PL203709B1

PL203709B1 - Zastosowanie związków o aktywności agonisty 5-HT1A w leczeniu zaburzeń zewnętrznej siatkówki

Info

Publication number: PL203709B1
Application number: PL358306A
Authority: PL
Inventors: Robert J. Collier Jr.; Michael A. Kapin; Mark R. Hellberg; Thomas R. Dean
Original assignee: Alcon Inc
Priority date: 2000-03-17
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2009-11-30
Also published as: DE60100625D1; AU2005202600B2; DE60100625T2; KR20020082885A; JP4789231B2; CA2400639C; CA2400639A1; MXPA02009071A; CN1418100A; AU2001238552A1; BR0109211A; WO2001070223A1; TWI268777B; WO2001070230A3; WO2001070222A3; MXPA02009072A; CA2399985A1; AR028258A1; KR100749191B1; BR0109230A

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania związków o aktywności agonisty 5-HT1A, w leczeniu zaburzeń zewnętrznej siatkówki, wynikających z ostrych lub przewlekłych degeneracyjnych stanów lub chorób oka.

Związana z wiekiem degeneracja plamki (AMD) stanowi wiodącą przyczynę ślepoty w starszym wieku, a jej występowanie wynosi od około 20% u osób w wieku 65 lat do około 37% u osób w wieku 75 lat lub starszych. AMD bez wysięku charakteryzuje się nagromadzeniem druzów i zanikiem fotoreceptorów pręcików i czopków w zewnętrznej części siatkówki, epiteliopatią barwnikową siatkówki (RPE), błoną Brucha oraz zapaleniem naczyń włosowatych naczyniówki, natomiast AMD z wysiękiem prowadzi do neowaskularyzacji naczyniówki (Green i Enger, Ophtalmol, 100: 1519-35, 1993; Green i in., Ophtalmol, 92: 615-27, 1985; Green i Key, Trans Am Ophtalmol Soc, 75: 180-254, 1977; Bressler i in., Retina, 14: 130-42, 1994; Schneider i in., Retina, 18: 242-50, 1998; Green i Kuchle (1997). W: Yannuzzi, L.A., Flower, R.W., Slakter, J.S. (wyd.) Indocyjanine green angiography. St. Louis: Mosby, str. 151-6). Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) stanowi grupę dziedzicznych dystrofii charakteryzujących się degeneracją pręcików z wtórnym zanikiem fotoreceptorów czopków oraz leżącego poniżej nabłonka barwnikowego. (Pruett, Trans Am Ophtalmol Soc, 81: 693-735; Heckenlively, Trans Am Ophtalmol Soc, 85: 438-470; Pagon, Sur Ophtalmol, 33: 137-177, 1988; Berson, Invest Ophtalmol Vis Sci, 34: 1659-1676, 1993; Nickells i Zack, Ophtalmic Genet, 17: 145-65, 1996). Patogeneza degeneracyjnych schorzeń siatkówki, takich jak AMD i RP, jest złożona; zaburzenia te mogą być wyzwalane czynnikami środowiskowymi u zdrowych osobników lub u osób z predyspozycją genetyczną. Obecnie zmapowano lub sklonowano ponad 100 genów, które mogą wiązać się z różnymi stanami degeneracyjnymi zewnętrznej części siatkówki.

Ekspozycja na światło stanowi czynnik środowiskowy, który - jak stwierdzono - przyczynia się do progresji degeneracyjnych schorzeń siatkówki, takich jak AMD (Young, Sur Ophtal, 32: 252-269, 1988; Taylor i in., Arch Ophtal, 110: 99-104, 1992; Cruickshank i in., Arch Ophtal, 111: 514-518, 1993). Wykazano, że stres fotooksydacyjny, prowadzący do świetlnego uszkodzenia komórek siatkówki, stanowi użyteczny model badania chorób degeneracyjnych siatkówki z następujących powodów: uszkodzenie dotyczy przede wszystkim fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego (RPE) zewnętrznej siatkówki, czyli tych samych komórek, które dotknięte są zmianami w przebiegu wrodzonych schorzeń degeneracyjnych (Noell i in., Invest Ophtal Vis Sci, 5, 450-472, 1966; Bressler i in., Sur Ophtal, 32, 375-413, 1988; Curcio i in., Invest Ophtal Vis Sci, 37, 1236-1249, 1996); apoptoza jest mechanizmem śmierci komórek, w którym dochodzi do utraty komórek fotoreceptorów i RPE w przebiegu AMD i RP, a także po uszkodzeniu wywołanym stresem fotooksydacyjnym (Ge-Zhi i in., Trans Am Ophtal Soc, 94, 411-430, 1996; Abler i in., Res Commun Mol Pathol Pharmacol 92, 177-189, 1996; Nickells i Zack, Ophtalmic Genet, 17: 145-65, 1996); sugerowano, że światło stanowi środowiskowy czynnik ryzyka progresji AMD i RP (Taylor i in., Arch Ophtalmol, 110, 99-104, 1992; Naash i in., Invest Ophtal Vis Sci, 37, 775-782, 1996); wykazano, że interwencje terapeutyczne, hamujące uszkodzenie wywołane fotooksydacją, są również skuteczne w modelach zwierzęcych wrodzonych degeneracyjnych schorzeń siatkówki (LaVail i in., Proc Nat Acad Sci, 89, 11249-11253, 1992; Fakforovich i in., Nature, 347, 83-86, 1990; Frasson i in., Nat Med. 5, 1183-1187, 1990).

