PL206118B1 - Kombinacja farmaceutyczna wykazująca synergizm terapeutyczny in vivo w leczeniu chorób nowotworowych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kombinacja farmaceutyczna wykazująca synergizm terapeutyczny in vivo w leczeniu chorób nowotworowych. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy kombinacji docetakselu (Taxotere®) z cyklino-zależną kinazą, flawopirydolem.

Taksany i taksoidy są rodziną naturalnie występujących związków diterpenowych, obejmującą silny lek przeciwnowotworowy, paklitaksel. Paklitaksel (Taxol®) początkowo wyodrębniony z kory drzewa Pacific Yew (Taxus brevifolia/cis krótkolistny), okazał się być bardzo skutecznym środkiem we wspomagającym leczeniu i nowym wspomagającym leczeniu pacjentów z rakiem sutka i rakiem jajników. Stwierdzono także niedawno, że jego półsyntetyczny analog, docetaksel (Taxotere®), jest także skuteczny w chemoterapii raka sutka, która rozwija się w szereg chorób wrażliwych na tę klasę związków, włącznie z rakiem płuc i rakiem okrężnicy. Zarówno Taxol® (paklitaksel) jak i Taxotere© (docetaksel) wiążą się z tubuliną, hamują rozpad mikrokanalików i ograniczają mitozę, blokując przez to przejście przez fazę M cyklu komórkowego i ułatwiając apoptozę.

Pomimo niewątpliwych ogólnych sukcesów klinicznych taksoidów, niektóre nowotwory rozwijają oporność na leczenie tymi lekami. Ta odporność na leki może być wewnętrzną właściwością nowotworu lub też może rozwinąć się u nowotwora w czasie. Donoszono o trzech głównych mechanizmach oporności nowotworów: (i) punktowe mutacje genu tubuliny, (ii) selekcja izopostaci tubuliny o małej zdolności wiązania z taksanami i (iii) ekspresja fenotypu o oporności wielolekowej (MDR) pośredniczona przez pompę wypływową P-glikoproteiny (P-gp) kodowana przez gen mdr1. Mechanizm (iii) może wyjaśniać wewnętrzną oporność na Taxol© i Taxotere® nowotworów, które często wewnętrznie wyrażają P-gp, takich jak raki okrężnicy i nerek.

Kombinacje lub zestawy według wynalazku umożliwiają uniknięcie lub opóźnienie zjawiska oporności pleotropowej lub „oporności wielolekowej.

Wytwarzanie Taxol'u® i Taxotere® oraz ich pochodnych jest przedmiotem, na przykład, zgłoszeń Patentów Europejskich EP 0,253,738 i EP 0,253,739 oraz Zgłoszenia Patentu Międzynarodowego PCT WO 92/09,589.

Stwierdzono obecnie i stanowi to przedmiot niniejszego wynalazku, że skuteczność docetakselu (Taxotere®) można znacznie polepszyć, gdy jest on podawany w kombinacji z jedną substancją, która jest użyteczna w leczeniu przeciwnowotworowym i ma identyczny lub różny mechanizm działania, jak ten taksan.

Substancją, która może być stosowana w połączeniu lub w kombinacji z Taxotere® jest enzym, cyklino-zależna kinaza, mianowicie flawopirydol.

Ponieważ aktywność produktów zależy od stosowanych dawek, możliwe jest stosowanie wyższych dawek i zwiększenie aktywności, z równoczesnym zmniejszeniem zjawiska toksyczności lub opóźnianie ich włączanie do działania przez połączenie czynników wzrostu typu krwiotwórczego, takich jak G-CSF lub CM-CSF lub pewnych interleukin z docetakselem (Taxotere®).

Przedmiotem wynalazku jest kombinacja farmaceutyczna wykazująca synergizm terapeutyczny in vivo w leczeniu chorób nowotworowych, zawierająca docetaksel (Taxotere©) i flawopirydol.

