощта на SPIN-X® (Corning Incorporated) от 0.8% агарозен гел Seakem.

Циклите на реакциите за секвениране се провеждат в GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) и включват един начален етап при 96°С за 2 min, последвано от 99 цикъла от 96°С за 10 вунди, 55°С за 5 зунди и 60°С за 4 min. Звенционните продукти се преципитират с два обема етанол и 1/10 обем от 3 М NaAc (pH 5.5), промиват се с 70% етанол, ресуспендират се в 5 μΙ буфер за натоварване и се пропускат върху 4% акриламидни ввенционни гелове с помощта на автоматичен ввенатор ABI377.

Последователността на сДНК на говежди SLC35A3 е показана на Фиг.4 (SEQ ID NO: 18).

Пример 5:Идентифициране и изолиране на ВАС, съдържащи микросателитни маркери

Последваща хибридизация

Филтрите се прехибридизират в хибридизационен разтвор (6 х SSC (52.6 g NaCI, 26.46 g натриев цитрат за литър), 5х Denhardt (2 g FucoIl (тип 400, Pharmacia), 5 х поливинилпиролидон, 5 g говежди серумен албугтнп (Фракция V, Sygma), 0.5% SDS 50 gg/ml SS-ДНК) при 65°С за 3 h с ротация. 100 μΙ от S’крайния маркиран олигонуклеотид след това се инкубира с филтрите за 16 h при 65°С. За крайното маркиране, 5 pmol олигонуклеотид се комбинира с 5 μΙ (50 μθϊ) гама-³²Р-АТФ (специфична активност > 5000 Ci/mmole), 2 μΙ 10 х киназен буфер, 11 μΙ Н₂О и 1 μΙ (10 U) от Т4 полинуклеотид киназа (New England Biolabs Inc.), и сместа се инкубира при 37°С за 1.5 h, последвано от 5 min варене за термично инактивиране на ензима. Маркираната сонда е преципитирана с NaAc/етанол с помощта на стандартни процедури, и след промиване с 70% етанол, сондата отново се разтваря в 100 μΙ Н₂О. След хибридизация, филтрите се промиват еднократно с разтвор за промиване I (2xSSC, 0.2% SDS) и двукратно при 65°С с разтвор за промиване II (0.1 х SSC, 0.5% SDS), и се експонира на филм Kodak ВЮМАХ™ за 2 дни при 80°С.

Следните 5’-белязани олигонуклеотиди се използват за идентифициране на ILSTS029 и INRA003 позитивни ВаС клонове:

ILSTS029 олиго: 5’-САС ACC GCT GTA CAG GAA AAA GTG TGC САА ССС TGG ТСТ AAA TCC AAA ATC CAT TAT СТТ CCA AGT АСА Т-3’ (SEQ ID NO: 23)

INRA003 олиго: 5’-CGT ССС CTA TGC GCT TAC TAC ATA CAC TCA AAT GGA AAT GGG AAA ACT GGA GGT GTG TGA GCC CCA TTT A-3’ (SEQ ID NO: 24)

PCR скрининг на говежда ВАС библиотека

ВАС проби се изготвят от ВАС библиотека и се скринират с PCR. PCR реакцията се осъществява в GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystem) в краен обем от 10 μΙ, състоящ се от 1 μ110 х ΝΗ₄ реакционен буфер, 0.5 μΙ 50 mM

MgCI₂, 0.8 μΙ dNTPs (2.5 mM от всеки), 5.65 μΙ Н₂О, 1 μΙ прав и обратен праймер (5 pmol от всеки) и 0.05 μΙ 5 U/μΙ BIOTAQ ДНК полимераза (Bioline).

