BR0115439B1 - Método para detectar malformação vertebral complexa (CVM) de bovino, bem como kit de diagnóstico para detectar a presença de pelo menos um marcador genético associado com CVM em bovinos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO

PARA DETECTAR MALFORMAçãO VERTEBRAL COMPLEXA (CVM) DE

BOVINO, BEM COMO KIT DE DIAGNÓSTICO PARA DETECTAR A

PRESENçA DE PELO MENOS UM MARCADOR GENÉTICO ASSOCIADO COM CVM EM BOVINOS".

CAMPO DA INVENçãO A presente invenção refere-se, geralmente, a uma doença genética observada em bovinos denominada Malformação Vertebral Complexa (CVM).

Mais particularmente, invenção refere-se a marcadores moleculares para identifi- car veículos bovinos potenciais de CVM e para identificar locos de gene de CVM e mutações destes responsáveis pela malformação vertebral complexa em bovinos.

FUNDAMENTO DA INVENçãO A Malformação Vertebral Complexa (CVM) é um distúrbio verte- bral congênito detectado em gado leiteiro preto e branco Holstein-Friesian (HF). A doença recentemente foi descrita (Agerholm e outros, 2000). Em Denmark, todos os casos diagnosticados até hoje (17 de outubro de 2000) foram geneticamente relacionados ao touro US Holstein da elite anterior Car- lin-M Ivanhoe Bell. De acordo com os presentes dados, a CVM parece ser herdada como uma doença recessiva autossômica. A doença é caracterizada por uma artrogripose simétrica bilate- ral congênita das articulações distais e malformações da coluna, principal- mente na junção cervico torácica combinada com peso corporal reduzido (Agerholm e outros, 1994).

Externamente, existem as seguintes principais descobertas: Em muitos casos a parte cervical e/ou a torácica da coluna parecem ser curtas. A contração simétrica bilateral moderada das articulações carpais e grave contração e supinação da articulação falango-metacarpiana (machinho) são descobertas constantes. A contração e pronação da articular falango- metatársica e ligeira extensão do tarso são também descobertas comuns.

Na maioria dos casos um curso irregular da coluna em torno da junção cer- vico torácica é observado. A escoliose pode ser observada, e lesões podem estar presentes em outras regiões da coluna. O curso irregular é frequente- mente reconhecido por inspeção e palpação do aspecto ventral da coluna.

Entretanto, lesões podem ser mínimas e restritas a duas ou poucas vérte- bras. Em tais casos coluna pode ser de comprimento quase normal. Por- tanto, exame radiológico da coluna é recomendado para excluir malforma- ções vertebrais em casos suspeitos. A medula espinhal é de tamanho nor- mal fundeada com o canal vertebral sem compressões óbvias. Empregando- se radiologia, malformações vertebrais complexas consistindo em hemivér- tebras, fundidas e vértebras deformadas, escoliose, e anquilose são encon- tradas em graus variáveis. Isto é melhor demonstrado seguindo-se a remo- ção dos arcos vertebrais. Em alguns casos as malformações do coração estão presente, principalmente como um defeito septo interventricular ele- vado e hipertrofia ecêntrica do ventrículo direito. As malformações dos va- sos grandes podem ocorrer. Nos pulpões a atelectasia fetal está presente.

Os fluidos sorohemorrágicos estão mais presente na cavidade toráxica.

Uma variedade de outras malformações foi observada, porém estas não são descobertas constantes ou comuns. Lesões devido à distocia são freqüen- temente encontradas. Têm sido observadas malformações igualmente em fetos abor- tados, bezerros nascidos prematuramente e em bezerros natimortos nasci- dos a termo. Casos entre bezerros mais velhos não foram ainda observa- dos. Em geral, o peso corporal é reduzido, e o peso corporal é menor em bezerros nascidos prematuros do que em bezerros nascidos a termo.

Adicionalmente, parece existir uma freqüência aumentada de abortos em vacas inseminadas com sêmen de touros veículos. No momento a causa disto é desconhecida.

Atualmente, a única ferramenta disponível para a diagnose de CVM é a diagnose pato-anatômica com base na acima descrita presença de artrogripose simétrica bilateral das articulações distais e malformações da coluna, principalmente na junção cervico torácica combinada com peso cor- poral reduzido. Entretanto, as contrações simétricas dos membros são des- cobertas comuns e gerais em malformações vertebrais em bezerros. Por- tanto, os problemas de diagnóstico diferencial existe como é freqüente- mente difícil diferenciar entre CVMe outras malformações. O fato de que o defeito genético parece ser espalhado pelo tou- ro Carlin-M Ivanhoe Bell que tem sido intensivamente empregado em todo o mundo torna de importância econômica significante ser capaz de testar se os touros de reprodução corrente e potencial são veículos do defeito. A fim de obter uma estimativa da frequência de animais veículos de CVM potencial dentro da população de gado dinamarquês, os presente inventores extraíram informação da árvore genealógica da base de dados de gado nacional dinamarquês. No momento da extração (Outubro de 2000) foram registrados 919.916 vacas e bezerras de raça pura, e 169.821 touros e bezerros machos de raça pura. Bell foi encontrado 707.915 vezes na árvo- re genealógica das vacas e bezerras e 161.043 vezes nas árvores genealó- gicas macho. Nas Tabelas 1 e 2 abaixo, o número de ocorrências de Bell em cada geração das árvores genealógicas é mostrado. TABELA 1 Ocorrência de Bell nas árvores genealógicas de vacas e bezerras "Danish Holstein".

Gerações_ NR_____Fr_e_qüênçia__Percentual_____Freqü_ênçi_a_ Cu mulativa 2 21240 3,0 21244 3 202460 28,6 223704 4 321043 45,4 544747 5 133956 18,9 678703 6 27307 3,9 706010 7 1869 0,3 707879 8 36 0,0 707915 TABELA 2 Ocorrência de Bell nas árvores aenelógicas de touros "Danish Holstein11. _ Gerações_____Fre_qüênç]a___Percentual_____Fieqüênçia, Cumulativa 2 436 0,3 436 3 20144 12,5 20580 4 82394 51,2 102974 5 44545 27,7 147519 6 12455 7,7 159974 7 1040 0,6 161014 8 29 0,0 161043 Embora estes números também incluam algumas ocorrências duplas e triplas de Bell nas árvores genealógicas, os dados claramente mostram que uma maioria do gado "Danish Holstein" são veículos potenci- ais de CVM. Claramente, o problema é imenso sobre uma escala global.

Desse modo, existe grande demanda na indústria de gado para um teste genético que permite a identificação de gado em várias raças que são veículos potenciais de CVM (por exemplo, antes do início detectável de sintomas clínicos).

Antes da presente invenção, o mapeamento de microssatélite não foi aplicado ao gene causando as malformações vertebrais complexas acima que não têm sido isoladas ou caracterizadas. Desse modo, para me- lhor conhecimento dos inventores, o método diagnóstico de acordo com in- venção descrito em maiores detalhes no seguinte não foi anteriormente su- gerido ou descrito.

Conseqüentemente, a presente invenção, que compreende o mapeamento do locos da doença para CVM, tem fornecido um teste de DNA com base em marcadores de microssatélite localizados no cromossoma bo- vino BTA3. A capacidade do teste para definir o estado do veículo de ani- mais descendentes de Bell tem confirmado o que aparece nos exemplos abaixo.

Sumário da Invenção Em seu aspecto mais amplo, a presente invenção fornece um método para detectar a presença em um indivíduo bovino de um marcador genético associado com malformação vertebral complexa bovina {CVM), compreendendo as etapas de fornecer um material genético bovino, e de- tectar no material genético a presença ou ausência de pelo menos um mar- cador genético que é ligado a um traço de doença de malformação vertebral complexa bovina ou um polimorfismo de nucleotídeo específico que causa um traço de doença de malformação vertebral complexa.

Em um outro aspecto, a invenção pertence a um kit de diagnós- tico para uso em detecção da presença em um indivíduo bovino de pelo menos um marcador genético associado com a malformação vertebral com- plexa bovina (CVM), compreendendo pelo menos uma seqüência de oligo- nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID

NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID

NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38, e combinações destas. Além disso, a invenção refere-se a um método diagnóstico incluindo um kit diagnóstico para a de- tecção de um polimorfismo G/T no gene SLC35A3 bovino causativo e dia- gnóstico para CVM em gado.

Descrição Detalhada da Invenção Um primeiro objetivo da presente invenção é possibilitar a iden- tificação de gado transportando a malformação vertebral complexa bovina (CVM). Isto é conseguido por um método que detecta a presença de um marcador genético associado com CMV bovino em um indivíduo bovino.

Mais especificamente, o marcador genético pode ser o gene SLC35A3 bovi- no ou ainda mais especificamente os polimorfismos específicos no gene SLC35A3 bovino.

