ES2204848T3 - Compuestos con actividad sobre 5-ht1a utiles para el tratamiento de trastornos de la retina externa. - Google Patents

Abstract

El uso de un compuesto con actividad agonista de 5-HT1A para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos de la retina externa.

Description

Compuestos con actividad sobre 5-HT_{1A} útiles para el tratamiento de trastornos de la retina externa.

La presente invención se refiere al uso de compuestos con actividad agonista de 5-HT_{1A} para preparar un medicamento para el tratamiento de trastornos de la retina externa que son el resultado de enfermedades o afecciones degenerativas crónicas o agudas de los ojos.

Antecedentes de la invención

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es la principal causa de ceguera en la vejez, con una incidencia de aproximadamente el 20% en adultos de 65 años y que aumenta al 37% en individuos de 75 años o más. La AMD no exudativa se caracteriza por la acumulación de drusa y atrofia de los fotorreceptores de los bastones y los conos en la retina externa, epitelio pigmentario retiniano (RPE), membrana de Bruch y coriocapilares; mientras que la AMD exudativa conduce a una neovascularización coroidal (Green y Enger, Ophthalmol, 100:1519-35, 1993; Green et al., Ophthalmol, 92:615-27, 1985; Green y Key, Trans Am Ophthalmol Soc, 75:180-254, 1977; Bressler et al., Retina, 14:130-42, 1994; Schneider et al., Retina, 18:242-50, 1998; Green y Kuchle (1997). En: Yannuzzi, L.A., Flower, R.W., Slakter, J.S. (Eds.) Indocyanine green angiography. St. Louis: Mosby, p. 151-6). La retinopatía pigmentaria (RP) representa un grupo de distrofias hereditarias caracterizadas por la degeneración de los bastones con atrofia secundaria de los fotorreceptores de los conos y un epitelio pigmentario subyacente. (Pruett, Trans Am Ophthalmol Soc, 81:693-735, 1983; Heckenlively, Trans Am Ophthalmol Soc, 85:438-470, 1987; Pagon, Sur Ophthalmol, 33:137-177, 1988; Berson, Invest Ophthalmol Vis Sci, 34:1659-1676, 1993; Nickells y Zack, Ophthalmic Genet, 17:145-65, 1996). La patogénesis de las enfermedades degenerativas de la retina, tales como AMD y RP, es multifacética y puede desencadenarse por factores ambientales en individuos normales o en los que están genéticamente predispuestos. Hasta la fecha se han mapeado o clonado más de 100 genes que pueden estar asociados con diversas degeneraciones de la retina externa.

La exposición a la luz es un factor ambiental que se ha identificado como un factor que contribuye a la progresión de los trastornos degenerativos de la retina, tales como AMD (Young, Sur Ophthal, 32:252-269, 1988; Taylor, et al.,Arch Ophthal, 110:99-104, 1992; Cruickshank et al., Arch Ophthal, 111:514-518, 1993). Se ha demostrado que el estrés fotooxidativo que conduce al daño inducido por la luz de las células de la retina es un modelo útil para estudiar las enfermedades degenerativas de la retina por las siguientes razones: el daño se produce principalmente en los fotorreceptores y en el epitelio pigmentario retiniano (RPE) de la retina externa, las mismas células que se ven afectadas en las enfermedades heredodegenerativas (Noell et al., Invest Ophthal Vis Sci, 5: 450-472, 1966; Bressler et al., Sur Ophthal, 32:375-413, 1988; Curcio et al., Invest Ophthal Vis Sci, 37:1236-1249, 1996); la apoptosis es el mecanismo de muerte celular por el cual se produce la pérdida de células de fotorreceptores y RPE en la AMD y RP, así como la posterior lesión celular inducida de forma fotooxidativa (Ge-Zhi et al., Trans AM Ophthal Soc, 94:411-430, 1996; Abler et al., Res Commun Mol Pathol Pharmacol, 92:177-189, 1966; Nickells y Zack, Ophthalmic Genet, 17:145-65, 1966); la luz se ha implicado como un factor de riesgo ambiental para la progresión de la AMD y RP (Taylor et al., Arch Ophthalmol, 110:99-104, 1992; Naash et al., Invest Ophthal Vis Sci, 37, 775-782, 1996); y las intervenciones terapéuticas que inhiben las lesiones fotooxidativas han resultado ser eficaces en modelos animales de enfermedad heredodegenerativa de la retina (LaVail et al., Proc Nat Acad Sci, 89:11249-11253, 1992; Fakforovich et al., Nature, 347, 83-86, 1990; Frasson et al., Nat. Med. 5, 1183-1187, 1990).