Kombinacja według wynalazku nadaje się do podawania oddzielnie i w różnym czasie.

Korzystnie, docetaksel (Taxotere®) podaje się w pierwszym i ostatnim dniu dziesięciodniowego cyklu leczenia a flawopirydol podaje się w ciągu pierwszych czterech dni i ostatnich czterech dni wspomnianego cyklu dziesięciodniowego.

Korzystnie również docetaksel (Taxotere®) podaje się w 14 i 23 dniu leczenia a flawopirydol podaje się w dniach od 14 do 17 i dniach od 20 do 23.

Korzystnie, flawopirydol podaje się doustnie.

Szczególnie korzystnie, docetaksel (Taxotere®) podaje się w 14 i 25 dniu leczenia a flawopirydol podaje się doustnie w dniach od 14 do 18 i dniach od 21 do 25.

Szczególnie korzystna jest kombinacja według wynalazku, w której jednym składnikiem jest docetaksel (Taxotere®) a drugim składnikiem jest flawopirydol, przy czym wspomniane składniki podaje się oddzielnie i w różnym czasie a flawopirydol podaje się doustnie.

Wszystkie powyższe postaci kombinacji według wynalazku nadają się zwłaszcza do leczenia choroby nowotworowej takiej jak rak sutka oraz rak płuc.

Cyklino-zależne kinazy (CDK) są ważnymi regulatorami, które sterują przebiegiem w czasie i koordynacją cyklu komórkowego. CDK tworzą odwracalne kompleksy z ich obowiązkowym partnerem cyklinowym dla sterowania przejścia przez kluczowe węzły w cyklu komórkowym.

PL 206 118 B1

Na przykład, zaktywowany kompleks CDK-4 - cyklina D1 reguluje przejście przez fazę G1, podczas gdy kompleks CDK-1 - cyklina B1 reguluje wejście w fazę mitozy cyklu komórkowego. Wiadomo, że wewnątrzpochodne inhibitorowe proteiny cyklino-zależnych kinaz (CDKI) wiążą albo CDK albo składnik cyklinowy i hamują aktywność kinazy. W wielu nowotworach, takich jak czerniaki, raki trzustki i raki przeł yku, te naturalne CDKI są albo nieobecne, albo zmienione. Tak więc, selektywne inhibitory CDK mogą okazać się być skutecznymi środkami chemoterapeutycznymi.

Flawopirydol (cis-5,7-dihydroksy-2-(2-chlorofenylo)-8-[4-(3-hydroksy-1-metylo)-piperydynylo]-1-benzopiran-4-on) jest syntetycznym flawonem, dla którego stwierdzono, że wykazuje aktywność przeciwnowotworową przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych, takich jak ludzki nowotwór płuc, nowotwór sutka oraz hamuje także wzrost nowotworu w modelach heteroprzeszczepowych. Stwierdzono, że wywołuje on zatrzymanie zarówno fazy G1 jak i G2 cyklu komórkowego. Flawopirydol jest silnym i selektywnym inhibitorem CDK a jego aktywność przeciwnowotworowa jest związana z aktywnoś cią hamowania CDK. Badania pokazał y, ż e jego aktywno ść hamowania wzrostu nowotworu odbywa się w cyklu komórkowym w specyficzny sposób. Patrz Bioorg. & Med. Chem. Letters, 10:1037-1041 (2000).

Taxotere® i flawopirydol mają różne mechanizmy działania, które mogą polepszyć skuteczność każdego z nich. Polepszenie skuteczności kombinacji według wynalazku może zostać przedstawione przez określenie synergizmu terapeutycznego. Kombinacja wykazuje synergizm terapeutyczny, jeśli jest lepsza w leczeniu niż jeden lub drugi ze składników stosowanych w ich optymalnej dawce (T. Corbett i inni, Cancer Treatment Reports, 66: 1187 (1982)).