Como aqui empregado, o termo um "indivíduo bovino" refere-se ao gado de qualquer raça. Desse modo, quaisquer das várias espécies de vaca ou boi, se macho ou fêmea, são incluídos no termo, e igualmente ani- mais adultos e recém-nascidos são destinados a serem recuperados. O ter- mo não denota uma idade particular. Um exemplo de um indivíduo bovino é um membro da população de gado "Holstein-Friesian". O termo "marcador genético" refere-se a uma seqüência de nu- cleotídeo variável (polimorfismo) que está presente em DNA genômico bovi- no em um cromossoma e que é identificável com oligonucleotídeos específi- cos. Uma tal seqüência de nucleotídeo variável é, por exemplo, distingüível por amplificação de ácido nucléico e observação de uma diferença em ta- manho ou seqüência de nucleotídeos devido ao polimorfismo. Em modali- dades úteis, tais marcadores genéticos podem ser identificados por diversas técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica, e incluem represen- tação de microssatélites ou repetições tandem curtas (STR), polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de sítios de deleção ou inserção, e DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPD) bem como a representação de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) por mé- todos incluindo reação de cadeia de polimerase de restrição-fragmento- comprimento, hibridização de oligômero específica do alelo, ensaios de li- gação específica de oligômero, mini-seqüenciamento, seqüenciamento di- reto, ensaios de 5'-exonuclease detectada por fluorescência, e a hibridiza- ção com sondas de PNA e LNA e outras. Entretanto, será apreciado que outras técnicas e marcadores genéticos possam ser aplicados de acordo com a invenção.

Como acima descrito, "malformação vertebral complexa bovina" (CVM) é um distúrbio vertebral congênito. Atualmente, a doença tem sido apenas detectada em gado leiteiro preto e branco Holstein-Friesian (HF); entretanto, é também contemplado que outras raças bovinas possam ser afetadas. A doença foi recentemente descrita por Agerholm e outros, 2000.

Conseqüentemente, no presente contexto a CVM e o traço de doença de malformação vertebral complexa bovina devem ser entendidos como doença resultando nos sintomas clínicos previamente aqui descritos, e como relata- do e definido por Agerholm e outros, 2000. O método de acordo com a invenção inclui a provisão de um material genético bovino. Tal material inclui material de DNA bovino que pode ser fornecido por qualquer método ou meio convencional. O material de DNA bovino pode, por exemplo, ser extraído, isolado e purificado do sangue (por exemplo, fresco ou congelado), amostras de tecido (por exem- plo, baço, esfregaço bucal), amostras de cabelo contendo células foliculares e sêmen.

Como previamente descrito, o método da presente invenção também compreende uma etapa de detectar no material genético presença ou ausência de um marcador genético que é ligado a um traço de doença de malformação vertebral complexa bovina. A fim de detectar se o marcador genético está presente no ma- terial genético, os métodos padrão bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica podem ser aplicados, por exemplo, pelo uso de amplificação de ácido nucléico. A fim de determinar se o marcador genético está genetica- mente ligado ao traço de doença de malformação vertebral complexa, um escore com limite de determinação (lod score) pode ser aplicado. Um escore com limite de determinação (lod score), que é também algumas vezes refe- rido como Zmax, indica a probabilidade (o logaritmo da proporção da probabi- lidade) que um locos marcador genético e um locos de gene específico são ligados em uma distância particular. Os escores com limite de determinação (lod score) podem, por exemplo, ser calculados aplicando-se um programa de computador tal como o programa MLINK do pacote LINKAGE (Lathrop e outros, 1985). Um escore com limite de determinação (lod score) de mais do que 3.0 é considerado ser evidência significante para a ligação entre o mar- cador genético e o traço de doença de malformação vertebral complexa ou locos de gene.

Em uma modalidade da invenção, o marcador genético é locali- zado no cromossoma bovino BTA3. A região de cromossoma bovino BTA3 compreendendo os marcadores genéticos que são úteis no método da pre- sente invenção é indicada na Figura 2.

Consequentemente, os marcadores genéticos localizados no cromossoma bovino BTA3 na região flanqueada por e incluindo os marcado- res de microssatélite polimórficos BM4129 e BMS1266 podem ser úteis de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade específica, o pelo menos um marcador genético é localizado na região de cerca de 59,5 cM a cerca de 67,9 cm em cromossoma bovino BTA3.

Em uma outra modalidade útil, o pelo menos um marcador ge- nético é localizado no cromossoma bovino BTA3 na região flanqueada por e incluindo os marcadores de microssatélite polimórficos INRAA003 e BMS937.

Em um outro aspecto, o pelo menos um marcador genético é localizado no cromossoma bovino BTA3 na região flanqueada por e incluin- do os marcadores de microssatélite polimórficos INRAA003 e ILSTS029.

Em outra modalidade vantajosa, o pelo menos um marcador ge- nético é selecionado do grupo consistindo em marcadores de microssatélite BM4129, INRAA003, BMS2790, ILSTS029, INRA123, BM220, HUJ246, BMS862, BMS937, BL1048, BMS2095 e BMS1266.

Como descrito nos exemplos, o pelo menos um marcador gené- tico pode ser ligado a um gene causando a doença de malformação verte- bral complexa bovina. Desse modo, em uma modalidade, o pelo menos um marcador genético é localizdo em cromossoma bovino BTA3 na região flan- queada por e incluindo os marcadores de microssatélite polimórfico BM4129 e BMS1266 e geneticamente ligados o traço de doença de CVM ou ao locos de gene de CVM em um escore com limite de determinação (lod score) de pelo menos 3,0, tal como pelo menos 4,0, incluindo pelo menos 5,0, tal como pelo menos 6,0, incluindo pelo menos 7,0 tal como pelo menos 8,0, incluindo pelo menos 9,0 tal como pelo menos 10,0, incluindo pelo menos 11,0, tal como pelo menos 12,0. A definição específica e locos dos marcadores de microssatélite polimórfico acima pode ser encontrada no mapa genético USDA (Kappese e outros, 1997).

Será apreciado que a fim de detectar a presença ou ausência em um indivíduo bovino de um marcador genético associado com CVM, mais do que um marcador genético pode ser aplicado de acordo com a in- venção. Desse modo, o pelo menos um marcador pode ser uma combinação de dois ou mais marcadores genéticos que são mostrados serem informati- vos por meio do qual a precisão do teste pode ser aumentada.

Conseqüentemente, como também exemplificado abaixo, em uma modalidade útil, dois ou mais dos marcadores de microssatélite IN- RAA003, BMS2790, ILSTS029, INRA 123, BM220, HUJ246, BMS862, BMS937 podem ser empregados em combinação.

De acordo com a invenção, as seqüências de nucleotídeo dos pares iniciadores para amplificar os marcadores de microssatélite acima são descritos na Tabela 4 abaixo.

Os mapas comparativos (Solinas-Told e outros, 1995) mostram que a maior parte do cromossoma bovino BTA3 corresponde a uma parte de cromossoma humano 1 (HSA1). O mapeamento genético do locos CVM apresentado aqui torna possível usar a informação disponível em torno dos genes humanos e concentrar a pesquisa para o gene candidato para genes presentes no cromossoma humano 1. Isto limitará enormemente o número de genes candidatos e facilitará a pesquisa para o gene causativo de CVM.

Os marcadores genéticos da presente invenção podem ser fei- tos empregando-se metodologias diferentes conhecidas por aqueles versa- dos na técnica. Desse modo, será entendido que com o conhecimento aqui apresentado, as seqüências de nucleotídeo dos marcadores de microssaté- lite polimórfico acima descrito de cromossoma bovino BTA3 têm sido identi- ficadas como sendo geneticamente ligadas ao locos do gene de CVM, e marcadores adicionais podem ser gerados das seqüências conhecidas ou a localização indicada no cromossoma bovino BTA3 para uso no método da presente invenção.

Por exemplo, empregando-se o mapa ilustrado na Figura 2, a região de CVM de cromossoma bovino BTA3 pode ser microdissecada, e fragmentos clonados em vetores para isolar segmentos de DNA que podem ser testados para ligação com o locos de gene CVM. Alternativamente, com as seqüências de nucleotídeo fornecidas na Tabela 4, os segmentos de DNA isolados podem ser obtidos da região de CVM por amplificação de áci- do nucléico (por exemplo, reação de cadeia de polimerase) ou por seqüen- ciamento de nucleotídeo da região relevante de cromossoma bovino BTA3 ("caminhada cromossômica").

Adicionalmente, a homologia acima descrita entre o cromosso- ma bovino BTA3 e o cromossoma humano 1 (HSA1) indica que qualquer gene ou rótulo de seqüência expressa que é mapeada para esta reação análoga em ser humano pode também mapear para a região de CVM de cromossoma bovino BTA3. Desse modo, os genes ou seqüências conserva- das que mapeam no cromossoma humano HSA1 podem ser analisados para ligação ao locos do gene de CVM empregando-se métodos de rotina. A genotipagem é baseada na análise de DNA genômico que pode ser fornecida empregando-se métodos de extração de DNA padrão como aqui descrito. Quando o DNA genômico é isolado e purificado, a am- plificação de ácido nucléico (por exemplo, reação de cadeia de polimerase) pode ser empregada para amplificar a região do DNA correspondente a cada marcador genético a ser usado na análise para detectar a presença em um indivíduo bovino de um marcador genético associado com CVM.