W różnych modelach zwierzę cych zidentyfikowano wiele róż nych klas zwią zków, minimalizują cych fotooksydacyjne uszkodzenie siatkówki. Należą do nich: antyoksydanty takie jak askorbinian (Organisciak i in., Invest Ophtal Vis Sci, 26: 1589-1598, 1985), dimetylotiomocznik (Organisciak i in.,

Invest Ophtal Vis Sci, 33: 1599-1609, 1992; Lam i in., Arch Ophtal, 108: 1751-1752, 1990), α-tokoferol (Kozaki i in., Nippon Ganka Gakkai Zasshi, 98: 948-954, 1994) i β-karoten (Rapp i in., Cur Eye Res, 15: 219-232, 1995); antagoniści wapnia, jak flunaryzyna (Li i in., Exp. Eye Res, 56: 71-78, 1993;

Edward i in., Arch Ophtal, 109, 554-622, 1992; Collier i in., Invest Ophtal Vis Sci, 36:S516); czynniki wzrostu, takie jak zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów, mózgopochodny czynnik wzrostu nerwów, rzęskowy czynnik neurotropowy i interleukina 1-β (LaVail i in., Proc Nat Acad Sci, 89, 11249-11253, 1992); glukokortykoidy takie jak metyloprednizolon (Lam i in., Graefes Arch Clin Exp Ophtal, 231, 729736, 1993) i deksametazon (Fu i in., Exp Eye Res, 54, 583-594, 1992); chelatory żelaza, takie jak desferroksamina (Li i in., Cur Eye Res, 2, 133-144, 1991); antagoniści NMDA, jak eliprodil i MK-801 (Collier i in., Invest Ophtal Vis Sci, 40:S159, 1999).

Agonistów receptorów serotoninergicznych 5-HT1A (tj. buspiron, ziprasidon, urapidil) zarejestrowano lub wprowadzono do leczenia lęku, nadciśnienia, schizofrenii, psychozy lub dwubiegunowych

PL 203 709 B1 zaburzeń depresyjnych. Wykazano ponadto, że agoniści receptorów 5-HT1A wywierają działanie neuroprotekcyjne w różnych zwierzęcych modelach i są w trakcie oceny klinicznej w leczeniu niedokrwienia mózgu, urazu głowy, choroby Alzheimera, stwardnienia rozsianego i zanikowego stwardnienia bocznego. Wykazano, że agoniści receptorów 5-HT1A-8-OH-DPAT (8-hydroksy-2-(di-n-propyloamino)tetralina) i ipsapiron - zapobiegają wywołanemu NMDA ekscytotoksycznemu uszkodzeniu neuronów w wielkokomórkowym jądrze początkowym u szczurów (Oosterink i in., Eur J Pharmacol, 358: 147-52, 1998), traktowanie Bay-x-3072; znacznie zmniejsza niedokrwienne uszkodzenie w modelu ostrego krwiaka podskórnego u szczura (Alessandri i in., Brain Res, 845: 232-5, 1999), natomiast 8-OH-DPAT, Bay-x-3702, urapidil, gepiron i CM 57493 istotnie zmniejszały objętość zawału korowego u szczura (Bielenberg i Burkhardt, Stroke, 21(Suppl):IV161-3; Semkova i in., Eur J Pharmacol, 359: 251-60, 1998; Peruche i in., J Neural Transm - Park Dis Dement Sect, 8:73-83, 1994) i myszy (Prehn i in., Eur J Pharmacol, 203: 213-22, 1991; Prehn i in., Brain Res, 630:10-20, 1993) po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu. Wykazano ponadto, że leczenie szczurów SR 57746A, silnym agonistą 5-HT1A, ma działanie neuroprotekcyjne przy czteronaczyniowym niedokrwieniu ogólnym, przy wywoływanych siarczanem winkrystyny zmianach w obrębie przegrody hipokampa, przy wywoływanej akryloamidem neuropatii obwodowej i przy zmiażdżeniu nerwu kulszowego (Fournier i in., Neurosci, 55:629-41, 1993); wykazano także, że substancja ta opóźnia progresję degeneracji neuronów ruchowych u myszy z postępującą neuropatią ruchową (PMN) (Fournier i in., Br J Pharmacol, 124: 811-7, 1998).

Tę klasę związków ujawniono do leczenia jaskry (obniżenie i kontrola ciśnienia wewnątrzgałkowego, IOP), patrz np. WO 98/18458 (DeSantis i in.) i EP 0771563A2 (Mano i in.), Osborne i in. (Ophtalmologica, tom 210: 308-314, 1996) donoszą, że 8-hydroksydipropyloaminotetralina (8-OH-DPAT) (agonista 5-HT1A) zmniejsza IOP u królików. Wang i in. (Current Eye Research, tom 16 (8): 769-775, sierpień 1997 oraz IVOS, tom 39(4), S488, marzec 1998) ujawniają, że 5-metylourapidil (antagonista a_1A i agonista 5-HT_1A) obniża IOP u małp, ale ze względu na aktywność w stosunku do receptora a_1A. Ujawniono również antagonistów 5-HT1A jako substancje użyteczne w leczeniu jaskry (podwyższonego IOP) (np. WO 92/0338, McLees). Ponadto DeSai i in. (WO 97/35579) oraz Macor i in. (US 5578612) ujawniają zastosowanie agonistów 5-HT1 i 5-HT1-podobnych w leczeniu jaskry (podwyższonego IOP). Te przeciwmigrenowe związki są agonistami 5-HT1B,D,E,F, np. sumatriptan, naratriptan i związki pokrewne.