W celu przedstawienia skuteczności kombinacji może być potrzebne porównanie maksymalnej tolerowanej dawki kombinacji z maksymalną tolerowaną dawką każdego z oddzielnych składników w omawianych badaniach. Skuteczność może być oceniana ilościowo, na przykład, jako log10 uśmierconych komórek, które określa się zgodnie z następującym wzorem:

log10 uśmierconych komórek = T-C(dni)/3,32xTd, w którym T-C reprezentuje czas wzrostu komórek, który jest ś rednim czasem w dniach dla nowotworu leczonej grupy (T) i nowotworów leczonej grupy (C), który musi osiągnąć określoną wartość (na przykład 1 g) a Td przedstawia czas w dniach potrzebny do dwukrotnego zwiększenia objętości nowotworu u zwierząt kontrolnych (T. H. Corbett i inni, Cancer, 40, 2660-2680 (1977); F. M. Schabel i inni, Cancer Drug Development, Część B, Methods In Cancer Research, 17, 3-51, Nowy Jork, Academic Press Inc., (1979)). Produkt uważany jest za aktywny, jeśli log10 uśmierconych komórek jest większy niż, lub równy 0,7. Produkt uważany jest za silnie aktywny, jeśli log10 uśmierconych komórek jest większy niż, lub równy 2,8.

Kombinacja, stosowana w jej własnej maksymalnie tolerowanej dawce, w której każdy ze składników jest zawarty w dawce generalnie nie przekraczającej jego maksymalnie tolerowanej dawki, będzie wykazywać synergizm terapeutyczny, gdy log10 uśmierconych komórek jest większy niż wartość log10 uśmierconych komórek najlepszego ze składników podawanego samodzielnie.

Skuteczność kombinacji w stosunku do stałych nowotworów może być oznaczana doświadczalnie w następujący sposób.

Zwierzęta poddawane doświadczeniom, generalnie myszy, szczepi się podskórnie obustronnie za pomocą 30 do 60 mg fragmentu nowotworu w dniu zero. Zwierzęta obciążone nowotworem miesza się przed poddaniem różnymi postaciami leczenia i kontroli. W przypadku leczenia zaawansowanych nowotworów, nowotworom pozwala się na wzrost do określonych rozmiarów a zwierzęta, u których nowotwór rozwinął się w stopniu niedostatecznym eliminuje się. Wyselekcjonowane zwierzęta rozdziela się przypadkowo do określonego leczenia i kontroli. Zwierzęta nie noszące w sobie nowotworu mogą być także poddawane takiemu samemu leczeniu jak zwierzęta z nowotworem, w celu umożliwienia rozróżnienia efektu toksycznego od specyficznego działania na nowotwór. Chemoterapia zaczyna się generalnie od 3 do 22 dnia po zaszczepieniu, zależnie od typu nowotworu a zwierzęta obserwuje się każdego dnia. Różne grupy zwierząt waży się 3 lub 4 razy w tygodniu, aż osiągnie się maksymalną utratę masy a następnie waży się grupy przynajmniej raz w tygodniu aż do końca doświadczenia.

Nowotwory mierzy się 2 lub 3 razy na tydzień aż nowotwór osiągnie około 2 g lub, gdy zwierzę zdechnie, jeśli zdarzy się to zanim nowotwór osiągnie 2 g. Zwierzęta poddaje się sekcji zwłok po uśmierceniu.

Aktywność przeciwnowotworową określa się zgodnie z różnymi parametrami podanymi w tabelach 1 i 2.

PL 206 118 B1

Do badań wpływu kombinacji na białaczki, zwierzęta szczepi się określoną ilością komórek i określa się aktywność przeciwnowotworową przez zwiększenie czasu przeżycia leczonych zwierząt w stosunku do zwierząt kontrolnych. Produkt uważa się za aktywny, jeśli zwiększenie czasu przeżycia jest większe niż 27% i uważa się za bardzo aktywny, jeśli zwiększenie wynosi więcej niż 75%, w przypadku biał aczek P388.

