PL201487B1 - Sposób wytwarzania ekstraktu roślinnego, ekstrakt roślinny, środek o czynności hamowania łaknienia i zastosowanie ekstraktu roślinnego - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy ekstraktu z ro sliny ro- dzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, zawie- rajacego skuteczn a do hamowania laknienia ilosc hamuj acego laknienie glikozydu steroido- wego o wzorze (1), a tak ze sposobu wytwarza- nia takiego ekstraktu, srodka zawieraj acego ekstrakt oraz zastosowania ekstraktu do wytwa- rzania leku do leczenia, zapobiegania lub zwal- czania oty lo sci. PL PL PL PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201487 (21) Numer zgłoszenia: 380957 _{(13) B1} (22) Data zgłoszenia: 15.04.1998 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:

336498 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

15.04.1998, PCT/GB98/01100 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

22.10.1998, WO98/46243 PCT Gazette nr 42/98 (51) Int.Cl.

A61K 36/27 (2006.01)

A61K 36/33 (2006.01)

A61K 31/704 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) A61P 3/04 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Sposób wytwarzania ekstraktu roślinnego, ekstrakt roślinny, środek o czynności hamowania łaknienia i zastosowanie ekstraktu roślinnego

	(73) Uprawniony z patentu: CSIR,Pretoria,ZA
(30) Pierwszeństwo: 15.04.1997,ZA,97/3201	(72) Twórca(y) wynalazku: Fanie Retief Van Heerden,Johannesburg,ZA
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 03.07.2000 BUP 14/00	Robert Vleggaar,Pretoria,ZA Roelof Marthinus Horak,Pretoria,ZA Robin Alec Learmonth,Pretoria,ZA Vinesh Maharaj,Pretoria,ZA Rory Desmond Whittal,Pretoria,ZA
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2009 WUP 04/09	(74) Pełnomocnik: Tykarski Wojciech, SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA,
	Biuro Patentów i Znaków Towarowych Sp.J.

⁽⁵⁷⁾ Wynalazek dotyczy ekstraktu z rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, zawierającego skuteczną do hamowania łaknienia ilość hamującego łaknienie glikozydu steroidowego o wzorze (1), a także sposobu wytwarzania takiego ekstraktu, środka zawierającego ekstrakt oraz zastosowania ekstraktu do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.

PL 201 487 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania ekstraktu roślinnego, ekstraktu roślinnego, środka o czynnoś ci hamowania ł aknienia i zastosowania ekstraktu roś linnego.

Ekstrakt można wytworzyć z materiału roślinnego, takiego jak łodygi i korzenie takich roślin rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia. Rodzaj Trichocaulon i rodzaj Hoodia obejmuje rośliny soczyste rosnące w jałowych regionach znajdujących się w Ameryce Południowej. Botanische jahrbUcher fur systematik pflanzengeschiete und pflanzengeographie, vol. 115, nr 2, str. 145-270 P. Bruynsa jest zasadniczo pracą przeglądową z dziedziny taksonomii i zawiera odniesienia do rodzajów Trichocaulon i Hoodia.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania ekstraktu z rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, zawierającego skuteczną do hamowania łaknienia ilość hamującego łaknienie glikozydu steroidowego o wzorze (1)

charakteryzującego się tym, że na materiał roślinny działa się rozpuszczalnikiem dla ekstrakcji frakcji o czynności hamowania łaknienia, oddziela się roztwór ekstrakcyjny od reszty materiału roślinnego, usuwa się rozpuszczalnik z roztworu ekstrakcyjnego i wyodrębnia się ekstrakt.

Korzystnie stosuje się roślinę rodzaju Trichocaulon wybraną z grupy obejmującej gatunek Trichocaulon piliferum i Trichocaulon officinale i roślinę rodzaju Hoodia wybraną z grupy obejmującej gatunek Hoodia currorii, Hoodia gordonii i Hoodia lugardii.

W szczególności ekstrakt ekstrahuje się z rośliny wybranej z grupy obejmującej gatunek Hoodia currorii, Hoodia gordonii i Hoodia lugardii.

W sposobie korzystnie zatęża się substancję czynną w wyekstrahowanym materiale drogą dalszej ekstrakcji rozpuszczalnikiem. Jako rozpuszczalnik w etapie ekstrakcji rozpuszczalnikiem lub etapach ekstrakcji rozpuszczalnikiem stosuje się jeden lub większą liczbę rozpuszczalników wybranych z grupy obejmującej chlorek metylenu, wodę, metanol, heksan, octan etylu i ich mieszaniny.

W korzystnej odmianie zatęża się substancję czynną w wyekstrahowanym materiale drogą rozdzielania chromatograficznego. Korzystnie w etapie rozdzielania chromatograficznego jako eluent stosuje się jeden lub większą liczbę rozpuszczalników wybranych z grupy obejmującej chloroform, metanol, octan etylu, heksan i ich mieszaniny. Także korzystnie przy rozdzielaniu chromatograficznym w kolumnie, zbiera się eluat we frakcjach z kolumny, ocenia się frakcje dla określenia ich czynności hamowania łaknienia i wybiera się co najmniej jedną frakcję zawierającą substancję hamującą łaknienie.

W korzystnej odmianie ekstrakt poddaje się obróbce z wytworzeniem sypkiego proszku.

Wynalazek dotyczy także ekstraktu roślinnego zawierającego środek hamujący łaknienie, wytworzonego sposobem określonym powyżej. Korzystnie ekstrakt nadaje się do stosowania jako lek o czynności hamowania łaknienia, lub jako lek do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.

Wynalazek dotyczy również środka o czynności hamowania łaknienia, charakteryzującego się tym, że zawiera ekstrakt określony powyżej. Środek ten korzystnie jest zmieszany z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem, a także sformułowany w jednostkową postać dawkowaną.

Korzystnym środkiem jest produkt żywnościowy lub napój.

Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania ekstraktu roślinnego z rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, zawierającego skuteczną do hamowania łaknienia ilość hamującego łaknienie glikozydu steroidowego o wzorze (1)

PL 201 487 B1

charakteryzującego się tym, że prasuje się materiał roślinny, oddziela się sok od stałego materiału roślinnego i wyodrębnia się sok wolny od stałego materiału roślinnego z wytworzeniem ekstraktu. Korzystnie ekstrakt suszy się z wytworzeniem sypkiego proszku.

Wynalazek dotyczy ekstraktu roślinnego zawierającego środek hamujący łaknienie wytworzonego sposobem określonym powyżej. Ekstrakt korzystnie nadaje się do stosowania jako lek o czynności hamowania łaknienia, lub jako lek do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.

Wynalazek dotyczy środka o czynności hamowania łaknienia charakteryzującego się tym, że zawiera powyższy ekstrakt. Środek ten korzystnie jest zmieszany z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem, a także sformułowany w jednostkową postać dawkowaną.

Korzystnym środkiem jest produkt żywnościowy lub napój.

Wynalazek dotyczy także zastosowania powyższego ekstraktu do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.

Próby biologiczne prowadzone przez zgłaszającego na szczurach wykazały, że ekstrakty mają czynność hamowania łaknienia.

Materiał roślinny może być homogenizowany w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika, np. mieszaniny rozpuszczalników metanol/chlorek metylenu, z użyciem urządzenia, takiego jak mieszarka Waringa. Roztwór ekstrakcyjny można następnie oddzielić od pozostałego materiału roślinnego z zastosowaniem odpowiedniego sposobu rozdzielania, takiego jak, np. odsączenia lub odwirowania. Rozpuszczalnik ten można usunąć z użyciem wyparki rotacyjnej, korzystnie w łaźni wodnej w temperaturze wynoszącej 60°C. Oddzielony surowy ekstrakt można następnie poddać ekstrakcji chlorkiem metylenu i wody, po czym rozdzielić ekstrakty w chlorku metylenu i w wodzie. Ekstrakt w chlorku metylenu może zawierać rozpuszczalnik, który usuwa się korzystnie drogą odparowania w wyparce rotacyjnej i uzyskany ekstrakt może być dodatkowo oczyszczany drogą ekstrakcji z użyciem mieszaniny metanol/heksan. Produkt z ekstrakcji mieszaniną metanol/heksan można następnie oddzielić z uzyskaniem ekstraktu w metanolu i ekstraktu w heksanie. Ekstrakt w metanolu można następnie odparować w celu usunięcia rozpuszczalnika z uzyskaniem częściowo oczyszczonego czynnego ekstraktu.

Częściowo oczyszczony czynny ekstrakt można rozpuścić w metanolu i dodatkowo frakcjonować drogą chromatografii kolumnowej z zastosowaniem żelu krzemionkowego jako ośrodka adsorbującego i mieszaniny chloroform/30% metanol jako eluentu. Można otrzymać wiele różnych frakcji i każ d ą z nich moż na oceniać poprzez zastosowanie odpowiednich procedur prób biologicznych i określić ich czynność hamowania łaknienia.

Frakcję o czynności hamowania łaknienia można korzystnie dodatkowo frakcjonować drogą chromatografii kolumnowej z użyciem żelu krzemionkowego jako ośrodka adsorpcyjnego i mieszaniny chloroform:metanol w stosunku 9:1 jako rozpuszczalnika i uzyskane podfrakcje można poddawać próbom biologicznym odnośnie ich czynności hamowania łaknienia. Podfrakcje wykazującą czynność hamowania łaknienia, w razie potrzeby, można dodatkowo frakcjonować i oczyszczać, dogodnie z uż yciem metody chromatografii kolumnowej na ż elu krzemionkowym jako oś rodku adsorpcyjnym i z użyciem mieszaniny chloroform:metanol w stosunku 9:1 jako rozpuszczalnika. Uzyskane oczyszczone frakcje można ponownie oceniać drogą odpowiednich procedur prób biologicznych pod względem ich czynności hamowania łaknienia.

Zgłaszający stwierdził, że co najmniej jedna taka oczyszczona frakcja wykazuje dobrą czynność hamowania łaknienia i czynną zasadę we frakcji zidentyfikowano drogą konwencjonalnych technik

PL 201 487 B1 chemicznych w tym nuklearnego rezonansu magnetycznego i stwierdzono że jest nią związek o wzorze strukturalnym

Zgodnie z nomenklaturą S.I. czynną zasadą (1) jest związek 3-O-[-e-D-tewetopiranozylo(1 >4)-e-D-cymaropiranozylo-(1 >4)-e-D-cymaropiranozylo]-12e-O-tygloiloksy-14-hydroksy-14e-pregn-50-en-20-on (C47H74O15 M⁺878).

Ekstrakt można przetworzyć lub wysuszyć i usunąć wodę, np. drogą suszenia rozpyłowego, liofilizacji lub suszenia pod próżnią z wytworzeniem sypkiego proszku.

Wynalazek dotyczy zatem środka o czynności hamowania łaknienia zawierającą opisany powyżej ekstrakt.

Środek można mieszać z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem i ewentualnie formułować w jednostkową postać dawkowania. Środkiem może być produkt żywnościowy lub napój.

W dalszych postaciach wynalazek dotyczy zastosowania ekstraktu opisanego powyżej do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości, ekstraktu opisanego powyżej do stosowania jako lek o czynności hamowania łaknienia lub do stosowania jako lek do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.

Związek (1) jest nowym związkiem i ten trisacharyd steroidowy ma właściwości hamowania łaknienia. Wynalazek obejmuje również kompozycję oraz preparat mające czynność hamowania łaknienia, w których substancję czynną stanowi ekstrakt uzyskany z rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, jak opisano powyżej.