Conseqüentemente, um kit diagnóstico para uso em uma tal modalidade compreende, em um pacote separado, pelo menos uma seqüência de oligo- nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID

NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID

NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38, e as combinações destas.

Identificação de uma mutação no gene SLC35A3 bovino causativo e dia- gnóstico para CVM em gado.

Tendo estabelecido a localização genômica do gene de CVM delimitada pelos marcadores de microssatélite polimórfico, uma pesquisa para a identificação do gene estrutural e a mutação causativa inclusa foi realizada que pode ser empregada como um marcador genético final para CVM. O genoma humano compartilhando homologia de seqüência com a região de CVM, definida como a região entre os marcadores IN- RA003 e ILSTS029, foi identificado. O marcador BMS2790 é localizado neste intervalo (Figura 1). Inicialmente, 5 diferentes clones de uma bibliote- ca BAC bovina (RPCI-42, construída e tornada disponível por P. de Jonge e co-trabalhadores) foram identificados, cada qual alojando um dos marcado- res INRA003, ISLTS029 ou BMS2790. Empregando-se a informação de se- qüência obtida destes clones BAC, uma região simples no cromossoma hu- mano 1 que continha a região de homologia com os BACs contendo marca- dor foi identificada empregando-se o programa BLASTN em bases de dados de seqüências públicas. Esta região abrange cerca de 6 milhões de pares de base e é localizada em posição aproximada 107,4 - 113,5 (Figura 3) (ob- servador ENSEMBL, The Sanger Centre).

Isolamento e seaüenciamento do cDNA SLC35A3.

Com base em um alinhamento de homologia do gene SLC35A3 entre homo sapiens e canis familiaris, 2 oligos (SL1F e SL8R) foram desi- gnados para amplificação de quase o cDNA inteiro para SLC35A3 bovino, incluindo o códon de partida. A PCR foi realizada em cDNA isolado de amostras de tecido do coração coletadas de um animal do tipo silvestre, um veículo CVM, e um animal afetado, respectivamente. Para obter a seqüência da extremidade 3' do gene, o fragmento de PCR resultante foi seqüenciado e um novo oligo designado (SL5F). Para amplificar a extremidade 3' do SLC35A3, SL5F foi empregada em combinação com um oligo (bSLCBVIR), designado empregando-se a seqüência publicada de um EST bovino parcial (banco de gene, dbEST). A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 18) e a se- qüência de peptídeo transladada (SEQ ID NO: 17) de SLC35A3 de bovino é mostrada na Figura 4. A proteína codificada por SLC35A3 bovino contém 326 aminoácidos e compartilha homologia com uma família de proteínas previamente conhecidas envolvidas no transporte de açúcares de nucleotí- deo do citosol dentro do lúmen de Golgi. O alinhamento representado na Figura 5 mostra a homologia com as proteínas SLC35A3 previamente des- critas em ser humano (Ishida e outros 1999) e em cão (Guillen e outros 1998).

Detecção de um polimorfismo no gene SLC35A3 Para detectar polimorfismos potenciais no gene SLC35A3 bovi- no, a amplificação de PCR do gene foi realizada empregando-se o cDNA

isolado de amostras de tecido do coração coletadas de um veículo de CVM e um animal afetado, respectivamente. O seqüenciamento do fragmento isolado do animal afetado revelou uma seqüência idêntica ao tipo silvestre, exceto para o animal afetado sendo homozigoto para o nucleotídeo T na posição 559 de nucleotídeo, comparado com o animal tipo silvestre sendo homozigoto para G na posição correspondente (veja a Figura 4). O seqüen- ciamento do cDNA de um animal sendo veículo do defeito de CVM mostrou este animal ser heterozigoto tendo igualmente T e G na posição 559. A troca de G para T na posição 559 afeta a seqüência do peptí- deo resultante em alteração de uma valina na posição 180 para uma fenila- lanina (veja a Figura 4).

Tipaqem do polimorfismo de SLC35A3 por um ensaio com base em seqüen- ciamento de DNA. A Figura 6 mostra os resultados obtidos de seqüenciamento de um fragmento de PCR amplificado de DNA genômico e contendo a região (de 544 a 572 do cDNA de SLC35A3, para numeração veja a Figura 4) contendo a mutação G/T. Os grupos esquerdo e direito mostram o seqüen- ciamento dianteiro e reverso, respectivamente. A série superior (marcada por -/-) mostra o resultado de tipo silvestre, mostrando um G na posição po- limórfica empregando-se o seqüenciamento dianteiro e um C na posição similar no outro filamento empregando-se o seqüenciamento reverso (mar- cado por asteriscos). A série inferior +/+ mostra os resultados de um bezerro afetado, mostrando um T na posição polimórfica empregando-se seqüenci- amento dianteiro e um A na posição similar no outro filamento empregando- se seqüenciamento reverso (marcado por asteriscos). O heterozigoto (+/-) é mostrado no grupo mediano e supostamente mostra-se como uma mistura do tipo silvestre e sinal afetado, e desse modo tem igualmente um sinal T e um G empregando-se seqüenciamento dianteiro e um sinal A e um C no ou- tro filamento.

Todos os bezerros afetados pela CVM são homoziqotos para o alelo T. A genotipagem de 39 bezerros afetados por CVM foi realizada por seqüenciamento de um produto de PCR amplificado de DNA genômico (veja a Figura 6 e exemplo 6). Todos estes animais foram homozigotos para o alelo T, confirmando os resultados iniciais. O alelo T não é encontrado em animais não-relacionados com Bell.

Uma vez que os bezerros afetados por CVM tenham sido relata- dos apenas em árvores genealógicas contendo o touro BELL amplamente empregado, foi investigado se o alelo T estava presente em animais não- relacionados com BELL. Tirando vantagem da Base de Dados Danish Cattle, 496 animais da raça Holstein sem BELL em sua árvore genealógica foram identificados e amostrados. A genotipagem destes animais foi reali- zada por seqüenciamento de um produto de PCR amplificado de DNA ge- nômico (veja a Figura 6 e exemplo 6). Nenhum destes animais conteve o alelo T, sugerindo que este alelo fosse encontrado exclusivamente na cepa de animais intimamente relacionados com BELL.

Por seqüenciamento, mais do que 326 animais não- relacionados (pelo menos pelas três últimas gerações) ou 12 raças diferen- tes foram também genotipadas. Todos estes animais foram homozigotos para o alelo tipo silvestre (alelo G) novamente demonstrando a ausência do alelo relacionado com CVM (o alelo T) na população de gado geral.

Tipaqem do polimorfismo de SLC35A3 por um ensaio de PCR específico do alelo (AS-PCRL A fim do tipo o polimorfismo G/T eficazmente, um ensaio de PCR específico do alelo empregando a Polimerase de DNA de Diamante BIOLASE de Bioline foi desenvolvido. Esta polimerase requer uma compa- ração perfeita da extremidade 3' do iniciador com o padrão, e uma má com- paração nesta posição resultará em nenhuma amplificação (ou muito fraca).

Deste modo, é possível distinguir entre os animais tipo silvestre, veículos ou doentes identificando a presença ou ausência de produtos de PCR específi- cos de alelo (Figura 7). A parte esquerda da Figura 7 mostra os produtos de PCR específicos de alelo do filamento de codificação. Como esperado, os animais do tipo silvestre mostram amplificação com o iniciador específico de G porém não com o iniciador específico de T. Os veículos mostram amplifi- cação de ambos os iniciadores específicos de G e T, ao mesmo tempo que os animais doentes apenas mostram amplificação do iniciador específico de T. A parte direita mostra os produtos de PCR específicos do alelo do fila- mento de não-codificação, e como esperado, os padrões são os mesmos como o filamento de codificação. Os animais do tipo silvestre são homozi- góticos C, os veículos são heterozigóticos C/A, e os animais doentes são homozigóticos A.

Dos resultados acima descritos do emprego de um método de gene candidato posicionai, um gene bovino foi identificado que é homólogo ao gene humano SLC35A3 codificando um transcarreador de UDP-N- acetilglicosamina. Dentro deste gene um polimorfismo G/T foi identificado que altera a sequência de aminoácido da proteína. Todos os bezerros afe- tados analisados (39) são homozigotos para o alelo T (T/T) e veículos co- nhecidos (108) são todos heterozigotos para o polimorfismo (G/T). A análise de mais do que 500 animais da raça Holstein, escolhidos como sendo não relacionados com Bell, deixaram de identificar quaisquer animais transpor- tando o alelo T. Mais do que 1500 animais foram analisados tendo Bell na árvore genealógica sem descobrir qualquer animal não-afetado sendo ho- mozigoto para o alelo T. Além disso, mais do que 300 gados selecionados de 12 raças diferentes foram analisadas sem detectar o alelo T em qualquer destes animais. Juntas, as descobertas descritas no presente pedido de- monstram que o alelo T está presente em uma cópia simples em animais que são veículos de CVM e em duas cópias em animais afetados por CVM. A detecção do alelo T na posição 559 (numeração da Figura 4) é portanto diagnostica para CVM e ideal para a detecção de veículos do defeito de CVM.

