CZ20031664A3 - Genetický test pro identifikaci přenašečů komplexních vertebrálních malformací u hovězího dobytka - Google Patents

Description

Genetický test pro identifikaci přenašečů komplexních vertebrálních malformací u hovězího dobytka

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká genetické choroby u ** . ' hovězího dobytka nazvané komplexní vertebrální malformace $ (Complex Vertebral Malformation, CVM). Zejména se vynález týká molekulárních markérů pro identifikaci potenciálních přenašečů CVM u skotu a identifikace genového lokusu a jeho mutací, které jsou u skotu zodpovědné za CVM.

Dosavadní stav techniky

Komplexní vertebrální malformace (CVM) je vrozená vertebrální choroba zjištěná u holštýnsko-fríského (Holstein-Friesian, HF) černostrakatého plemene mléčného skotu. Choroba byla popsána nedávno (Agerholm et al.,

2000). V Dánsku všechny dosud diagnostikované případy (k 17.10.2000) byly geneticky příbuzné s dříve používaným elitním US holštýnským býkem Carlin-M Ivanhoe Bell. Podle současných údajů se jeví, že CVM je dědičnou autosomálně recesivní chorobou.

Choroba je charakterizována vrozenou bilaterální symetrickou artrogrypózou distálních kloubů a malformacemi ,*’’ páteře, zejména cerviko-thorakální junkce v kombinaci se sníženou tělesnou váhou (Agerholm et al., -1994) .

Zevně jsou pozorovatelné, následující hlavní nálezy: v mnoha případech se jeví cervikální a/nebo thorakální části páteře jako zkrácené. Stálými nálezy jsou mírné bilaterální kontrakce karpálních kloubů a vážné kontrakce a supinace falango-metakarpálního kloubu (spěnky). Kontrakce a pronace falango-metakarpálního kloubu a mírná extenze •· ···· tarsu jsou rovněž běžnými příznaky. V mnoha případech je pozorován nepravidelný průběh páteře okolo cervikothorkální junkce. Rovněž může být pozorována skolióza a mohou být přítomny léze v dalších oblastech páteře. Nepravidelný průběh je často rozpoznáván vyšetřením a palpací ventrálního vzhledu páteře. Nicméně, léze mohou být minimální a omezené na dva nebo několik obratlů. V takových případech může být páteř o téměř normální délce. Proto je doporučováno radiologické vyšetření k vyloučení vertebrálních malformací u podezřelých případů. Mícha má normální velikost a leží ve vertebrálním kanálu bez zřejmých kompresí. Při komplexní vertebrální malformací jsou s použitím radiologie zjišťovány v různých stupních hemiobratle, fúzované a chybně tvarované obratle, skolióza a ankylóza. Toto je nejlépe demonstrováno po odstranění oblouku obratle. V některých případech jsou přítomny malformace srdce, většinou jako výrazný interventrikulární defekt septa a excentrická hypertrofie pravé srdeční komory. Mohou se též objevit .malformace velkých cév. V plicích je přítomna fetální atelektáza. Sérohemoragické tekutiny jsou nejvíce přítomny v thorakální dutině. Byla pozorována řada dalších malformací, avšak tyto jsou konstantní nebo běžné nálezy. Často jsou též zjištěny léze způsobené distocií (těžkým porodem).

Byly pozorovány malformace, jak u potracených plodů, předčasně narozených telat, tak i u mrtvě narozených telat narozených v termínu. Případy u starších telat nebyly pozorovány. Obecně je snížena tělesná váha a tělesná váha je nižší u předčasně narozených telat, než u telat narozených v termínu.

Kromě toho se zdá, že je zvýšena frekvence potratů u krav inseminovaných semenem býků přenašečů. V současnosti není známá příčina tohoto jevu.

··

V současnosti je jediným dostupným prostředkem pro diagnózu CVM patologicko anatomická diagnóza na základě výše popsané přítomnosti bilaterální symetrické artrogrypózy distálních kloubů a malformací páteře, zejména červíko-thorakální junkce v kombinaci se sníženou tělesnou váhou. Nicméně, symetrické kontrakce končetin jsou běžným a obecným nálezem u telat s vertebrálními malformacemi. Proto existují problémy s diagnózou a je často obtížné rozlišit CVM od jiných malformací.

Skutečnost, že genetický defekt byl rozšířen býkem Carlin-M Ivanhoe Bell, který byl intenzivně používán po celém světě, má závažný ekonomický význam z hlediska schopnosti testovat, zda současní a potenciální plemenní býci jsou přenašeči defektu.

Aby bylo možné získat odhad frekvence potenciálních přenašečů CVM v dánské populaci hovězího dobytka, získali původci vynálezu rodokmenové informace z Dánské národní databáze skotu. V době získávání údajů (říjen 2000) bylo registrováno 919 916 čistokrevných krav a jalovic a 169 821 čistokrevných býků a býčků. Býk Bell byl nalezen 707 915 x v rodokmenu krav a jalovic a 161 043 x v rodokmenu samců.

V Tabulkách 1 a 2, uvedených níže_z je uveden počet výskytů Bella v každé rodokmenové generaci.

Tabulka 1

Výskyt Bella	v rodokmenu	dánských holštýnských krav a
jalovic
Generace č.	Frekvence	Procento	Kumulativní frekvence
2	21240	3,0	21244
3	202460	28,6	223704
4	321043	45,4	544747
5	133956	18,9	678703

• 0 «000 ···0

6	27307	3,9	706010
7	1869	0,3	707879
8	36	0,0	707915

Tabulka 2	dánských	holštýnských býků
Výskyt Bella	v rodokmenu
Generace č.	Frekvence	Procento	Kumulativní	frekvence
2	436	0,3	436
3	20144	12,	20580
4	82394	51,2 :	102974
5	44545	27,7	147519
6	12455	7,7	159974
7	1040	0,6 ;	161014
8	29	0,0	161043

Ačkoliv tato čísla rovněž zahrnují v rodokmenu některé dvojité a trojité výskyty Bella, údaje jasně ukazují, že většina dánského holštýnského skotu je potenciálním přenašečemm CVM. Je zřejmé, že problém je obrovský v globálním měřítku.

0v

Z tohoto důvodu existuje významný požadavek průmyslu chovu skotu na genetický test, který dovoluje v různých chovech identifikaci dobytka, který je potenciálním přenašečem CVM (tj. před detekovatelným počátkem klinických symptomů).

Před.tímto předkládaným vynálezem nebylo mikrosatelitní mapování aplikováno na gen způsobující výše uvedené komplexní vertebrální' malformace, který nebyl izolován nebo charakterizován. Podle nejlepší znalosti ·· ·· ···· ·· ···· • · · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · · •·· ·· · ·<

obj evena detailně dále.

původců vynálezu nebyla dosud návřžeha nebo diagnostická metoda podle vynálezu, popsaná

Podle předkládaného vynálezu, který obsahuje mapováni lokusu pro chorobu CVM, je poskytnut test DNA založený na mikrosatelitnich markérech umístěných na bovinnim chromozómu BTA3. Byla potvrzena schopnost testu definovat status přenašeče u zvířat odvozených od Bella, jak je zřejmé z dále uvedených příkladů.

Podstata vynálezu

V nejširším aspektu poskytuje předložený vynález způsob detekce přítomnosti genetického markéru, který je spojen s komplexní vertebrálnl malformací (CVM))^ u bovinního subjektu, přičemž způsob zahrnuje kroky poskytující bovinní genetický materiál, detekci v genetickém materiálu přítomnosti nebo absence alespoň jednoho genetického markéru, který je ve vazbě se znakem choroby bovinní komplexní ver,tebrální malformace, nebo specifického nukleotidového polymorfismu, který způsobuje znak komplexní vertebrálnl malformace.

V dalším aspektu se vynález týká diagnostického kitu pro detekování u bovinního subjektu alespoň jednoho markéru spojeného s bovinními komplexními malformacemi (CVM), obsahující alespoň jednu nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:'5, SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 a SEQ ID NO:38, a jejich kombinace.

Dále se vynález týká diagnostické metody zahrnující

diagnostický kit pro detekci G/T pólýmorfismu v kausativním bovinním genu SLC35A3 a rozpoznávání.CVM u skotu.

Podrobný popis vynálezu

Primárním cílem předkládaného vynálezu je umožnit identifikaci hovězího dobytka nesoucího bovinní komplexní vertebrální malformace (CVM). Tohoto je dosaženo způsobem, kterým se detekuje přítomnost genetických markérů spojených s bovinním CVM u bovinního subjektu. Konkrétněji, genetickým markérem může být bovinní gen SLC35A3, a ještě konkrétněji, specifický polymorfismus v bovinním genu SLC35A3.