Wykazano, że agoniści receptorów serotoninergicznych 5-HT1A są silnymi środkami neuroprotekcyjnymi przy narażeniu na działanie różnych szkodliwych czynników na ośrodkowy układ nerwowy. Nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że 8-OH-DPAT (8-hydroksy-2-(di-n-propyloamino)tetralina), buspiron i SR-57746A (chlorowodorek ksaliprodenu) wykazują silne działanie neuroprotekcyjne w siatkówce oraz zapobiegają wyzwalanej światłem śmierci komórek typu fotoreceptorów i komórek RPE w mechanizmie apoptozy. Stwierdziliśmy, że traktowanie buspironem może całkowicie zapobiec wywołanej fotooksydacją retinopatii oraz istotnie ograniczyć utratę DNA siatkówki i cieńczenie ONL. Korzyści związane z bezpieczeństwem niektórych z tych związków sprawiają, że związki te są szczególnie pożądane w leczeniu zarówno ostrym, jak i przewlekłym. Taki środek mógłby znaleźć zastosowanie w leczeniu różnych chorób degeneracyjnych zewnętrznej siatkówki.

W naszych modelach uszkodzenia świetlnego antyoksydanty były albo nieskuteczne (α-tokoferol) lub marginalnie skuteczne w wysokich dawkach (askorbinian, analogi witaminy E). Podobnie niektóre związki o aktywności antagonisty wapnia (flunarizyna, nikardipina) okazały się umiarkowanie skuteczne, podczas gdy inne (nifedipina, nimodipina, werapamil) nie zapobiegały wywołanym światłem zmianom funkcjonalnym bądź morfologicznym. Jednak stwierdziliśmy, że związki o aktywności agonisty 5-HT1A są 100-krotnie silniejsze w tych modelach uszkodzenia świetlnego i w związku z tym są one użyteczne w leczeniu schorzeń zewnętrznej siatkówki.

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania agonisty 5-HT1A, wybranego z grupy obejmującej następujące związki: tandospiron, urapidil, ziprasidon, chlorowodorek repinotanu, chlorowodorek ksaliprodenu (SR-57746A), buspiron, flesinoksan, 5-{4-[4-(5-cyjano-3-indolilo)-butylo]-1-piperazynylo}benzofurano-2-karboksamid (EMD-68843), mesylat bifeprunoksu (DU-127090), gepiron, alnespiron, (Z)-2-butenodioan (R)-5,6-dihydro-5-(metyloamino)-4H-imidazo[4,5,1-ij]chinolin-2-(1H)-onu (PNU95666), chlorowodorek [N-piperonylo-2-amino-1,2,3,4-tetrahydrobenzo(b)tieno(2,3-c)pirydyno]-karbamidu (AP-521), fibanserynę, chlorowodorek 5-{3-[((2S)-1,4-benzodioksan-2-ylometylo)amino]propoksy}-1,3-benozodioksolu (MKC-242), lesopitron, chlorowodorek sarizotanu, cytrynian 4-(4-fluorofenylo)-1,2,3,6-tetrahydro-1-[4-(1,2,4-triazol-1-ilo)butylo]pirydyny (E-5842), 3-chloro-4-[4-[4-(2-pirydynylo)-1,2,3,6-tetrahydropirydyn-1-ylo]butylo]-1,4-benzoksazepin-5(4H)-on (SUN-N4057), (E)-2-bu4

PL 203 709 B1 tenodioan 1-(4-trifluorometylo-2-pirydynylo)-4-[4-[2-okso-1-pirolidynylo]-butylo]piperazyny (Org-130-11), oraz 8-hydroksy-2-(di-n-propyloamino)tetralinę (8-OH-DPAT), oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, w leczeniu schorzeń zewnętrznej siatkówki.

Określenie „dopuszczalne farmaceutycznie oznacza, że związki te można bezpiecznie stosować w leczeniu schorzeń zewnętrznej siatkówki. Stosowane tutaj określenie „zewnętrzna siatkówka obejmuje RPE, fotoreceptory, komórki Mullera (w takim zakresie, w jakim ich wypustki sięgają zewnętrznej siatkówki) oraz zewnętrzną warstwę splotowatą. Związki te formułuje się w preparaty do stosowania ogólnego lub miejscowego do oka.

Zaburzenia zewnętrznej siatkówki obejmują ostre i przewlekłe, wywoływane czynnikami środowiskowymi (urazem, niedokrwieniem, stresem fotooksydacyjnym) stany degeneracyjne fotoreceptorów i komórek RPE u prawidłowych lub predysponowanych genetycznie osobników. Należą do nich m.in. AMD, RP oraz inne postaci wrodzonych degeneracyjnych schorzeń siatkówki, odwarstwienie siatkówki, rozdarcia, pomarszczenie plamki, niedokrwienie obejmujące zewnętrzną siatkówkę, retinopatia cukrzycowa, uszkodzenia związane z laseroterapią (typu grid, focal i panretinal), w tym terapią fotodynamiczną (PDT), cieplną lub krioterapią, urazem, zabiegiem chirurgicznym (translokacja siatkówki, chirurgia podsiatkówkowa lub witrektomia), wywoływana światłem retinopatia jatrogenna i konserwacja przeszczepów siatkówki.

W szczególno ś ci lek jest przeznaczony do leczenia zaburzenia wybranego z grupy obejmującej AMD, RP i retinopatię cukrzycową, a zwłaszcza do leczenia AMD.