Se han identificado varias clases de compuestos diferentes en diversos modelos animales que minimizan la lesión fotooxidativa retiniana. Éstos incluyen: antioxidantes tales como ascorbato (Organisciak et al., Invest Ophthal Vis Sci, 26:1589-1598, 1985), dimetiltiourea (Organisciak et al., Invest Ophthal Vis Sci, 33:1599-1609, 1992; Lam et al., Arch Ophthal, 108:1751-1752, 1990), \alpha-tocoferol (Kozaki et al., Nippon Ganka Gakkai Zasshi, 98:948-954, 1994) y \beta-caroteno (Rapp et al., Cur Eye Res, 15:219-232, 1995); antagonistas de calcio tales como flunarizina (Li et al., Exp Eye Res, 56:71-78, 1993; Edward et al., Arch Ophthal, 109, 554-622, 1992; Collier et al., Invest Ophthal Vis Sci, 36:S516); factores de crecimiento tales como el factor básico de crecimiento de fibroblastos, factor nervioso derivado de cerebro, factor neurotrófico ciliar e interleuquina-1-\beta (LaVail et al., Proc Nat Acad Sci, 89:11249-11253, 1992); glucocorticoides tales como metilprednisolona (Lam et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthal, 231, 729-736, 1993) y dexametasona (Fu et al., Exp Eye Res, 54:583-594, 1992); quelantes de hierro tales como desferrioxamina (Li et al., Cur Eye Res, 2, 133-144, 1991); antagonistas de NMDA tales como eliprodil y MK-801 (Collier et al., Inves Ophthal Vis Sci, 40:S159, 1999).

Los agonistas de 5-HT_{1A} serotonérgicos (es decir, buspirona, ziprasidona, urapidil) se han registrado o lanzado para el tratamiento de la ansiedad, hipertensión, esquizofrenia, psicosis o trastornos de depresión bipolar. Además, se ha demostrado que los agonistas de 5-HT_{1A} son neuroprotectores en diversos modelos animales y se están evaluando en clínica para el tratamiento de la isquemia cerebral, traumatismo craneal, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple y esclerosis lateral amiotrófica. Se demostró que los agonistas de 5-HT_{1A}, 8-OH-DPAT (8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)tetralina) e ipsapirona prevenían el daño neuronal excitotóxico inducido por NMDA en el núcleo basal magnocelular de la rata (Oosterink et al. Eur J Pharmacol, 358:147-52, 1998), la administración de Bay-x-3702 reducía significativamente el daño isquémico en un modelo de hematoma subdérmico agudo en rata (Alessandri et al., Brain Res, 845:232-5, 1999), mientras que 8-OH-DPAT, Bay-x-3702, urapidil, gepirona y CM 57493 reducían significativamente el volumen de infarto cortical en la rata (Bielenberg y Burkhardt, Stroke, 21(suppl):IV161-3; Semkova et al., Eur J Pharmacol, 359:251-60, 1998; Peruche et al., J Neural Transm - Park Dis Dement Sect, 8:73-83, 1994) y ratón (Prehn et al., Eur J Pharmacol, 203:213-22, 1991; Prehn et al., Brain Res, 630:10-20, 1993) tras la oclusión de la arteria cerebral media. Además, se ha demostrado que el tratamiento de ratas con SR 57746A, un potente agonista de 5-HT_{1A}, es neuroprotector después de una isquemia global transitoria de 4 vasos, en las lesiones del septohipocampo inducidas por sulfato de vincristina, en la neuropatía periférica inducida por acrilamida y en la compresión del nervio ciático (Fournier et al., Neurosci, 55:629-41, 1993) y se ha demostrado que retrasa la progresión de la degeneración de neuronas motoras en ratones pmn (Fournier et al., Br J Pharmacol, 124:811-7, 1998).

Esta clase de compuestos se ha descrito para el tratamiento del glaucoma (reduciendo y controlando la presión intraocular (IOP)), véanse, por ejemplo, los documentos WO 98/18458 (DeSantis et al.) y EP 0771563A2 (Mano, et al.). Osborne, et al. (Ophthalmologica, Vol. 210:308-314, 1996) muestran que la 8-hidroxidipropilaminotetralina
(8-OH-DPAT) (un agonista de 5-HT_{1A}) reduce la IOP en conejos. Wang et al. (Current Eye Research, Vol. 16(8):769-775, agosto de 1997, y IVOS, Vol. 39(4), S488, marzo de 1998) describen que el 5-metilurapidil, un antagonista de \alpha_{1A} y agonista de 5-HT_{1A} reduce la IOP en el mono, pero debido a su actividad en el receptor \alpha_{1A}. También se han descrito antagonistas de 5-HT_{1A} como agentes útiles para el tratamiento del glaucoma (IOP elevada) (por ejemplo, en el documento WO 92/0338, McLees). Además, DeSai, et al. (documento WO 97/35579) y Macor, et al. (documento U.S. 5.578.612) describen el uso de agonistas de 5-HT_{1} y semejantes a 5-HT_{1} para el tratamiento del glaucoma (IOP elevada). Estos compuestos contra la migraña son agonistas de 5-HT_{1B,D,E,F}, por ejemplo, sumatriptan y naratriptan y compuestos relacionados.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B muestran el mantenimiento de la función de las ondas a y b del electrorretinograma (ERG) en ratas tratadas sistémicamente con 8-OH-DPAT y expuestas a una agresión fotooxidativa grave.