W przykładach podanych dalej, myszy szczepi się gruczolakorakiem sutka MA 13/C i leczy kombinacjami Taxotere® i flawopirydolu z różnymi reżimami podawania i różnymi sposobami podawania. Zarówno Taxol jak i Taxotere oraz flawopirydol mogą być podawane doustnie jak też i dożylnie. Niektóre z tych reżimów wykazują wyraźny synergizm terapeutyczny.

Dodatkowe przedmioty i korzyści wynalazku zostaną przedstawione w następującej dalszej części opisu, a część będzie oczywista z opisu lub może wypływać z realizacji wynalazku. Przedmioty i korzyś ci z wynalazku zostaną zrealizowane i uzyskane za pomocą skł adników i kombinacji szczególnie podkreślonych w załączonych zastrzeżeniach.

Powinno być zrozumiałe, że zarówno niniejszy opis ogólny jak i dalszy opis szczegółowy są jedynie przykładowe i wyjaśniające i nie są ograniczające dla wynalazku podanego w zastrzeżeniach.

P r z y k ł a d 1

W celu określenia aktywności każdego ze składników kombinacji Taxotere® i flawopirydol podawane są pojedynczo myszom obciążonym MA 13/C. Taxotere® podawany był dożylnie w 15 i 21 dniu; dawka w każdym dniu wynosiła 30 mg/kg a dawka ogólna wynosiła 60 mg/kg. Przy podawaniu pojedynczo, dawka ta dawała log10 uśmierconych komórek wynoszący 4,7 i ogólną odpowiedź u wszystkich tak 5 leczonych myszy. Podawanie samego flawopirydolu w dniu 15 i 21 w dawce 6 mg/kg każdego dnia lub w ogólnej dawce 12 mg/kg prowadziło do braku odpowiedzi u 5 badanych myszy.

Związki łączono następnie na dwa różne sposoby i badano w reżimie przerywanym. W pierwszej kombinacji flawopirydol podawany był najpierw w dniu 15 i 20 (ogólna dawka 9 mg/kg) a Taxotere® podawany był w następnych dniach 16 i 21 (ogólna dawka 45 mg/kg). Przy podawaniu w ten sposób, uzyskiwano log10 uśmierconych komórek wynoszący 5,5 i całkowitą odpowiedź u wszystkich 5 na 5 leczonych myszy. W tym przerywanym reż imie log10 uś mierconych komórek był lepszy niż dla Taxotere® podawanego samodzielnie i wciąż dawał 5 na 5 odpowiedzi niezależnie od faktu, że podawano o 25% mniej Taxotere® i o 25 mniej % flawopirydolu w tej kombinacji niż w przypadku zwierzą t kontrolnych.

Gdy składniki kombinacji podawane były odwrotnie i Taxotere® był podawany jako pierwszy w dniu 15 i 20 a flawopirydol podawany był w dniu 16 i 21 w tych samych iloś ciach, log10 uś mierconych komórek był nieco mniejszy niż dla samego Taxotere®, lecz wystąpiło znowu 5 odpowiedzi na 5. Tabela I przedstawia te wyniki i pokazuje, że kombinacja flawopirydolu i Taxotere® podawanych w iloś ci mniejszej o 25% miał a skuteczność podobną do samego Taxotere®.

T a b e l a 1

Kombinacja flawopirydol Taxotere® dla myszy noszących MA 13/C: odstęp 24 godziny

Środek IV	Reżim	HNTD (DT) mg/kg	% bwl (nadir)	Ick	Uwagi
docetaksel	flawopirydol
Taxotere®	15,21	30,0	-	8(27)	4,7	5/5 CR
		(60)				HDE
Flawopirydol	15,21	-	6,0	6(16)	0,4	0/5 CR
			(12,0)
Kombinacja odstęp 24h Flawopirydol 1-szy	15,20	22,5	4,5	7(22)	5,5	5/5 CR
Taxotere®	16,21	(45,0)	(9,0)			HDE
Taxotere 1-szy		22,5	4,5	7(25)	4,4	5/5 CR
		(45,0)	(9,0)			HDE