Związki stosowane zgodnie z wynalazkiem charakteryzują się znacznym powinowactwem do receptorów 5-HT1A z wartościami IC50 w zakresie do około 500 nM (korzystnie poniżej 100 nM). Związki te są również pełnymi lub częściowymi agonistami z wartościami IC₅₀ w zakresie do około 1 μΜ (korzystnie poniżej 500 nM).

Wiązanie z receptorem oraz aktywność agonistyczną związków stosowanych zgodnie z niniejszym wynalazkiem ustalić można z wykorzystaniem poniższych sposobów.

Krótki opis figur

Na Fig. 1A i 1B przedstawiono zachowanie fal a i b ERG u szczurów otrzymujących ogólnoustrojowo 8-OH-DPAT i eksponowanych na ciężki stres fotooksydacyjny.

Na Fig. 2 przedstawiono ochronne działanie na morfologię siatkówki (fotoreceptory i RPE) u szczurów otrzymujących ogólnoustrojowo 8-OH-DPAT i eksponowanych na ciężki stres fotooksydacyjny.

Na Fig. 3 przedstawiono ochronne działanie na DNA siatkówki, miarę liczby komórek siatkówki (A) oraz pełne działanie ochronne na morfologię siatkówki (fotoreceptory) u szczurów otrzymujących ogólnoustrojowo buspiron i eksponowanych na ciężki stres fotooksydacyjny.

Na Fig. 4A i 4B przedstawiono zachowanie fal a i b ERG u szczurów otrzymujących ogólnoustrojowo SR-57746A i eksponowanych na ciężki stres fotooksydacyjny.

Sposób 1

Test na wiązanie z receptorem 5-HT1A

Badania wiązania 5-HT1A przeprowadzono z zastosowaniem ludzkich klonowanych receptorów, ulegających ekspresji w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) z zastosowaniem (³H)8-OH-DPAT jako liganda. Błony komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), na których ekspresji ulegały klonowane receptory 5-HT1A (wytwarzane dla NEN przez Biosignal, Inc., Montreal, Kanada) homogenizowano w około 40 objętościach 50 mM Tris, pH 7,4, przez 5 sekund. Rozcieńczenia leków wykonano przy pomocy robota Beckman Biomek 2000 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Inkubacje prowadzono z preparatami błon, badanymi związkami oraz 0,25 nM [³H]8-OH-DPAT (NEN, Boston, MA) w tym samym buforze w temperaturze 27°C przez 1 godzinę. Oznaczenia kończono szybką filtracją próżniową na filtrach z włókna szklanego Whatman GF/B, wstępnie nasączonych 0,3% polietylenoiminą. Radioaktywność związaną mierzono przy pomocy spektrometrii scyntylacji cieczowej. Dane analizowano z zastosowaniem programów dopasowujących krzywe nieliniowe (Sharif i in., J. Pharmac. Pharmacol., 51: 685-694, 1999).

Badania wiązania ligandu można również prowadzić z wykorzystaniem preparatów błon komórkowych z mózgu cielęcia i szczura (źródło lokalne) oraz błon kory ludzkiej. Odpowiednie okolice mózgowia wycinano, homogenizowano w 10 objętościach od 0,32 M sacharozy i wirowano przez 10 minut przy 700 x g. Uzyskany płyn znad osadu wirowano przy 43500 x g przez 10 minut, a osad ponownie zawieszano w 50 mM Tris-HCl (pH 7,7, 25°C) przy użyciu urządzenia polytron włączanego na 10 sekund. Próbki przechowywano w temperaturze -140°C. Celem usunięcia endogennej serotoniny preparaty inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 minut przed doświadczeniem. Inkubacje

PL 203 709 B1 w oznaczeniu koń czono szybką filtracją na filtrach Whatman GF/C z zastosowaniem urzą dzenia do zbierania komórek Brandel. Wartości Ki obliczano z zastosowaniem równania Cheng-Prusoff (De Vry i in., J Pharm Exper Ther, 284:1082-1094, 1998).

Sposób 2

Testy funkcjonalne 5-HT1A

Działanie związków stosowanych według niniejszego wynalazku można określić z zastosowaniem szeregu sposobów oceny aktywności funkcjonalnej agonistów 5-HT1A. Jedną z takich ocen prowadzono z zastosowaniem skrawków hipokampa pochodzących od samców szczurów Sprague-Dawley, mierząc hamowanie stymulowanej forskoliną cyklazy adenylanowej (J. Med. Chem., 42: 36, 1999; J. Neurochem., 56: 1114, 1991; J. Pharm. Exp. Ther., 284: 1082, 1998). Błony hipokampa szczura homogenizowano w 25 objętościach od 0,3 M sacharozy, zawierającej 1 mM EGTA, 5 mM EDTA, 5 mM ditiotreitolu oraz 20 mM Tris-HCL, pH 7,4, w temperaturze 25°C. Homogenat wirowano przez 10 minut przy 1000 x g. Następnie płyn znad osadu wirowano przy 39000 x g przez 10 minut. Uzyskany osad ponownie zawieszono w buforze do homogenizacji w stężeniu białka około 1 mg/ml, a próbki przechowywano w temperaturze -140°C. Przed zastosowaniem błony ponownie homogenizowano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema. Do buforu do inkubacji, zawierającego 100 mM NaCl, 2 mM octanu magnezu, 0,2 mM ATP, 1 mM cAMP, 0,01 mM GTP, 0,01 mM forskoliny, 80 mM Tris-HCl, 5 mM fosforanu kreatyny, 0,8 U/μΙ fosfokinazy kreatynowej, 0,1 mM IBMX, 1-2 μ Ci a-[³²P]ATP dodano 50 μΐ zawiesiny błon (50 μg białka). Inkubacje z badanymi związkami (10 minut w temperaturze 30°C) rozpoczynano dodaniem roztworu błon do mieszaniny do inkubacji (ogrzanej wstępnie przez 5 minut do temperatury 30°C). [³²P]cAMP mierzono zgodnie ze sposobem według Salomon (Adv Cyclic Nucleotide Res, 10: 35-55, 1979). Białko mierzono z zastosowaniem testu według Bradford (Anal Blochem, 72:248-254, 1976).