Como o polimorfismo G/T tem sido identificado como sendo causativo para CMV, quaisquer marcadores genéticos intimamente acopla- dos a este polimorfismo pode ser diagnóstico para CMV em uma população bovina. Conseqüentemente, a presente invenção descreve um método para identificar indivíduos bovinos ou afetados por CMV ou veículos de CMV de- terminando-se a presença do polimorfismo G/T na posição 559 do gene SLC35A3 bovino, ou indiretamente analisando-se quaisquer marcadores genéticos, tal como microssatélites aqui descritos, acoplados ao SLC35A3 bovino ou diretamente analisando-se a seqüência do gene SLC35A3 bovi- no, por exemplo, como descrito acima e em maiores detalhes nos exemplos.

Dentro do escopo da presente invenção está portanto um méto- do para a detecção e/ou quantificação da presença de um marcador genéti- co associado com a CVM bovina em um indivíduo bovino a fim de ser capaz de identificar os indivíduos bovinos afetados por CMV ou veículos de CMV.

As etapas do método compreendem: a) fornecer um material genético bovino, e b) detectar, no referido material genético, a presença ou ausência de pelo menos um marcador genético que é ligado a um traço de doença de malformação vertebral complexa de bovino. O pelo menos um marcador genético é ligado a um gene cau- sando a doença CMV de bovino, o referido gene sendo identificado aqui ser o gene SLC35A3 de bovino que codifica a proteína SLC35A3 de bovino compreendendo uma seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 17.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um mé- todo para detectar a CMV de bovino, onde o marcador genético é um poli- morfismo de nucleotídeo simples em uma posição equivalente ao nucleotí- deo 559 de SEQ ID NO: 18, o referido polimorfismo de nucleotídeo simples sendo um polimorfismo de G/T. O presente pedido, além disso, descreve um ensaio eficiente para a genotipagem do presente polimorfismo empregando-se PCR especí- fica de alelo. Isto é porém um de uma batería de métodos para a tipagem de SNPs, outros métodos que poderíam ser empregados incluem, porém não estão limitados a, mini-seqüenciamento, extensão de iniciador, pirosse- qüenciamento, PCR-RFLP, amplificação de círculo de laminação específica de alelo, extensão de iniciador seguida por espectrometria de massa MAL- DI-TOF bem como uma faixa de outros métodos com base em hibridização e enzimática.

Um fenótipo parecendo-se com CVM tem sido demonstrado existir em camundongos mutados na fímbria lunática do gene (Evrad e ou- tros, 1998). Similar aos bezerros afetados por CVM, os camundongos ho- mozigotos para uma mutação nula em fímbria lunática exibem uma seg- mentação de somito alterada e padronização, tendo um eixo corporal en- curtado, fusões de costela e vértebras e vértebras incompletamente forma- das (Evrad e outros, 1998). A fímbria parece participar na definição de for- mação de limite e padrão de somito modulando-se a atividade de receptores de entalhe (Klein e Arias, 1998; Moloney e outros, 2000, Brückner e outros, 2000). A atividade de modulação de entalhe parece ser mediada por uma atividade de transferase de N-acetilglicosaminila de fímbria, que em Golgi inicia o alongamento de resíduos de fucose ligada por O ligada às repeti- ções de seqüência tipo EGF de Entalhe (Moloney e outros, 2000; Brückner e outros, 2000).

Além disso, como o gene SLC35A3 bovino é homólogo ao gene SLC35A3 humano, é, com a informação aqui mencionada, óbvio analisar a seqüência de codificação do gene SLC35A3 humano para mutações causa- tivas e diagnosticas quando estudando defeitos de desenvolvimento huma- no, especialmente envolvendo segmentação de somito e padronização. O efeito de uma mutação no transcarreador de N- acetilglicosaminila localizada em Golgi (SLC35A3) afetando o transporte de N-acetilglicosamina do citosol no lúmen de Golgi seria suposto privar a fa- mília de Fímbria de proteínas para seu substrato. Isto afetaria a capacidade da Fímbria modular à atividade de incisura e desse modo causar um defeito de segmentação tipo CVM. Portanto parece muito plausível que a mutação em SLC35A3, a parte de ser diagnostica para CVM, é também a mutação causando este defeito genético difundido. A invenção é descrita em maiores detalhes nos seguintes exemplos: EXEMPLOS: Exemplo 1 Mapeamento Genético de Malformação Vertebral Complexa (CVM).

Este exemplo ilustra a localização do locos do gene de CVM para o cromossoma bovino BTA3. Adicionalmente, esta modalidade descre- ve a identificação de marcadores ligados ao locos do gene de CVM, e desse modo a caracterização da região de CVM de cromossoma bovino BTA3. A fim de mapear o locos responsável pela CVM, amostras foram obtidas de animais participando em um estudo de reprodução. Resumida- mente, aproximadamente 300 vacas e bezerras descendentes do touro T

Burma e inseminadas com o sêmen do touro KOL Nixon foram selecionadas para o estudo de reprodução. Treze bezerros afetados foram selecionados com base no exame pós-morte, como descrito em Agerholm e outros, 2000.

Estes 13 bezerros bem com seus pais, no total de 28 animais, foram empre- gados no exame de genoma inicial. Os bezerros foram separados por 4 ge- rações pelo seu antepassado, o touro de raça pura Carlin-M Ivanhoe Bell. O exame de genoma foi conduzido, abrangendo todos os 29 autossomas, empregando-se uma bateria de marcadores de microssatélite colhidos do mapa de genoma USDA (Kappes e outros, 1997). Os marcado- res foram selecionados com distâncias em pares entre 10 e 20 cM. Em áre- as de dúvida devido à baixa informatividade de marcador, novos marcado- res foram incluídos e tipados. Um total de 194 marcadores foi empregado.

As reações de PCR foram realizadas em duplas em um volume de 5 μΙ em um robô de PCR ABI 877 (Applied Biosystems), contendo 12 ng de DNA genômico, 1x de tampão de PCR, 0,4 U AmpliTaq Gold (Applied Biosys- tems), 20 pmoles de cada iniciador e 2,0 mM de MgC^. Todos os marcado- res foram desenvolvidos nas mesmas condições de contato por PCR: incu- bação em 94°C durante 12 minutos para ativar as enzima, 35 ciclos as 94°C, 30 segundos; Ta, 45 segundos; 72°C, 20 segundos, terminando com uma extensão final a 72°C durante 10 minutos. Os primeiros 10 ciclos Ta diminuídos de 67°C a 58°C, um grau para cada ciclo, e os restantes 25 ci- clos Ta foram fixados a 58°C. Os produtos PCR foram agrupados e 5 a 9 diferentes marcadores foram desenvolvidos em cada linha em um ABI 377 (Applied Biosystems), e géis foram analisados com o software de acompa- nhamento. Os alelos foram designados com o programa Genotyper (Versão 2.1, Applied Biosystems).

Para três marcadores, os escores com limite de determinação (lod score) de dois pontos foram calculados empregando-se o programa MLINK do pacote LINKAGE (Lathrop e outros, 1985). Devido à estrutura de árvore genealógica (Figura 1) com alças de endogamia múltipla, a árvore genealógica foi dividida em treze pequenas famílias, um para cada bezerro afetado incluindo o Sire (KOL Nixon), a mãe e o avô materno (7 Burma). A doença foi assumida ser recessivamente herdada com uma penetração completa do genótipo.

Ligação significante foi encontrada para todos os três marcado- res. O escore com limite de determinação (lod score) mais elevado (Z) foi observado com BMS2790 e ILSTS029 com Z = 10,35 a Θ = 0. Além disso, o marcador próximo INRA003 foi também significantemente ligado ao locos CVM (Tabela 3).

Os resultados acima localizam o locos CVM para BTA3 (Figura 2) de acordo com o mapa genético USDA (Kappes e outros, 1997). • Onze bezerros foram homozigotos para o intervalo definido por INRA003, BMS2790, ILSTS029, BMS862 e HUJ246, enquanto BMS2790 e ILSTS029 sozinhos foram homozigotos em todos os treze bezerros como descrito na Figura 1. Foi possível construir haplótipos destes marcadores, permitindo-se deduzir o haplótipo de CVM mais provável (Figura 1). Os ha- plótipos são definidos pelo tamanho dos alelos marcadores que são nume- rados de 1 a N onde 1 define o alelo mais curto do marcador amplificado e N define o alelo mais longo. O comprimento real dos alelos associados com CVM em Bell é como segue: INRA003 (alelo n° 3): 176 pares de base BMS2790 (alelo n° 3): 118 pares de base ILSTS029 (alelo n° 2): 164 pares de base BMS862 (alelo n° 1): 130 pares de base HUJ246 (alelo n° 3): 262 pares de base O comprimento real dos alelos dependerá dos iniciadores em- pregados para amplificar o marcador, e o comprimento do fragmento mos- trado acima é baseado no emprego dos iniciadores descritos na Tabela 4.

Além disso, dezessete bezerros afetados adicionais amostrados como parte do programa de vigilância "Danish" para defeitos genéticos fo- ram incluídos no estudo. Todos os animais afetados tiveram o touro Bell raça pura como um antepassado comum. O DNA foi extraído das amostras de sangue ou sêmen empregando-se os procedimentos padrão.