La figura 2 muestra la protección de la morfología de la retina (fotorreceptores y RPE) en ratas tratadas sistémicamente con 8-OH-DPAT y expuestas a una agresión fotooxidativa grave.

La figura 3 muestra la protección del ADN de la retina, una medida del número de células retinianas (A), y la completa protección de la morfología de la retina (fotorreceptores) en ratas tratadas sistémicamente con buspirona y expuestas a una agresión fotooxidativa grave.

Las figuras 4A y 4B muestran el mantenimiento de la función de las ondas a y b del ERG en ratas tratadas sistémicamente con SR-57746A y expuestas a una agresión fotooxidativa grave.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de agonistas de 5-HT_{1A} para preparar un medicamento útil en el tratamiento de trastornos de la retina externa, particularmente: AMD; RP y otras formas de enfermedades heredodegenerativas de la retina; desprendimiento y desgarro de retina; membrana epirretiniana; isquemia que afecta a la retina externa; retinopatía diabética; lesiones asociadas con la terapia láser (en rejilla, focal y panretiniana) incluyendo la terapia fotodinámica (PDT); traumatismo; cirugía (translocación retiniana, cirugía subretiniana o vitrectomía) o retinopatía iatrogénica inducida por la luz; y mantenimiento de trasplantes de retina.

Descripción de las realizaciones preferidas

Se ha demostrado que los agonistas del receptor 5-HT_{1A} serotonérgico son potentes agentes neuroprotectores después de varias agresiones al sistema nervioso central. Inesperadamente, hemos demostrado que 8-OH-DPAT (8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)tetralina), buspirona y SR-57746A muestran una potente actividad neuroprotectora en la retina y previenen la muerte celular apoptótica inducida por la luz en fotorreceptores y células del RPE. Hemos descubierto que el tratamiento con buspirona puede prevenir completamente la retinopatía inducida por fotooxidación y reducir significativamente la pérdida de ADN de la retina y el adelgazamiento de la capa nuclear externa (ONL). Las ventajas en cuanto a seguridad de algunos de estos compuestos hacen que sean particularmente deseables para terapias tanto agudas como crónicas. Tales agentes tendrían utilidad en el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas de la retina externa.

En nuestros modelos de daño inducido por luz, los antioxidantes no tenían efecto (\alpha-tocoferol) o eran marginalmente eficaces a altas dosis (ascorbato, análogos de vitamina E). De forma similar, algunos antagonistas del calcio (flunarizina, nicardipina) eran moderadamente eficaces, mientras que otros (nifedipina, nimodipina, verapamil) no tenían efecto en la prevención de los cambios funcionales o morfológicos inducidos por la luz. Sin embargo, se ha descubierto que los agonistas de 5-HT_{1A} son 100 veces más potentes en estos modelos de daño inducido por luz y, por lo tanto, son útiles para tratar trastornos de la retina externa.

La invención contempla el uso de cualquier agonista de 5-HT_{1A} farmacéuticamente aceptable, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables, para preparar un medicamento para tratar trastornos de la retina externa (compuestos). Farmacéuticamente aceptable significa que los compuestos pueden usarse con seguridad para el tratamiento de enfermedades de la retina externa. Como se usa en la presente invención, la retina externa incluye el RPE, fotorreceptores, células de Muller (en la medida en que sus procesos penetran en la retina externa), y la capa plexiforme externa. Los compuestos se formulan para la administración sistémica u ocular local.

Los trastornos de la retina externa incluyen afecciones degenerativas crónicas y agudas inducidas por el ambiente (traumatismo, isquemia, estrés fotooxidativo) de fotorreceptores y de células del RPE en individuos normales o predispuestos genéticamente. Estas afecciones incluirían, pero sin limitación, AMD, RP y otras formas de enfermedad heredodegenerativa de la retina, desprendimiento de retina, desgarros, membrana epirretiniana, isquemia que afecta a la retina externa, retinopatía diabética, lesiones asociadas con la terapia láser (en rejilla, focal y panretiniana) incluyendo terapia fotodinámica (PDT), térmica o crioterapia, traumatismo, retinopatía inducida por cirugía (translocación retiniana, cirugía subretiniana o vitrectomía) o retinopatía iatrogénica inducida por luz y mantenimiento de trasplantes de retina.