Aktywność funkcjonalną można również określić w rekombinowanych ludzkich receptorach zgodnie ze sposobem według Schoeffter i in. (Neuropharm, 36: 429-437, 1997). Komórki HeLa, transfekowane rekombinowanymi ludzkimi receptorami 5-HT1A, namnażano do konfluencji na płytkach 24-studzienkowych. Komórki przemyto 1 ml solanki buforowanej Hepes (w mM): NaCl 130; KCl 5,4; CaCl2 1,8; MgSO4 0,8; NaH2PO4 0,9; glukoza 25, Hepes 20, pH 7,4 oraz czerwień fenolowa 5 mg/l. Komórki znakowano 6 μφ/ml [³H]adeniną (23 Ci/mmol, Amersham, Rahn AG, Zurich, Szwajcaria) w 0,5 ml solanki o temperaturze 37°C przez 2 godziny. Komórki te następnie płukano dwukrotnie 1 ml buforowanej solanki, zawierającej 1 mM izobutylometyloksantyny. Komórki inkubowano przez 15 minut w 1 ml tego roztworu (37°C) w obecności lub pod nieobecność 10 μM forskoliny i badanego związku. Następnie usuwano bufor i celem ekstrakcji próbek dodawano 1 ml 5% kwasu trichlorooctowego (TCA), zawierającego 0,1 mM cAMP i 0,1 mM ATP. Po 30 minutach w temperaturze 4°C ekstrakty TCA poddawano rozdziałowi chromatograficznemu na Dowex AG 50W-X4 oraz kolumnach aluminiowych (Salomon, Meth Enzymol, 195: 22-28, 1991). Wytwarzanie cyklicznego AMP obliczano jako stosunek [³H]cAMP/( [³H]cAMP + [³H]ATP).

Powyższe procedury, opisane w Sposobach 1 i 2, stosowano uzyskując następujące dane. T a b e l a 1. Wiązanie z receptorem 5-HT1A oraz dane z testów funkcjonalnych

Związek	Wiązanie z receptorem (IC50 nM, SEM)	Hamowanie cAMP (EC50)
(R,S) 8-OH-DPAT	1,5 nM	4,7 nM
(R) 8-OH-DPAT	0,5 nM	2,6 nM
SR-57746A	2,5 nM	3,7 nM

Ogólnie, w przypadku schorzeń degeneracyjnych, agonistów 5-HT1A stosowanych według niniejszego wynalazku podaje się drogą doustną, a dzienna dawka tych związków jest w zakresie od około 0,001 do około 500 miligramów. Korzystnie całkowita dawka dzienna jest w zakresie od około 1 do około 100 miligramów. Stosowanie drogą inną niż doustna, taką jak do ciała szklistego, miejscowo do oka, przezskórnie (przy użyciu plastra), podskórnie, pozajelitowo, doocznie, podspojówkowo, pozagałkowo lub w postaci iniekcji pod pochewkę Tenona, przeztwardówkowo (w tym przez jonoforezę) lub z zastosowaniem biodegradowalnych polimerów lub liposomów o powolnym uwalnianiu, może wymagać dostosowania całkowitej dawki dziennej, potrzebnej do dostarczenia terapeutycznie skutecznej ilości związku. Agonistów 5-HT1A można również podawać w roztworach do płukania oka. Stężenia powinny znajdować się w zakresie od około 0,001 do około 100 μM, korzystnie od około 0,01 do około 5 μM.

PL 203 709 B1

Agonistów 5-HT1A można włączyć do wielu różnych preparatów stosowanych w okulistyce w celu ich dostarczania do oka (np. miejscowo, do komory lub przez implant). Związki te można łączyć z farmaceutycznie dopuszczalnymi w okulistyce konserwantami, środkami powierzchniowo czynnymi, substancjami zwiększającymi lepkość, środkami żelującymi, substancjami zwiększającymi penetrację, buforami, chlorkiem sodu oraz wodą, z wytworzeniem stosowanym w okulistyce wodnych, sterylnych zawiesin, roztworów, wstępnie wytworzonych żeli lub żeli tworzonych in situ. Okulistyczne preparaty w postaci roztworów można wytworzyć poprzez rozpuszczenie związku w fizjologicznie dopuszczalnym, izotonicznym roztworze wodnym. Ponadto roztwór okulistyczny może zawierać okulistycznie dopuszczalny środek powierzchniowo czynny, wspomagający rozpuszczanie związku. Roztwory okulistyczne mogą zawierać substancję zwiększającą lepkość, taką jak hydroksymetyloceluloza, hydroksyetyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, metyloceluloza, poliwynylopirolidon lub tym podobne, aby poprawić utrzymywanie preparatu w worku spojówkowym. W celu wytworzenia sterylnych maści okulistycznych aktywny składnik łączy się z konserwantem w odpowiednim nośniku, takim jak olej mineralny, ciekła lanolina lub biała wazelina. Sterylne żele okulistyczne wytworzyć można przez zawieszenie aktywnego składnika w hydrofilowym podłożu, wytworzonym przez połączenie np. carbopolu-940 lub podobnych substancji, zgodnie z opublikowanymi formulacjami dla analogicznych preparatów okulistycznych; w ich skład wchodzić mogą konserwanty oraz środki regulujące toniczność.