Tak, jak je zde termín „bovinní subjekt použit, týká se hovězího dobytka jakéhokoliv plemene. Proto jakékoliv hovězí dobytče, samčí nebo samičí, je v termínu zahrnuto, stejně jako jsou zahrnuta jak dospělá, tak novorozená zvířata. Výraz nevyjadřuje konkrétní věk. Jeden z příkladů bovinního subjektu je příslušník populace holštýnskofríského skotu

Termín „genetický markér se týká variabilní nukleotidové sekvence (polymorfní), která je přítomna v bovinní genomové DNA na chromozomu a která je identifikovatelná se specifickými oligonukleotidy. Taková varibilní nukleotidová sekvence je například rozpoznatelná amplifikací nukleové kyseliny a pozorováním rozdílu ve velikosti nebo sekvenci nukleotidů díky polymorfismu.

Ve výhodném provedení mohou být takové genetické markéry identifikovány řadou technik,známých odborníkům v oboru a zahrnují typizování mikrosatelitů nebo krátkých repetitivních tandemových sekvencí (short tandem repeats, STR), polymorfismus délky restrikčních fragmentů (restriction.fragment lenght polymorphisms, RFLP), detekci ·· «··· * · · · · • · · • · · ·

........

nebo deleci inzerčních míst, náhódfidb amplifikaci polymorfní DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD), stejně jako typizování polymorfismu jednotlivých nukleotidů (single nucleotide polymorphism SNP) s použitím metod zahrnujících RFL-polymerázovou řetězovou reakci (restriction-fragment-lenght polymerase Chain reaction), alelově-specifickou oligomerní hybridizaci (allele-specific oligomer hybridization), oligomerně specifické ligační zkoušky, mini-sekvenování, přímé sekvenování, fluorescenčně detekované 5'-exonukleázové zkoušky, hybridizaci s PNA a LNA próbami a jiné. Nicméně, je třeba si uvědomit, že i jiné genetické markéry a techniky mohou být aplikovány v souladu s překládaným vynálezem.

Jak bylo výše uvedeno, je „bovine complex vertebral malformation (CVM) vrozenou „vertebrální chorobou. V této době byla nemoc zjištěna pouze u holštýnsko-fríského černostrakatého mléčného skotu; nicméně, uvažuje se také o tom, že mohou být postižena i jiná plemena hovězího dobytka. Chorobu nedávno popsal Agerholm et al., 2000.

Podle toho je třeba v daném kontextu CVM a znaky choroby bovinní komplexní vertebrální malformace chápat jako onemocnění vedoucí ke klinickým symptomům zde výše popsaným, jak je uvádí a definuje Agerholm ét al., 2000.

Způsob podle vynálezu zahrnuje poskytnutí bovinního genetického materiálu. Takový materiál zahrnuje bovinní DNA materiál, který může získán jakoukoliv konvenční metodou nebo prostředkem. Bovinní DNA materiál může například být extrahován, izolován a purifikován z krve (tj. čerstvé i zmrazené), vzorků tkání (tj. sleziny, bukálních stěrů), vzorků srsti, obsahujících folikulární buňky, a semene.

Jak bylo dříve uvedeno, způsob podle překládaného vynálezu dále zahrnuje krok detekce v genetickém materiálu přítomnosti nebo absence genetického markéru, který je ve

• 9 99 99 ·· 9999 • · 9 9 »9999999 99

9 9 • 9 · • 9 · • 9* 9

99 vazbě se znakem choroby bovinní komplexní vertebrální malformace.

Ke stanovení, zda je genetický markér přítomen v genetickém materiálu, může odborník v oboru aplikovat standardní metody, tj. použít amplifikaci nukleových kyselin. K určení, zda je genetický markér v genetické vazbě se znakem komplexní vertebrální malformace, může být aplikováno LOD skóre. LOD skóre , které je také někdy označováno jako Z_max,udává pravděpodobnost (logaritmus procenta pravděpodobnosti), že lokuš genetického markéru a lokus specifického genu jsou ve vazbě v určité vzdálenosti.

LOD skóre mohou být vypočítána s použitím počítačových programů, jako je program MLINK balíčku LINKAGE (Lathrop et al., 1985). LOD skóre vyšší než 3,0 je považováno za signifikantní důkaz pro vazbu mezi genetickým markérem a genovým lokusem pro znak choroby komplexní vertebrální malformace.

Podle jednoho provedení .vynálezu je genetický markér lokalizován na bovinním chromozomu BTA3. Oblast bovinního chromozomu BTA3 obsahující genetické markéry, které jsou použitelné ve způsobu podle vynálezu, je zobrazena na Obr.

2.

Podle předloženého vynálezu mohou být užitečné genetické markéry, umístěné na bovinním chromozomu BTA3 v oblasti lemované a obsahující polymorfní mikrosatelitní markéry BM4129 a BMS1266.. V jednom specifickém provedení alespoň jeden genetický markér je umístěn na bovinním chromozomu BTA3 v oblasti od přibližně 59,5 cM do přibližně 67,9 cM. V dalším provedení je alespoň jeden genetický markér umístěn na bovinním chromozomu BTA v.oblasti lemované a obsahující polymorfní mikrosatelitní markéry INRAA003 a BMS937.

» · ♦ <

·· ··

Podle dalšího aspektu je alespoň jeden genetický markér umístěn na bovinním chromozomu BTA3 v oblasti lemované a obsahující polymorfní mikrosatelitní markéry INRAA003 a ILSTS029.

Jak je popsáno v příkladech provedení, alespoň jeden genetický markér může být ve vazbě s genem způsobujícím chorobu bovinní komplexní vertebrální malformace.. Podle jednoho provedení alespoň jeden genetický markér je umístěn na bovinním.chromozomu BTA3 v oblasti lemované a obsahující polymorfní mikrosatelitní markéry BM4129 a BMS1266 v genetické vazbě se znakem onemocnění CVM nebo genovým lokusem CVM o LOD skóre alespoň 3,0, jako je alespoň 4,0 zahrnující alespoň 5,0, jako je alespoň 6,0 zahrnující alespoň 7,0, jako je alespoň 8,0 zahrnující alespoň 9,0, jako je alespoň 10,0 zahrnující alespoň 11,0 a jako je alespoň 12,0.

^!í

Specifická definice a lokus výše uvedených polymorfních mikrosatelitních markérů může být nalezena v USDA genetické mapě (Kappes et al., 1997).

Je třeba si uvědomit, že podle vynálezu pro detekci il přítomnosti nebo absence genetického markéru spojeného s CVM u bovinního subjektu může být aplikován více než jeden genetický markér. Proto alespoň jeden markér může být kombinací dvou nebo více genetických markérů, u nichž bylo prokázáno, že jsou informativní, a s jejichž pomocí se může přesnost testu zvýšit:

Proto, jak je doloženo příklady níže, může být v dalším výhodném provedení použito dvou nebo více mikrosatelitních markérů INRAA003, BMS2790, ILSTS029, INRA 123, BM220, HUJ246, BMS, BMS937 nebo jejich kombinace.

Podle vynálezu jsou nukleotidové sekvence příměrových párů pro amplifikaci výše uvedených mikrosatelitních markérů popsány níže v Tabulce 4.

φφ φφφφ • φ

Φ· φφφφ

♦ φ φ φ φ φ • φ ’^:···^:··

Komparativní mapy (Solinas-Toldo et al., 1995) ukazují, že většina bovinního chromozomu BTA koresponduje s částí lidského chromozómu 1 (HSA1). Zde uváděné genetické mapování lókusu CVM umožňuje použít informace dostupné o lidských genech a zaměřit vyhledávání kandidátských genů na geny přítomné na lidském chromozomu 1. Toto významně limituje počet kandidátských genů a umožňuje vyhledávání příčinného CVM genu.

Genetické markéry podle předloženého vynálezu mohou být připraveny s použitím různých metod známých odborníkům v oboru. Proto je třeba si uvědomit, že na základě zde uvedeného zjištění, že nukleotidové sekvence výše popsaných polymorfních mikrosatelitních markérů bovinního chromozomu BTA3 byly identifikovány jako geny ve vazbě s lokusem genu CVM, mohou být generovány další markéry ze známých sekvencí nebo určené polohy na bovinním chromozomu BTA3 pro použití ve způsobu podle předkládaného vynálezu.

Tak například, s použitím mapy znázorněné na Obr.2, může být oblast CVM bovinního chromozomu BTA3 rozdělena na mikročásti a fragmenty mohou být klonovány do vektorů pro izolaci DNA segmentů, které mohou být testovány na vazbu s lokusem genu CVM. Nebo s použitím nukleotidových sekvencí, uvedených v Tabulce 4, mohou být získány DNA segmenty z oblasti CVM pomocí amplifikace nukleové kyseliny (např. polymerázovou řetězovou reakcí ) nebo sekvenováním nukleotidů relevantní oblasti bovinního chromozomu BTA3 („chromosome walking).

Kromě toho naznačuje výše uvedená homologie mezi bovinním chromozomem BTA3 a lidským chromozomem 1 (HSA1), že jakýkoliv gen nebo exprimovaná sekvence tag, která je zmapována v této analogické lidské oblasti, může rovněž mapovat oblast CVM bovinního chromozomu BTA3. Proto geny nebo konzervované sekvence, které mapují lidský chromozom ·· ···· *'· ··*· • · · · · · 1 • · · 1 1 * · · · · 1 · 1 · ........... ·· ··

HSAl, mohou být analyzovány na vazbu s lokusem genu CVM s použitím rutinních metod.