Los compuestos útiles en la presente invención tienen una potente afinidad por los receptores 5-HT_{1A} con valores de IC_{50} que se extienden hasta aproximadamente 500 nM (preferiblemente menos de 100 nM). Estos compuestos también son agonistas parciales o totales con valores de IC_{50} que se extienden hasta aproximadamente 1 \muM (preferiblemente menos de 500 nM). Los agonistas de 5-HT_{1A} útiles representativos de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación: tandospirona, urapidil, ziprasidona, clorhidrato de repinotan, clorhidrato de xaliproden (SR-57746A), buspirona, flesinoxan, EMD-68843, DU-127090, gepirona, alnespirona, PNU-95666, AP-521, flibanserina, MKC-242, lesopitron, clorhidrato de sarizotan, Org-13011, Org-12966, E-5842, SUN-N4057 y 8-OH-DPAT.

La unión al receptor y la actividad agonista de acuerdo con esta invención puede determinarse usando los siguientes métodos.

Método 1 Ensayo de unión al receptor 5-HT_{1A}

Los estudios de unión a 5-HT_{1A} se realizaron con células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban receptores clonados humanos usando (^{3}H)8-OH-DPAT como ligando. Se homogeneizaron membranas de células de hámster chino (CHO) que expresaban receptores 5-HT_{1A} clonados (fabricados para NEN por Biosignal, Inc., Montreal, Canadá) en aproximadamente 40 volúmenes de Tris pH 7,4 50 mM, durante 5 seg. Se realizaron diluciones del fármaco usando un robot Beckman Biomek 2000 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Se realizaron incubaciones con preparados de membrana, los compuestos de ensayo y [^{3}H]8-OH-DPAT 0,25 nM (NEN, Boston, MA) en el mismo tampón a 27ºC durante 1 h. Los ensayos se terminaron con una rápida filtración al vacío sobre filtros de fibra de vidrio GF/B de Whatman empapados previamente en polietilenimina al 0,3%. La radiactividad unida se midió usando espectrometría de centelleo líquido. Los datos se analizaron usando programas de ajuste de curvas no lineales (Sharif et al., J Pharmac Pharmacol, 51:685-694, 1999).

Los estudios de unión a ligando también pueden realizarse usando preparaciones de membrana de cerebro de rata y de ternero (fuente local) y membranas de corteza humana. Se diseccionaron regiones específicas de cerebro, se homogeneizaron en 10 volúmenes de sacarosa 0,32 M y se centrifugaron durante 10 min a 700 x g. El sobrenadante resultante se centrifugó a 43.500 x g durante 10 min y el sedimento se resuspendió en Tris-HCl (pH 7,7, 25ºC) 50 mM usando un tratamiento de 10 seg en un politrón. Se almacenaron alícuotas a -140ºC. Para eliminar la serotonina endógena, los preparados se incubaron a 37ºC durante 10 min antes del experimento. Las incubaciones del ensayo se detuvieron por filtración rápida sobre fibras GF/C de Whatman usando un colector de células Brandel. Los valores de Ki se calcularon usando la ecuación de Cheng-Prusoff (De Vry et al., J Pharm Exper Ther, 28:1082-1094, 1998).

Método 2 Ensayos funcionales de 5-HT_{1A}

La función de los compuestos de la presente invención puede determinarse usando varios métodos para evaluar la actividad funcional de agonistas de 5-HT_{1A}. Uno de tales ensayos se realiza usando cortes de hipocampo de ratas Sprague-Dawley macho y midiendo la inhibición de la adenilato ciclasa estimulada por forskolina (J Med Chem, 42:36, 1999; J Neurochem, 56:1114, 1991; J Pharm Exper Ther, 284:1082, 1998). Se homogeneizaron membranas de hipocampo de rata en 25 volúmenes de sacarosa 0,3 M que contenía EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 5 mM y Tris-HCl, pH 7,4 20 mM a 25ºC. Se centrifugó el homogeneizado durante 10 min a 10.000 x g. El sobrenadante posteriormente se centrifugó a 39.000 x g durante 10 min. El sedimento resultante se resuspendió en tampón de homogeneización a una concentración de proteína de aproximadamente 1 mg/ml y se almacenaron alícuotas a -140ºC. Antes de su uso, las membranas se volvieron a homogeneizar en un Potter-Elvehjem. Se añadieron 50 \mul de la suspensión de membrana (50 \mug de proteína) a un tampón de incubación que contenía NaCl 100 mM, acetato de magnesio 2 mM, ATP 0,2 mM, AMPc 1 mM, GTP 0,01 mM, forskolina 0,01 mM, Tris-HCl 80 mM, fosfato de creatina 5 mM, 0,8 U/\mul de creatina fosfoquinasa, IBMX 0,1 mM, y 1-2 \muCi de \alpha-[^{32}P]ATP. Las incubaciones con los compuestos de ensayo (10 min a 30ºC) se iniciaron por la adición de la solución de membrana a la mezcla de incubación (previamente calentada 5 min a 30ºC). El [^{32}P]ATP se midió de acuerdo con el método de Salomon (Adv Cyclic Nucleotide Res, 10:35-55, 1979). Las proteínas se midieron usando el ensayo de Bradford (Anal Biochem, 72:248-2554, 1976).