Substancją czynną jest związek o wzorze (1), wyekstrahowany z rośliny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia. Roślina może być z gatunku Trichocaulon officinale lub Trichocaulon piliferum, albo gatunku Hoodia currorii, Hoodia gordonii lub Hoodia lugardii.

Środkiem hamującym łaknienie może być, przykładowo, dowolny naturalny związek o wzorze:

Środek lub preparat hamujące łaknienie mogą składać się ze środka hamującego łaknienie zmieszanego z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem. W razie potrzeby można dodać innych odpowiednich substancji pomocniczych, w tym stabilizatora i takie inne składniki.

PL 201 487 B1

Wynalazek obejmuje zastosowanie związku (1) w wytwarzaniu leku mającego czynność hamowania łaknienia, jak opisano powyżej.

Wynalazek ponadto obejmuje związek (1) do zastosowania jako lek mający czynność hamowania łaknienia, jak opisano powyżej.

Opisano tu sposób ekstrahowania glikozydu steroidowego o czynności hamowania łaknienia z materiału roślinnego uzyskanego z roś liny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia. Wynalazek swoim zakresem obejmuje więc ekstrakt uzyskany z materiału roślinnego rodzaju Trichocaulon lub Hoodia i zawierają cy zasadniczo czysty glikozyd steroidowy o wzorze (1), jak opisano powyż ej.

Wynalazek swoim zakresem obejmuje także artykuły żywnościowe oraz napój zawierające skuteczną ilość glikozydu steroidowego o wzorze (1), który po spożyciu ma działanie hamowania łaknienia.

Molekularne badania genetyczne są prowadzone w celu lepszego zrozumienia regulacji łaknienia, nasycenia i wagi ciała. Badania te ujawniły wiele centralnych szlaków regulatorowych, mediowanych przez wiele neuropeptydów. Normalną wagę ciała utrzymuje się w wyniku skomplikowanej równowagi pomiędzy dostarczana energią, przyjmowaniem pokarmu i zużyciem energii. Na homeostazę energii działa wiele czynników, ostatecznie kontrolowane przez mózg. Do takich różnych sygnałów należą zmysł węchu i smaku oraz sygnały układu żołądkowo-jelitowego, takie jak rozszerzenie przewodu żołądkowo-jelitowego, chemiczne sygnały do błony śluzowej żołądka i przenoszone przez krew metabolity, takie jak kwasy tłuszczowe i glukoza.

Dowiedziono, że w układzie ośrodkowym neuropeptyd ”Y (NPY) ujemnie regulowany przez leptynę, jest jednym z dodatnich regulatorów zachowania odżywiania się. Wykazano, że ekspresja endogenicznego antagonisty receptorów melanokortyny przyczynia się do otyłości w konkretnym modelu (myszy ob/ob). Rzeczywiście defekt receptora melanokortyny MC4 w pełni powtarza syndrom otyłości. Do innych mediatorów, w przypadku których wykazano, że odgrywają rolę w bilansie energii, należą bombesyna, galonina i glukagono-podobny peptyd-1.

Wynalazek oraz jego skuteczność dodatkowo będzie opisana poprzez poniższe przykłady i rysunki, bez ograniczenia zakresu ochrony wynalazku.

Na rysunkach:

Figura 1 obrazuje diagram przebiegu ogólnego sposobu ekstrahowania pierwszego surowego ekstraktu hamującego łaknienie i oczyszczonego ekstraktu hamującego łaknienie z materiału rośliny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia;

Figura 2 jest graficznym przedstawieniem prób biologicznych prowadzonych na szczurach z uż yciem częściowo oczyszczonego ekstraktu Trichocaulon piliferum w metanolu;

Figury 3 i 4 łącznie są schematycznym przedstawieniem sposobu wytwarzania ekstraktu z materiału rośliny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia; a

Figury 5 i 6 są graficznym przedstawieniem procentowej zmiany masy ciała szczurów dla różnych grup odpowiednio dla dni od -7 do 7 i dni 0 - 7, w badaniu z powtarzaniem dawki, z użyciem ekstraktu soku i suszonego rozpryskowo ekstraktu soku z Hoodia gordonii.

P r z y k ł a d 1

Ogólny sposób ekstrahowania pierwszego surowego ekstraktu hamującego łaknienie i oczyszczonego ekstraktu hamującego łaknienie z materiału rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia ilustruje diagram przebiegu na figurze 1.

P r z y k ł a d 2

Próby biologiczne prowadzone na szczurach z użyciem częściowo oczyszczonego ekstraktu w metanolu uzyskanego sposobem podanym w przykł adzie 1, wykazał y, ż e ekstrakt rzeczywiś cie wykazuje czynność hamowania łaknienia. Czynność hamowania łaknienia czynnego ekstraktu mogą ilustrować typowe przykłady działania ekstraktu Trichocaulon piliferum w metanolu na szczurach poprzez graficzne przedstawienie na figurze 2.

Jest oczywiste z figury 2, że grupa badana szczurów, którym podawano ekstrakt dnia 5, wykazywała zasadnicze zmniejszenie przyjmowania pokarmu w ciągu następnych dwóch dni, podczas gdy grupa kontrolna nie ujawniła porównywalnego zmniejszenia przyjmowania pokarmu. Przyjmowanie pokarmu przez grupę badaną powróciło do normy, a rzeczywiście zwiększyło się od dnia 8.

P r z y k ł a d 3

Korzystną postać sposobu według wynalazku wytwarzania ekstraktu mającego czynność hamowania łaknienia zilustrowano schematycznie przykładowo na figurach 3 i 4, które to dwie figury

PL 201 487 B1 razem ilustrują wyczerpująco sposób. Jednak można użyć różnych innych sposobów, co jest zrozumiałe dla fachowców.

Zgodnie z figurą 3 materiał rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia umieszcza się w mieszarce 3, np. mieszarce Waringa, z użyciem linii zasilania 1, z rozpuszczalnikiem w postaci roztworu chlorek metylenu/metanol dostarczonym poprzez linię zasilania 2. Homogenizowany produkt dostarcza się poprzez linię 4 do etapu rozdzielania 5, np. poprzez odsączenie lub odwirowanie, i pozostały materiał roślinny usuwa się z użyciem linii 27.

Mieszaninę rozpuszczalnik/ekstrakt dostarcza się z użyciem linii 6 do etapu odparowania 7, gdzie rozpuszczalnik usuwa się, np. z użyciem wyparki rotacyjnej. Wysuszony surowy ekstrakt doprowadza się z użyciem linii 8 do etapu dalszego ekstrahowania 9 z dodawaniem roztworu chlorek metylenu/woda wprowadzonego z użyciem linii zasilania 29 w celu przeprowadzenia dodatkowej ekstrakcji, po czym do etapu rozdzielania 13 z użyciem linii 11, gdzie frakcję wodną usuwa się z użyciem linii 31. Rozpuszczoną frakcję ekstraktu doprowadza się z użyciem linii 15 do etapu suszenia 17, gdzie rozpuszczalnik odparowuje się, np. z użyciem wyparki rotacyjnej.

Zgodnie z figurą 4 wysuszony ekstrakt dostarcza się z użyciem linii 10 do etapu ekstrahowania 12. Roztwór metanol/heksan także dostarcza się z użyciem linii 14 do etapu ekstrahowania 12 w celu przeprowadzenia dodatkowego oczyszczania i ekstrakcji wysuszonego ekstraktu. Mieszaninę ekstrakt/metanol/heksan doprowadza się z użyciem linii 16 do etapu rozdzielania 18, frakcję heksanową usuwa się z użyciem linii 20 i mieszaninę metanol/ekstrakt następnie doprowadza się z użyciem linii 22 do etapu suszenia 24. W etapie suszenia 24 usuwa się rozpuszczalnik, np. drogą odparowania z uż yciem wyparki rotacyjnej.

Wysuszony, częściowo oczyszczony czynny ekstrakt doprowadza się z użyciem linii 26 i z dodatkiem metanolu z linii 28 do etapu rozpuszczania 30, i rozpuszczoną frakcję doprowadza się z użyciem linii 36 do kolumny chromatograficznej 38.

W kolumnie 38 frakcję rozpuszczoną w metanolu frakcjonuje się dalej, z uż yciem ż elu krzemionkowego i mieszaniny rozpuszczalników chloroform/30% metanol, z uzyskaniem różnych frakcji wskazanych na schemacie jako frakcje I - V. Zgodnie z aktualną procedurą frakcjonowania prowadzoną przez zgłaszającego, w wyniku procedury frakcjonowania uzyskuje się poniższe frakcje o wadze: I (3,9 g); II (2,6 g); III (2,1 g); IV (1,1 g) i V (2,0 g). Frakcje te oddzielnie oceniono zgodnie z odpowiednią procedurą prób biologicznych (w etapie, którego nie pokazano) i zidentyfikowano jako frakcje I i II, wykazujące wyraźną czynność hamowania łaknienia, i dostarczono z użyciem linii zasilania 40 i 42 odpowiednio do kolumn 44 i 46, gdzie poddano je dodatkowemu frakcjonowaniu i oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej, ponownie z użyciem żelu krzemionkowego i układu rozpuszczalników 9:1 chloroform:metanol.

Podfrakcje II(A) - (C) uzyskane z kolumny 44 nie wykazywały, podczas badania, godnej uwagi czynności hamowania łaknienia, i można je poddawać dalszej chromatografii.

Podfrakcje I(A) - (L) uzyskane z kolumny 46 również oceniono (w etapie prób, którego nie pokazano), i stwierdzono, że podfrakcja I(C) ma wyraźną czynność hamowania łaknienia.

Podfrakcje I(C) dostarcza się z użyciem linii 48 do kolumny 50 w celu przeprowadzenia dodatkowego frakcjonowania i oczyszczania, z użyciem żelu krzemionkowego i mieszaniny rozpuszczalników 9:1 octan etylu:heksan. Stwierdzono, że spośród pozostałych oczyszczonych frakcji, frakcja I (C) (ii) po badaniu, posiada wyraźną czynność hamowania łaknienia.

Oczyszczony produkt zidentyfikowano z użyciem spektroskopii nuklearnego rezonansu magnetycznego (jak wskazano w poniższych tabelach 1 i 2, jako związek (1).