Genotypizace je založena na analýze genomové DNA, která může být poskytnuta s použitím standardních extrakčních metod, jak je zde popsáno. Jestliže je genomová DNA izolována a purifikována, může být použita amplifikace nukleové kyseliny (např. polymerázová řetězová reakce) k amplifikaci oblasti DNA odpovídající každému genetickému markéru pro použití v analýze pro detekci přítomnosti genetického markéru spojeného s CVM v bovinním subjektu.

Proto diagnostický kit pro použití v tomto provedení obsahuje, v oddělených baleních, alespoň jednu oligonukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ IDÍNO:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 a SEQ ID NO:38 a jejich kombinace.

Identifikace mutace v kausativním bovinním genu SLC35A3 a diagnostika CVM u skotu

Na základě zjištění genomové lokalizace genu CVM s ohraničením polymorfními mikrosatelitními markéry, bylo provedeno vyhledávání pro identifikaci strukturálního genu a kauzativní mutace, která může být použita jako rozhodující genetický markér pro CVM.

Byla identifikována sdílená sekvenční homologie mezi lidským genomem a oblastí CVM, definované jako oblast mezi markéry INRA003 a ILSTS029. Markér BMS2790 je lokalizován v tomto intervalu (Obr. 1). Nejprve bylo identifikováno 5 odlišných klonů z bovinní BAC knihovny (RPCI-42, • · • · • ·

·· ·« • · · . ·» ··♦· • · · zkostruované a zpřístupněné P.de Jonge a spolupracovníky), každý obsahující jeden z markérů INRA003, ISLTS029 nebo BMS2790. S použitím sekvenčních informací získaných z těchto BAC klonů, bylo identifikována jedna oblast na lidském chromozomu 1, která obsahovala oblast homologie k BAC obsahujícím markér, a to s využitím programu BLASTIN ve veřejné sekvenční databázi. Interval oblasti představuje 6 miliónů párů baží a je lokalizován přibližně v pozici 107.4-113.5 (Obr.3)(ENSEMBL prohlížeč, The Sanger Centre)).

Izolace a sekvenování SLC35A CDNA.

Na základě alignmentu ke stanovení homologie SLC35A genu mezi homo sapiens a canis familiaris byly navrženy 2 oligonukleotidy (oligos) (SL1F a SL8R) pro amplifikací téměř úplné cDNA pro bovinní SLC35A3, včetně kodonu start. Byla provedena PCR na cDNA izolované ze'vzorků srdeční tkáně, získaných ze standardního zvířete (wild type), přenašeče CVM a postiženého zvířete. Aby byla získána sekvence 3' konce genu, byl výsledný PCR fragment sekvenován a navržen nový oligo (SL5F). ,Pro amplifikací 3'konce SLC35A byl použit SL5F v kombinaci s oligo (bSLCBVIR), navržený s použitím zveřejněné sekvence parciální bovinní EST (genbank, dbEST). Sekvence cDNA (SEQ ID NO:18) a sekvence translatovaného peptidu (SEQ ID NO:17) bovinního SLC35A jsou uvedeny na Obr. 4. Protein kódovaný bovinním SLC35A3 obsahuje 326 aminokyselin a sdílí homologii s rodinou dříve známých proteinů zúčastněných v transportu cukerných složek nukleotidů z cytosolu do Golgiho aparátu. Alignment, zobrazený na Obr. 5, znázorňuje homologii s proteiny SLC35A3, dříve popsanými u člověka (Ishida et al, 1999) a u psa (Guillen et al., 1998).

040·

0' 0 • 4 • 0 0 ·

0 • 0 • . 0 •000 000·

0400

0 0

0 0 0 0 0 • 0 0 0

Detekce polymorfismu v genu SLC35A3

Pro detekci potenciálního polymorfismu v bovinním genu SLC35A3 byla provedena PCR amplifikace genu s použitím cDNA izolované ze vzorků srdeční tkáně, získané z přenašeče CVM i

a postiženého zvířete v uvedením pořadí. Sekvenování fragmentu izolovaného z postiženého zvířete odhalilo sekvenci identickou se sekvencí standardní s tou výjimkou, že postižené zvíře bylo homozygotní pro nukleotid T v nukleotidové pozici 559, ve srovnání se zvířetem standardním, které je v odpovídající pozici homozygotní pro G (viz Obr. 4). Sekvenování cDNA ze zvířete, které je přenašečem CVM defektu, ukázalo, že toto zvíře je heterozygotní a má jak T, tak G v pozici 559.

Záměna G za T v pozici 559 ovlivňuje sekvenci výsledného peptidu záměnou valinu v pozici 180 za fenylalanin (viz Obr. 4).

Typizace polymorfismu SLC35A3 zkouškou na základě DNA sekvenování

Obr. 6 ukazuje výsledky získané ze sekvenování PCR fragmentu amplifikovaného z genomové DNA a obsahující oblast (od 544 do 572 SLC35A3 cDNA, pro číslování viz Obr. 4) obsahující G/T mutaci. Levé a pravé části obrázku ukazují „forward a reverse sekvenování v uvedeném pořadí. Horní řádek (označený -/-) ukazuje výsledek pro standard, uvádí G v polymorfní. pozici s> použitím forward sekvenování a C v obdobné pozici na druhém řetězci s použitím reverse sekvenování (označeno hvězdičkami). Dolní řádek (+/+) ukazuje výsledek z postiženého zvířete, uvádí T v polymorfní pozici s použitím forward sekvenování a A v obdobné pozici na druhém řetězci s použitím reverse • Φ φφ • φ φ φ • φ • φ • φ φφφφ φφφφ φφ *·«· • φ · φ φ φ φφφ · φφφ φφ φ φφ φφφφ φ φ « • φ φφφ φ • φ φ φ φφ φφ sekvenování (označeno hvězdičkami). Heterozygot (+/-) je uveden ve střední části obrázku a podle očekávání vykazuje směs signálů,jak zvířete standardního, tak zvířete postiženého, a proto má jak T, tak G signál s použitím forward sekvenování a A a C signál na druhém řetězci.

Všechna telata postižená CVN jsou homozygotní pro T-alelu.

Byla provedena genotypizace 39 kusů telat postižených CVM pomocí sekvenování PCR produktu amplifikovaného z genomové cDNA /(viz Obrázek 6 a Příklad 6). Všechna tato zvířata byla homozygotní pro T-alelu, což potvrdilo počáteční výsledky.

T-alela není nalézána u zvířat nepříbuzných s býkem Bell

Vzhledem k tomu, že bylo uváděno postižení CVM pouze u plemenných zvířat, v jejichž rodokmenu byl široce používaný býk Bell, bylo studováno, zdá je T-alela přítomna u zvířat, která nejsou s Bellem příbuzná. S využitím Dánské databáze hovězího dobytka (Danish Cattle Database) bylo identifikováno 496 zvířat holštýnského plemene bez Bella v rodokmenu a byly jim odebrány vzorky. Byla provedena genotypizace těchto zvířat sekvenováním PCR produktu amplifikovaného z genomové DNA (viz Obr.6 a Příklad 6). Žádné z těchto zvířat neobsahovalo T-alelu, což naznačuje, že tato alela je výlučně nalézána v linii zvířat blízce příbuzných s Bellem.

Sekvenováním bylo genotypizováno více než 326 nepříbuzných (alespoň po poslední tři generace) zvířat z odlišných 12 chovů. Všechna tato zvířata byla homozygotní pro alelu divokého typu (G-alela), což opět demostruje nepřítomnost alely mající vztah k CVM (T-alely) v obecné populaci dobytka.

Stanovení polymorfismu SLC35A3 pomocí alelově-specifické

PCR.

K účinnému stanovení polymorfismu G/T byla vyvinuta alelově-specifická zkouška s použitím BIOLASE Diamond DNA polymerázy od Bioline. Tata polymeráza' vyžaduje přesné párování 3'konce primeru s templátem a chybné párování v této pozici má za následek žádnou (nebo velmi slabou) amplifikaci. Tímto způsobem je možné rozlišit zvířata standardní, přenašeče a nemocná zvířata pomocí identifikace přítomnosti nebo nepřítomnosti alelově-specifických produktů PCR (Obr. 7). Levá část Obr. 7 ukazuje alelově specifické produkty PCR kódujícího řetězce. Jak bylo očekáváno, vykazují standardní zvířata amplifikaci s Gspecifickým primerem, nikoliv však s T-specifickým primerem. Přenašeči vykazují amplifikaci jak

G-, tak T-specifických primerů, zatímco nemocná zvířata vykazují pouze amplifikaci s t-specifickým primerem. Pravá část obrázku ukazuje alelově-specifické produkty PCR nekódujícího řetězce, a jak bylo očekáváno, vzorky jsou shodné, jako u kódujícího řetězce. Standardní zvířata jsou C homozygotní, přenašeči jsou C/A heterozygotní a nemocná zvířata jsou A homozygotní.