\newpage

La actividad funcional también se puede determinar en receptores humanos recombinantes de acuerdo con el método de Schoeffter et al. (Neuropharm, 36:429-437, 1997). Se cultivaron células HeLa transfectadas con el receptor 5-HT_{1A} humano recombinante hasta la confluencia en placas de 24 pocillos. Las células se aclararon con 1 ml de solución salina tamponada con Hepes (en mM) NaCl 130, KCl 5,4, CaCl_{2} 1,8, MgSO_{4} 0,8, NaH_{2}PO_{4} 0,9, glucosa 25, Hepes 20, pH 7,4 y rojo fenol a 5 mg/l. Las células se marcaron con 6 \muCi/ml de [^{3}H]adenina (23 Ci/mmol, Amersham, Rahn AG, Zurich, Suiza) en 0,5 ml de solución salina a 37ºC durante 2 h. Posteriormente, las placas se aclararon dos veces con 1 ml de solución salina tamponada que contenía isobutilmetilxantina 1 mM. Las células se incubaron durante 15 min en 1 ml de esta solución (37ºC) en presencia o ausencia de forskolina 10 \muM y el compuesto de ensayo. Después se retiró el tampón y se añadió 1 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 5% que contenía AMPc 0,1 mM y ATP 0,1 mM para extraer las muestras. Después de 30 min a 4ºC, los extractos de TCA se sometieron a separación cromatográfica en Dowex AG 50W-X4 y columnas de alúmina (Salomon, Meth Enzymol, 195:22-28, 1991). La producción de AMP cíclico se calculó como la relación [^{3}H]AMPc/([^{3}H]AMPc + [^{3}H]ATP).

Los procedimientos anteriores descritos en los métodos 1 y 2 se usaron para generar los siguientes datos.

TABLA 1 Datos del ensayo de unión al receptor 5-HT_{1A} y funcional.

Compuesto	Unión al Receptor (IC_{50} nM,SEM)	Inhibición de AMPc (EC_{50})
(R,S) 8-OH-DPAT	1,5 nM	4,7 nM
(R) 8-OH-DPAT	0,5 nM	2,6 nM
SR-57746A	2,5 nM	3,7 nM

En general, para enfermedades degenerativas, los agonistas de 5-HT_{1A} de esta invención se administran por vía oral con una dosificación diaria de estos compuestos que varía entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 500 miligramos. La dosis total diaria preferida varía entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 miligramos. La administración no oral, tal como intravítrea, tópica ocular, con parches transdérmicos, subdérmica, parenteral, intraocular, subconjuntival o retrobulbar o inyección subtenon, transescleral (incluyendo iontoforesis), o con liposomas o polímeros biodegradables de liberación lenta, puede requerir un ajuste de la dosis diaria total necesaria para proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto. Los agonistas de 5-HT_{1A} también pueden administrarse en soluciones de irrigación ocular. Las concentraciones deben variar de aproximadamente 0,001 \muM a aproximadamente 100 \muM, preferiblemente de aproximadamente 0,01 \muM a aproximadamente 5 \muM.

Los agonistas de 5-HT_{1A} pueden incorporarse en diversos tipos de formulaciones oftálmicas para su liberación en el ojo (por ejemplo, por vía tópica, intracameral o a través de un implante). Pueden combinarse con conservantes, tensioactivos, potenciadores de la viscosidad, agentes gelificantes, potenciadores de la penetración, tampones, cloruro sódico y agua, siendo tales agentes oftalmológicamente aceptables, para formar suspensiones o soluciones oftálmicas acuosas estériles o geles preformados o geles formados in situ. Las formulaciones de soluciones oftálmicas pueden prepararse disolviendo el compuesto en un tampón acuoso isotónico fisiológicamente aceptable. Además, la solución oftálmica puede incluir un tensioactivo oftalmológicamente aceptable para ayudar a la disolución del compuesto. Las soluciones oftálmicas pueden contener un potenciador de la viscosidad tal como hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona o similares, para mejorar la retención de la formulación en el saco conjuntival. Para preparar formulaciones de pomadas oftálmicas estériles, el ingrediente activo se combina con un conservante en un vehículo apropiado, tal como aceite mineral, lanolina líquida o vaselina blanca. Las formulaciones de geles oftálmicos estériles pueden prepararse suspendiendo el ingrediente activo en una base hidrófila preparada por la combinación de, por ejemplo, carbopol-940, o similar, de acuerdo con las formulaciones publicadas para preparaciones oftálmicas análogas; se pueden incorporar conservantes y agentes de tonicidad.