За идентифициране на BMS2790 съдържащ ВАС клонове чрез PCR са използвани следните праймери:

BMS2790F: 5-AAG АСА AGG ACTТТС AGC СС-3’ (SEQ ID NO: 25) BMS2790R: 5’-ААА GAG TCG GAC ATT ACT GAG C-3’ (SEQ ID NO: 26)

PCR реакцията се състои от един начален етап на активиране при 95°С за 2 min, последвано от 10 цикъла денатурация за 30 s при 95°С, деспирализация при 70°С за 30 s (0.5°С понижение) и елонгация за 20 s при 72°С, плюс допълнителни 30 цикъла с денатурационен етап при 95°С за 30 s, деспирализация при 65°С за 30 s и елонгация при 72°С за 20 s.

Изолиране на ВАС ДНК и секвениране:

ВАС ДНК се изготвя съгласно Qiagens Large Construct Kit, и приблизително 1 pg ВАС ДНК се използва като матрица за циклично секвениране с кит BigDye™ Terminator Cycle Sequencing (PE Applied Biosystems). Реакциите на циклично секвениране се провеждат в краен обем от 6 μΙ, съдържащ 1μΙ BigDye™ Terminator смес, 1 μΙ от праймера (4 pmol), 1μΙ реакционен буфер и 2μΙ вода. Реакциите на циклично секвениране се провеждат в GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystem)n включват един изходен етап при 96°С за 2 min, последвано от 130 цикъла при 96°С за 10 s, 55°С за 5 s и 60°С за 4 min. Бвенционните продукти преципитират с два обема етанол и 1/10 обем ЗМ NaAc (pH 5.5), промиват се със 70% етанол, ресуспендират се в 2 μΙ буфер за натоварване и се пропускат върху 4% акрилатю ввенционни гелове с помощта на автоматичен секвенатор ΑΒΙ377.

Секвенционни праймери:

Т7: 5’-ТТА ТАС GAC ТСА СТА TAG GG-3’ (SEQ ID NO: 27) SP6: 5’-ATT TAG GTG АСА CTA TAG-3’ (SEQ ID NO: 28) INRA003F: 5-CTG GAG GTG TGT GAG CCC CAT TTA-3’ (SEQ ID NO: 29) INRA003R: 5’-CTA AGA GTC GAA GGT GTG ACT AGG-3’ (SEQ ID NO: 30)

Пример 6: Определяне на CVM статус чрез секвениране

PCR реакции (проба от 2 μΙ преметена матрична геномна ДНК, 2 μΙ от 10 х PCR буфер, 2 μΙ от 25 mM MgCI₂, 3.3 μΙ от всеки dNTP (Ultrapure dNTP, 27-203301; Amersham Pharmacia Biotech), 6 pmol праймер (възходящ: CBFEX1, 5’-GGC CCT CAG ATT CTC-3’ (SEQ ID NO: 31); обратен: CBTEXR, 5’-GTT GAA TGT TTC TTA-3’) (SEQ ID NO: 32, 0.165 u Taq полимераза (Biotaq, M95801B; Bioline), dH₂O и тотален обем) се осъществява в свободни на масло 96-ямкови пластинки на Primus НТ (MWG Biotech AG). Условията на привеждане на циклите са: 95°С 120 sec, 35 х [95°С 30 sec, 60°С 30 sec, 72°С 110 sec]. Пост-реакционното пречистване се осъществява чрез гел-филтрация (Millipore Filtration System) Sephadex G-50 Superfine (17-0041-01, Amersham Pharmacia Biotech) осъществяван съгласно препоръките на производителя, с помощта на 50 μΙ dH₂O за финалната елуация на пробата. Правите и обратни ввенциони реакции се провеждат със същите праймери както са използвани за генерирането на PCR продукта (2 μΙ PCR продукт, 8 μΙ ввенционна смес, 0.6 μΙ 6 pmol праймер (виж погоре), dH₂O 20 μΙ; DYEnamyc ЕТ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (US81095). След термоциклирането (30 x [95°C 20 s, 55°C 15 s, 60°C 70 s]) пробите се пречистват c гел филтрация както е описано по-горе и се анализира върху МедаВАСЕЮОО (Amersham Pharmacia Biotech) с помощта на LPA матрикс и при следните секвенционни условия: 90 s инжектиране при 3 kV и 35 min време на пропускане при 9 kV.