Na základě výše popsaných výsledků a s použitím metody „positional candidate gene approach byl identifikován bovinní gen, který je homologní s lidským genem SLC35A3 kódujícím UDP-N-acetylglukosaminový transportér. V rámci tohoto genu byl identifikován polymorfismus, který pozměňuje aminokyselinovou sekvenci proteinu. Všechna postižená analyzovaná telata (39)jsou homozygotní pro T♦ ··· ·· ···<· ·· n 4 4 · · • 4 «

• *

444» 4444 alelu (T/T) a známí přenašeči (108) jsou všichni heterozygotní pro polymorfismus (G/T). Analýza více než 500 zvířat holštýnského plemene, vybraných jako nepříbuzných s Bellem, neidentifikovala žádná zvířata nesoucí T-alelu. Více než 1500 zvířat, majících v rodokmenu Bella, bylo analyzováno, aniž by bylo nalezeno jediné nepostižené zvíře homozygotní v T-alele. Dále, více než 300 dobytčat vybraných z 12 odlišných chovů bylo analyzováno, aniž by byla nalezena T-alela u jakéhokoliv z těchto zvířat. Shrnuto, zjištění popsaná v předkládaném vynálezu prokazují, že T-alela je přítomna v jednotlivé kopii u zvířat, která jsou přenašeči CVM a ve dvou kopiích u zvířat postižených CVM. Detekce T-al'ely v pozici 559 (číslování podle Obr. 4) je proto diagnostikující pro CVM a je ideální pro detekci přenašečů defektu CVM.

Protože byl identifikován G/T polymorfismus jako kauzativní pro CVM, jakékoliv markéry svázané s tímto polymorfismem mohou být diagnostikující pro CVM v bovinní populaci. Předkládaný vynález tedy popisuje metodu identifikace bovinních subjektů buďto postižených CVM, nebo přenašečů CVM, stanovením přítomnosti G/T polymorfismu v pozici 559 v bovinním genu .SLC35A3, a to buď nepřímo analýzou jakýchkoliv markérů, takových jako zde popsaných mikrosatelitů, které jsou svázány s bovinním SLC35A3 genem, nebo přímo analýzou sekvence bovinního genu SLC35A3, např. tak, jak je popsáno výše a detailněji v příkladech provedení.

Do rozsahu předkládaného vynálezu spadá způsob detekce a/nebo kvantifikace přítomnosti genetického markéru asociovaného s bovinním CVM u bovinního subjektu tak, aby bylo možné identifikovat bovinní subjekty postižené CVM nebo přenašeče CVM. Kroky postupu zahrnují:

a) poskytnutí bovinního genetického materiálu, a

• · ·· ···· • · • ·

b) detekci, v řečeném genetickéťn materiálu, přítomnosti nebo absence alespoň jednoho genetického markéru, který je ve vazbě se znakem choroby komplexní vertebrální malformace.

Tento alespoň jeden genetický markér je ve vazbě s genem způsobujícím bovinní chorobu CVM, přičemž řečený gen byl identifikován jako bovinní gen SLC35A3, který kóduje bovinní SLC35A3 protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedena v SEQ ID NO:17.

Konkrétně, předkládaný vynález se týká způsobu detekce bovinní CVM, kde genetickým markérem je polymorfismus jednoho nukleotidu v pozici ekvivalentní nukleotidu 559 ze SEQ ID NO:18, přičemž řečený polymorfismus v jediném nukleotidu je G/T polymorfismu.

Předkládaná přihláška dále popisuje účinnou zkoušku pro genotypizaci daného polymorfismu s použitím alelověspecifické PCR. Tato metoda je jednou z celého souboru metod pro typizaci SNPs, přičemž metody, které mohou být použity, bez omezení zahrnují „mini-sequencing (mini- sekvenování), „primer-extension (extenzi* primerů), „pyrosequencing (pyro-sekvenování), PCR-RFLP, „allele-specifíc rolling circle-amplification, „primer extension s následnou „MALDI-TOF hmotovou spektrometrií, stejně jako metody ze souboru jiných enzymových a hybridizačních metod.

Bylo zjištěno, že fenotyp podobný CVM existuje u myší mutovaných v genu „lunatic fringe (Evrad et.al., 1998). Podobně jako dobytčata postižená CVM vykazují myši homozygotní pro nulovou mutaci v „lunatic fringe pozměněnou somitovou segmentaci a patterning, mají zkrácenou osu těla, vertebrální a žeberné fúze a neúplně vyvinuté obratle (Evrad et al., 1998). Zdá se, že „fringe se účastní ve stanovení ohraničení a somitovém patterningu modulací aktivity receptorů Notch (Klein and Arias, 1998;

• Λ ···· ····

Moloney et al., 2000, Bruckner et ais, 2000). Zdá se, že Notch-modulační aktivita je zprostředkována Nacetylglukosáminyl-transferázovou aktivitou „fringe, která v Golgiho aparátu iniciuje elongaci O-vázaných zbytků fukózy připojených v Notch k repetitivním sekvencím „EGFlike repeats(Moloney et al., 2000, , Bruckner et al.,

2000). '

Kromě toho, protože bovinní gen SLC35A3 je homologní s lidským genem SLC35A3, je na základě zde uvedené informace zřejmé, jak analyzovat kódující sekvenci lidského genu SLC35A3 na kausativnost a diagnostikovat mutace při studiu lidských vývojových defektů, zejména zahrnujících somitovou segmentaci a patterning.

Očekávalo by se, že účinek mutace v N-acetylglukosaminyl transportéru lokalizovaném v Golgiho aparátu (SLC35A3), působící na transport

N-acetylglukosaminu z cytosolů do lumen Golgiho aparátu, připraví proteiny z rodiny „fringe o jejich substráty.

Toto by působilo na schopnost „fringe modulovat aktivitu Notch, a tak způsobilo segmentační defekt, jako je CVM. Je velmi pravděpodobné, že mutace v SLC35A3, bez ohledu na to, že byla diagnostikována pro CVM, je rovněž mutací způsobující široce rozšířené genetické defekty.

Vynález je podrobněji popsán v následujících příkladech provedení.

Příklady provedení

Příklad 1

Genetické mapování komplexní vertebrální malformace (CVM) • ·' · · · · • · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·

Tento příklad ilustruje lokalizaci lokusu genu CVM na bovinním chromozómu BTA3. Kromě toho, provedení popisuje identifikaci markérů, které jsou ve vazbě s lokusem genu CVM, a tak charakterizaci oblasti CVM bovinního chromozomu BTA3.

Pro mapování lokusu zodpovědného za CVM byly získány vzorky od zvířat zahrnutých v brídingové studii. Stručně, přibližně 300 krav a dojnic odvozených od býka T Burma a inseminovaných semenem od býka KOL Nixon bylo vybráno pro brídingovou.studii. Na základě post mortem vyšetření bylo vybráno třináct krav, jak popsal Agerholm et al., 2000. Těchto 13 krav, stejně jako jejich rodiče, v celkovém počtu 28 zvířat, bylo použito pro počáteční genomové skenování. Zvířata byla od svého společného předka, čistokrevného býka Carlin-M-Ivanhoe Bell, oddělena čtyřmi generacemi.

Bylo provedeno genomové skenování pokrývající všech 29 autosomů, s použitím souboru mikrosatelitních markérů získaných z USDA genome map (Kappes et al., 1997). Markéry byly vybrány v párech ve vzdálenosti 10 a 20 cM.

V oblastech pochybností díky malé informovanosti o markérech, byly začleněny a typizovány nové markéry. Celkem bylo použito 194 markérů. Reakce PCR byly provedeny duplexně v objemu 5 μΐ v ABI 877 PCR Robot (Applied Biosystems), obsahujícím 12 ng genomové DNA, 1 x PCR pufr, 0,4 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), 20 pmol každého z primerů a 2,0 mM MgCl₂. Všechny markéry byly podrobeny stejným podmínkám PCR: inkubace při 94 °C, po dobu 12 minut pro aktivaci enzymu, 35 cyklů při 94 °C, 30 s; teplota, 45 s; 72 °C, 20 s, končící konečným prodloužením při 72 °C po 10 minut. Prvních deset cyklů teplota poklesla z 67 °C na 58 °C, o jeden stupeň v každém cyklu, a zbývajících 25 cyklů byla teplota fixována na 58 °C. Produkty PCR byly shromážděny a 5 až 9 odlišných markérů bylo sledováno v • · · · • · · · každé dráze ABI 377 (Apllied Biosystems), a gely byly analyzovány doprovodným softwarem. Alely byly označeny pomoci Genotyper programme (Version 2.1, Applied Biosystems).

Pro tři markéry byly vypočítány „two-point LOD skóre s použitím programu MLINK balíčku LINKAGE (Lanthrop et al., 1985). Díky struktuře rodokmenu (Obr. 1) s mnohonásobnými inbrídingovými smyčkami, byl rodokmen rozdělen na třináct malých rodin, t j . pro každou postiženou krávu mající „Sire (KOL Nixon), „dam a „maternal grandsire (T Burma). Předpokládalo se, že onemocnění je děděno recesivně s kompletní penetrancí genotypu.