W przypadku stosowania miejscowego, agonistów 5-HT1A korzystnie umieszcza się w stosowanych miejscowo okulistycznych zawiesinach lub roztworach o pH w zakresie około 4-8. Agoniści 5-HT1A będą zazwyczaj znajdować się w tych środkach w ilości 0,001-5% wagowych, korzystnie 0,01-2% wagowych. W związku z tym miejscowo na powierzchnię oka zastosowanych zostanie 1-2 krople środka, 1-4 razy dziennie, zgodnie z zaleceniami doświadczonego klinicysty.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem użyteczne są następujące preparaty okulistyczne, podawane 1-4 razy dziennie, zgodnie z zaleceniami doświadczonego klinicysty.

P r z y k ł a d 1

Składniki	Ilość (% wagowe)
Buspiron	0,01-2%
Hydroksypropylometyloceluloza	0,5%
Wodorofosforan (V) sodu (bezwodny)	0,2%
Chlorek sodu	0,5%
Sól disodowa EDTA	0,01%
Polisorbat 80	0,05%
Chlorek benzalkonium	0,01%
Wodorotlenek sodu/kwas chlorowodorowy	do dostosowania pH do wartości 7,3-7,4
Woda oczyszczona	do 100%

P r z y k ł a d 2

Składniki	Ilość (% wagowe)
Buspiron	0,01-2%
Metyloceluloza	4,0%
Wodorofosforan (V) sodu (bezwodny)	0,2%
Chlorek sodu	0,5%
Sól disodowa EDTA	0,01%
Polisorbat 80	0,05%
Chlorek benzalkonium	0,01%
Wodorotlenek sodu/kwas chlorowodorowy	do dostosowania pH do wartości 7,3-7,4
Woda oczyszczona	do 100%

PL 203 709 B1

P r z y k ł a d 3

Składniki	Ilość (% wagowe)
Związek	0,01-2%
Guma guar	0,4-6,0%
Wodorofosforan (V) sodu (bezwodny)	0,2%
Chlorek sodu	0,5%
Sól disodowa EDTA	0,01%
Polisorbat 80	0,05%
Chlorek benzalkonium	0,01%
Wodorotlenek sodu/kwas chlorowodorowy	do dostosowania pH do wartości 7,3-7,4
Woda oczyszczona	do 100%

P r z y k ł a d 4

Składniki	Ilość (% wagowe)
Chlorowodorek ksaliprodenu	0,01-2%
Biała wazelina, olej mineralny i lanolina	konsystencja maści
Wodorofosforan (V) sodu (bezwodny)	0,2%
Chlorek sodu	0,5%
Sól disodowa EDTA	0,01%
Polisorbat 80	0,05%
Chlorek benzalkonium	0,01%
Wodorotlenek sodu/kwas chlorowodorowy	do dostosowania pH do wartości 7,3-7,4

P r z y k ł a d 5

10 mM roztwór IV (stosunek wagowo-objętościowy)
Buspiron	0,384%
Kwas L-winowy	2,31%
Wodorotlenek sodu	pH 3,8
Kwas chlorowodorowy	pH 3,8
Woda oczyszczona	do 100%

P r z y k ł a d 6

Kapsułki 5 mg
Składnik	mg/kapsułkę (waga całkowita 22 mg)
Chlorowodorek buspironu	5
Laktoza, bezwodna	55,7
Sól sodowa karboksymetyloskrobi	8
Celuloza, mikrokrystaliczna	30
Koloidalny ditlenek krzemu	0,5
Stearynian magnezu	0,8

PL 203 709 B1

Sposób 3

Działania neuroprotekcyjne w modelu wywołanej fotooksydacją retinopatii u szczura

Ochronne działanie tych agonistów 5-HT1A na siatkówkę oceniano w naszym modelu retinopatii wywoływanej fotooksydacją.

Wywoływanie zmian fotochemicznych. Zmiany fotochemiczne wywoływano u zaadaptowanych do ciemności szczurów (24 godziny) poprzez ekspozycję (220 fc) na światło niebieskie (pasmo połówkowej amplitudy = 435-475 nm) przez 6 godzin. Zwierzętom umożliwiono powrót do zdrowia przez 5 dni w ciemności przed dokonaniem elektrodiagnostycznej oceny funkcji siatkówki. Podczas tej ekspozycji na światło szczury trzymano pojedynczo w przezroczystych klatkach z poliwęglanu.

Ocena elektrodiagnostyczna. U znieczulonych szczurów po okresie 24-godzinnej adaptacji rejestrowano elektroretinogram (ERG). Szczury znieczulano dootrzewnową iniekcją chlorowodorku ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyną (6 mg/kg). Błyski ERG po stymulacji typu ganzfeld rejestrowano z platynowo-irydowej elektrody w kształcie pętli, umieszczonej na rogówce. Odpowiedzi elektryczne na serię błysków światła o wzrastającym natężeniu digitalizowano w celu zanalizowania charakterystyk czasowych fal oraz zależności pomiędzy potencjałem odpowiedzi i logarytmem natężenia (VlogI). Zmiany w fali a ERG wiązały się z uszkodzeniem fotoreceptorów oraz barwnikowego nabłonka siatkówki, natomiast uszkodzenie wewnętrznej części siatkówki odzwierciedlały zmiany fali b ERG.