PL 206 118 B1

Td = 2,2 dni; czas dla zwierząt kontrolnych osiągnięcia 1 g = 20,3 dni; średnia masa na początku leczenia - 130-160 mg; CR = całkowita odpowiedź; IV = dożylnie; bw1 = utrata masy w najniższym stanie; nadis = stan najniższy; (DT) dawka ogólna; HNDT = najwyższa dawka nie toksyczna; lck = log10 uśmierconych komórek.

P r z y k ł a d 2

Zwiększono ilość dni, w których podawano flawopirydol i odkryto, że gdy myszy noszące w sobie MA 13/C poddane zostały działaniu podobnych dawek flawopirydolu podawanych przez 8 dni w 10 dniu cyklu, podczas gdy Taxotere® podawany był w dniu pierwszym i ostatnim dziesięciodniowego cyklu, wystąpił wyraźny synergizm.

Tabela 2 poniżej podaje najwyższe nietoksyczne dawki całkowite każdego ze składników samego - 96,8 mg/kg Taxotere® i 23,2 mg/kg flawopirydolu. Gdy składniki były podawane w kombinacji, przy czym Taxotere® był podawany w dniu 14 i 23 a flawopirydol w dniach 14-17 i 20-23, trzy kombinacje były wyraźnie synergiczne a czwarta wykazywała taką samą skuteczność jak sam Taxotere®. Wszystkie cztery kombinacje powodowały 6 na 6 kompletnych odpowiedzi, tzn. 100% kompletnych odpowiedzi.

Przeprowadzono 3 ubogie badania dawka-odpowiedź u myszy C3H/HeN noszących mierzalne nowotwory na początku terapii (230 mg). Wybranym modelem był mysi gruczolakorak sutka MA 13/C, wybrany na bazie jego chemowrażliwości na docetaksel. Myszy leczono flawopirydolem (tzn. raz dziennie w dniu 14 do 17 i w dniach 20-23 po wszczepieniu nowotworu lub docetakselem (tzn. w dniach 14 i 23) lub ich kombinacją . Wyniki: przy najwyż szej dawce nie toksycznej (HNDT, 2,9 mg/kg/dawkę , ogólnej dawce 23,2 mg/kg), flawopirydol podawany IV jako pojedynczy składnik był nieaktywny z log uśmierconych komórek netto -0,4 (log uśmierconych komórek netto = opóźnienie wzrostu nowotworu - czas trwania leczenia/3,32 x czas podwojenia nowotworu) i nie wystąpiła regresja całkowita (CR). HNDT dla samego docetakselu (48,1 mg/kg/wstrzyknięcie, ogólna dawka 96,8 mg/kg) okazał się bardzo aktywny (log uśmierconych komórek netto 3, 6/6 CR). Otrzymano wyraźny synergizm przy kombinacji najwyższych dawek nietoksycznych (flawopirydol z 1,93 mg/kg/dawkę i docetaksel z 53,2 mg/kg/wstrzyknięcie) z log uśmierconych komórek netto 7,6 i 6/6 CR. Ta kombinacja był a dobrze tolerowana, wywołując 13% utratę masy ciała w najniższym stanie następującym w 6 dni po ostatnim leczeniu. Synergizm utrzymywał się dla dwóch dodatkowych mniejszych dawek w porównaniu do HNDT dla docetakselu. Ten synergizm utrzymywał się także, gdy flawopirydol podawany był doustnie.