Byla zjištěna signifikantní vazba pro všechny tři markéry. Nejvyšší LOD skóre(Zjbylo zjištěno u BMS2790 a ILSTS029, a to Z = 10,35 při 0=0. Kromě toho sousedící markér INRA003 byl rovněž v signifikantní vazbě s lokusem CVM (Tabulka 3).

Tabulka 3 „Two point LOD skóre (Z) a rekombinantní frakce (0)z analýzy vazby lokusu CVM a markérů na bovinním chromozomu

3.

Markér	Rekombinantní frakce	LOD skóre (Z)
BMS2790	0,00	10,35
INRA003	0,003	6, 44
ILSTS029	0,00	10,35

Uvedené výsledky lokalizují lokus CVM na BTA3 (Obrázek 2) podle genetické mapy USDA (Kappes et al., 1997).

Jedenáct telat bylo homozygotních pro interval definovaný pomocí INRA003, BMS2790, ILSTS029, BMS862 a HUJ246, zatímco samotné BMS2790 a ILSTS029 byly homozygotní • · · · • · · • · · · » ······· ·· ti u všech třinácti telat, jak je uvedeno na Obrázku 1. Bylo možné zkonstruovat haplotypy těchto markérů, což umožnilo dedukovat nejpravděpodobnější haplotyp CVM (Obrázek 1). Haplotypy jsou definovány velikostí markerových alel, které jsou číslovány od 1 do N, kde 1 definuje nej kratší alelu amplifikovaného markéru a N definuje nejdelší alelu. Konkrétní délky alel asociovaných s CVM Bell jsou následuj ící:

INRA003 (alela číslo 3): 176 párů baží

BMS2790 (alela číslo 3): 118 párů baží

ILSTS029 (alela číslo 2)·: 164 párů baží

BMS862 (alela číslo 1): 130 párů baží

HUJ246 (alela číslo 3) : ‘262 párů baží.

Skutečné délky alel závisejí na primerech, které byly použity pro amplifikaci markérů, délky fragmentů uvedených výše jsou založeny na použití primerů popsaných v Tabulce 4.

Kromě toho bylo do studie začleněno dalších sedmnáct postižených krav zařazených jako součást programu „Danish surveillance programme for genetic defects (Dánský program dozoru nad genetickými defekty). Všechna postižená zvířata měla jako společného předka čistokrevného býka Bella. Za použití standardních metod byla DNA extrahována z krevních vzorků nebo semene.

Bylo genotypizováno sedmnáct krav a jejich matky s 8 markéry INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937 a HUJ246 umístěných na BTA3 v oblasti od přibližně 59,5cM do 67,9cM, a protože bylo předpokládáno, že dodatečných 17 krav, podobně jako v původní brídingové studii, pochází ze společného předka býka Bella, bylo očekáváno, že existuje u všech postižených krav podobná oblast identity v rodové linii (IBD). Ukázalo se, že u 17 ze 17 telat byl chromozomový segment definovaný pomocí • ·

INRA003 a BMS2790 homozygotní, nesoucí stejné alely, jako mají zvířata z brídingové studie. U dvou z devatenácti zvířat byla pozorována heterozygotnost v lokusech ILSTS029 a BMS86 , vysvětlitelná jako důsledek jednoduché rekombinace mezi BMS2790 a ILSTS029. Na základě kombinace výsledků genotypizace bylo tak zjištěno, že genetický defekt CVM je nepravděpodobněji lokalizován v intervalu menším než 6 cM, lemovaný markéry INRA003 a ILSTS029, jak je znázorněno na Obrázku 2 s označením „CVM region.

Sekvence primerů pro 8 použitých markérů INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937, a HUJ246 jsou uvedeny v následující Tabulce 4.

Tabulka 4 .

Genetický Sekvence primerů SEQ ID NO markér

INRA003

F: R:

CTG CTA

GAG AGA

GTG GTC

TGT GAA

GAG GGT

CCC GTG

CAT ACT

TTA AGG

SEQ SEQ

ID ID

NO: NO:

1 2

BMS2790

F:

AAG

ACA

AGG

ACT

TTC

AGC

CC

SEQ

ID

NO:

3

R:

AAA

GAG

TCG

GAC

ATT

ACT

GAG

C

SEQ

ID

NO:

4

ILSTS029

F:

TGT

TTT

GAT

GGA

ACA

CAG

CC

SEQ

ID

NO:

5

R:

TGG

ATT

TAG

ACC

AGG

GTT

GG

SEQ

ID

NO:

6

INRA123

F:

TCT

AGA

GGA

TCC

CCG

CTG

AC

SEQ

ID

NO:

7

R:

AGA

GAG

CAA

CTC

CAC

TGT

GC

SEQ

ID

NO:

8

BM220

F:

TTT

TCT

ACT

GCC

CAA

CAA

AGT

G

SEQ

ID

NO:

9

R:

TAG

GTA

CCA

TAG

CCT

AGC

CAA

G

SEQ

ID

NO:

10

HUJ246

F:

ACT

CCA

GTT

TTC

TTT

CCT

GGG

SEQ

'ID

NO:

11

R:

TGC

CAT

GTA

GTA

GCT

GTG

TGC

SEQ

ID

NO:

12

BMS862

F:

TAT

AAT

GCC

CTC

TAG

ATC

CAC

TCA

SEQ

ID

NO:

13

R:

ATG

GAA

AAA

TAA

GAT

GTG

GTA

TGT

G SEQ

ID

NO

: 14

BMS

F:

GTA

GCC

ATG

GAG

ACT

GGA

CTG

SEQ

ID

NO:

15

R:

CAT

TAT

CCC

CTG

TCA

CAC

ACC

SEQ

ID

NO:

16

·· ·· • · · · · v ·· ··

Příklad 2

Diagnostický test pro identifikaci přenašečů CVM

Diagnostický test pro stanovení bovinních přenašečů CVM byl založen na určení, zda potomci Bella byli nositelé haplotypu asociovaného s onemocněním.

Test byl založen na 8 mikrosatelitních markérech INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862, BMS937 a HUJ246 a závisel na rozpoznání alel specifických pro onemocnění nebo haplotypu (viz obrázek 1) u zvířat, která jsou potomky Bella.

Tímto způsobem bylo stanoveno, že zvířata jsou přenašeči, jestliže měla dědičné s onemocněním spojené alely v oblasti definované markéry INRA003, BMS2790, ILSTS029 a BM22 od Bella neboi od zvířat, která jsou potomky Bella. U zvířat, která nezdědila haplotyp spojený s onemocněním od Bella nebo od zvířat, jež jsou potomky Bella, bylo pak stanoveno, že nejsou přenašeči.

V případech, kdy Bell haplotyp byl rozštěpen rekombinací, byla zvířata označena jako neurčitelná. Čtyři dodatečné markéry byl použity pouze v případech, kdy informační obsah v testovaných markérech byl snížen díky neschopnosti rozlišení mezi maternální a paternální dědičností.

Podobně jako všechny genetické testy založené na DNA markérech ve vazbě, i CVM test má nedostatek v možnosti, že není možné stanovit dvojitou rekombinací (po jedné rekombinací na každé straně kausativního genu mezi genem a lemujícími markéry). Tato možnost jev současnosti extrémně vzácná, vzhledem k těsné vazbě mezi markéry a genem CVM, a proto je spolehlivost testu odhadována na více než 99 %.

•'· ·'· ·· ···· ·· ···· • 9 · · · · · ·· ·

Příklad 3

Disekce tkáni, izolace RNA a syntéza cDNA

Zhruba 5 gramů srdeční tkáně od mrtvě narozených telat bylo během 3 hodin po porodu rozřezáno a bezprostředně zmraženo v tekutém dusíku a uchováváno při -80 °C. 250 mg tkáně bylo použito pro izolaci RNA. RNA byla izolována s použitím RNA izolačního kitu Stratagene (kat.200345).

Byla syntetizována cDNA smícháním 2,5pg celkové RNA s 1 pg oligo (dT)i₂-is (500 pg/ml), 1 pl lOmM směsi dNTP a H₂O k dosažení konečného objemu 12 pl. Výsledná směs byla zahřáta při 65 °C po dobu 5 minut, zchlazena na ledu a rychle odstředěna. Po přidání 4 pl 5 x „first strand buffer, 2 pl 0,lM DTT a 1 pl H₂O, byly obsahy smíchány a inkubovány při 42 °C po dobu 2 minut,a po té byl přidán 1 pl (200 U) Superscript II (GibcoBRL® Lifetechnologies) a inkubace pokračovala při 42 °C po dobu 1,5 hodiny. Reakce byla inaktivována při 70 °C po dobu 15 minut. K odstranění RNA byla cDNA inkubována při 37 °C po 20 minut s 1 U RNAsy H (Roche Molecular Biochemicals).

Příklad 4

Sekvenování SLC35A3

Na základě homologního alignmentu genu SLCL35A3 mezi homo sapiens a canis familiaris, byly navrženy 2 oligos (SL1F a SL8R) pro amplifikaci téměř celé cDNA pro bovinní SLCL35A3, včetně start kodónu. Pro získání 3' konce genu byl vznikající PCR fragment sekvenován a byl navržen nový oligo (SL5F). Pro amplifikaci 3'konce SLC35A3 byl použit SL5F ·· ···· v kombinaci s oligo (bSLCBVIR), na základě publikované sekvence pro bovinní EST.