Si se administran tópicamente, los agonistas de 5-HT_{1A} se formulan preferiblemente como suspensiones o soluciones oftálmicas tópicas, con un pH de aproximadamente 4 a 8. Los agonistas de 5-HT_{1A} normalmente estarán contenidos en estas formulaciones en una cantidad del 0,001% al 5% del peso, pero preferiblemente en una cantidad del 0,01% al 2% en peso. De esta manera, para la presentación tópica, se administrarían 1 ó 2 gotas de estas formulaciones en la superficie del ojo de 1 a 4 veces diarias a discreción del experto clínico.

Las siguientes formulaciones oftálmicas tópicas son útiles de acuerdo con la presente invención administradas de 1 a 4 veces por día a discreción del experto clínico.

Ejemplo 1

Ingredientes	Cantidad (% en peso)
Buspirona	0,01-2%
Hidroxipropilmetilcelulosa	0,5%
Fosfato sódico dibásico (anhidro)	0,2%
Cloruro sódico	0,5%
EDTA disódico (Edetato disódico)	0,01%
Polisorbato 80	0,05%
Cloruro de benzalconio	0,01%
Hidróxido sódico/Ácido clorhídrico	Para ajustar el pH a 7,3-7,4
Agua purificada	c.s. hasta 100%

Ejemplo 2

Ingredientes	Cantidad (% en peso)
Buspirona	0,01-2%
Metilcelulosa	4,0%
Fosfato sódico dibásico (anhidro)	0,2%
Cloruro sódico	0,5%
EDTA disódico (Edetato disódico)	0,01%
Polisorbato 80	0,05%
Cloruro de benzalconio	0,01%
Hidróxido sódico/Ácido clorhídrico	Para ajustar el pH a 7,3-7,4
Agua purificada	c.s. hasta 100%

Ejemplo 3

Ingredientes	Cantidad (% en peso)
Compuesto	0,01-2%
Goma guar	0,4-6,0%
Fosfato sódico dibásico (anhidro)	0,2%
Cloruro sódico	0,5%
EDTA disódico (Edetato disódico)	0,01%
Polisorbato 80	0,05%

(Continuación)

Ingredientes	Cantidad (% en peso)
Cloruro de benzalconio	0,01%
Hidróxido sódico/Ácido clorhídrico	Para ajustar el pH a 7,3-7,4
Agua purificada	c.s. Hasta 100%

Ejemplo 4

Ingredientes	Cantidad (% en peso)
Clorhidrato de xaliproden	0,01-2%
Vaselina blanca, aceite mineral y lanolina	Para dar consistencia a la pomada
Fosfato sódico dibásico (anhidro)	0,2%
Cloruro sódico	0,5%
EDTA disódico (Edetato disódico)	0,01%
Polisorbato 80	0,05%
Cloruro de benzalconio	0,01%
Hidróxido sódico/Ácido clorhídrico	Para ajustar el pH a 7,3-7,4

Ejemplo 5

Solución i.v. 10 mM (% p/v)
Buspirona	0,384%
Ácido L-tartárico	2,31%
Hidróxido sódico	pH 3,8
Ácido clorhídrico	pH 3,8
Agua purificada	c.s. hasta 100%

Ejemplo 6

Cápsulas de 5 mg
Ingrediente	mg/cápsula (peso total 22a mg)
Clorhidrato de buspirona	5
Lactosa, anhidra	55,7
Carboximetil almidón sódico	8
Celulosa, microcristalina	30
Dióxido de silicio coloidal	0,5
Estearato de magnesio	0,8

Método 3 Efectos neuroprotectores en el modelo de retinopatía inducida por fotooxidación en la rata

Se evaluó el efecto protector de la retina de estos agonistas de 5-HT_{1A} en nuestro modelo de retinopatía inducido por fotooxidación.

Inducción de la lesión fotoquímica

Se indujeron lesiones fotoquímicas en ratas adaptadas a la oscuridad (24 horas) mediante la exposición a luz azul (220 fc) (paso de banda de la amplitud media = 435 a 475 nm) durante 6 horas. Se dejó que los animales se recuperaran durante 5 días en la oscuridad antes de la evaluación electrodiagnóstica de la función de la retina. Las ratas se encerraron individualmente en jaulas de policarbonato transparente durante esta exposición a la luz.

Evaluación electrodiagnóstica

Se registró el electrorretinograma (ERG) de ratas anestesiadas después de un periodo de adaptación a la oscuridad de 24 horas. Las ratas se anestesiaron con una inyección IP con ketamina-HCl (75 mg/kg) y xilazina (6 mg/kg). Los ERG con flash registrados desde un electrodo del bucle del cable de platino-iridio colocado en la córnea se indujeron mediante la estimulación de un ganzfeld. Las respuestas eléctricas a una serie de destellos de luz que se incrementaban en intensidad se digitalizaron para analizar las características temporales de la forma de onda y la respuesta de la relación voltaje-log de intensidad (VlogI). Los cambios en la onda a del ERG están asociados con las lesiones en los fotorreceptores y en el epitelio pigmentario retiniano, mientras que el daño en la retina interna se refleja en cambios en la onda b del ERG.