Os 17 bezerros e suas mães foram genotipados com os 8 mar- cadores INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937, e HUJ246 analisando a região em BTA3 de aproximadamente 59,5 cM a 67,9 cM, e uma vez que o gene CVM nos 17 bezerros adicionais, como no estudo de reprodução inicial, foi assumido originar-se do touro Bell de antepassado comum, uma região similar de identidade por descendência (IBD) foi suposta existir em todos os bezerros afetados. Isto também pare- ceu ser o caso: em 17 além dos 17 bezerros o segmento de cromossoma definido por INRA003 e BMS2790 foi homozigoto, compartilhando os mes- mos alelos como os animais do estudo de reprodução. Em dois dos dezeno- ve animais, a heterozigose foi observada nos locos ILSTS029 e BMS862 explanado por eventos de recombinação simples entre BMS2790 e ILSTS029. Desse modo, com base nos resultados de genotipagem combi- nados, descobriu-se que o defeito genético de CVM é mais provavelmente localizado em um intervalo de menos do que 6 cM, flanqueado pelos marca- dores INRA003 e ILSTS029 como ilustrado na Figura 2 e denota "região de CVM".

As seqüências dos iniciadores para os 8 marcadores aplicados INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937, e HUJ246, são representadas na Tabela 4 abaixo.

Exemplo 2 Teste Diagnóstico para identificar veículos de CVM

Um teste diagnóstico para determinar veículos bovinos de CVM estabelecido determinando-se se descendentes de Bell eram veículos do haplótipo associado com a doença. O teste foi baseado nos 8 marcadores de microssatélite IN- RA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937, e HUJ246, e contam com o reconhecimento dos alelos ou haplótipo específi- cos da doença (veja a Figura 1) em animais descendendes de Bell.

Os animais foram desse modo determinados serem veículos se eles tivessem herdado os alelos associados com a doença na região defini- da pelos marcadores INRA003, BMS2790, ILSTS029 e BM220 de Bell ou de animais descendendo de Bell. Se os animais não herdaram o haplótipo as- sociado com a doença de Bell ou de animais descendentes de Bell, eles fo- ram determinados serem não veículos. Nos casos onde o haplótipo de Bell foi dividido por recombinação, os animais foram designados como indeter- mináveis. Os quatro marcadores adicionais foram apenas empregados quando o conteúdo de informação nos marcadores de teste foi diminuído devido à incapacidade de distinguir entre herança materna e paterna.

Como todos os testes genéticos diagnósticos com base nos marcadores de DNA ligados, o teste de CVM sofre da desvantagem de que um evento de recombinação dupla (um evento em cada lado do gene cau- sativo, entre o gene e os marcadores de flanqueamento) não pode ser de- tectado. No presente caso, este evento será extremamente raro devido à firme ligação entre os marcadores e o gene de CVM, e a segurança do teste é estimada ser maior do que 99%.

Exemplo 3 Dissecação de Tecido e Isolamento de RNA e Síntese de cDNA: Aproximadamente 5 gramas de tecido do coração foram disse- cados de bezerros nascidos mortos dentro de 3 horas de liberação, imedia- tamente congelados em nitrogênio líquido e estocados a -80°C. 250 mg de tecido foram empregados para isolamento de RNA. O RNA foi isolado em- pregando-se o Kit de Isolamento de RNA da Stratagene (cat. 200345). O cDNA foi sintetizado misturando-se 2,5 pg de RNA total com 1 μΙ de oligo (dT)i2-i8 (500 pg/ml), 1 μΙ de 10 mM de mistura de dNTP e H20 para produzir um volume final de 12 μΙ. A mistura resultante foi aquecida a 65°C durante 5 minutos, resfriada sobre gelo e rapidamente girada. Seguin- do a adição de 4 μΙ de 5 x tampão de primeiro filamento, 2 μΙ de 0,1 M de DTT e 1 μΙ de H20, os conteúdos foram misturados e incubados a 42°C du- rante 2 minutos, após o que 1 μΙ (200 U) de Superscript II (GibcoBRL® Li- fetechnologies) foi adicionado e a incubação permitida continuar a 42°C du- rante 1,5 horas. A reação foi inativada a 70°C durante 15 minutos. Para re- mover o RNA, o cDNA foi incubado a 37°C durante 20 minutos com 1 U de RNase H (Roche Molecular Biochemicals).

Exemplo 4 Seqüenciamento de SLC35A3: Com base em um alinhamento de homologia do gene SLC35A3 entre homo sapiens e canis familiaris, 2 oligos (SL1F e SL8R) foram desi- gnados para amplificação de quase o cDNA inteiro para SLC35A3 bovino, incluindo o códon de partida. Para obter a extremidade 3' do gene, o frag- mento de PCR resultante foi seqüenciado e um novo oligo designado (SL5F). Para amplificar a extremidade 3' de SLC35A3, SL5F foi empregado em combinação com um oligo (bSLCBVIR), com base em uma seqüência publicada de um EST bovino.

As mesmas condições de PCR foram aplicadas para ambos os grupos de iniciador.

As reações de PCR foram realizadas em um Sistema de PCR

GeneAmp® 9700 (Applied Bio-systems) em um volume final de 10 μΙ con- sistindo em 1 μΙ de tampão de reação 10 x NH4, 0,5 μΙ de 50 mM de MgCI2, 0,8 μΙ de dNTPs (2,5 mM de cada), 5,65 μΙ de H20, 1 μΙ de iniciador diantei- ro e reverso (5 pmoles de cada) e 0,05 μΙ de 5 U/μΙ de polimerase de DNA BIOTAQ (Bioline). A reação de PCR "touchdown" consistiu em uma etapa de ativa- ção de aquecimento inicial a 95°C durante 2 minutos seguido por 10 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 95°C, anelando a 62°C durante 30 segundos (diminuições de 0,5°C), e alongamento para 20 segundos a 72°C, mais um adicional de 30 ciclos com uma etapa de desnaturação durante 30 segundos a 95°C, uma temperatura de anelamento de 57°C durante 30 se- gundos e uma etapa de alongamento a 72°C durante 30 segundos.

Os seguintes iniciadores foram empregados para amplificar o cDNA SLC35A3 completo: SL1F: 5'-GGA GGC AAA TGA AGA TA A A AAC-3' (SEQ ID NO: 19) SL8R: 5'-CTA TGC TTT AGT GGG ATTT-31 (SEQ ID NO: 20) SL5F: 5'-GAG TTG CTT TTG TAC AGT GG-3' (SEQ ID NO: 21) bSLCBVIR: 5'-ACT GGC TAC TAT CTA GCA CAG GA-3' (SEQ ID NO: 22) A seqüência de DNA completa foi obtida aplicando-se estes ini- ciadores em quatro reações de seqüenciamento de ciclo separado empre- gando-se os produtos de PCR purificados como o padrão. Os produtos de PCR foram purificados empregando-se SPIN-X® (Corning Incorporated) de um gel de agarose Seakem a 0,8%.

As reações de seqüenciamento de ciclo foram realizadas em um Sistema de PCR GeneAmp® 9700 (Applied Biosystems) e incluíram uma etapa inicial a 96°C durante 2 minutos seguido por 99 ciclos de 96°C du- rante 10 segundos, 55°C durante 5 segundos e 60°C durante 4 minutos. Os produtos de seqüenciamento foram precipitados com dois volumes de etanol e 1/10 de volume de 3 M de NaAc (pH 5,5), lavados com 70% de etanol, ressuspenso em 5 μΙ de tampão de carga e desenvolvidos sobre géis de seqüenciamento de acrilamida a 4% empregando-se um seqüenciador au- tomático ABI377. A seqüência de cDNA do SLC35A3 bovino é mostrada na Figura 4 (SEQ ID NO: 18).

Exemplo 5 Identificação e isolamento de BACs contendo marcadores de microssatélite.

Hibridizacão de Filtro: Os filtros foram pré-hibridizados em solução de hibridização (6xSSC (52,6 g de NaCI, 26,46 g de citrato de sódio por litro), 5x Denhardt (2 g de ficoll (tipo 400, Pharmacia), 5 g de polivinilpirrolidona, 5 g de albu- mina de soro bovino (Fração V, Sigma), 0,5% SDS e 50 pg/ml de SS-DNA) a 65°C durante 3 horas com rotação. 100 μΙ de oligonucleotídeo rotulado de extremidade 5' foram então incubados com os filtros durante 16 horas a 65°C. Para rotulagem de extremidade, 5 pmoles de oligonucleotídeo foram combinados com 5 μΙ (50 μΟί) de gama-32P-ATP (atividade específica > 5000 Ci/mmol), 2 μΙ de 10x de tampão de cinase, 11 μΙ de H20 e 1 μΙ (10 U) de cinase de polinucleotídeo de T4 (New England Biolabs Inc.), e a mistura foi incubada a 37°C durante 1,5 hora seguido durante 5 minutos de ebulição para inativar por aquecimento a enzima. A sonda rotulada foi NaAc/etanol precipitado empregando-se os procedimentos padrão, e após uma lavagem em 70% de etanol, a sonda foi redissolvida em 100 μΙ de H20. Seguindo a hibridização os filtros foram lavados uma vez com solução de lavagem I (2x SSC, 0,2% de SDS) e duas vezes a 65°C com solução de lavagem II (0,1xSSC, 0,5% de SDS), e expostos à película MS Kodak BIOMAX® du- rante 2 dias a 80°C.