Ocena morfologii siatkówki. Tkanki oka pozyskiwano od szczurów kontrolnych i otrzymujących lek lub nośnik i utrwalano przez zanurzenie w mieszaninie 2% paraformaldehydu i 2% glutaraldehydu. Utrwalone gałki oczne odwadniano w serii rosnących stężeń etanolu, zawieszano w żywicy syntetycznej JB-4 i cięto na skrawki 1-1,5 μm, które analizowano ilościowo z zastosowaniem systemu komputerowej analizy obrazu, w połączeniu z mikroskopem. Mierzono grubość warstwy siatkówki (nabłonek barwnikowy siatkówki, RPE; grubość warstwy jądrzastej zewnętrznej, ONL; grubość warstwy jądrzastej wewnętrznej, INL; oraz długość wewnętrznych i zewnętrznych segmentów fotoreceptorów, IS+OS).

Ocena zmian DNA. Szczury albinosy uśmiercano przy pomocy inhalacji CO₂, a poszczególne siatkówki mrożono w oddzielnych probówkach. Każdą siatkówkę poddawano sonikacji w 0,8 ml (2,0 M NaCl, 50 mM NaPO4, pH 7,4, 2 mM EDTA), uzyskując jednorodny homogenat, który następnie przechowywano w postaci zamrożonej. Porcje (0,1 ml) każdej próbki rozcieńczano dziesięciokrotnie przy użyciu 2,0 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH 7,4, 2 mM EDTA, zawierającym 1,1 μg/ml bisbenzimidazolu (Hoechst 33258). Krzywą standardową konstruowano z zastosowaniem DNA cielęcej grasicy (0-25 μg/ml) w tym samym buforze. Porcje (0,2 ml) każdej próbki siatkówki oraz standard przenoszono w trzech powtórzeniach na płytkę 96-studzienkową w celu pomiarów fluorescencji w Cytofluor II. Długość fali wzbudzenia wynosiła 360 nm, a długość fali emisji wynosiła 460 nm.

Zwierzęta i dawkowanie. Samce szczurów Sprague-Dawley losowo przydzielano do grup doświadczalnych otrzymujących lek i nośnik. Szczury kontrolne przechowywano w ich klatkach z normalną cykliczną ekspozycją na światło. Wszystkie szczury otrzymywały dawkę na 48, 24 i 0 godzin przed sześciogodzinną ekspozycją na niebieskie światło. Dawkowanie było następujące:

1. 8-OH-DPAT (8-hydroksy-2-(di-n-propyloamino)-tetralina): szczury otrzymujące nośnik (n=10) lub 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg [n=5] lub 1,0 mg/kg [n=10]) otrzymywały trzy podskórne iniekcje przed ekspozycją na światło. Pięć szczurów służyło jako kontrole. Ochronę siatkówki oceniano przez analizę odpowiedzi ERG oraz przez pomiar zmian morfologii siatkówki.

2. Buspiron: W celu ilościowej analizy DNA, sześć szczurów w grupie leczonej otrzymywało drogą dootrzewnową nośnik lub buspiron (0,5 i 1 mg/kg) przed ekspozycją na światło. Siatkówki od siedmiu zdrowych szczurów służyły jako kontrole. W celu oceny zmian morfologii siatkówki szczury otrzymywały dootrzewnowo nośnik (n=8) lub buspiron (1,0 mg/kg [n=9]). Sześć szczurów służyło jako kontrole. Ochronne działanie na siatkówkę oceniano poprzez ilościowy pomiar zmian DNA siatkówki oraz pomiar zmian morfologii siatkówki.

3. SR-57746A: szczury otrzymywały dootrzewnowo nośnik (n=15) lub SR-57746A (0,5 mg/kg [n=5] lub 1 mg/kg [n=15]). Jedenaście szczurów służyło jako kontrole. ERG analizowano po 5-dniowym okresie powrotu do zdrowia w celu oceny ochronnego wpływu na siatkówkę.

Wyniki oceny 8-OH-DPAT. Ekspozycja na światło niebieskie przez 6 godzin spowodowała istotne zmniejszenie amplitudy odpowiedzi ERG (ANOVA, p < 0,001; test t Bonferroni, p < 0,05) w porównaniu ze zwierzętami zdrowymi, mierzonej po 5-dniowym okresie powrotu do zdrowia (Fig. 1 i 2). Ekspozycja na światło niebieskie spowodowała 75% zmniejszenie maksymalnych amplitud fal

PL 203 709 B1 a i b u szczurów otrzymujących nośnik w porównaniu z kontrolnymi. Ponadto odpowiedzi progowe były niższe i wyzwalane przy jaśniejszych intensywnościach błysków.

W wywołanej retinopatii fotooksydacyjnej u szczurów, którym podawano 8-OH-DPAT wykazano zależną od dawki ochronę funkcji zewnętrznej i wewnętrznej siatkówki (Fig. 1A i B). Maksymalne amplitudy odpowiedzi fal a i b u szczurów otrzymujących 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg) nie różniły się od wartości uzyskanych u szczurów otrzymujących nośnik i wynosiły około 27% amplitud kontrolnych. Natomiast maksymalne amplitudy odpowiedzi fal a i b u szczurów otrzymujących 8-OH-DPAT (1,0 mg/kg) wynosiły odpowiednio około 53% i 61% wartości prawidłowych i były istotnie wyższe w porównaniu z odpowiedziami mierzonymi u szczurów otrzymujących nośnik (Fig. 1A i 1B).