T a b e l a 1: Dane ¹H (300,13 MHz) NMR dla związku (1) CDCl3 Związek (1)

Atom wodoru	J(HH) /Hz	ÓH/p.p.m.
1	2	3
Aglikon-3	-	3,522 m
6	-	5,381 m
12	11,5, 4,1	4,607 dd
17	9,3, 9,3	3,157 dd

PL 201 487 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
18	-	1,029 s
19	-	0,951 s
21	-	2,164 s
3*	7,1, 1,5	6,888 qq
4*	7,1, 1,2	1,806 dg
5*	1,6, 1,2	1,853 dg
Cym-1'	9,4, 2,1	4,816 dd
2'	13,8, 3,7, 2,1	2,055 ddd
2' aq	13,8, 9,4, 2,6	1,552 ddd
3' ax	3,7, 2,9, 2,6	3,776 ddd
4'	9,4, 2,9	3,179 dd
5'	6,3, 9,4	3,821 dd
6'	6,3	1,279 da
3'-OMe	-	3,408 sd
1	9,4, 2,1	4,730 dd
2	13,8, 3,7, 2,1	2,108 ddd
2 aq	13,8, 9,4, 2,6	1,601 ddd
3 ax	3,7, 2,9, 2,6	3,755 ddd
4	9,4, 2,9	3,239 dd
5	6,3, 9,4	3,898 dd
6	6,3	1,243 db
3-OMe	-	3,392 se
Tew-1'	7,7	4,273 d
2'	7,7, 8,0	3,469 dd
3'	8,0, 2,9	3,099 dd
4'''	9,3, 2,9	3,179 dd
5'	6,3, 9,3	3,351 dd
6'	6,3	1,183 d'c
3''' -OMe		3,622 s

a, b, c w każdej kolumnie mogą być zamienne d, e w każdej kolumnie mogą być zamienne odnosi się do atomów grupy tyglinianu

PL 201 487 B1

T a b e l a 2: Odpowiednie dane ¹³C (75,25 MHz) NMR dla związku (1) w CDCl3 grupa aglikonu grupa cukrowa

Węgiel	8c/p.p.m.	Węgiel	8c/p. p. m.
1	37,04 T	cym-1'	95,84 D
2	29,44 T	2'	35,57 T
3	77,24 D	3'	77,05 D
4	38,62 T	4'	82,57 D
5	138,95 S	5'	68,48 D
6	131,90 D	6'	18,14 Q
7	27,30 T	3'-OMe	57,93 Q
8	35,30 D	1	99,54 D
9	43,04 D	2	35,17 T
10	37,22 S	3	76,99 D
11	26,04 T	4	82,52 D
12	75,88 D	5	68,30 D
13	53,71 S	6	18,36 Q
14	85,69 S	3”-OMe	57,09 Q
15	34,36 T	Tew-1'	104,28 D
16	24,31 T	2'	74,62 D
17	57,18 D	3'	85,30 D
18	9,85 Q	4'”	74,62 D
19	19,27 Q	5'	71,62 D
20	216,85 S	6'	17,75 Q
21	33,01 Q	3'-OMe	60,60 Q
1*	167,60 S
2*	128,69 D
3*	137,66 D
4*	14,41 Q
5*	12,08 Q

* odnosi się do atomów grupy tyglinianu Związek (1)

Dane IR: 3440 cm^-1 (OH), 2910 cm^-1 (CH), 1700 cm^-1 (C=O) [αο]²%89 = 12,67° (C=3, CHCfe) T.t.: 147°C - 152°C

P r z y k ł a d 4

Poniżej podano wyniki poniższych trzech prób biologicznych odnośnie hamowania łaknienia.

a) Próba Irwina;

PL 201 487 B1

b) Próba ostrej toksyczności; i

c) Próba anorektyczna dawki doustnej

a) Próba Irwina

Celem tej próby była ocena hamowania łaknienia związków według wynalazku uzyskanych z ekstraktu roślinnego jak opisano wcześniej na podstawie uspokojenia się zwierząt w próbie Irwina i działania uspokajającego.

Procedura doświadczalna

Związek hamujący łaknienie został wyekstrahowany z materiału roślinnego przez Zgłaszającego opisanym tu sposobem i podany dwóm z czterech grup, po 3 zwierzęta w każdej: jedna grupa nie otrzymała leku, druga grupa otrzymała rozpuszczalnik, dimetylosulfotlenek (DMSO), trzecia grupa otrzymała badaną próbkę w ilości 50 mg/kg, a czwarta grupa otrzymała badaną próbkę w ilości 300 mg/kg. Podawanie odbyło się drogą iniekcji wewnątrzotrzewnowo i dokonywano obserwacji w określonych odstępach czasu do 5 godzin po podaniu. W interpretacji wyników posłużono się tylko objawami innymi niż te zaobserwowane u zwierząt, którym podawano DMSO.

Wyniki

Było oczywiste, że rozpuszczalnik DMSO działał w określony sposób na zwierzęta, zwłaszcza na mechanizm regulujący pracę serca. Zauważono znaczący spadek temperatury ciała u wszystkich zwierząt, którym podawano rozpuszczalnik, sam lub razem z badaną próbką.

Zwierzęta w grupie z niską dawką wykazywały zmniejszone rozproszenie w klatce i osłabienie czynności lokomotorycznej jak we wszystkich innych grupach, łącznie z grupą kontrolną. Zaobserwowano apatię w takim samym stopniu jak w grupie, której podawano DMSO. Po 15-60 minutach po podaniu zauważono spowolnienie oddychania. Opadanie (zamykanie się powiek) również zaobserwowano w większym stopniu niż w grupie DMSO. Zauważono reakcję małżowiny usznej (ucha) jak również pozytywną reakcję palca, wskazującą na przestraszenie. Po podaniu nastąpił spadek temperatury ciała do 32,7°C.

Zwierzęta w grupie z wysoką dawką wykazywały jak w innych grupach na początku zmniejszenie rozproszenia w klatce i zmniejszenie czynności lokomotorycznej, lecz wykazywały przed śmiercią zwiększone rozproszenie i czynność lokomotoryczną, występującą po około 1 godzinie po podaniu. 30 minut po podaniu wystąpiły ostre symetryczne drgawki kloniczne. Początkowo miało miejsce spowolnienie oddychania, lecz przed śmiercią nastąpiło przyspieszenie. Wystąpiło opóźnienie reakcji małżowiny usznej (ucha) i zaobserwowano pozytywną odpowiedź palca, wskazującą na przestraszenie, obserwowane także u zwierząt w grupie z niską dawką. Po podaniu nastąpił spadek temperatury ciała do 30,7°C. Zaobserwowano zwiększoną inercję pozycyjną, jak również zmniejszone napięcie ciała. Zaobserwowano nieprawidłowy obrót kończyny, zmniejszenie siły uścisku, brak reakcji na ból i brak odruchów postawy i ułożenia.

Dyskusja

W porównaniu z kontrolną grupą zwierząt i zwierzętami poddanymi działaniu DMSO zwierzęta otrzymujące niską dawkę (50 mg/kg) wykazywały tylko spowolnienie oddychania i zwiększony stopień opadania powiek. Zwierzęta otrzymujące wysoką dawkę (300 mg/kg) badanej próbki reagowały bardzo silnie z nastąpieniem drgawek i śmierci. Wszystkie inne obserwacje dokonane u tych zwierząt można przypisać zwierzętom znajdującym się w drgawkach i umierającym. Nie zauważono żadnych oznak świadczących o działaniu trankwilizującym i uspokajającym, takie jak zauważalne zmniejszenie rozproszenia w klatkach, zmniejszenie czynności lokomotorycznej i apatia w grupach badanych, które można przypisać badanej próbce.

Zatem można wywnioskować, że badana próbka jest śmiertelna dla myszy w ilości 300 mg/kg i ma działanie hamowania czynności oddychania u myszy przy 50 mg/kg, podając dootrzewnowo z DMSO jako rozpuszczalnikiem.

b) Próba ostrej toksyczności

Celem tej próby było uzyskanie informacji o toksyczności badanej próbki.

Procedura doświadczalna

Ekstrakt z roślin wytworzony zgodnie z opisanym tu sposobem według wynalazku i o czynności hamowania łaknienia, oczyszczono i myszom podawano doustnie jedną próbkę badaną ze zwiększeniem dawek. Użyto po dwa zwierzęta w grupie dawkowania, z wyjątkiem grupy o najwyższej dawce, gdzie tylko jedno zwierzę poddano próbie. Zwierzęta badano pod kątem dobrego zdrowia i ich masy ciała w dniu podawania.

PL 201 487 B1

Zakres dawek wynosił od 100 mg/kg do 3028,5 mg/kg. Dawkę obliczono i zmieszano z przygotowaną skrobią ziemniaczaną, tak, że każde zwierzę otrzymało całkowitą dawkę 0,2 ml. Trzynaste zwierzę otrzymało 0,25 ml. Skrobię ziemniaczaną przygotowano poprzez zmieszanie 20 g skrobi w niewielkiej objętości zimnej wody, dodano ją do wrzącej wody i uzupełniono do objętości 1 litra. Pozwolono by zawiesiną ochłodziła się do temperatury pokojowej przed podaniem.

Zwierzęta w grupach 1 i 2 potraktowano dawką tego samego dnia. Obserwowano je przez 24 godziny i jeśli nie pojawiały się objawy toksyczności, traktowano dawką następną grupę. W ten sam sposób badano następne grupy. Zastosowano tę procedurę w celu zapewnienia, że nie nastąpiło niepotrzebne badanie tych zwierząt w przypadku, gdy osiągnięto dawkę wywołującą ostrą toksyczność w poprzedniej grupie.

U zwierząt poszukiwano objawów klinicznych toksyczności niezwłocznie po podaniu (1-2 godziny) i każdego następnego dnia. Masę ciała określano raz na tydzień i mierzono całkowite przyjmowanie pokarmu i wody przez każdego zwierzęcia.

Zwierzęta, które przeżyły, usypiano poprzez iniekcję dootrzewnową pentobarbitonu sodu (dostępny w handlu jako produkt o znaku towarowym Euthanaze, Centaur®) czternastego dnia eksperymentu. Badanie po śmierci przeprowadzano na tych zwierzętach, jak również na zwierzętach, które zdechły w trakcie eksperymentu. Pobrano próbki w celu badania histopatologicznego.

Wyniki

Grupa 1 (grupa kontrolna)

Nie zaobserwowano żadnych objawów klinicznych toksyczności podczas 14-dniowego okresu obserwacji. Przyjmowanie pokarmu i wody było w normie. Wahania masy ciała były także w normie. W próbkach wą troby nie odnotowano ż adnych zmian histopatologicznych.

Grupa 2 (100 mg/kg)

Nie zaobserwowano żadnych objawów klinicznych toksyczności podczas okresu obserwacji. Przyjmowanie pokarmu i wody było w normie. Nie zaobserwowano żadnej patologii makroskopowej oraz nie odnotowano w próbkach wątroby żadnych zmian histopatologicznych oraz morfologicznych.

Grupa 3 (200 mg/kg)

Zwierzęta w tej grupie nie wykazywały żadnych klinicznych objawów toksyczności podczas eksperymentu. Przyjmowanie pokarmu i wody było normalne jak również zmiany masy ciała. Nie zaobserwowano żadnej patologii makroskopowej, lecz wątroby wykazywały zmiany histopatologiczne podczas badania. U 6 zwierząt było słabe mętne obrzmienie hepatocytów, lecz średnie u 5 zwierząt. U pię ciu zwierzą t również zaszło umiarkowane zwyrodnienie wodniczkowe w hepatocytach.

Grupa 4 (400 mg/kg)

Nie zaobserwowano żadnych objawów klinicznych toksyczności podczas okresu obserwacji oraz żadnej patologii makroskopowej podczas badania po śmierci. Zaobserwowano umiarkowane mętne obrzmienie i łagodne zmiany obrzękowe po histologii.

Przyjmowanie pokarmu i wody oraz zwiększenie masy ciała u zwierzęcia 7 było w normie. Zwierzę 8 spożyło prawie dwukrotnie więcej od zwierzęcia 7 (odpowiednio 144,6 g i 73,9 g), lecz zwiększenie masy ciała było tylko 0,81 g w porównaniu do 2,7 g.

Grupa 5 (800 mg/kg)

Jedno zwierzę (zwierzę 10) zdechło po 3 godzinach po podaniu bez wykazywania żadnych specyficznych objawów. Drugie zwierzę (zwierzę 9) przeżyło początkowy okres obserwacji bez żadnych oznak toksyczności. Przyjmowanie wody u zwierzęcia, które przeżyło, było normalne (42,42 ml), podczas gdy przyjmowanie pokarmu było wysokie (134,2 g). Masa ciała wzrosła do 2,85 g i była największa w przypadku wszystkich zwierząt eksperymentu.