Pro oba průměrové sety byly použity shodné podmínky. PCR reakce byly prováděny v GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) v konečném objemu 10 μΐ 10xNH₄ reakčního pufru, 0,5 μΐ 20mM MgCl₂, 0,8 μΐ dNTPs (2,5 mM každého), 5,65 μΐ H₂O, 1 μΐ forward a reverse primeru (5 pmol každého) a 0,05 μΐ 5 U/μΙ BIOTAQ DNA polymerázy (Bioline).

PCR reakce spočívala v prvním zahřívacím aktivačním stupni při 95 °C po dobu 2 minut, následovalo 10 cyklů denaturace po 30 s při 95 °C, anelování při 62 °C po dobu 30 s (0,5 °C snížení) a elongace po 20 s při 72 °C včetně dalších 30 cyklů s denaturačním krokem po 30 s při 95 °C, při teplotě anelování 57 °C po 30 s a elongačním kroku při 72 °C po dobu 30 sekund.

Pro amplifikaci kompletní SLC35A3 cDNA byly použity následující primery:

SL1F: 5'- GGA GGC AAA TGA AGA TAA AAC-3'(SEQ ID NO:19)

SL8R: 5'- CTA TGC TTT AGT GGG ATT3'- (SEQ ID NO:20)

SLF: 5'- GAG TTG CTT TTG TAC AGT GG-3'(SEQ ID NO:21) BSLCBVIR: 5'- ACT GGC TAC TAT CTA GCA CAG GA-3'(SEQ ID NO:22).

Kompletní cDNA sekvence byla získána s použitím primerů ve čtyřech oddělených cyklech sekvenčních reakcí s použitím purifikovaných PCR produktů jako templátů. PCR produkty byly purifikovány s použitím SPIN-X® (Corning Incorporated) z 0,8% agarózového gelu „Seakem.

Cyklické sekvenovací reakce byly prováděny v GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) a zahrnovaly iniciační krok při 96 °C po 2 min, následovaný 99 cykly při 96 °C po 10 s, 55 °C po dobu 5 .s a 60 °C po 4 min. Sekvenční produkty byly precipitovány dvěma objemy ethanolu a 1/10 ·· ·· 91 ···· «· 1111 • · · · » · Φ · φ φ φ · 119 1111

1111 1111 li 9 11 11 objemu 3Μ NaAc (pH 5,5), promyty 70% ethanolem, resuspendovány v 5 μΐ zaváděcího pufru a naneseny na 4% akrylamidový gel pro sekvenování s použitím ABI377 automatického sekvenátoru.

Sekvence cDNA bovinního SLC35A3 je znázorněna na Obr.

(SEQ ID NO:18).

Příklad 5

Identifikace a izolace BAC obsahujících mikrosatelitní markéry

Hybridizace na filtru

Filtry byly prehybridizovány v hybridizačním roztoku (6xSSC (52,6 g NaCl, 26,46 g citrátu sodného na litr), 5x Denhardtův roztok (2 g Ficcolu (typ 400, Pharmacia), 5 g polyvinylpyrrolidonu, 5 g hovězího sérového albuminu (Fraction V, Sigma), 0,5% SDS a 50 μρ/ml SS-DNA) při 65 °C po dobu 3 hodin bez rotace. 100 μΐ oligonukleotidu značeného na 5'konci bylo pak inkubováno s filtry po 16 hodin při 65 °C. Pro konečné značení bylo 5 pmol oligonukleotidu kombinováno s 5 μΐ (50 μθί) gamma-³²P-ATP (o specifické aktivitě > 5000 Ci/mmol), 2 μΐ lOx kinázového pufru, 11. μΐ H₂O a 1 μΐ (10 U) T4 polynukleotid kinázy (New England Biolabs lne.), a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1,5 hodiny s následným 5 minutovým zahřátím pro tepelnou inaktivaci enzymu. Za použití standardních metod byla značená próba precipitována NaAc/ethanolem a po promytí v 70% ethanolu byla próba znovu rozpuštěna ve 100 μΐ H₂O. Po hybridizaci byly filtry jednou promyty s promývacím roztokem I (2xSSC, 0,2% SDS) a dvakrát při 65 ··- *-· ·'·' ···· «· ···· * ·' '· · * · · ·. · · °C promývacím roztokem II (0,lxSSC, 0,5% SDS) a exponovány na Kodak BIOMAX™ MS film po 2 dny při 80°C.

Pro identifikaci ILSTS029 a INRA003 pozitivních BAC klonů byly použity následující značené 5'-oligonukleotidy:

ILSTS029 oligo: 5'-CAC ACC GCT GTA CAG GAA AAA GTG TGC CAA CCC TGG TCT AAA TCC AAA ATC CAT TAT CTT CCA AGT ACA T3 ' (SEQ ID NO:23)

INRA003 oligo: 5'-CGT CCC CTA TGC GCT TAC TAC ATA CAC TCA AAT GGA AAT GGG AAA ACT GGA GGT GTG TGA GCC CCA TTT A3'(SEQ ID NO:24).

PCR skríning bovinní knihovny BAC

Pooly BAC byly připraveny z knihovny BAC a skrínovány pomocí PCR. Reakce PCR byly prováděny v GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) v konečném objemu 10 μί sestávajícího z 1 μΐ 10xNH₄ reakčního.pufru, 0,5 μΐ 50mM MgCl2, 0,8 μΐ dNTPs (každého 2,5 mM), 5,65 μΐ H₂O, 1 μί forward a reverse primeru (5 pmol každého) a 0,05 μΐ 5 ϋ/μΐ BIOTAQ DNA polymerázy (Bioline).

Pro identifikaci klonů BAC obsahujících BMS2790 pomocí PCR byly použity následující primery:

BMS2790F: 5'-AAG ACA AGG ACT TTC AGC CC-3'(SEQ ID NO:25)

BMS2790R: 5'-AAA GAG TCG, GAC ATT ACT GAG C-3'(SEQ ID NO: 2 6) .

PCR reakce spočívala v prvním zahřívacím aktivačním stupni při 95 °C po dobu 2 minut, následovalo 10 cyklů denaturace po 30 s při 95 °C,:anelování při 70 °C po dobu 30 s (0,5 °C snížení) a elongace po 20 s při 72 °C včetně dalších 30 cyklů s denaturačním krokem po 30 s při 95 °C, ·» «··· ·♦ '· '· anelování při 65 °C po 30 s a elongacě při 72 °C po dobu 20 sekund.

Izolace a sekvenování BAC DNA

BAC DNA byla připravena podle Quiagens Large Construct Kit, přibližně 1 pg BAC DNA bylo použito jako templát pro cyklizační sekvenování prováděném s BigDye™ Terminátor Cycle Sequencing Kit.(PE Applied Biosystems). Cyklické sekvenační, reakce byly prováděny v konečném objemu 6 μΐ obsahujícím 1 μΐ primerů (5 pmol), 1 μΐ reakčního pufru a 2 μΐ H₂O. Cyklické sekvenační reakce byly prováděny v GeneAmp®PCR System 9700 (Applied Biosystems) a zahrnovaly iniciační krok při 96 °C po 2^ min následovaný 130 cykly 96 °C po 10 s, 55 °C po 5 s a 60 °C po 4 min. Sekvenační produkty byly precipitovány dvěma objemy ethanolu a 1/10 objemu 3M NaAc (pH 5,5), promyty 70% ethanolem, resuspendovány ve 2 μΐ zaváděcího pufru a naneseny na 4% akrylamidové sekvenační gely s použitím automatického sekvenátoru.

Primery pro sekvenování:

	T7 :	5'	-TTA	TAC	GAC	TCA	CTA	TAG	GG-3' (SEQ	ID NO:27
	SP6:	5'	-ATT	TAG	CTG	ACA	CTA	TAG-	-3'(SEQ ID	NO:28)
-?	INRA003F: NO:29)	5'	-CTG	GAG	CTG	TGT	GAG	CCC	CAT TTA-3'	(SEQ ID
	INRA003R:	5'	-CTA	AGA	GTC	GAA	GGT	GTG	ACT AGG-3	(SEQ ID

NO:30).