Evaluación de la morfología de la retina

Se obtuvieron tejidos oculares de ratas de control y tratadas con fármaco o vehículo y se fijaron por inmersión es una mezcla de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2%. Los globos oculares fijados se deshidrataron en una serie ascendente de etanol, se incluyeron en resina plástica JB-4 y se analizaron cortes de 1 a 1,5 micrómetros de grosor usando un sistema computerizado cuantitativo de análisis de imágenes acoplado al microscopio. Se midió el grosor de la capa retiniana (epitelio pigmentario retiniano, RPE; grosor de la capa nuclear externa, ONL; grosor de la capa nuclear interna, INL; y longitud de los segmentos interno y externo de fotorreceptores, IS+OS).

Evaluación de los cambios de ADN

Se sacrificaron ratas albinas por inhalación de CO_{2} y las retinas individuales se congelaron en tubos separados. Cada retina se había sonicado en 0,8 ml (NaCl 2,0 M, NaPO_{4}, pH 7,4 50 mM, EDTA 2 mM) para producir un homogeneizado uniforme, que se almacenó congelado. Se diluyeron 10 veces alícuotas (0,1 ml) de cada muestra con NaCl 2,0 M, NaPO_{4} pH 7,4 50 mM, EDTA 2 mM que contenía 1,1 \mug/ml de bisbencimidazol (Hoechst 33258). Se construyó una curva patrón usando ADN de timo de ternero a una concentración de 0 a 25 \mug/ml en el mismo tampón. Utilizando una pipeta, se introdujeron alícuotas de 0,2 ml de cada muestra de retina y patrón, por triplicado, en una placa de 96 pocillos para medir la fluorescencia en el Cytofluor II. La longitud de onda de excitación fue de 360 nm y la longitud de onda de emisión fue de 460 nm.

Sujetos y dosificación

Se asignaron aleatoriamente ratas Sprague Dawley macho a grupos experimentales de fármaco y de control. Las ratas de control se encerraron en su jaula bajo una exposición a la luz cíclica normal. Todas las ratas recibieron la dosificación 48, 24 y 0 horas antes de una exposición a luz azul durante 6 horas. La dosificación fue como se indica a continuación:

1.) 8-OH-DPAT (8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)tetralina)

A las ratas que recibieron el vehículo (N = 10) u 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg [N = 5] o 1,0 mg/kg [N = 10]) se les administraron tres inyecciones subcutáneas (SC) antes de la exposición a la luz. Se usaron cinco ratas como controles. La protección de la retina se evaluó analizando la respuesta ERG y midiendo los cambios en la morfología de la retina.

2.) Buspirona

Para la cuantificación del ADN, se trataron seis ratas por grupo de tratamiento con dosis IP del vehículo o buspirona (0,5 y 1 mg/kg) antes de la exposición a la luz. Como controles, se usaron las retinas de siete ratas normales. Para evaluar los cambios en la morfología de la retina, a las ratas se les administró (IP) vehículo (N = 8) o buspirona (1,0 mg/kg [N = 9]). Se usaron seis ratas como controles. La protección de la retina se evaluó cuantificando los cambios en el ADN de la retina y midiendo los cambios en la morfología de la retina.

3.) SR-57746A

A las ratas se les administró (IP) vehículo (N = 15) o SR-57746A (0,5 mg/kg [N = 5] o 1 mg/kg [N = 15]). Se usaron once ratas como controles. Se analizó el ERG después de un periodo de recuperación de 5 días para evaluar la protección de la retina.

Evaluación de los resultados de 8-OH-DPAT

La exposición a la luz azul durante 6 horas tuvo como resultado una disminución significativa de la amplitud de la respuesta ERG (ANOVA, p < 0,001; ensayo t de Bonferroni, p < 0,05) en comparación con las normales cuando se midió después de un periodo de recuperación de 5 días (figuras 1A y 1B). La exposición a la luz azul produjo una reducción del 75% en las amplitudes máximas de las ondas a y b en ratas que recibieron el vehículo en comparación con los controles. Además, las respuestas umbral eran más bajas y provocadas en intensidades de destellos más brillantes.

Las ratas tratadas con 8-OH-DPAT mostraron una protección dependiente de la dosis de la función de la retina externa e interna contra esta retinopatía inducida por fotooxidación (figuras 1A y 1B). Las amplitudes máximas de la respuesta de ondas a y b en ratas tratadas con 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg) no se diferenciaron de las de las ratas tratadas con vehículo y eran aproximadamente un 27% de las amplitudes de control. Sin embargo, las amplitudes máximas de la respuesta de ondas a y b de las ratas tratadas con 8-OH-DPAT (1,0 mg/kg) eran aproximadamente un 53% y un 61% de la normal, respectivamente, y significativamente más altas que las respuestas medidas en las ratas tratadas con vehículo (figuras 1A y 1B).