W badaniu pośmiertnym u zwierzęcia 10, które zdechło krótko po podaniu doustnym, płuca były przekrwione. Nie występowała reakcja na ciało obce, która wskazywałaby na inhalację badanego związku. U zwierzęcia 9 nie zaobserwowano żadnej patologii makroskopowej. U zwierzęcia 10 była obecna łagodna cytoplazmatyczna wakuolizacja (zwyrodnienie wodniczkowe), a średnia u zwierzęcia 9. Gruczołowy cytoplazmatyczny wygląd wątroby zaklasyfikowano jako umiarkowany u obu zwierząt.

Grupa 6 (1600 mg/kg)

Żadne ze zwierząt nie miało objawów klinicznych toksyczności podczas trwania eksperymentu. Nie zaobserwowano patologii makroskopowej podczas badania pośmiertnego, lecz podczas badania histopatologicznego zaobserwowano umiarkowane zmiany zwyrodnieniowe w wątrobie zwierzęcia 11. Zwierzę 12 wykazywało umiarkowane mętne obrzmienie i łagodne zmiany obrzękowe hepatocytów.

PL 201 487 B1

Przyjmowanie pokarmu i wody było normalne, jak również zwiększenie masy ciała w czasie trwania eksperymentu.

Grupa 7 (3028,5 mg/kg)

Tylko jednemu zwierzęciu podano taką dawkę. Zwierzę to nie wykazywało oznak toksyczności podczas okresu obserwacji i nie zauważono żadnych zmian makroskopowych. Podczas badania histopatologicznego zaobserwowano umiarkowane mętne obrzmienie i zwyrodnienie wodniczkowe hepatocytów. Zwierzę wykazało ubytek masy ciała podczas okresu obserwacji (-0,82 g), lecz przyjmowanie pokarmu i wody było normalne.

Omówienie

Ponieważ bardzo niewielkie liczby zwierząt użyto w każdej grupie dawek, trudno jest wyciągnąć jakiekolwiek wnioski. Fakt, że tylko jedno zwierzę zdechło po podaniu niskiej dawki bez wykazywania jakichkolwiek objawów, może wskazywać, że śmierć nie była związana z próbką badaną, lecz na skutek stresu podczas i/lub po podaniu. Żadne ze zwierząt w grupach o wyższych dawkach nie zdechło lub nie wykazywało żadnych objawów toksyczności, co dodatkowo potwierdziło to przypuszczenie.

Obserwowane zwiększenie przyjmowania pokarmu przez zwierzę 8 mogłoby ewentualnie być przypisane nadmiernemu rozsypywaniu się pokarmu, co miało wyraz w małym wzroście masy ciała. Należy pamiętać, że w tym eksperymencie zwierzętom podano raz dawkę i jest mało prawdopodobne, że środek hamujący łaknienie będzie miał znaczący wpływ na przyjmowanie pokarmu lub wody albo na masę ciała w ciągu czternastodniowego okresu, jak w przypadku tego eksperymentu.

Z badania histopatologicznego próbek z wą troby był o oczywiste, ż e zmiany patologiczne był y zależne od dawek, i zwierzęta otrzymujące wyższe dawki wykazywały rozległe zmiany. Obserwowana patologia nie miała charakteru metabolicznego, lecz była prawdopodobnie wywołana próbką badaną. Zmiany były tylko zwyrodnieniowe, a zatem odwracalne. Nie zaobserwowano żadnych objawów nieodwracalnych zmian komórek wątroby.

Zatem można wnioskować, że tylko jedno zwierzę zdechło przy niskiej dawce (800 mg/kg), lecz śmierć być może nie była związana z próbką badaną. Żadne z innych zwierząt w dowolnej grupie dawek nie wykazywało żadnych objawów toksyczności podczas czternastodniowej obserwacji po podaniu ani nie zdechło w wyniku podania. Pojedyncza dawka doustna próbki badanej wzbudziła odwracalne zależne od dawki zmiany komórek wątroby.

c) Próba anorektyczna dawki doustnej

Celem tej próby było określenie czynności ekstraktu z rośliny wytworzonego sposobem według wynalazku i minimalnej skutecznej dawki, a jednocześnie zbadanie możliwych działań ubocznych, takich jak hamowanie oddychania, jak stwierdzono w próbie Irwina (powyżej).

Procedura eksperymentalna

Zwierzęta rozdzielono do grup, którym podawano środek, z użyciem tabel doboru losowego. Każda grupa, której podawano środek, składała się z trzech zwierząt, a grupa kontrolna z sześciu. Próbkę badaną podawano młodym samicom szczurów ważącym 100-150 g w czasie aklimatyzacji, przez trzy dni z rzędu. Zwierzęta oznaczono z użyciem metalowych znaczników na uszy i znakowania skóry KMnO4 w celu łatwiejszej identyfikacji. Zwierzęta trzymano oddzielnie w standardowych klatkach poliwęglanowych dla gryzoni ze swobodnym dostępem do wody i rozdrobnionych handlowych granulek dla gryzoni. Przyjmowanie wody i pokarmu mierzono i obliczano każdego dnia. W celu określenia minimalnej dawki skutecznej próbki badanej badano 5 dawek. Próbkę badaną w zawiesinie w skrobi ziemniaczanej podawano doustnie poprzez zgłębnik.

Badaną substancją był związek (1), biały, granulowany proszek wytworzony z ekstraktu z materiału roślinnego sposobem według wynalazku, i odmierzoną ilość badanej próbki zmieszano ze skrobią ziemniaczaną i podawano. Zmieszanie ze skrobią ziemniaczaną miało miejsce niezwłocznie przed podaniem każdego dnia. Przed pobraniem objętości dawkowanej dla każdego zwierzęcia zawiesiny mieszano dokładnie z użyciem urządzenia Vortex.

Badano 5 dawek, przy czym grupa kontrolna otrzymała tylko nośnik. Dawki dobierano na podstawie skutków zaobserwowanych we wcześniejszej próbie Irwina i wynosiły one:

Grupa 1: 0,00 mg/kg (grupa kontrolna)

Grupa 2: 6,25 mg/kg

Grupa 3: 12,50 mg/kg

Grupa 4: 25,00 mg/kg

Grupa 5: 37,50 mg/kg

Grupa 6: 50,00 mg/kg

PL 201 487 B1

Wyniki

Podawanie nie wpłynęło na zdrowie zwierząt w ciągu okresu badań. Zwierzęta, którym podawano próbkę badaną we wszystkich grupach dawek, wykazywały znaczące zmniejszenie przyrostu średniej masy ciała w ciągu całkowitego okresu badań i zwierzęta w trzech, z pięciu grup, którym podawano środek, rzeczywiście straciły na wadze.

Średnie przyjmowanie pokarmu dla wszystkich grup, którym podawano środek, zmniejszyło się w czasie trwania badań. Zwierzęta z grup o wyższych dawkach wykazywały zwiększone spożycie wody.

Nie zmieniła się znacząco częstość oddechów u żadnego ze zwierząt w żadnej z grup dawek.

Zwierzęta we wszystkich grupach dawek wykazywały kruchość wątroby podczas badania pośmiertnego, lecz nie zaobserwowano u nich żadnej patologii w skali makroskopowej.

Omówienie

Dane uzyskane w trakcie trwania okresu aklimatyzacji potwierdziły, że wszystkie zwierzęta objęte eksperymentem były zdrowe i przyrost masy ciał był porównywalny pomiędzy zwierzętami.

Zmniejszenie przyrostu, a u niektórych zwierząt ubytek masy ciała w połączeniu ze zmniejszonym przyjmowaniem pokarmu wyraźnie wskazuje na hamowanie ośrodka łaknienia.

Zmniejszenie przyjmowania pokarmu i zmniejszenie przyrostu masy ciała występowało nawet w przypadku grupy o najniższej dawce (6,25 mg/kg). Rzeczywisty ubytek masy ciała miał miejsce w grupie 12,50 mg/kg.

Istotne jest to, że w przypadku wszystkich grup, którym podawano środek, nastąpiło zwiększone spożycie wody, podczas gdy spożycie pokarmu zmalało (fig. 2). Może to być skutkiem działania moczopędnego próbki badanej lub stymulowania ośrodka pragnienia w mózgu.

Pozytywnym aspektem jest fakt, że nie wystąpiło spowolnienie oddychania, co zaobserwowano w próbie ostrej toksyczności, opisanej powyżej, przy podawaniu dootrzewnowym. Mogło to być wywołane zmniejszeniem absorpcji z przewodu pokarmowego, a w konsekwencji zmniejszeniem biodostępności. Biodostępność przy testowanych dawkach doustnych, była jednak wystarczająca dla zapewnienia skuteczności próbki badanej. Nieznaczne zmniejszenie częstości oddychania po 1 godzinie od podania w większości grup można przypisać napełnianiu żołądka objętością dawki i wynikłą pasywnością zwierząt.

Kruchość wątroby zaobserwowana w grupach, którym podawano środek, mogła być spowodowana zmianami w metabolizmie energii w wyniku zmniejszenia przyjmowania pokarmu, powodując zwiększenie metabolizmu tłuszczu i przeciążenie wątroby. Gdyby rzeczywiście miało to miejsce, zmiany takie można by ewentualnie uznać za zmiany przejściowe, które mogłyby ustępować z czasem po osiągnięciu stanu ustalonego lub po wycofaniu badanej próbki. Możliwy wpływ na wątrobę również wymaga dalszych badań.

Ponieważ z założenia badanie to stanowiło jedynie próbę przesiewową, użyto małych grup badanych zwierząt. W związku z tym trudno było o interpretację statystyczną, zwłaszcza gdy poszczególne zwierzęta reagowały całkowicie różnie. Jednak dane wskazują, że próbka badana ma działanie hamowania łaknienia, nawet przy podaniu najniższej dawki (6,25 mg/kg). W przypadku badanych dawek nie zaszły żadne kliniczne objawy zmniejszenia częstości oddychania.

P r z y k ł a d 5

Zebrane rośliny Hoodia uzyskane z naturalnego środowiska lub z hodowli najpierw przechowywano w 4°C przez maksymalnie 48 godzin. Rośliny przemyto wodą wodociągową, po czym pokrojono na fragmenty o rozmiarach ±1 cm. Pokrojone kawałki zebrano i sprasowano z użyciem prasy hydraulicznej pod ciśnieniem 30000 kPa przez minimum 0,5 godziny. Sok uzyskany z roślin zbierano oddzielnie. Sok przechowywano w temperaturze -18°C aż do przeprowadzenia dalszej obróbki.

Sok suszono rozpyłowo w odpowiednich warunkach z wytworzeniem sypkiego proszku. Zawartość wilgoci w proszku wyniosła korzystnie mniej niż 5%, po suszeniu rozpyłowym, a w razie konieczności proszek, dalej suszono w piecu próżniowym lub z użyciem suszarki ze złożem fluidalnym.

Wykazano w próbach biologicznych, że zarówno sok jak i wysuszony próżniowo materiał były skuteczne jako środki hamujące łaknienie u szczurów.

Doświadczenie kg roślin Hoodia gordonii przemyto wodą wodociągową, po czym pokrojono na kawałki o rozmiarach 1 cm. Pokrojone roś liny następnie sprasowano z użyciem prasy hydraulicznej pod ciśnieniem 30000 kPa przez minimum 0,5 godziny/partię. Sok zebrano i stwierdzono masę 10 kg

PL 201 487 B1 w przypadku gdy uż yto roślin Hoodia gordonii ze środowiska naturalnego, zaś 20 kg gdy użyto roślin Hoodia gordonii z hodowli. Sok (500 g) suszono rozpyłowo stosując poniższe warunki:

Szybkość przepływu: Temperatura na wlocie: Temperatura na wylocie: Temperatura komory:

2,85 ml/min 110°C 70°C 78°C

Uzyskany w wyniku suszenia rozpyłowego proszek stanowił sypki proszek (22 g) o zawartości wilgoci 6,9%.