. -9-9 99 *999 99 9999 • · · 9 9 9 9 9 9 9 • 9,99 9 9 9 9 • 9 9 9 9 999 9

9999 9999 ♦» “9 99 ·9

Příklad 6

Stanovení statutu CVM sekvenováním

PCR reakce (2μ1 purifikované templátové/vzorkové genomové DNA, 2 μΐ lOxPCR pufru, 2 μΐ 25mM MgCl₂, 3,3 μΐ 0,2mM každého z dNTP (Ultrapure dNTP, 27-2033-01; Amersham Pharmacia Biotech), 6 pmol primeru (forward: CBFEX1, 5'-GGC CCT CAG ATT CTC-3'(SEQ ID NO:31); reverse:CBTEXR, 5'-GTT GAA TGT TTC TTA-3')(SEQ ID NO:31), 0,165 U Taq polymerázy (Biotaq, M95801B; Bioline), dH₂O do konečného objemu) byly prováděny v odmaštěných 96-jamkových destičkách s použitím Primus HT (MWG Biotech AG). Cyklizační podmínky: 95 °C 120 s, 35x [95 °C 20 s, *55 °C 15 s, 60 °C 70 s]. Postreakční čištění bylo provedeno gelovou filtrací (Millipore Filtration System)se Sephádex G-50 Superfine (17-0041-01, Amersham Pharmacia Biotech), prováděném podle doporučení výrobce, s použitím 50 μΐ dH₂O pro konečnou eluci vzorku. Forward a reverse sekvenační reakce byly prováděny se stejnými primery, jaké byly použity pro generování produktu PCR (2 μΐ produktu PCR, 8 μΐ sekvenační směsi, 0,6 μΐ 6 il pmol primeru (viz výše), dH₂O i do objemu 20 μΐ; DYEnamic ET Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit (US81095). Po termocyklování (30x [95 °C 20 s, 55 °C 15 s, 60 °C 70 s] byly vzorky čištěny gelovou filtrací, jak je uvedeno výše, a analyzovány na MegaBACElOOO (Amersham Pharmacia Biotech) s použitím LPA „long-read matrix a následujících sekvenačních podmínek: 90 s injekce při 3 kV a 35 min run time při 9 kV.

• · <· > · · ' · »· · · ···*

.. ·· ···· * · · • · · ·· ···· • · ě • ♦ ' · • · · ♦' »· ··

Příklad 7

Alelově-specifická PCR zkouška

Byly navrženy primery z cDNA sekvence a čtyři alelověspecifické primery byly navrženy tak, aby měly 3'bázi v pozici mutace.

Primerové sekvence:

T_fwd: 5'-CAG TGG CCC TCA GAT TCT CAA GAG CTT AAT

TCT AAG GAA CTT TCA GCT GGC TCA CAA TTT GTA GGT CTC ATG GCA T-3'(SEQ ID NO:33)

G_fwd: 5'-CAC AAT TTG TAG GTC TCA TGG CAG-3'(SEQ ID

NO:34)

A_rev: 5'-GCC ACT GGA AAA ACA TGC TGT GAG AAA3'(SEQ ID NO:35)

C_rev_link*: 5'- aat gct act act att agt aga att gat gcc

acc	ttt tca	gct	cgc	. gcc	cca	aat	gaa aat ata gct	aaa	cag	gtt
att	gac cat	ttg	ega	aat	gta	tet	aat ggt caa act	ttt	ttc	TGG
AAA	AAC ATG	CTG	TGA	GAA	C-3	'(SEQ ID NO:36)
Fwd:	5'-GGC	CCT	CAG	ATT	CTC	AAG	AGC-3'(SEQ ID NO	:37)
Rev:	5'-CGA	TGA	AAA	AGG	AAC	CAA	AAG GG-3'(SEQ ID	NO:	38) .
C_rev_link primer obsahuje linkerovou sekvenci z	fága M13

(uvedena malými písmeny). Tento linker byl přidán pro získání delšího produktu PCR tak, aby bylo možné multiplexovat C-a A-primery v jedné PCR reakci. 3'báze v pozici mutace je uvedena tučným písmenem. C- a G-primery φφφφ φφ φφ «····'< -φφ '* · · · · φ · · -φ φ • Φ , Φ Φ φ 4 4 4 • 4 4 4 4 4 · φ Φ φ • · Φ Φ Φ Φ Φ φ φ ·φ·φ..φ· φ. ♦ φφ φφ jsou specifické pro standardní (wilďtype) alelu, zatímco Ta A-specifické primery jsou specifické pro mutaci.

Primerové páry:

C- a A-specifický multiplex: Fwd + A_rev + C_rev_link (dolní řetězec, lower strand)

T-specifická reakce: T_fwd + Rev (horní řetězec, upper strand)

G-specifická reakce: G_fwd + Rev (horní řetězec, upper strand).

Podmínky alelově specifické PCR (AS-PCR)

Každá PCR reakce byla prováděna v objemu 10 μΐ, obsahujícím 20-100 ng genomové DNA, 0,025 jednotek/μΐ BIOLASE Diamond DNA polymerázy, 0,75 mM dNTPs, 3 mM MgCl2, 0,25 prnol/μΐ primeru (0,125 pmol/μΐ dvou reverse primerů v multiplexu) v 1 x NH₄ pufru (Bioline). PCR byla prováděna v GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) za následujících podmínek: 95 °C po 4 min, 35 cyklů při 94 °C po 30 s, 62 °C (56 °C pro T- a G- reakci) na 80% rampě po 30 s, a 72 °C po 30 s následovaných konečnou extenzí při 72 °C po 7 min a uchováváním při 4 °C. Po PCR -následovala elektroforéza na 2% agarózovém gelu při 200 V po 30 min.

Výsledky alelově-specifické PCR analýzy pro dvě standardní zvířata, dva přenašeče a dvě postižené zvířata jsou znázorněny na Obrázku 7.

Popis obrázků

Obrázek 1 znázorňuje rodokmen použitý pro lokalizaci lokusu bovinní komplexní vertebrální malformace (CVM) a haplotypy pěti mikrosatelitních markérů na bovinním chromozomu 3.

Nejpravěpodobnější haplotypy CVM jsou vytištěny tučně.

44 4 ,44 4444 44 · . · 4 4 4 , 4 4 4 4 4 4

4444 >4 4 4

4· 4 4 4 4 4

4 44 44

Černě vybarvené čtverce představují postižené krávy.

Dvojitá čára mezi „sire a „dam naznačuje inbrídingovou smyčku. N znamená počet zvířat. Genotypy třinácti odlišných „dam nejsou z důvodu zjednodušení uvedeny.

Obrázek 2 znázorňuje genetickou mapu bovinního chromozomu

3. Počty po stranách se týkají genetických vzdáleností uvedených v centiMorgan (cM) podél chromozomu. Je vyznačeno nejpravděpodobnější umístění lokusu bovinní komplexní vertebrálnl malformace (CVM).

Obrázek 3 znázorňuje relativní vzdálenost v cM mezi 3 mikrosatelitními markéry ILSTS029, BMS2790 a INRA003 (uvedeno v řádku označeném jako „contig markers na bovinnim Chr.3) na bovinnim chromosomu 3, jak bylo zobrazeno U.S.Meat Animal Research Center (Kappes et al. 1997) . BACs obsahující tyto 3 markéry byly izolovány buďto hybridizaci k replikačním filtrům o vysoké hustotě („high density replica filters) (ILSTS029 a INRA003), nebo pomocí PCR skríningu RPCI-42'bovinní BAC knihovny (BMS2790) . Identifikované BACs jsou znázorněny černými čarami a označeny počet na plotnu/počét na jamku. BACs byly podrobeny sekvenování konců („end-sequencing) s použitím SP6 a T7 primerů nebo sekvenování s použitím primerů extendujících z mikrosatelitů. Výsledné sekvence byly porovnány (BLAST) proti lidskému chromosomu 1 s použitím Ensemble Server v Sanger Centre. Přírůstková čísla z „blast search jsou uvedena jako čísla pod. lidským chromosomem 1 a relativní vzdálenosti mezi zásahy jsou uvedeny v MB.

Vybrané geny v oblasti jsou uvedeny v políčkách.

Obrázek 4 znázorňuje cDNA sekvenci a translaci genu SLC35A3 (SEQ ID NO:18) a kódovanou aminokyselinovou sekvenci (SEQ _ · ·', «4 .. · ♦ 4444 ·· «··«

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·' 9 ^ 9 9 9 9 9 4 ' • · 4 · · 4444 •4444444 44 4 44 99

ID NO:17). Polymorfní nukleotid v pďzici 559 a dotčený valin v pozici 180 jsou vytištěny tučně.

Obrázek 5 uvádí porovnání odvozené aminokyselinové sekvence genu skotu SLC35A s lidským genem (AB021981)(Ishida et al. 1999) a genem psa (AF057365)(Guillen et al. 1998). Tečky označují zbytky, které odpovídají sekvenci Bos taurus (skotu). Pomlčky označují mezery, které byly zavedeny pro optimalizaci alignmentu.

Obrázek 6 uvádí výsledky získané ze sekvenování oblasti (od nukleotidu 544 do nukleotidu 572 genu SLC35A3, viz Obrázek 4) a znázorňuje G/T polymorfismus v pozici 559 při stanovení statutu CVM sekvenováním. Levé a pravé sloupce ukazují „forward a „reverse sekvenování v uvedeném pořadí. Horní řádek (-/-) uvádí sekvenování standardního zvířete (wild type), střední řádek uvádí sekvenování přenašeče (heterozygot) a dolní řádek uvádí výsledek sekvenování postiženého zvířete.