Пример 7: PCR алел-специфично изпитване:

Праймерите са конструирани от сДНК последователността и четирите алел-специфични праймера са конструиране така, че да имат 3’-базата в мястото на мутацията.

Праймерна последователност:

T_fwd: 5’-CAG TGG ССС ТСА GAT ТСТ CAA GAG СТТ ААТ ТСТ AAG GAA

СТТ ТСА GCT GGC ТСА CAA TTT GTA GGT СТС ATG GCA Т-3’ (SEQ ID NO: 33)

G_fwd: 5 -САС ААТ TTG TAG GTC ТСА TGG CAG-3’ (SEQ ID NO: 34)

A_rev: 5’-GCC ACT GGA AAA ACA TGC TGT GAG AAA-3’ (SEQ ID NO: 35)

C_revjink*: 5’-aaa get act att agt aga att gat gcc acc ttt tea get cgc gcc cca aat gaa aat ata get aaa cag gtt att gac cat ttg ega aat gta tot aat ggt caa act ttt ttC TGG AAA AAC ATG CTG TGA GAA C-3’ (SEQ ID NO: 36)

Fwd: 5’-GGC CCT CAG ATT CTC AAG AGC-3’ (SEQ ID NO: 37)

Rev: 5’-CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG-3' (SEQ ID NO: 38)

Праймерът C_rev_link съдържа линкерна последователност от фага М13 (показана е малки букви). Този линкер се добавя за получаване на по-дълъг PCR продукт е оглед мултиплициране на С-и А-праймерите в една PCR реакция. 3’базата в позицията на една мутация е показана с плътни букви. С-и Gпраймерите са специфични за дивият тип алел, докато Т-и А-специфичните праймери са специфични за мутацията.

Праймерни двойки:

С-и А-специфичен мултиплекс: Fwd + A_rev + C_rev_link (долната верига) Т-специфична реакция: T_fwd + Rev (горната верига) G-специфична реакция: G_fwd + Rev (горната верига)

AS-PCR условия:

Всяка PCR реакция се осъществява в 10 μΙ обем, съдържащ 20-100 ng геномна ДНК, 0.025 единици/μΙ BIOLASE Diamond ДНК полимераза, 0.75 тМ dNTPs, 3 тМ MgCI₂, 0.25 pmol/μΙ праймер (0.125 pmol/μΙ от двата обратни праймери в мултиплекса) в 1 х NH4 буфер (Bioline). PCR се провежда в GeneAmp® PCR System 9700 (РЕ Applied Biosystems) при следните условия: 95°С за 4 min, 35 цикъла при 94°С за 30 s, 62°С (56°С за Т-и G-реакцията) при наклон 80% за 30 s и 72°С за 30 s след финалната екстензия при 72°С за 7 min и съхранение при 4°С. PCR е последвана от електрофореза в 2% агарозен гел при 200 V за 30 min.

Резултатите от алел-специфичния PCR анализ на два диви типа, два носителя и две болни животни са показани на Фиг.7.

Claims (29)

1. I. Метод за установяване на комплексна гръбначна малформация (CVM) при едър рогат добитък, характеризиращ се с това, че се идентифицира наличието на най-малко един генетичен маркер, локализиран в говеждата хромозома ВТАЗ в участъка, фланкиран от и включващ полиморфни микросателитни маркери ВМ4129 и BMS1266, свързан с комплексна гръбначна малформация при говедата (CVM), който включва: осигуряване на говежди генетичен материал и последващо установяване в посочения генетичен материал наличието или отсъствието на най-малко един генетичен маркер, който е свързан с характеристиката на заболяването комплексна гръбначна малформация при едрия рогат добитък.

   w
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е локализиран в участъка от около 59.5 сМ до около 67.9 сМ.
3. 3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е локализиран в участъка, фланкиран от и включващ полиморфните микросателитни маркери INRAA003 и BMS937.
4. 4. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е локализиран в участъка, фланкиран от и включващ микросателитните маркери INRAA003 и ILSTS029.
5. 5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е микросателитният маркер INRAA003.
6. 6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е микросателитният маркер BMS2790.
7. 7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е микросателитният маркер ILSTS029.
8. 8. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е микросателитният маркер INRA123.
9. 9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е микросателитният маркер ВМ220.
10. 10. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е микросателитният маркер HUJ246.