Wysuszony rozpyłowo proszek poddano analizie na stężenie składnika czynnego z użyciem technik HPLC. Określono stężenie substancji czynnej w wysuszonym rozpyłowo proszku na 13 g/kg.

Analiza metodą HPLC

Eluent: Acetonitryl:woda (7:3), izokratycznie

Kolumna: układ faz odwróconych C-18

Absorbancja UV: 225 nm

Szybkość przepływu: 1 ml/min.

Objętość iniekcji: 10 μΐ

Sposób

Wysuszony rozpyłowo proszek (10 mg) rozpuszczono w wodzie (0,5 ml) i w acetonitrylu (0,5 ml). 10 μΐ tego roztworu wstrzyknięto do HPLC i określono stężenie związku czynnego (1) z użyciem standardowej krzywej uzyskanej dla czystego związku (1).

P r z y k ł a d 6

Podano poniżej wyniki badań oszacowania możliwego działania anorektycznego związku (1) u szczura. Poniższe badane próbki stanowią czysty sok (próbka 1), wysuszony rozpyłowo sok (próbka 2) i związek czynny (próbka 3). Próbki 1 i 2 stanowią odpowiednio sok i wysuszony rozpyłowo sok, jak opisano w przykładzie 43 powyżej. Próbkę 3 stanowi wyekstrahowany rozpuszczalnikiem związek (1) o czystości >95%.

Każdą z próbek 1-3 podawano w postaci pojedynczej dawki doustnej samcom szczurów Wistar. Dwie dodatkowe grupy kontrolne otrzymały nośnik (woda destylowana lub DMSO). Doustnie podawaną fenfluraminę (7,5 mg/kg) dołączono jako standardowy wzorzec.

W wyniku podania doustnie próbki 1 (czysty sok) uzyskano zależne od dawki zmniejszenie spożycia pokarmu, które było statystycznie znaczące przy dawkach 1600 mg/kg i wyższych, w porównaniu z grupami kontrolnymi, którym podawano nośnik. Odnotowano również towarzyszące zmniejszenie wagi ciała (lub szybkości wzrostu). W dniu podawania odnotowano statystycznie znaczące zwiększenie spożycia wody w 3 godzinie od podania (6400 i 10000 mg/kg) i 6 godzinie od podania (10000 mg/kg). Pomiędzy 24 i 48 godzinami od podania odnotowano statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia wody przy dawkach 3200 mg/kg i wyższych.

W wyniku podania doustnie dawki 2 (suszony rozpyłowo sok) w ilości 76 mg/kg także uzyskano statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu i zmniejszenie wagi ciała w porównaniu ze zwierzętami, którym podawano nośnik. Nie odnotowano żadnego znaczącego statystycznie wpływu na spożycie wody.

Próbka 3 (związek czynny) dała statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu przy dawce doustnej wynoszącej 5,0 mg/kg. Związek czynny nie wywołał żadnego statystycznie znaczącego wpływu na wagę ciała chociaż rozpatrywane dane z badań ujawniły nieznaczne opóźnienie we wzroście w porównaniu z grupami kontrolnymi zwierząt, którym podawano nośnik. Nie odnotowano żadnego znaczącego statystycznie wpływu na spożycie wody.

Wzorzec fenfluramina (7,5 mg/kg), dawała statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu w 6 i 24 godziny po podaniu w porównaniu ze stosowną grupą kontrolną, której podawano nośnik. Nie odnotowano żadnego statystycznie znaczącego wpływu na spożycie wody lub wagę ciała.

Nie odnotowano żadnego zależnego od podawania wpływu na wątrobę.

PL 201 487 B1

Badana substancja

Tożsamość	Próbka 1 (czysty sok)	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	Próbka 3 (substancja czynna)
Wygląd	Brązowa ciecz	Proszek	Biały proszek
Warunki przechowywania	-20°C w ciemności	Temperatura pokojowa w ciemności	4°C w ciemności
Czystość	Czysty sok	Czysty suszony rozpyłowo sok	>95%
Nośnik	Woda destylowana	Woda destylowana	Dimetylosulfotlenek (DMSO)

Procedura eksperymentalna W badaniu użyto 55 samców szczurów Wistar.

Codziennie w tym samym czasie, od momentu przybycia do zakończenia badań, zapisywano ciężar ciała, spożycie pokarmu (ciężar skrzyni z pokarmem) i spożycie wody (ciężar butelki).

Zgodnie z poniższą tabelą 1 dnia szczury otrzymały pojedynczą dawkę doustnie (przez zgłębnik):

Grupa	n	Podawanie doustnie	Dawka (mg/kg)
1	5	Nośnik (woda destylowana)	-
2	4	Próbka 1 (czysty sok)	800,0
3	5	Próbka 1 (czysty sok)	1600,0
4	5	Próbka 1 (czysty sok)	3200,0
5	5	Próbka 1 (czysty sok)	6400,0
6	5	Próbka 1 (czysty sok)	10000,0
7	5	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	38,0
8	5	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	76,0
9	5	Próbka 3 (substancja czynna)	2,5
10	5	Próbka 3 (substancja czynna)	5,0
11	3	Fenfluramina	7,5
12	3	Nośnik	-

Grupom 1 - 8 podawano dawkę z użyciem stałej objętości dawki wynoszącej 10 ml/kg, a grupom 9 - 12 podawano dawkę w objętości 1 ml/kg.

Mierzono również spożycie pokarmu i wody w 1, 3 i 6 godzinie po podaniu dnia 1.

Po przeprowadzeniu pomiaru w dniu 8 zwierzęta uśmiercono poprzez uduszenie z użyciem ditlenku węgla i wątroby wycięto i umieszczono w 10% buforowanej formalinie, przed histologią.

Wycinki 4 - 5 μm każdej wątroby w twardej parafinie zabarwiono z użyciem hematoksyliny i eozyny. Dodatkowe fragmenty pocięto na aparacie Cryostat na 12 μm i zabarwiono Oil Red O (ORO) umożliwiającym wykrywanie tłuszczu.

Analiza danych

Pomiary spożycia pokarmu i wody oraz ciężaru ciała po podawaniu w każdym punkcie czasowym u zwierząt, którym podawano P57, porównano z wynikami dla odpowiedniej grupy kontrolnej, której podawano w podobny sposób nośnik, z użyciem analizy wariancji, testu Williamsa dla porównania z kontrolami.

Dane odnośnie zwierząt, którym podawano fenfluraminę porównano z danymi odnośnie grupy kontrolnej, której podawano nośnik, z użyciem testu t Studenta.

PL 201 487 B1

Wyniki

Wyniki badań podano w tabelach.

Próbka 1 (czysty sok) podawana doustnie, dawała widoczne związane z dawką zmniejszenie spożycia pokarmu dziennie. Czas i amplituda tego zmniejszenia spożycia pokarmu były zależne od dawki. W 24 godziny po podaniu próbka 1 (czysty sok) dała znaczące statystycznie zmniejszenie spożycia pokarmu przy dawkach 1600 mg/kg i wyższych w porównaniu z grupami kontrolnymi, którym podawano nośnik. Najwyższa dawka próbki 1 (sok) (10000 mg/kg) dała statystycznie znaczące zmniejszenie dziennego spożycia pokarmu do 5 dni po podaniu.

Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok) i próbka 3 (związek czynny) dały widoczne i statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu przy dawkach podawanych doustnie odpowiednio 76 i 5,0 mg/kg. W obu przypadkach działania te trwały 48 godzin po podaniu.

Wzorzec, fenfluramina (7,5 mg/kg, doustnie) dała statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu w 6 i 24 godzinie po podaniu w porównaniu do odpowiedniej grupy kontrolnej, której podawano nośnik (Grupa 12).

Próbka 2 (suszony rozpyłowy sok) i próbka 3 (substancja czynna) nie wykazały widocznego związanego z dawką wpływu na spożycie wody. W dniu podawania czysty sok dawał statystycznie znaczące zwiększenie spożycia wody w 3 godzinie po podaniu (6400 i 10000 mg/kg) i 6 godzinie po podaniu (10000 mg/kg). W dwa dni po podaniu odnotowano jednak statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia wody u zwierząt otrzymujących próbkę 1 (sok) w ilości 3200, 6400 i 10000 mg/kg. Te zmniejszenia jednak nie były ściśle zależne od dawki i występowały tylko pomiędzy 1 i 2 dniem po podaniu. Biologiczne znaczenie tych wpływów zatem pozostaje niejasne.

Próbka 1 (czysty sok) ma związane z dawką statystycznie znaczące działanie na ciężar ciała w porównaniu do grupy kontrolnej, której podawano nośnik (Grupa 1). W przypadku podawania doustnie dawek w ilości 3200 mg/kg i większych, próbka 1 (czysty sok) dawała znaczące statystycznie zmniejszenie wagi ciała lub zmniejszenie szybkości wzrostu w porównaniu ze zwierzętami, którym podawano nośnik. Te wpływy były statystycznie znaczące od 48 godzin po podaniu, aż do zakończenia badań.

Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok) podawana doustnie w ilości 76 mg/kg także dawała statystycznie znaczące zmniejszenie wzrostu zwierząt w porównaniu z grupą kontrolną, której podawano nośnik (Grupa 1). Te wpływy były statystycznie znaczące pomiędzy dniami 3 i 5, włącznie (48 godzin po podaniu).

Aczkolwiek okazało się, że próbka 3 (związek czynny) opóźnia wzrost zwierząt przy najwyższej dawce (5,0 mg/kg) w porównaniu z odpowiednią grupą kontrolną, której podawano nośnik, Grupą 12, ten wpływ nie miał statystycznego znaczenia.

Fenfluramina (7,5 mg/kg) nie dawała żadnych widocznych lub statystycznie znaczących wpływów odnośnie spożycia wody lub ciężarów ciał w porównaniu z grupą kontrolną, której podano nośnik (Grupa 12).

Nie odnotowano żadnego zależnego od podawania wpływu na wątrobę.