Zgodnie z tymi zmianami ERG, analiza morfometryczna tych siatkówek, dokonana po

3-tygodniowym okresie powrotu do zdrowia, wykazała istotny (ANOVA, p < 0,01) ubytek komórek fotoreceptorów, skrócenie długości wewnętrznych + zewnętrznych segmentów fotoreceptorów oraz spłaszczenie RPE u zwierząt otrzymujących nośnik. Nie stwierdzono występowania istotnych zmian w grubości INL. Grubość ONL zmniejszyła się o 73%, długość segmentów wewnętrznych + zewnętrznych zmniejszyła się o 82%, grubość RPE zmniejszyła się o 59% w porównaniu z kontrolami (Fig. 2). Zmiany obserwowane u szczurów otrzymujących 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg) nie różniły się w sposób statystycznie istotny od zmian stwierdzanych u szczurów otrzymujących nośnik. ERG zmniejszyło się o około 63%, grubość ONL zmniejszyła się o 53%, długość segmentów fotoreceptorów zmniejszyła się o 60%, a grubość RPE zmniejszyła się o 34%. Natomiast zmiany świetlne obserwowane u szczurów otrzymujących 8-OH-DPAT (1,0 mg/kg) różniły się istotnie od szczurów, którym podawano nośnik. Amplitudy odpowiedzi ERG były wyższe o ponad 50% niż normalne, grubość ONL była 2,4-raza większa, długość segmentów fotoreceptorów była 2,9-raza większa, a grubość RPE była 1,9-raza wyższa w porównaniu ze szczurami otrzymującymi nośnik.

Wyniki oceny buspironu. Jak przedstawiono na Fig. 3A, u szczurów otrzymujących nośnik poziomy DNA w siatkówce były istotnie zmniejszone (ANOVA, p = 0,017) - o około 30% - w porównaniu z poziomami kontrolnymi. Nie stwierdzano istotnych różnic pomiędzy grupami otrzymującymi nośnik oraz 0,1 mg/kg buspironu. Ochronne działanie na siatkówkę stwierdzano u szczurów otrzymujących buspiron (1 mg/kg). Poziomy DNA w siatkówce były istotnie wyższe od mierzonych u szczurów, którym podawano nośnik, ale nie różniły się w istotny sposób od kontrolnych.

Ekspozycja na światło niebieskie spowodowała istotne zmniejszenie liczby fotoreceptorów (ANOVA, p < 0,05). Analiza morfometryczna tych siatkówek po 4-tygodniowym okresie powrotu do zdrowia wykazała 54% zmniejszenie grubości zewnętrznej warstwy jądrzastej u szczurów otrzymujących nośnik w porównaniu z kontrolnymi (Fig. 3B). Nie stwierdzano natomiast istotnej różnicy w grubości ONL pomiędzy szczurami zdrowymi a traktowanymi buspironem. U szczurów otrzymujących buspiron (1 mg/kg) grubość ONL wynosiła 28,3 um w porównaniu z 30,4 μm u szczurów zdrowych.

Wyniki oceny SR-57746A. U eksponowanych na światło szczurów, otrzymujących SR-57746A (0,5 i 1,0 mg/kg), obserwowano istotną ochronę funkcji siatkówki. Maksymalne odpowiedzi amplitudy fali a i b zmniejszyły się o 50% u szczurów otrzymujących nośnik w porównaniu z kontrolnymi (Fig. 4A i B). Maksymalne odpowiedzi wynosiły 82% wartości kontrolnych u szczurów otrzymujących SR-57746A (0,5 mg/kg) oraz 70% wartości prawidłowych u szczurów otrzymujących dawkę 1 mg/kg.

Wniosek. Badane związki o aktywności agonisty 5-HT_1A (8-OH-DPAT, buspiron i SR-57746A) wykazały odpowiednią siłę działania i skuteczność w tym oksydacyjnym modelu degeneracyjnej choroby siatkówki. Ochronę funkcjonalną i strukturalną uzyskiwano u szczurów, u których przez trzy kolejne dni stosowano dawki zaledwie 1 mg/kg.

Claims

1. Zastosowanie związku o aktywności agonisty 5-HT1A, którym jest związek wybrany z grupy obejmującej: tandospiron, urapidil, ziprasidon, chlorowodorek repinotanu, chlorowodorek ksaliprodenu (SR-57746A), buspiron, flesinoksan, EMD-68843, DU-127090, gepiron, alnespiron, PNU-95666, AP-521, fibanserynę, MKC-242, lesopitron, chlorowodorek sarizotanu, E-5842, SUN-N4057, Org13011 oraz 8-OH-DPAT, do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń zewnętrznej siatkówki.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym lek ma postać kompozycji zawierającej związek o aktywności agonisty 5-HT1A w ilości skutecznej farmaceutycznie.

PL 203 709 B1

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym lek przeznaczony jest do leczenia zaburzenia z grupy obejmującej: AMD, RP oraz inne postaci wrodzonych degeneracyjnych schorzeń siatkówki, odwarstwienie siatkówki, rozdarcie, pomarszczenie plamki, niedokrwienie obejmujące zewnętrzną siatkówkę, retinopatię cukrzycową, uszkodzenia związane z laseroterapią (typu grid, focal i panretinal), w tym terapią fotodynamiczną (PDT), urazem, zabiegiem chirurgicznym (translokacja siatkówki, chirurgia podsiatkówkowa, witrektomia), wywoływaną światłem retinopatię jatrogenną oraz konserwację przeszczepów siatkówki.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym lek jest przeznaczony do leczenia zaburzenia wybranego z grupy obejmującej AMD, RP i retinopatię cukrzycową.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym lek jest przeznaczony do leczenia AMD.