    II. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е микросателитният маркер BMS862.
11. 12. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е микросателитният маркер BMS937.
12. 13. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е свързан с ген, причиняващ заболяването комплексна гръбначна малформация при говедата.
13. 14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че гена, причиняващ заболяването комплексна гръбначна малформация при говедата е говеждият ген SLC35A3.
14. 15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че говеждият ген SLC35A3 кодира говеждият SLC35A3 протеин, включващ аминокиселина, показана на SEQ ID NO: 17.
15. 16. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че говеждият ген SLC35A3 е кодиран от сДНК последователност, включваща нуклеотидната последователност, показана на SEQ ID NO: 18.
16. 17. Метод съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че генетичният маркер е самостоятелен нуклеотиден полиморфизъм в позиция, еквивалентна на нуклеотид 559 от SEQ ID NO: 18.
17. 18. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че самостоятелният нуклеотиден полиморфизъм е G/Т полиморфизъм.
18. 19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че установяването на G/Т полиморфизма се осъществява чрез техники, избрани от групата, включваща алел-специфична PCR, т1писеквениране, праймерна екстензия, пиро-секвениране, PCR-RFLP, алел-сецифична цикло-амплификация и праймерна екстензия, последвана от MALDI-TOF масова спектрометрия.
19. 20. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един генетичен маркер е генетично свързан към ген или особеност на заболяване, причиняващо комплексна гръбначна малформация при говеда при логаритмична степен от най-малко 3.0, така също най-малко 4.0, включително най-малко 5.0, така също най-малко 6.0, включително най-малко 7.0, така също 7.0, така също най-малко 8.0, включително най-малко 9.0, така също най-малко 10.0, включително най-малко 11.0, така също най-малко 12.0.
20. 21. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият най-малко един маркер е комбинация от генетични маркери.
21. 22. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че праймерната двойка за амплифициране на микросателитния маркер INRAA003 е SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
22. 23. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че праймерната двойка за амплифициране на микросателитния маркер BMS2790 е SEQ ID N0:3 е SEQ ID N0:4.
23. 24. Метод съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че праймерната двойка за амплифициране на микросателитния маркер ILSTS029 е SEQ ID N0:5 е SEQ ID N0:6.
24. 25. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че праймерната двойка за амплифициране на микросателитния маркер INRA123 е SEQ ID N0:7 е _r SEQ ID N0:8.
25. 26. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че праймерната двойка за амплифициране на микросателитния маркер ВМ220 е SEQ ID N0:9 е SEQ ID N0:10.
26. 27. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че праймерната двойка за амплифициране на микросателитния маркер HUJ246 е SEQ ID N0:11 е SEQ ID N0:12.
27. 28. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че праймерната двойка за амплифициране на микросателитния маркер BMS862 е SEQ ID N0:13 е SEQ ID N0:14.
28. 29. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че праймерната двойка за амплифициране на микросателитния маркер BMS937 е SEQ ID N0:15 е SEQ ID N0:16.
29. 30. Диагностичен кит за използване при установяване в присъствието на субект говедо на най-малко един генетичен маркер, свързан с комплексна гръбначна малформация (CVM) при говедата, характеризиращ се с това, че включва най-малко една олигонуклеотидна последователност, избрана от групата, състояща се от SEQ ID N0: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 и комбинация от тях.

    Carfin-M Ivanhoe Bell