T a b e l a 1a

Wpływ podawania doustnego na spożycie pokarmu u szczurów (dane przed podaniem dawki, codziennie)

Grupa	Podawanie doustnie	Dawka (mg/kg)	Średnie spożycie pokarmu w grupie (g±sd) pomiędzy dniami:
- 6 -5	- 5 -4	- 4 -3	- 3 -2	- 2 -1
1	2	3	4	5	6	7	8
1	Nośnik (woda)	-	27,8±1,54	24,2±1,83	27,6±3,67	28,3±3,50	29,4±2,66
2	Próbka 1 sok	800,0	28,3±1,43	24,9±0,82	27,7±0,76	28,4±1,51	30,1±0,27
3	Próbka 1 sok	1600,0	29,0±1,39	25,0±2,16	27,4±1,96	28,8±0,61	29,5±1,55
4	Próbka 1 sok	3200,0	27,2±2,33	25,1±2,46	26,0±2,52	28,5±2,29	27,6±1,15
5	Próbka 1 sok	6400,0	28,7±1,64	25,3±1,73	27,3±1,45	29,2±1,09	30,3±0,90
6	Próbka 1 sok	10000,0	28,5±2,38	23,7±2,73	26,0±2,31	27,0±3,50	28,7±2,26
7	Próbka 2 suszona rozpyłowo	38,0	28,1 ±1,24	23,9±1,79	24,5±2,30	27,6±1,61	28,5±1,87

PL 201 487 B1 cd. tabeli 1a

1	2	3	4	5	6	7	8
8	Próbka 2 suszona rozpyłowo	76,0	28,7±0,91	26,541,55	27,1±1,01	28,7±1,99	28,9±1,37
9	Próbka 3 związek czynny	2,5	28,8±1,49	26,4±3,12	29,0±1,99	29,4± 1,76	29,5±2,81
10	Próbka 3 związek czynny	5,0	28,3±2,1	25,8±1,86	28,1 ±2,65	28,0±2,65	28,5±3,03
11	Fenfluramina	7,5	29,1 ±0,66	25,3±4,03	27,0±1,53	30,8±0,54	29,7±2,84
12	Nośnik (DMSO)	-	27,9±1,8	26,7+2,11	28,7±1,99	28,1±4,06	30,5±2,54

sd - odchylenie standardowe

T a b e l a 1b

Wpływ podawania doustnego na spożycie pokarmu u szczurów (dane po podaniu dawki, codziennie)

Gru- pa	Podawanie doustnie	Dawka (mg/kg)	Średnie spożycie pokarmu w grupie (g±sd) pomiędzy dniami:
1 - 2	2 - 3	3 - 4	4 - 5	5 - 6	6 - 7	7 - 8
1	Nośnik (woda)	-	29,5±3,15	29,6±2,84	30,6±3,49	31,8±3,21	30,7±2,24	31,7±3,03	32,9±3,18
2	Próbka 1 sok	800,0	26,1±0,98	29,3±1,49	30,7±1,15	30,9±0,60	33,3±1,69	32,7±0,80	40,1±13,40
3	Próbka 1 sok	1600,0	22,6**±3,17	26,9±2,06	30,9±2,54	30,9± 1,22	34,1±1,36	33,7±1,69	33,8±1,61
4	Próbka 1 sok	3200,0	20,1 **±1,39	19,0**±1,88	22,8**±1,77	28,0±3,14	31,4±2,82	32,3±2,91	33,0±3,01
5	Próbka 1 sok	6400,0	18,2**±4,18	14,8**±1,75	18,4**±0,97	22,4**±3,01	26,9±2,81	31,0±2,31	32,0±2,34
6	Próbka 1 sok	10000,0	15,1 **±2,98	12,4**±2,61	16,0**±3,15	19,7**±4,31	22,6*±5,70	30,1±4,79	32,6±5,90
7	Próbka 2 suszona rozpyłowo	38,0	25,6±2,85	27,3±0,95	30,3±2,06	31,0±2,13	31,8±1,63	31,1±1,94	31,8±2,45
8	Próbka 2 suszona rozpyłowo	76,0	24,2*±3,25	25,2*±3,24	29,9±1,85	30,2±2,28	31,2±2,26	32,3±1,44	33,1±0,61
9	Próbka 3 związek czynny	2,5	26,8±3,33	29,1±3,43	31,7±3,08	34,0±2,95	34,4±4,32	33,1±4,11	34,8±3,71
10	Próbka 3 związek czynny	5,0	22,1 ±2,19	21,0±3,07	27,6±5,26	30,5±3,33	33,0±3,16	32,4±3,25	33,0±3,84
11	Fenflura- mina	7,5	22,4^+3,19	31,9±0,84	32,7±2,50	33,0±2,55	30,4±0,23	32,7±1,90	32,4±1,60
12	Nośnik (DMSO)	-	29,9±3,36	30,6±4,43	30,1 ±4,17	32,4±5,26	31,8±3,08	32,8±3,98	33,3±3,76

sd - odchylenie standardowe,

Grupy 2 - 8 porównano z grupą 1 z nośnikiem: *p<0,05, **p<0,01

Grupy 9 - 11 porównano z grupą 12 z nośnikiem: ^łp<0,05, ^łp<0,01

PL 201 487 B1

T a b e l a 2a

Wpływ podawania doustnego na spożycie wody u szczurów (dane przed podaniem dawki, codziennie)

Gru- pa	Podawanie doustne	Dawka (mg/kg)	Średnie spożycie wody w grupie (g±sd) pomiędzy dniami:
- 6 -5	- 5 -4	- 4 -3	- 3 -2	- 2 -1
1	Nośnik (woda)	-	40,9±4,61	34,8±4,15	37,6±5,63	33,5±7,42	32,2±6,32
2	Próbka 1 sok	800,0	38,6±1,96	37,1±9,74	36,4±4,81	28,1±1,83	30,4±4,75
3	Próbka 1 sok	1600,0	43,4±10,53	35,9±3,84	38,4±4,56	31,1±4,47	36,5±5,39
4	Próbka 1 sok	3200,0	40,1±5,58	33,3±3,01	37,3±4,46	31,3±3,48	31,7±3,18
5	Próbka 1 sok	6400,0	43,8±8,57	36,3±9,02	35,4±8,18	34,0±6,62	35,1±5,72
6	Próbka 1 sok	10000,0	37,4±5,34	32,7±3,35	33,2±4,86	29,0±5,11	32,2±3,27
7	Próbka 2 suszona rozpyłowo	38,0	40,0±4,36	35,8±4,92	34,7±3,20	30,2±1,88	31,4±2,98
8	Próbka 2 suszona rozpyłowo	76,0	38,6±1,98	37,0±1,96	48,8±21,5	31,6±4,56	39,0±17,27
9	Próbka 3 związek czynny	2,5	42,0±6,70	37,0±5,05	34,1 ±3,16	28,0±2,58	31,6±3,12
10	Próbka 3 związek czynny	5,0	40,9±4,48	34,2±3,00	32,7±1,26	28,2± 1,65	33,1±4,82
11	Fenfluramina	7,5	47,0±5,3	35,5±7,49	34,7±3,73	30,9±2,12	31,6±2,80
12	Nośnik (DMSO)	-	43,3±5,67	34,5±4,97	35,2±4,34	28,3±4,64	31,4±6,44

sd - odchylenie standardowe

T a b e l a 2b

Wpływ podawania doustnego na spożycie wody u szczurów (dane po podaniu dawki, codziennie)

Gru- pa	Podawanie doustne	Dawka (mg/kg)	Średnie spożycie wody w grupie (g±sd) pomiędzy dniami:
1 - 2	2 - 3	3 - 4	4 - 5	5 - 6	6 - 7	7 - 8
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	Nośnik (woda)	-	34,9±5,45	36,9±6,06	38,0±7,59	37,2±6,18	37,7±5,54	35,3±2,86	36,5±5,85
2	Próbka 1 sok	800,0	30,9±3,77	34,4±8,12	38,2±13,71	35,9±13,51	39,5±11,20	28,8± 1,22	31,8±5,58
3	Próbka 1 sok	1600,0	29,2±1,66	31,7±5,35	41,3±11,21	34,6±4,10	48,1±12,27	37,8±7,28	36,9±9,28
4	Próbka 1 sok	3200,0	35,9±5,88	26,2*±2,66	30,5±2,44	34,1±4,80	45,8±18,54	51,0±35,21	42,6±13,88
5	Próbka 1 sok	6400,0	33,4±12,04	27,4*±8,13	32,6±10,67	35,4±10,78	45,2±8,72	36,2±6,72	35,9±9,58
6	Próbka 1 sok	10000,0	31,7±12,74	28,5*±8,85	32,4±8,87	36,6±6,50	40,7±11,51	38,0±6,66	37,5±6,21
7	Próbka 2 suszona rozpyłowo	38,0	36,0±6,02	34,5±1,79	38,2±7,16	39,6±7,09	42,7±9,74	45,6±17,15	46,1±9,49

PL 201 487 B1 cd. tabeli 2b

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
8	Próbka 2 suszona rozpyłowo	76,0	45,0±19,03	39,1±16,59	46,9±18,34	35,9±3,40	41,9±12,37	36,9±8,47	38,1±8,93
9	Próbka 3 związek czynny	2,5	32,2±4,01	36,1±12,42	38,3±11,71	41,5±16,60	34,7±7,57	33,0±4,20	35,3±8,70
10	Próbka 3 związek czynny	5,0	33,9±2,40	31,5±8,12	35,1±3,82	37,7±5,99	39,5±7,78	37,4±11,07	37,8±6,42
11	Fenflurami- na	7,5	34,1 ±3,60	37,2±1,48	36,7±3,92	33,8±2,89	33,7±5,43	32,1±1,93	33,6±2,50
12	Nośnik (DMSO)	-	40,7±9,10	33,8±9,37	32,9±7,07	35,2±11,49	33,8±9,82	32,3±7,44	32,0±7,22

sd - odchylenie standardowe

Grupy 2 - 8 porównano z grupą 1 z nośnikiem: * p<0,05 Grupy 9 - 11 porównano z grupą 12 z nośnikiem (bez istotności)

T a b e l a 3a

Wpływ podawania doustnego na masę ciała u szczurów (dane przed podaniem dawki, codziennie)

Grupa	Podawanie doustne	Dawka (mg/kg)	Średnia masa ciała w grupie (g±sd) w dniu:
-5	-4	-3	-2	-1
1	Nośnik (woda)	-	130,9±5,56	150,7±5,37	157,3±5,29	168,1 ±6,20	177,5±6,70
2	Próbka 1 sok	800,0	131,6±4,34	150,1±4,84	158,5±4,35	169,6±4,99	177,7±4,10
3	Próbka 1 sok	1600,0	130,1±4,3	148,6±6,59	156,7±6,38	167,5±6,04	176,6±6,37
4	Próbka 1 sok	3200,0	130,8±6,19	147,7±7,56	154,4±8,06	165,2±8,43	175,8±9,10
5	Próbka 1 sok	6400,0	132,6±7,01	151,3±7,23	158,4±8,50	169,0±8,79	178,1±7,75
6	Próbka 1 sok	10000,0	132,3±6,75	151,8±9,08	157,3±9,37	167,1±10,41	175,4±10,90
7	Próbka 2 suszona rozpyłowo	38,0	131,7±8,28	149,0±5,85	156,2±5,81	166,7±5,54	175,6±8,42
8	Próbka 2 suszona rozpyłowo	76,0	130,0±6,99	146,1 ±6,00	155,9±6,59	166,0±6,87	175,1±6,55
9	Próbka 3 związek czynny	2,5	132,6±7,63	148,9±8,51	157,3±8,91	169,8±8,96	179,4±8,71
10	Próbka 3 związek czynny	5,0	133,5±6,46	150,5±9,55	158,8±8,48	171,0±7,72	179,0±9,20
11	Fenfluramina	7,5	133,2±9,21	152,7±9,09	160,0±9,82	170,0±9,15	182,8±10,21
12	Nośnik (DMSO)	-	129,1±3,17	147,3±4,37	155,0±6,29	166,0±5,91	174,8±8,26

sd - odchylenie standardowe

PL 201 487 B1

T a b e l a 3b

Wpływ podawania doustnego na wagę ciała u szczurów (dane po podaniu dawki, codziennie)