Obrázek 7 je zobrazením produktů alelově-specifické PCR od dvou zvířat standardních, dvou zvířat přenašečů a dvou postižených zvířat. WT: standard (wild type), C:přenašeč (carrier), S: nemocné zvíře (sick), neg: negativní kontrola, M:marker (velikostní měřítko). Šipky označují alelově-specifické produkty PCR: C: 220 bp, A: 98 bp, T:340 bp a G: 288 bp.

•0 ····

0

0' . ·· 00 „99 *·0 0 • 0 0' · ·' · , 0 ·' 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0^S0₇ ·. • ’ ’ 0 0 0 0 0 *0

000····· ·· · >· ··

Reference

1. Agerholm 3S, Bendixen, C., Andersen O., Arnbjerg, 3. (2000) LK meddelelser October 2000.

2. Barendse W, Vaiman D, Kemp SJ, Sugimoto Y, Armitage SM, Williams JL, Sun HS, Eggen A, Agaba M, Aleyasin SA, Band M, Bishop MD, Buitkamp J, Byrne K, Collins F, Cooper L, Coppettiers W, Denys B, Drinkwater RD, Easterday K, Elduque C, Ennis S, Erhardt G, Li L, Lil L (1997) A medium-density genetic linkage map of the bovine genome. Mamm Genome 8, 21-28.

3. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., & Cohen, S., (2000) Glycosyltransferrase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions Nátuře 406, pp. 411-415.

4. Evrad, Y. A., Lun, Y., Aulehla, A,. Gan, L., & Johnson, R. L. (1998) Lunatic fringe is an • essential mediator of somite segmentation and patterning. Nátuře 394, pp. 377-381.

5. Guillen, E., Abeijon, C., & Hirschberg, C. Β. (1998) Mammalian Golgi apparatus UDP-Nacetylglucosamine transportér: Molecular cloning by phenotypic correction of a yeast mutant. Proč. Nati. Acad. Sci.USA. 95, pp. 7888-7892.

6. Ishida, N., Yoshioka, S., Chiba, Y., Takeuchi, M., & Kawakita, M. (1999) Molecular cloning and functional expression of the human golgi UDP-N-acetylglucosamine transportér. 3. Biochem. 126, pp. 68-77.

7. Kappes SM, Keele JW, Stone RT, McGraw RA, Sonstegard TS, Smith TP, Lopez-Corrales NL, Beattie CW (1997) A second-generation linkage map of the bovine genome.

Genome Res 7, 235-249.

8. Klein, T., & Arias, M. (1998) Interactions among Delta, Serrate and Fringe modulate Notch activity during drosophila wing development. Development 125, pp. 2951-2962.

9. Lathrop GM, Lalouel JM, Julier C, Ott J (1985) Multilocus linkage analysis in humans: detection of linkage and estimation of recombination. Am J Hum Genet37, 482-498

10. Moloney, D.J., Panln, V. M., Johnston, S. H., Chen, J., Shao, L., Wilson, Y., Stanley, P., Irvine, K. D., Haltiwanger, R. S., & Vogt, T. F. (2000) Fringe is a glycosyltrahsferase that modifies Notch. Nátuře 406, pp 369-375.

11. SolinasrToldo S, Lengauer C, Fries R (1995) Comparative genome map of human and cattle Genomics 27, 489-496.

Claims (30)

1. Patentové nároky

   1. Způsob detekce bovinní komplexní vertebrální malformace (CVM) u bovinního subjektu, ve kterém je stanovována přítomnost alespoň jednoho genetického markéru lokalizovaného na bovinním chromosomu BTA3 v oblasti lemované 'a obsahující polymorfní mikrosatelitní markéry BM4129 a BMS1266, asociovaného s bovinní komplexní vertebrální malformací (CVM) kde řečený způsob zahrnuje :

   a) poskytnutí bovinního genetického materiálu a

   b) detekci, v řečeném genetickém materiálu, přítomnosti nebo absence alespoň jednoho genetického markéru, který je ve vazbě se znakem bovinní komplexní vertebrální malformace.
2. 2. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je lokalizován v oblasti od přibližně 59,5 cM do přibližně 67,9 cM. ‘ ^;
3. 3. Způsob podle nároku 2, kdé alespoň jeden genetický markér je lokalizován v oblasti lemované a obsahující polymorfní mikrosatelitní markéry INRAA003 a BMS937.
4. 4. Způsob podle nároku 3, kde alespoň jeden genetický markér je lokalizován v oblasti lemované a obsahující polymorfní mikrosatelitní markéry INRAA003 a ILSTS029.
5. 5. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je mikrosatelitní markér INRAA003.
6. 6. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je mikrosatelitní markér BMS2790.

   »» ···· . · ·„ ♦« , «» '·*«· ο » · · · · · · · · « · ·· · , · · • ··»·· .·· , • · ··» « · · ·

   3θ ····.·,. ·« . ., .,
7. 7. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je mikrosatelitní markér ILSTS029.
8. 8. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je mikrosatelitní markér INRA123.
9. 9. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je mikrosatelitní markér BM220.
10. 10. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je mikrosatelitní markér HUJ246.
11. 11. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je mikrosatelitní markér BMS862.
12. 12. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je mikrosatelitní markér BMS937.
13. 13. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden genetický markér je ve vazbě s genem způsobujícím onemocnění bovinní komplexní vertebrální malformace.
14. 14. Způsob podle nároku 13, kde gen způsobující onemocnění bovinní komplexní vertebrální malformace je bovinní gen SLC35A3.
15. 15. Způsob podle nároku 14, kde bovinní gen SLC35A3 kóduje bovinní SLC35A3 protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:17.
16. 16. Způsob podle nároku 15, kde bovinní protein SLC35A3 je kódován sekvencí cDNA obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:18.

    • 1, ·*·♦·«

    91. 119 1

    11 ·

    111 ·· 11

    1 11 • » 1

    1 11 1

    11 99
17. 17. Způsob podle nároku 16, kde genetický markér je polymorfismus jednoho nukleotidu v pozici ekvivalentní nukleotidu 559 v SEQ ID NO:18.
18. 18. Způsob podle nároku 17, kde polymorfismus jednoho nukleotidu je G/T polymorfismus.
19. 19. Způsob podle nároku 18, kde detekce polymorfismu G/T je prováděna technikou vybranou ze skupiny sestávající z alelově-specifické PCR, mini-sekvenování, extenze primerů, pyro-sekvenování, PCR-RFLP, alelově-specifické „rolling circle-amplifikace, extenze primerů následovaná MALDI-TOF hmotovou spektrometrií.
20. 20. Způsob podle nároku 1, kde řečený alespoň jeden markér je v genetické vazbě s genem nebo znakem způsobujícím onemocnění bovinní komplexní vertebrální malformace o LOD skóre alespoň 3,0, jako je alespoň 4,0 zahrnující alespoň 5,0, jako je alespoň 6,0 zahrnující alespoň 7,0, jako je alespoň ‘8,0 zahrnující alespoň 9,0, jako je alespoň 10,0 zahrnující alespoň 11,0 a jako je alespoň 12,0.
21. 21. Způsob podle nároku 1, kde alespoň jeden markér je kombinací genetických markérů.
22. 22. Způsob podle nároku 5, kde primerový pár pro amplifikaci mikrosatelitního markéru INRAA003 je SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:2.

    4 4 444· • 4,. -444 4 • '4 • 4 44 * 4 4 4 « • 4 4 4 4

    44 4» 4444

    4 4 4 4 4 4

    4 «« 4 4
23. 23. Způsob podle nároku 6, kde průměrový pár pro amplifikaci mikrosatelitního markéru BMS2790 je SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4.
24. 24. Způsob podle nároku 7, kde primerový pár pro amplifikaci mikrosatelitního markéru ILSTS029 je SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:6.
25. 25. Způsob podle nároku 8, kde primerový pár pro amplifikaci mikrosatelitního markéru INRAA123 je SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO:8.
26. 26. Způsob podle nároku 9, kde primerový pár pro amplifikaci mikrosatelitního markéru BM220 je SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:10.
27. 27. Způsob podle nároku 10, kde primerový pár pro amplifikaci mikrosatelitního markéru HUJ246 je SEQ ID NO:11 a SEQ ID NO:12.
28. 28. Způsob podle nároku 11, kde primerový pár pro amplifikaci mikrosatelitního markéru BMS862 je SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:14.
29. 29. Způsob podle nároku 12, kde primerový pár pro amplifikaci mikrosatelitního markéru BMS937 je SEQ ID NO:15 a SEQ ID NO:16.
30. 30. Diagnostický kit pro použití k detekci přítomnosti alespoň jednoho genetického markéru v bovinním subjektu, asociovaného s bovinní komplexní vertebrální malformací (CVM), obsahující alespoň jednu nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO:1, SEQ ID ·· ··«· *· ·♦ ·* «·4» * · ♦ · · · · « « · _ · - · _ · · * ·· * • · · · · · · ·· · ·· ·· ···»·«··

    NO: 2, SEQ I D 1 NO:3, S EQ ID NC i: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ SEQ ID NO: 7 r SEQ ID NO: 8, SE IQ ID NO:9, SEQ ID NO NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO: 34, NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 a SEQ ID > NO :38

    kombinací .