Os seguintes oligonucleotídeos rotulados na extremidade 5' fo- ram empregados para identificar os clones BAC positivos ILSTS029 e IN- RA003: ILSTS029 oligo: 5'-CAC ACC GCT GTA CAG GAA AAA GTG TGC CAA

CCC TGG TCT AAA TCC AAA ATC CAT TAT CTT CCA AGT ACA T-3' (SEQ ID NO: 23) INRA003 oligo: 5'-CGT CCC CTA TGC GCT TAC TAC ATA CAC TC A

AAT GGA AAT GGG AAA ACT GGA GGT GTG TGA GCC CCA TTT A-3' (SEQ ID NO: 24) Avaliação de PCR da biblioteca BAC de bovino: Os lagos BAC foram preparados da biblioteca BAC e avaliados por PCR. As reações de PCR foram realizadas em um Sistema de PCR Ge- neAmp® 9700 (Applied Biosystems) em um volume final de 10 μΙ consistin- do em 1 μΙ de tampão de reação 10xNH4, 0,5 μΙ de 50 mM de MgCI2, 0,8 μΙ de dNTPs (2,5 mM de cada), 5,65 μΙ de H20, 1 μΙ de iniciador dianteiro e reverso (5 pmoles de cada) e 0,05 μΙ de 5 U/μΙ de polimerase de DNA BIO- TAQ (Bioline).

Os seguintes iniciadores foram empregados para identificar BMS2790 contendo clones BAC por PCR: BMS2790F: 5'-AAG ACA AGG ACT TTC AGC CC-3' (SEQ ID NO: 25) BMS2790R: 5’-AAA GAG TCG GAC ATT ACT GAG C-3' (SEQ ID NO: 26) A reação de PCR touchdown consistiu em uma etapa de ativa- ção de aquecimento inicial a 95°C durante 2 minutos seguido por 10 ciclos de desnaturação durante 30 segundos a 95°C, anelando a 70°C durante 30 segundos (0,5°C de diminuição), e alongamento durante 20 segundos a 72°C, mais um adicional de 30 ciclos com uma etapa de desnaturação a 95°C durante 30 segundos, anelamento a 65°C durante 30 segundos e alongamento a 72°C durante 20 segundos.

Seqüenciamento e isolamento de DNA BAC. O DNA BAC foi preparado de acordo com o Kit Qiagens Large Construct, e aproximadamente 1 μg de DNA BAC foi empregado como o padrão para o seqüenciamento de ciclo realizado com o Kit de Seqüencia- mento de Ciclo Terminador BigDye® (PE Applied Biosystems). As reações de seqüenciamento de ciclo foram realizadas em um volume final de 6 μΙ contendo 1 μΙ de mistura de Terminador Big Dye®, 1 μΙ de iniciador (5 pmo- les), 1 μΙ de tampão de reação e 2 μΙ de H20. As reações de seqüencia- mento de ciclo foram realizadas em um Sistema de PCR GeneAmp® 9700 (Applied Biosystems) e incluíram uma etapa inicial a 96°C durante 2 minutos seguido por 130 ciclos de 96°C durante 10 segundos, 55°C durante 5 se- gundos e 60°C durante 4 minutos. Os produtos de seqüenciamento foram precipitados com dois volumes de etanol e 1/10 volume de 3 M de NaAc (pH 5,5), lavados com 70% de etanol, ressuspensos em 2 μΙ de tampão de carga e desenvolvidos em 4% de géis de seqüenciamento de acrilamida empre- gando-se um seqüenciador automático ABI377.

Iniciadores de Seqüenciamento: T7: 5'-TTA TAC GAC TC A CTA TAG GG-3' (SEQ ID NO: 27) SP6: 5'-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3' (SEQ ID NO: 28) INRA003F: 5'-CTG GAG GTG TGT GAG CCC CAT TTA-3' (SEQ ID NO: 29) INRA003R: 5'-CTA AGA GTC GAA GGT GTG ACT AGG-3' (SEQ ID NO: 30) Exemplo 6 Determinação do estado de CVM por seqüenciamento: As reações de PCR (2 μΙ de DNA genômico de amostra/padrão purificado, 2 μΙ de tampão de 10xPCR, 2 μΙ de 25 mM de MgCI2, 3,3 μΙ de 0,2 mM de cada dNTP (Ultrapure dNTP, 27-2033-01; Amersham Pharmacia Biotech), 6 pmoles de iniciador (dianteira: CBFEX1, 5' -GGC CCT CAG ATT CTC-3' (SEQ ID NO: 31); reversa: CBTEXR, 5' -GTT GAA TGT TTC TTA-3') (SEQ ID NO: 32), 0,165 U Taq polimerase (Biotaq, M95801B; Bioline), vo- lume total ad de dH20) foram realizadas sem óleo em placas de 96 cavida- des empregando-se um Primus HT (MWG Biotech AG). Condições de cicli- zação: 95°C durante 120 segundos, 35x [95°C durante 60 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 110 segundos]. Limpeza pós-reação foi feita por filtração de gel (Millipore Filtration Sistem) com Sephadex G-50 Superfine (17-0041-01, Amersham Pharmacia Biotech) realizada de acordo com a recomendação do fabricante, empregando-se 50 μΙ de dH20 para eluição de amostra final. As reações de seqüenciamento dianteiro e reverso foram realizadas com os mesmos iniciadores como empregado para a gera- ção do produto de PCR (2 μΙ de produto de PCR, 8 μΙ de Mistura de Se- qüenciamento, 0,6 μΙ de 6 pmoles de Iniciador (ver acima), dH20 ad 20 μΙ; DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (US81095). Depois as amostras de termociclização (30x [95°C durante 20 segundos, 55°C durante 15 segundos, 60°C durante 70 segundos]) foram lavadas por filtração de gel essencialmente como descrito acima e anlisadas em um MegaBACE1000 (Amersham Pharmacia Biotech) empregando-se matriz de leitura longa LPA e as seguintes condições de seqüenciamento: injeção de 90 segundos a 3 kV e tempo de desenvolvimento de 35 minutos a 9 kV.

Exemplo 7 Ensaio de PCR específico de alelo: Os iniciadores foram designados da seqüência de cDNA e os quatro iniciadores específicos de alelo foram designados a terem a base 3' na posição da mutação.

Seqüências de iniciador: T_dianteria: 5'-CAG TGG CCC TC A GAT TCT CAA GAG CTT AAT TCT

AAG GAA CTT TC A GCT GGC TC A CAA TTT GTA GGT CTC ATG GCA T-3' (SEQ ID NO: 33) G_dianteira: 5'-CAC AAT TTG TAG GTC TC A TGG CAG-3' (SEQ ID NO: 34) A_reversa: 5'-GCC ACT GGA AAA ACA TGC TGT GAG AAA-3' (SEQ ID NO: 35) C_reversa_ligação: 5'-aat gct act act att agt aga att gat gcc acc ttt tca gct cgc gcc cca aat gaa aat ata gct aaa cag gtt att gac cat ttg cga aat gta tct aat ggt caa act ttt ttC TGG AAA AAC ATG CTG TGA GAA C-3' (SEQ ID NO: 36) Dianteira: 5'-GGC CCT CAG ATT CTC AAG AGC-3' (SEQ ID NO: 37) Reversa: 5'-CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG-31 (SEQ ID NO: 38) O iniciador C_reversa_ligação contém uma seqüência ligante do fago M13 (mostrado em letras minúsculas). Este ligante foi adicionado para obter um produto de PCR mais longo a fim de ser capaz de multiplicar os iniciadores C- e A- em uma reação de PCR. A base 3' na posição da muta- ção é mostrada em negrito. Os iniciadores C- e G- são específicos para o alelo do tipo silvestre, enquanto os iniciadores específicos de T- e A- são específicos para a mutação.

Pares de iniciadores: Multiplicação específica de C-e A-: Dianteira + A_reversa + C_rever- sajigação (filamento inferior) Reação específica de T-: T_dianteira + Reversa (filamento superior) Reação específica de G-: G_dianteira + Reversa (filamento superior) Condições de AS-PCR: Cada reação de PCR foi realizada em um volume de 10 μΙ con- tendo 20 a 100 ng de DNA genômico, 0,025 unidades/μΙ de polimerase de DNA de Diamante BIOLASE, 0,75 mM de dNTPs, 3 mM de MgCI2, 0,25 pmol/μΙ de iniciador (0,125 pmol/μΙ dos dois iniciadores reversos na multipli- cação) em 1 x NH4 de tampão (Bioline). PCR foi realizado em um Sistema de PCR 9700 GeneAmp® (PE Applied Biosystems) sob as seguintes condi- ções: 95°C durante 4 minutos, 35 ciclos de 94°C durante 30 s, 62°C (56°C para a reação de T- e G-) em rampa a 80% durante 30 s, e 72°C durante 30 s seguido por uma extensão final em 72°C durante 7 minutos e estocagem a 4°C. PCR foi seguido por eletroforese em um gel de agarose a 2% em 200 V durante 30 minutos.