Grupa	Poda- wanie doustne	Dawka (mg/kg)	Średnia masa ciała w grupie (g±sd) w dniu:
przed dawką (1)	2	3	4	5	6	7	8
1	Nośnik (woda)	-	185,4±7,77	192,6±7,16	202,0±10,17	211,2±7,98	220,2±10,35	227,2±10,26	235,8±11,82	242,8±11,97
2	Próbka 1 sok	800,0	186,0±4,90	187,0±4,55	198,5±4,20	206,8±5,91	214,8±4,65	222,8±4,99	231,5±3,70	240,0±3,65
3	Próbka 1 sok	1600,0	185,0±6,67	186,0±8,28	193,2±6,42	204,0±6,40	212,4±5,81	223,0±6,33	232,6±7,70	240,4±6,66
4	Próbka 1 sok	3200,0	181,8±9,18	184,6±8,88	186,2*±8,67	189,8**±9,99	199,2**±9,34	210,6**±10,21	219,0*±11,29	228,4*±12,18
5	Próbka 1 sok	6400,0	186,6±7,96	185,6±6,39	183,8**±6,87	185,2**±9,18	191,2**±7,89	201,0±6,89	213,0**±6,96	222,0**±7,94
6	Próbka 1 sok	10000,0	182,8±12,22	181,4±14,06	179,8**±15,85	180,6**±13,85	185,6**±11,28	192,2**± 10,99	203,4±11,68	212,4**±11,35
7	Próbka 2 suszona rozpyłowo	38,0	183,4±8,11	185,8±9,23	195,8±7,79	205,6±9,79	214,4±9,61	222,6±9,34	231,4±10,62	239,6±11,46
8	Próbka 2 suszona rozpyłowo	76,0	180,6±6,47	183,4±7,57	188,6*±6,73	198,2*±8,50	206,0*±9,43	214,0±9,51	222,0±9,49	232,2±9,68
9	Próbka 3 związek czynny	2,5	188,2±9,42	191,2±11,15	200,0±11,25	209,6±12,28	219,6±12,95	229,4±13,69	238,4±14,50	247,0±14,35
10	Próbka 3 związek czynny	5,0	186,4±10,02	192,0±9,93	192,4±9,84	201,0±11,27	209,4±12,70	219,8±11,86	228,2±12,28	236,0±13,95
11	Fenflura- mina	7,5	190,3±9,71	190,3±10,9	197,7±7,37	207,7±7,23	217,7±10,69	224,3±10,12	234,3±12,70	243,3±9,24
12	Nośnik DMSO)	-	183,3±8,33	190,3±10,26	199,0±10,82	207,7±12,66	215,7±14,05	222,3±14,84	230,7±15,95	239,0±17,35

sd - odchylenie standardowe

Grupy 2 - 8 porównano z grupą 1 z nośnikiem: * p<0,05, ** p<0,01 Grupy 9 - 11 porównano z grupą 12 z nośnikiem (bez istotności)

Raport histopatologiczny

Badanie histologiczne ograniczono do wątroby. Nie wykryto żadnych związanych z podawaniem zmian dla grup otrzymujących próbkę 1 (ciecz), próbkę 2 (suszony rozpyłowo sok), próbkę 3 (substancja czynna), fenfluraminę lub grupy kontrolnej z DMSO.

Odnotowane protokoły były podobne w grupie kontrolnej i grupach, którym podawano próbki.

T a b e l a

Zestawienie przypadków patologii w skali mikroskopowej

Płeć: samce Liczba badanych samców Zwierzęta, które przeżyły próby	Grupa 1 0 mg/kg 5 5	Grupa 2 800 mg/kg 4 4	Grupa 3 1600 mg/kg 5 5	Grupa 4 3200 mg/kg 5 5	Grupa 5 6400 mg/kg 5 5	Grupa 6 1000 mg/kg 5 5
1	2	3	4	5	6	7
Wątroba Badano	5	4	5	5	5	5 0

PL 201 487 B1 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6	7
Nie stwierdzono żadnych zmian	0	0	1	2	3	3
Miąższowe ogniska komórek zapaleniowych (ogólnie)	0	1	0	0	0	3
Minimalnie	0	1	0	0	0	1
Przerost hepatocytów - leżący w środkowej części zrazika (ogólnie)	0	0	0	0	0	1
Minimalnie	0	0	0	0	0	0
Hemopoeza pozaszpikowa (ogólnie)	2	0	0	0	0	0
Minimalnie	2	0	0	0	0	0
Martwica hepatocytów - ogniskowe (ogólnie)	1	0	0	0	0	0
Minimalnie	1	0	0	0	0	0
Wrotny limfoidalny naciek (ogólnie)	3	4	4	3	2	2
Minimalnie	3	4	4	3	2	2
Hepatocyty eozynochłonne ogniskowe (ogólnie)	1	0	0	0	0	0
Minimalnie	1	0	0	0	0	0
Zwłóknienie wrotne (ogólnie)	0	0	1	0	0	0
Minimalnie	0	0	1	0	0	0
Wątroba (wybarwianie ORO)
Badane	5	4	5	5	5	5
Nie stwierdzono żadnych zmian	2	3	2	4	3	3
Tłuszcz w komórkach wątroby leżący w środkowej części zrazika (ogólnie)	3	1	2	1	2	2
Minimalnie	3	1	2	1	2	2
Tłuszcz w komórkach wątroby pozawrotne	0	0	1	0	0	0
Minimalnie	0	0	1	0	0	0
	Grupa 7	Grupa 8	Grupa 9	Grupa 10	Grupa 11	Grupa 12
Płeć: samce	0 mg/kg	800 mg/kg	1600 mg/kg	3200 mg/kg	6400 mg/kg	1000 mg/kg
Liczba badanych samców	5	4	5	5	3	3
Zwierzęta, które przeżyły próby	5	4	5	5	3	3
Wątroba
Badano	5	5	5	5	3	3
Nie stwierdzono żadnych zmian	2	2	0	1	0	2
Miąższowe ogniska komórek zapaleniowych (ogólnie)	0	0	0	0	0	1
Minimalnie	0	0	0	0	0	1

PL 201 487 B1 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6	7
Martwica hepatocytów - ogniskowe (ogólnie) Minimalnie Wrotny limfoidalny naciek (ogólnie) Minimalnie Wrotne leukocyty (ogólnie) Minimalnie Wątroba (wybarwianie ORO) Badanie Nie stwierdzono żadnych zmian Tłuszcz w komórkach wątroby leżący w środkowej części zrazika (ogólnie) Minimalnie	0 0 3 3 0 0 5 5 0 0	0 0 3 3 0 0 5 3 2 2	1 1 5 5 1 1 5 3 2 2	0 0 4 4 0 0 5 3 2 2	0 0 3 3 0 0 3 2 1 1	0 0 1 1 0 0 3 2 1 0

P r z y k ł a d 7

Poniżej opisano dalsze próby biologiczne, w których użyto tych samych próbek badanych jak opisano w przykładzie 6. Zwierzęta w tym badaniu poddano ograniczonej diecie, to znaczy zwierzęta otrzymywały pokarm tylko pomiędzy 12:00 a 15:00 każdego dnia. Odróżnia to tę próbę od innych prób biologicznych, w których szczury miały swobodny dostęp do pożywienia. Zwierzęta aklimatyzowano w ciągu okresu 7 dni (dni -7 do -1), dozowanie miało miejsce od dnia 0 do dnia 6 o godzinie 9:00 doustnie poprzez zgłębnik. Okres powrotu do zdrowia był od dnia 7 do dnia 13. Grupy dawek opisano w tabeli 1 poniżej. Należy zwrócić uwagę, że aktualną grupę kontrolną zaznaczono w tabeli jako grupę 09. Grupa 5 jest grupą kontrolną, która otrzymała dietę równoważną tej dla grupy 4. Celem w przypadku tej grupy było oszacowanie, jaki wpływ ma ograniczona dieta na wątroby zwierząt.

Wyniki

Uzyskane w trakcie badania wyniki pokazały, że okres aklimatyzacji był za krótki. Szczury żywiły się przede wszystkim w ciągu nocy i nagła zmiana w ograniczeniu dostępu pokarmu do 3 godzin w ciągu dnia spowodowała zmniejszenie przyjmowanej dziennie ilości. Przyjmowanie dzienne pokarmu wciąż się zwiększało w większości grup pod koniec okresu aklimatyzacji, gdy rozpoczęto podawanie badanych próbek. Z tego powodu działanie badanych związków nie miało znaczącego wpływu na przyjmowanie pokarmu przez szczury podczas okresu podawania.

W tabeli D1 i tabeli D2 podano średnie masy ciał dla różnych grup dla dni od -7 do -1 i dni 0 - 6. Działanie różnych dawek soku i suszonego rozpyłowo soku pokazano na dołączonym wykresie jako % zmianę w masie ciała dla dni 0 - 7 (fig. 5) i % zmiana w masie ciała dla dni od -7 do 7 (fig. 6). Spadek masy ciała jest wyraźnie związany z dawką, zwłaszcza z wyższymi dawkami.

Badanie histopatologiczne wątrób nie wykazało żadnej znaczącej patologii w grupach otrzymujących badane próbki.

Pokarm

Spożycie pokarmu mierzono codziennie podczas aklimatyzacji i w trakcie trwania badania. Pokarm był dostępny przez 3 godziny w ciągu dnia, od 12:00 do 15:00. Zwierzęta głodzono przez resztę czasu. Zwierzęta w 5 grupie otrzymały obliczoną ilość pokarmu pierwszego dnia 1, równoważną średniemu spożyciu pokarmu przez 4 grupę dnia 0. Ten model kontrolowanej ilości pokarmu dla 5 grupy, określony jako średnie spożycie pokarmu przez 4 grupę z poprzedniego dnia, stosowano przez dni 1 - 7.

Woda

Wodę dostarczono w standardowych pojemnikach. Woda była dostępna bez ograniczeń (Magalies Water Board Tap Water, odpowiednia do spożycia przez ludzi). Spożycie wody mierzono raz dziennie, o tej samej godzinie każdego dnia po określeniu spożycia pokarmu.

PL 201 487 B1

Aklimatyzacja

Zwierzęta aklimatyzowano przez 7 dni zanim rozpoczęto badania, jak opisano powyżej, z określeniem spożycia pokarmu i wody. Masy ciała określano w tym czasie codziennie.

Projekt badania i procedury

T a b e l a 1 Projekt badania

Grupa	Próba	Numery	Dawka	Badana próbka
01	6 samców	001 - 006	100 mg/kg	Sok zamrożony
02	6 samców	007 - 012	400 mg/kg	Sok zamrożony
03	6 samców	013 - 018	1600 mg/kg	Sok zamrożony
04	6 samców	019 - 024	3200 mg/kg	Sok zamrożony
05	6 samców	025 - 030	kontrola	Elga Option 4 Woda destylowana
06	6 samców	031 - 036	2,2 mg/kg	Suszony rozpyłowo sok
07	6 samców	037 - 042	8,8 mg/kg	Suszony rozpyłowo sok
08	6 samców	043 - 048	35 mg/kg	Suszony rozpyłowo sok
09	6 samców	049 - 054	kontrola	Elga Option 4 Woda oczyszczona

Sposób podawania

Badane próbki podawano codziennie przez 7 dni z użyciem igły dożołądkowo. Zwierzęta głodzono przez 18 godzin zanim podano badane próbki (podawanie rozpoczęto o 09:00).

Czas podawania

Zwierzęta traktowano przez 7 kolejnych dni (od dnia 0 do dnia 6). Po trzy zwierzęta z każdej grupy uśmiercano po 24 godzinach od ostatniej dawki (dzień 7). Pozostałe 3 zwierzęta uśmiercono po 7 dniach od ostatniego podania (dzień 13). Procedurę tę zastosowano dla wszystkich grup z wyjątkiem grupy 5, w której 3 zwierzęta uśmiercono 24 godziny po ostatnim kontrolowanym podawaniu pożywienia (dzień 8), pozostałe 3 zwierzęta uśmiercono po 7 dniach od ostatniego podawania (dzień 13).

Masa ciała

Masy ciała określano codziennie, w przybliżeniu w tym samym czasie każdego dnia w trakcie badania, w tym w ciągu okresu aklimatyzacji.