En consonancia con estos cambios en ERG, el análisis morfométrico de estas retinas después de un periodo de recuperación de 3 semanas demostró una pérdida significativa (ANOVA, p < 0,01) de células fotorreceptoras, un acortamiento de la longitud de los segmentos interno + externo de fotorreceptores y un aplanamiento del RPE en animales tratados con vehículo. No se detectaron cambios significativos en el grosor de la INL. El grosor de la ONL se redujo un 73%, la longitud del segmento interno + externo se redujo un 82% y el grosor del RPE se redujo un 59% en comparación con los controles (figura 2). Las lesiones observadas en las ratas tratadas con 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg) no eran significativamente diferentes de las lesiones medidas en ratas tratadas con vehículo. Mientras que los ERG se redujeron aproximadamente un 63%, el grosor de la ONL se redujo un 53%, la longitud de los segmentos de fotorreceptores se redujo un 60% y el grosor de RPE se redujo un 34%. Sin embargo, las lesiones fóticas observadas en ratas tratadas con 8-OH-DPAT (1,0 mg/kg) eran significativamente diferentes de las de las ratas tratadas con vehículo. Mientras que la amplitud de la respuesta ERG era superior al 50% de la normal, el grosor de la ONL era 2,4 veces mayor, la longitud de los segmentos fotorreceptores era 2,9 veces mayor y el grosor de RPE era 1,9 veces mayor en comparación con las ratas tratadas con vehículo.

Resultados de la evaluación de buspirona

Como se ve en la figura 3A, los niveles de ADN de retina de los tratamientos con vehículo se habían reducido significativamente (ANOVA, p = 0,017) a aproximadamente el 30% de los niveles control. No se midieron diferencias significativas entre los grupos tratados con vehículo o con 0,1 mg/kg de buspirona. La protección de la retina se midió en ratas tratadas con buspirona (1 mg/kg). Los niveles de ADN de retina eran significativamente mayores que los medidos en ratas tratadas con vehículo, pero no significativamente diferentes de los de los controles.

La exposición a la luz azul durante 6 horas provocó una reducción significativa en el número de fotorreceptores (ANOVA, p < 0,05). El análisis morfométrico de estas retinas después de un periodo de recuperación de 4 semanas demostró un adelgazamiento del 54% de la capa nuclear externa en las ratas tratadas con vehículo en comparación con los controles (figura 3B). Sin embargo, no se midieron diferencias significativas en el grosor de la ONL entre las ratas normales y las tratadas con buspirona. En ratas tratadas con buspirona (1 mg/kg), el grosor de la ONL era de 28,3 \mum en comparación con el valor de 34 \mum en ratas normales.

Resultados de la evaluación de SR-57746A

Se midió una protección significativa de la función retiniana en ratas expuestas a la luz tratadas con SR-57746A (0,5 y 1,0 mg/kg). Las amplitudes máximas de la respuesta de ondas a y b se redujeron en un 50% en las ratas tratadas con vehículo en comparación con los controles (figuras 4A y B). Las respuestas máximas eran del 83% de los controles en ratas tratadas con SR-57746A (0,5 mg/kg) y del 70% del normal en ratas tratadas con 1 mg/kg.

Conclusión

Estos agonistas de 5-HT_{1A} (8-OH-DPAT, buspirona y SR-57746A) demostraron buena potencia y eficacia en este modelo oxidativo de enfermedad degenerativa de la retina. Se logró la protección funcional y estructural en ratas tratadas en tres días consecutivos con una dosis tan baja como 1 mg/kg.

Claims (4)

1. El uso de un compuesto con actividad agonista de 5-HT_{1A} para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos de la retina externa.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, de un compuesto seleccionado entre tandospirona, urapidil, ziprasidona, clorhidrato de repinotan, clorhidrato de xaliproden (SR-57746A), buspirona, flesinoxan, EMD-68843, DU-127090, gepirona, alnespirona, PNU-95666, AP-521, flibanserina, MKC-242, lesopitron, clorhidrato de sarizotan, E-5842, SUN-N4057, Org-13011, Org-12966 y 8-OH-DPAT.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el trastorno se selecciona entre AMD; RP y otras formas de enfermedad heredodegenerativa de la retina; desprendimiento y desgarro de retina; membrana epirretiniana; isquemia que afecta a la retina externa; retinopatía diabética; lesiones asociadas con la terapia láser (en rejilla, focal y panretiniana) incluyendo la terapia fotodinámica (PDT); traumatismo; retinopatía inducida por cirugía (translocación retiniana, cirugía subretiniana o vitrectomía) o retinopatía iatrogénica inducida por la luz; y mantenimiento de trasplantes de retina.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, donde el trastorno es AMD, RP o retinopatía diabética.