T a b e l a 2

Kombinacja flawopirydol-Taxotere® Gruczolakorak sutka MA 13/C „powtarzalne narażenie”

Środek IV mg/kg/dawkę (dawka ogólna)	% bw1 (nadir)	Ick	CR	Uwagi
Taxotere® d14,23	Flawopirydol d14-17, 20-23
78,1 (156,2)	-	20(29)	-	-	2/6DD
48,1 (96,8)	-	8(28)	4,4	6/6	HNDT
-	4,8(38,4)	>20	-	-	4/5DD
-	2,9(23,2)	3(18)	1,0	0/6	HNDT
-	1,75(14)	+ 10(24)	0,0	0/6
48,4(96,8)	2,9(23,2)	15(27)	-	-	2/5DD
53,2(106,4)	1,93(15,44)	13(29)	9,0	6/6	HNDT
43,6(57,2)	1,6(12,8)	9(29)	7,0	6/6
36,3(72,6)	1,31(10,48)	3(29)	5,1	6/6
31,5(63,0)	1,14(9,12)	6(28)	4,4	6/6
24,2(48,4)	0,88(7,04)	5(19)	2,0	2/6

PL 206 118 B1

Td = 2,2 dni; czas dla zwierząt kontrolnych osiągnięcia 1 g = 17,8 dni; średnia masa nowotworu na początku leczenia = 210-260 mg; CR = całkowita odpowiedź; IV = dożylnie; bw1 = utrata masy w najniż szym stanie (nadir); (DT) dawka ogólna; HNDT = najwyższa dawka nie toksyczna; lck = log10 uśmierconych komórek

P r z y k ł a d 3

Taxotere wstrzykiwano IV w dniu 14 i 25 po wszczepieniu nowotworu. Flawopirydol podawano doustnie raz dziennie w dniach od dnia 14 do 18 i od dnia 21 do 25.

Flawopirydol (po)-Docetaksel(iv) Przedłużone narażenie na MC 13/C

Środek	Reżim	HNDT(DT) mg/kg	% bw1 (nadir)	lck	Uwagi
TXT	Flavo
TXT	14,25	30	-	3,6(33)	0,9	HNDT
Flawopirydol	14-18, 21-25	(60)			0,1	HNDT
			2,7	11,6
			(27)	(26)
Kombinacja TXT	14,25	45	4,5	9,7(19)	□5	HNTC

«320 mg - masa nowotworu w dniu 14; po - doustnie; iv - dożylnie; numer doświadczenia (BCM1252); TXT Taxotere®

Jak w przykładzie 2, kombinacja docetakselu i powtarzalne podawanie codzienne flawopirydolu okazało się bardziej skuteczne niż poszczególne składniki same w równych dawkach toksycznych. Synergizm wykazano na podstawie log 4 zwiększenia uśmierconych komórek.

Inne postaci wykonania wynalazku staną się oczywiste dla fachowców z rozważenia niniejszego opisu i realizacji wynalazku ujawnionych w niniejszym opisie. Zamiarem jest, aby opis i przykłady były uważane jedynie za przykładowe.

Claims (8)

1. Kombinacja farmaceutyczna wykazująca synergizm terapeutyczny in vivo w leczeniu chorób nowotworowych, znamienna tym, że zawiera docetaksel (Taxotere®) i flawopirydol.

2. Kombinacja według zastrz. 1, znamienna tym, że składniki kompozycji podaje się oddzielnie i w różnym czasie.

3. Kombinacja według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą nowotworową jest rak sutka.

4. Kombinacja według zastrz. 1, znamienna tym, że chorobą nowotworową jest rak płuc.

5. Kombinacja według zastrz. 1, znamienna tym, że flawopirydol podaje się doustnie.

6 Kombinacja według zastrz. 1, znamienna tym, że jednym składnikiem jest docetaksel (Taxotere®) a drugim składnikiem jest flawopirydol, przy czym wspomniane składniki podaje się oddzielnie i w różnym czasie a flawopirydol podaje się doustnie.

7. Kombinacja według zastrz. 6, znamienna tym, że chorobą nowotworową jest rak sutka.

8. Kombinacja według zastrz. 6, znamienna tym, że chorobą nowotworową jest rak płuc.