Os resultados da análise de PCR específico de alelo de dois tipos silvestres, dois veículos, e dois animais doentes são mostrados na Fi- gura 7.

Legendas das figuras: Figura 1 mostra a árvore genealógica empregada para localizar o locos de malformação vertebral complexa de bovino (CVM) e haplótipos de cinco marcadores de microssatélite no cromossomo bovino 3. Os hapló- tipos de CVM mais prováveis estão em negrito. Os quadrados pretos cheios representam bezerros afetados. Linhas duplas entre o pai e as mães indi- cam alça de endogamia. N refere-se ao número de animais. Genótipos das treze diferentes mães são por razões de simplicidade não mostrados.

Figura 2 mostra o mapa genético do cromossomo bovino 3. Os números nos lados referem-se às distâncias genéticas dadas em centiMor- gan (cM) ao longo do cromossomo. A localização mais provável do locos de malformação vertebral complexa de bovino (CVM) é indicada.

Figura 3 mostra a distância relativa em cM entre os 3 marcado- res de microssatélite ILSTS029, BMS2790 e INRA003 (mostrado na linha denotada marcadores Contig em Cromossomo 3 bovino) no cromossomo 3 bovino como representado pelo U.S. Meat Animal Research Center (Kappes e outros 1997). BACs contendo esses 3 marcadores foram isolados ou por hibridização a filtros de réplica de alta densidade (ILSTS029 e INRA003), ou por análise de PCR da livraria de BAC de bovino RPCI-42 (BMS2790). Os BACs identificados são mostrados em barras pretas e anotados por número de placa/número de cavidade. Esses BACs foram submetidos a seqüencia- mento de extremidade empregando-se iniciadores SP6 e T7 ou a seqüenci- amento empregando-se iniciadores estendendo-se do microssatélite. As seqüências resultantes foram "blasted" contra o cromossoma humano 1 em- pregando-se o Ensemble Server no Sanger Centre. Os números de acesso da pesquisa "blast" são mostrados como números sob o cromossoma hu- mano 1 e a distância relativa entre os hits é dada em MB. Os genes selecio- nados na região são mostrados em caixas.

Figura 4 mostra a seqüência de cDNA e translação do gene SLC35A3 (SEQ ID NO: 18) e a seqüência de aminoácido codificada (SEQ ID NO: 17). O nucleotídeo polimórfico na posição 559 e a valina 180 afetada são indicados em negrito.

Figura 5 mostra uma comparação da seqüência deduzida de SLC35A3 de vaca com seqüências de humano (AB021981) (Ishida e outros 1999) e cão (AF057365) (Guillen e outros 1998). Os pontos indicam resídu- os que comparam a seqüência Bos Taurus. Os travessões indicam espaços que foram introduzidos para otimizar o alinhamento.

Figura 6 mostra os resultados obtidos do seqüenciamento da região (do nucleotídeo 544 a 572 de SLC35A3, ver Figura 4) mostrando o polimorfismo G/T na posição 559 em determinação do estado de CVM por seqüenciamento. Os grupos de esquerda e direita mostram seqüenciamento dianteiro e reverso, respectivamente. A série superior (-/-) mostra o seqüen- ciamento de um animal de tipo silvestre, a série mediana mostra o seqüen- ciamento de um veículo (heterozigoto), e a série inferior mostra o seqüenci- amento de um animal afetado.

Figura 7 é uma figura mostrando os produtos de PCR específico de alelo de dois tipos silvestres, dois veículos, e dois animais doentes.

Anotações: WT: tipo silvestre, C: veículo, S: doente, neg\ controle negativo, M: marcador (escada lateral). As séries mostram os produtos de PCR espe- cífico de alelo: C: 220 bp, A: 98 bp, T: 340 bp, e G: 288 bp. REFERÊNCIAS: 1. Agerholm JS, Bendixen, C., Andersen O., Ambjerg, J. (2000) LK meddelelser October 2000. 2. Barendse W, Vaiman D, Kemp SJ, Sugimoto Y, Armitage SM, Williams JL, Sun HS, Eggen A, Agaba M, Aleyasin SA, Band M, Bishop MD, Buitkamp J, Byrne K, Collins F, Cooper L, Coppetti- ers W, Denys B, Drinkwater RD, Easterday K, Elduque C, Ennis S, Erhardt G, Li L, Lil L (1997). A medium-density genetic linka- ge man of the bovine genome, Mamm Genome 8, 21-28. 3. Brückner, K., Perez, L., Clausen, H., & Cohen, S., (2000) Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta in- teractions Nature 406, pp. 411-415. 4. Evrad, Y. A., Lun, Y., Aulehla, A., Gan, L., & Johnson, R. L. (1998) Lunatic fringe is an essential mediator of somite seg- mentation and patterning. Nature 394, pp; 377-381. 5. Guillen, E., Abeijon, C., & Hirschberg, C. B. (1998) Mammalian Golgi apparatus UDP-N-acetylglucosamine transporter: Mole- cular cloning by phenotypic correction of a yeast mutant. Proc.

Natl. Acad. Sei. USA. 95, pp. 7888-7892. 6. Ishida, N., Yoshioka, S., Chiba, Y., Takeuchi, M., & Kawakita, M. (1999) Molecular cloning and functional expression of the human golgi UDP-N-acetylglucosamine transporter. J. Biochem. 126, pp. 68-77. 7. Kappes SM, Keele JW, Stone RT, McGraw RA, Sonstegard TS, Smith TP, Lopez-Corrales NL, Beattie CW (1997) A second- generation linkage map of the bovine genome. Genome Res 7, 235-249. 8. Klein, R., & Arias, M. (1998) Interactions among Delta, Serrate and Fringe modulate Notch activity during drosophila wing de- velopment. Development 125, pp. 2951-2962. 9- Lathrop GM, Lalouel JM, Julier C, Ott J (1985) Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of re- combination. Am J Hum Genet 37, 482-498. 10. Moloney, D.J., Panin, V. M., Johnston, S.H., Chen, J., Shao, L., Wilson, Y., Stanley, P., Irvine, K. D., Haltiwanger, R.S., & Vogt, T. F. (2000) Fringe is a glycosyltransferase that modifies Notch.

Nature 406, pp 369-375. 11. Solinas-Toldo S, Lengauer C, Fries R (1995) Comparative ge- nome map of human and cattle Genomics 27, 489-496.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Kvaegavlsforeningen Dansire Aarhus Universitet <120> MÉTODO PARA DETECTAR MALFORMAçãO VERTEBRAL COMPLEXA (CVM) DE BOVINO, BEM COMO KIT DE DIAGNÓSTICO PARA DETECTAR A PRESENçA DE PELO MENOS

UM MARCADOR GENÉTICO ASSOCIADO COM CVM EM BOVINOS <130> 25652 <140> PI0115439-7 <141> 15/11/2001 <150> DKPA200001717 <151> 16/11/2000 <150> DKPA200100765 <151> 15/05/2001 <160> 38 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 1 ctggaggtgt gtgagcccca ttta 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 2 ctaagagtcg aaggtgtgac tagg 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 3 aagacaagga ctttcagccc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 4 aaagagtcgg acattactga gc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 5 tgttttgatg gaacacagcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 6 tggatttaga ccagggttgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 7 tctagaggat ccccgctgac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 8 agagagcaac tccactgtgc 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 9 ttttctactg cccaacaaag tg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 10 taggtaccat agcctagcca ag 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 11 actccagttt tctttcctgg g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 12 tgccatgtag tagctgtgtg c 21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 13 tataatgccc tctagatcca ctca 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 14 atggaaaaat aagatgtggt atgtg 25 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 15 gtagccatgg agactggact g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 16 cattatcccc tgtcacacac c 21 <210> 17 <211> 326 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <223> Proteína de SLC35A3 bovino <400> 17 Met Ser Ala Asn Leu Lys Tyr Leu Ser Leu Gly Ile Leu Vai Phe Gin 15 10 15 Thr Thr Ser Leu Vai Leu Thr Met Arg Tyr Ser Arg Thr Leu Lys Glu 20 25 30 Glu Gly Pro Arg Tyr Leu Ser Ser Thr Ala Vai Vai Vai Ala Glu Leu 35 40 45 Leu Lys Ile Met Ala Cys Ile Leu Leu Vai Tyr Lys Asp Ser Lys Cys 50 55 60 Ser Leu Arg Ala Leu Asn Arg Ile Leu His Asp Glu Ile Leu Asn Lys 65 70 75 80 Pro Met Glu Thr Leu Lys Leu Ala Ile Pro Ser Gly Ile Tyr Thr Leu 85 90 95 Gin Asn Asn Leu Leu Tyr Vai Ala Leu Ser Asn Leu Asp Ala Ala Thr 100 105 110 Tyr Gin Vai Thr Tyr Gin Leu Lys Ile Leu Thr Thr Ala Leu Phe Ser 115 120 125 Vai Ser Met Leu Ser Lys Lys Leu Gly Vai Tyr Gin Trp Leu Ser Leu 130 135 140 Vai Ile Leu Met Thr Gly Vai Ala Phe Vai Gin Trp Pro Ser Asp Ser 145 150 155 160 Gin Glu Leu Asn Ser Lys Glu Leu Ser Ala Gly Ser Gin Phe Vai Gly 165 170 175 Leu Met Ala Vai Leu Thr Ala Cys Phe Ser Ser Gly Phe Ala Gly Vai 180 185 190 Tyr Phe Glu Lys Ile Leu Lys Glu Thr Lys Gin Ser Vai Trp Ile Arg 195 200 205 Asn Ile Gin Leu Gly Phe Phe Gly Ser Ile Phe Gly Leu Met Gly Vai 210 215 220 Tyr Vai Tyr Asp Gly Glu Leu Vai Ser Lys Asn Gly Phe Phe Gin Gly 225 230 235 240 Tyr Asn Arg Leu Thr Trp Ile Vai Vai Vai Leu Gin Ala Leu Gly Gly 245 250 255 Leu Vai Ile Ala Ala Vai Ile Lys Tyr Ala Asp Asn Ile Leu Lys Gly 260 265 270 Phe Ala Thr Ser Leu Ser Ile Ile Leu Ser Thr Leu Ile Ser Tyr Phe 275 280 285 Trp Leu Gin Asp Phe Vai Pro Thr Ser Vai Phe Phe Leu Gly Ala Ile 290 295 300 Leu Vai Ile Thr Ala Thr Phe Leu Tyr Gly Tyr Asp Pro Lys Pro Ala 305 310 315 320 Gly Asn Pro Thr Lys Ala 325 <210> 18 <211> 1217 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <223> cDNA de SLC35A3 bovino <400> 18 caggcaaatg aagataaaac aatgtcagcc aacctaaaat acctttcttt aggaattttg 60 gtctttcaga ctaccagttt ggttctgacg atgcgttatt ctaggacatt aaaagaagag 120 gggcctcgtt atctgtcatc tacagctgtg gttgttgctg aacttttgaa gataatggcc 180 tgcattttat tagtctacaa agatagcaaa tgtagtctaa gagcactgaa tcgaatacta 240 catgatgaaa ttcttaataa acctatggaa acgcttaaac ttgctattcc atcagggata 300 tatactcttc agaataattt actctatgtg gcactgtcaa atctcgatgc agctacttat 360 caggtcacat atcagttgaa aattcttaca actgcactat tttctgtgtc aatgcttagt 420 aaaaaattag gtgtgtacca gtggctctcc ctagtaattt tgatgacagg agttgctttt 480 gtacagtggc cctcagattc tcaagagctt aattctaagg aactttcagc tggctcacaa 540 tttgtaggtc tcatggcagt tctcacagca tgtttttcca gtggctttgc tggggtttac 600 tttgagaaaa tcttaaaaga aaccaaacaa tcagtgtgga taagaaacat tcaacttggt 660 ttctttggga gtatatttgg attaatgggt gtatatgttt atgatggaga actggtatca 720 aagaatgggt tttttcaggg atataaccga ctgacctgga tagttgttgt tcttcaggca 780 ctgggaggcc ttgtaatagc tgctgttatt aagtatgcgg ataacatttt gaaaggattt 840 gcaacctctt tgtccataat attatcaaca ctaatatctt atttttggct acaagatttt 900 gtaccaacca gtgtcttttt ccttggagcc atccttgtaa taacagctac tttcctatat 960 ggttatgatc ccaaacctgc aggaaatccc actaaagcat agtggtaact tacctggttt 1020 ttcacagtgg tgcactggga atctcaacat taatgctgca cagaggactt ctacagattc 1080 taagagaaaa tcatcatgct gaatctgatc atgatgttca aatggtttga aaatataaaa 1140 gtttaaggat aaaatataca tatatgtaac aaaatgccta ttgcatctaa aaatcaaaac 1200 ttgaacattt ccaggga 1217 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 19 ggaggcaaat gaagataaaa c 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 20 ctatgcttta gtgggatt 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 21 gagttgcttt tgtacagtgg 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 22 actggctact atctagcaca gga 23 <210> 23 <211> 70 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 23 cacaccgctg tacaggaaaa agtgtgccaa ccctggtcta aatccaaaat ccattatctt 60 ccaagtacat 70 <210> 24 <211> 70 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 24 cgtcccctat gcgcttacta catacactca aatggaaatg ggaaaactgg aggtgtgtga 60 gccccattta 70 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 25 aagacaagga ctttcagccc 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 26 aaagagtcgg acattactga gc 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 27 ttatacgact cactataggg 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 28 atttaggtga cactatag 18 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 29 ctggaggtgt gtgagcccca ttta 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 30 ctaagagtcg aaggtgtgac tagg 24 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 31 ggccctcaga ttctc 15 <210> 32 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 32 gttgaatgtt tctta 15 <210> 33 <211> 76 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 33 cagtggccct cagattctca agagcttaat tctaaggaac tttcagctgg ctcacaattt 60 gtaggtctca tggcat 76 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 34 cacaatttgt aggtctcatg gcag 24 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 35 gccactggaa aaacatgctg tgagaaa 27 <210> 36 <211> 139 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 36 aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60 atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac ttttttctgg 120 aaaaacatgc tgtgagaac 139 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<223> Iniciador DNA <400> 37 ggccctcaga ttctcaagag c 21 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

Claims (28)

1. Método para detectar malformação vertebral complexa (CVM) de bovino em um indivíduo bovino, onde a presença de pelo menos um mar- cador genético localizado no cromossomo bovino BTA3 na região flanquea- da por e incluindo os marcadores de microssatélite polimórficos BM4129 e BMS1266 associada com malformação vertebral complexa (CVM) de bovino é identificada, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer um material genético de bovino, e b) detectar, no referido material genético, a presença ou ausência de pelo menos um marcador genético que é ligado a um traço de doença de malformação vertebral complexa de bovino, em que pelo menos um marcador genético está ligado a um gene causando doença de malformação vertebral complexa de bovino, que é o gene SLC35A3 bovino.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador genético está localizado na região de 59,5 cM a 67,9 cM.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético está localizado na região flanqueada por e incluindo os marcadores de microssatélite polimórficos INRAA003 e BMS937.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético está localizado na região flanqueada por e incluindo os marcadores de microssatélite polimórficos INRAA003 e ILSTS029.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético é o marcador de microssatéli- te INRAA003.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético é o marcador de microssatéli- te BMS2790.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético é o marcador de microssatéli- te ILSTS029.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético é o marcador de microssatéli- te INRA123.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético é o marcador de microssatéli- te BM220.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético é o marcador de microssatéli- te HUJ246.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético é o marcador de microssatéli- te BMS862.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador genético é o marcador de microssatéli- te BMS937.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene SLC35A3 bovino codifica a proteína de SLC35A3 bovina compreendendo uma sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 17.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- lo fato de que a proteína de SLC35A3 bovina é codificada por uma sequên- cia de cDNA compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 18.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe- lo fato de que o marcador genético é um polimorfismo de nucleotídeo sim- ples em uma posição equivalente ao nucleotídeo 559 de SEQ ID NO: 18.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe- lo fato de que o polimorfismo de nucleotídeo simples é um polimorfismo G/T.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe- lo fato de que a detecção do polimorfismo G/T é realizada por uma técnica selecionada do grupo consistindo em PCR específico de alelo, miniseqüen- ciamento, extensão de iniciador, piro-seqüenciamento, PCR-RFLP, amplifi- cação de círculo de laminação específico de alelo e extensão de iniciador seguida por espectrometria de massa MALDI-TOF.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido pelo menos um marcador genético é geneticamente ligado a um gene ou traço de doença causando doença de malformação ver- tebral complexa de bovino em um escore com limite de determinação (lod score) de pelo menos 3,0, tal como pelo menos 4,0, incluindo pelo menos 5.0, tal como pelo menos 6,0, incluindo pelo menos 7,0, tal como pelo menos 8.0, incluindo pelo menos 9,0 tal como pelo menos 10,0, incluindo pelo me- nos 11,0, tal como pelo menos 12,0.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador é uma combinação de marcadores genéticos.

20. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o par de iniciador para amplificação do marcador de microssatéli- te INRAA003 é SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

21. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o par de iniciador para amplificação do marcador de microssatéli- te BMS2790 é SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

22. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o par de iniciador para amplificação do marcador de microssatéli- te ILSTS029 é SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

23. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o par de iniciador para amplificação do marcador de microssatéli- te INRA123 é SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

24. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o par de iniciador para amplificação do marcador de microssatéli- te BM220 é SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.

25. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- lo fato de que o par de iniciador para amplificação do marcador de microssa- télite HUJ246 é SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

26. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- lo fato de que o par de iniciador para amplificação do marcador de microssa- télite BMS862 é SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14.

27. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que o par de iniciador para amplificação do marcador de microssa- télite BMS937 é SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16.

28. Kit de diagnóstico para emprego em detectar a presença em um indivíduo bovino de pelo menos um marcador genético associado com malformação vertebral complexa de bovino (CVM), caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência de oligonucleotídeo sele- cionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38, e combinações destes.