Eutanazja zwierzęta z każdej grupy uśmiercono po 24 godzinach od podania ostatniej dawki (dzień 7).

Pozostałe 3 zwierzęta uśmiercono po 7 dniach od ostatniego podania. Procedurę tę zastosowano dla wszystkich grup z wyjątkiem grupy 5, w której 3 zwierzęta uśmiercono 24 godziny po ostatnim kontrolowanym podawaniu pożywienia (dzień 8), pozostałe 3 zwierzęta uśmiercono po 7 dniach od ostatniego podawania (dzień 13). Zwierzęta uśmiercano pod koniec okresu badań z użyciem gazu, CO2.

Badania z użyciem oftalmoskopu

Badania oftalmoskopowe z użyciem oftalmoskopu przeprowadzono przed pierwszym podaniem badanej próbki i na koniec, u wszystkich zwierząt z każdej grupy.

Patologia makroskopowa

Całkowite badania po uśmierceniu wykonano na każdym zwierzęciu, które uśmiercono pod koniec okresu badania.

Histopatologia

Badania histopatologiczne wykonano na wątrobie każdego zwierzęcia.

PL 201 487 B1

T a b e l a D.1

Średnia masa ciała/grupę/tydzień

Gru- pa	Podawanie doustnie	Dawka (mg/kg)	Średnia masa ciała (g) & odchylenie standardowe
Dzień -7	Dzień -6	Dzień -5	Dzień-4	Dzień -3	Dzień -2	Dzień -1
01	Próbka 1 (Sok)	100,0	203,38±95,39	197,13±90,63	192,75±89,49	188,62±86,75	184,95±84,80	182,48±83,47	182,25±82,57
02	Próbka 1 (Sok)	400,0	192,53±65,60	183,92±61,20	178,25±59,37	173,17±58,10	170,82±57,42	168,25±58,40	169,37±59,25
03	Próbka 1 (Sok)	1600,0	149,25±54,80	142,87±51,89	136,85±52,17	132,37±49,64	131,50±49,50	129,67±48,89	131,12±48,22
04	Próbka 1 (Sok)	3200,0	224,15±80,70	214,45±77,25	207,10±76,38	201,82±75,42	198,25±74,82	194,83±75,34	196,77±74,56
05	Elga Option woda oczyszczona (kontrola)	-	214,55±74,90	204,85±72,41	198,57±71,79	193,48±68,49	192,40±67,48	190,87±67,39	190,15±65,24
06	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	2,2	208,65±65,74	199,37±62,49	193,18±61,18	188,25±60,89	186,22±59,98	184,55±58,86	185,97±58,76
07	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	8,8	256,95±77,55	246,02±73,67	237,47±73,53	232,62±71,73	229,78±71,76	228,07±69,88	228,45±68,81
08	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	35,0	194,37±43,74	185,83±42,70	177,53±41,10	172,05±40,13	170,10±39,49	167,25±37,61	168,00±38,81
09	Elga Option woda oczyszczona (kontrola)	-	171,52±69,81	162,67±62,68	154,95±61,83	151,38±59,48	149,63±57,66	148,30±57,12	149,01±56,01

T a b e l a D.2

Średnia masa ciał/grupa/tydzień (ciąg dalszy)

Gru- pa	Podawa- nie doustnie	Dawka (mg/kg)	Średnia masa ciała (g) & odchylenie standardowe
Dzień 0	Dzień 1	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Dzień 5	Dzień 6
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
01	Próbka 1 (Sok)	100,0	183,87±83,33	175,83±81,82	175,72±79,05	175,48±77,54	175,53±76,20	177,95±73,99	178,43±72,68
02	Próbka 1 (Sok)	400,0	173,45±60,73	164,58±58,52	164,75±58,37	166,22±57,69	166,55±57,79	169,93±57,47	171,77±57,29
03	Próbka (Sok)	1600, 0	134,38±46,01	129,20±44,74	127,53±43,20	127,20±41,36	126,70±39,19	128,00±39,22	128,07±38,66
04	Próbka (Sok)	3200, 0	199,60±75,16	196,38±73,96	192,20±71,20	189,05±69,11	186,57±66,29	186,05±67,45	185,68±65,73

PL 201 487 B1 cd. tabeli D2

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
05	Elga Option 4 woda oczyszczona (kontrola)	-	194,27±67,46	187,93±65,48	181,97±65,01	177,53±64,73	174,73±61,08	172,85±58,63	171,45±56,79
06	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	2,2	189,07±60,15	181,52±58,99	181,48±57,79	184,42±55,64	185,75±55,29	189,35±54,66	189,68±53,70
07	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	8,8	230,28±69,32	221,55±68,02	220,17±66,63	221,80±63,88	222,82±63,56	224,82±62,38	224,90±62,05
08	Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok)	35,0	169,10±38,40	164,42±38,03	162,50±36,81	162,75±36,36	162,52±36,93	164,30±37,69	164,22±37,18
09	Elga Option 4 woda oczyszczona (kontrola)	-	151,02±55,45	146,55±53,77	148,10±52,67	149,70±52,05	152,58±50,37	155,82±49,91	157,85±49,70

T a b e l a D.3

Średnia masa ciała/grupę/tydzień (ciąg dalszy)

Gru- pa	Podawanie doustnie	Dawka (mg/kg)	Średnia masa ciała (g) & odchylenie standardowe
Dzień 7	Dzień 8	Dzień 9	Dzień 10	Dzień 1 1	Dzień 12	Dzień 13
01	Próbka 1 (Sok) (GHA I 35A)	100,0	185,38±72,64	234,73±62,44	236,73±62,39	234,07±62,09	236,33±62,31	239,07±60,24	238,43±59,85
02	Próbka 1 (Sok) (GHA I 35A)	400,0	178,83±58,24	225,63±13,05	277,13±14,18	227,10±14,03	229,43±16,97	234,93±18,35	236,20±15,97
03	Próbka 1 (Sok) (GHA I 3 5 A)	1600,0	132,22±37,08	133,80±55,17	135,23±455,74	134,53±54,96	138,30±53,03	139,30±51,10	142,80±49,51
04	Próbka 1 (Sok) (GHA 9 35A)	3200,0	188,57±66,14	199,63±61,07	198,90±57,48	198,70±54,55	194,73±52,78	194,93±50,78	197,93±51,57
05	Elga Option 4 woda oczyszczona (kontrola)	-	173,97±54,29	172,98±52,06	157,80±58,62	158,87±57,76	160,80±57,67	163,40±56,27	167,80±58,49
06	Próbka 2 (Suszony rozpyłowo sok) (GHA I 59)	2,2	196,00±53,09	190,27±27,78	190,27±29,54	192,60±29,09	194,73±29,68	196,97±29,04	198,60±30,18
07	Próbka 2 (Suszony rozpyłowo sok) (GHA I 59)	8,8	231,30±61,91	177,27±24,48	178,17±23,79	180,67±25,04	182,03±25,31	185,10±24,60	189,73±23,58
08	Suszony rozpyłowo sok (GHA I 59)	35,0	167,48±36,75	164,90±22,54	166,63±23,08	168,43±22,66	171,67±24,42	174,90±25,70	178,57±23,58
09	Elga Option 4 woda oczyszczona (kontrola)	-	165,50±49,27	193,73±22,37	196,87±21,86	198,07±21,02	199,83±20,21	204,93±18,65	207,13±18,22

PL 201 487 B1

T a b e l a 1: Histologiczna ocena sekcji wątroby szczurów (samce) Próbka 1

Grupa 1: 100 mg/kg Próbka 1	Grupa 2: 400 mg/kg Próbka 1
	Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie		Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie
Dzień 7	01	NPL		07	FHS1 +
	02	NPL		08	NPL C1 +
	03	NPL C1 +		09	NPL
Dzień 13	04	NPL MLC	Dzień 13	10	DHS1 +
	05	FHS1 +		11	NPL
	06	NPL		12	DHS1 +

Grupa 3: 1600 mg/kg Próbka 1	Grupa 4: 3200 mg/kg Próbka 1
	Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie		Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie
Dzień 7	13	NPL		19	NPL
	14	NPL		20	NPL
	15	NPL		21	NPL
Dzień 13	16	NPL	Dzień 13	22	DHS1 +
	17	DHS1 +		23	FHS1 +
	18	NPL		24	NPL

Grupa 5: Kontrola: Elga option 4, woda oczyszczona; ograniczone przyjmowanie pokarmu Legenda:

Grupa 5: Kontrola: Elga option 4, woda oczyszczona
	Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie
Dzień 7	25	NPL MLC
	26	NPL
	27	NPL
Dzień 13	28	DHS1 +
	29	DHS1 +
	30	NPL

C = przekrwienie

DHS = rozsiane puchlinowe pęcznienie komórek

FHS = ogniskowe puchlinowe pęcznienie komórek

NPL = brak zmian miąższowych MLC = min. obrost limfocytowy 1+ = łagodnie

2+ = średnie 3+ = ciężkie

T a b e l a 2: Histologiczna ocena sekcji wątroby szczurów (samce) Próbka 2

Grupa 6: 2,2 mg/kg Próbka 2	Grupa 7: 8,8 mg/kg Próbka 2
	Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie		Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie
1	2	3	4	5	6
Dzień 7	31	NPL		37	NPL
	32	NPL MLC		38	NPL
	33	FHS1 +		39	NPL C1 +

PL 201 487 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6
Dzień 13	34	NPL	Dzień 13	40	DHS1 +
	35	DHS1 +		41	NPL
	36	NPL		42	MLC DHS1 +

Grupa 8:35 mg/kg Próbka 2
	Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie
Dzień 7	43	NPL
	44	NPL
	45	NPL
Dzień 13	46	NPL
	47	NPL C1 +
	48	MLC FHS1 +

Grupa 9: Kontrola: Elga option 4, woda oczyszczona Legenda:

C = przekrwienie

Grupa 9: Kontrola: Elga option 4, woda oczyszczona
	Zwierzę nr	Zmiany w wątrobie
Dzień 7	49	NPL
	50	NPL
	51	FHS1 +
Dzień 13	52	DHS1 +
	53	NPL
	54	FHS1 +

DHS = rozsiane puchlinowe pęcznienie komórek

FHS = ogniskowe puchlinowe pęcznienie komórek

NPL = brak zmian miąższowych MLC = min. obrost limfocytowy 1+ = łagodne

2+ = średnie

3+ = ciężkie

Nie odnotowano żadnych konkretnych zmian we fragmentach wątrób u poddanych doświadczeniu szczurów, które otrzymały zamrożony sok jak również suszony rozpyłowo sok, które można byłoby przypisać podawaniu doustnemu wyżej wymienionych substancji chemicznych. Puchlinowe obrzmienie komórek zauważone zarówno w przypadku próby kontrolnej jak i u szczurów poddanych doświadczeniu może wskazywać na normalne metaboliczne obrzmienie komórek i zmiany na skutek niedotlenienia. Minimalne ogniska obrostu limfocytowego okołonaczyniowe wykryto u niektórych zwierząt i stanowią najprawdopodobniej przypadkowe spostrzeżenie. U kilku szczurów w zatokach wątrobowych nastąpiły przekrwienia o łagodnym stopniu i należy je traktować jako przypadkowe spostrzeżenie.

Istotną cechą tego wynalazku, którą obrazują wyniki tego badania jest to, że w czasie badania nie rozwinęła się żadna tolerancja na żadną z próbek. Może to stanowić znaczącą korzyść, zwłaszcza w zwią zku z leczeniem otył o ś ci.

Chociaż wcześniej opisano środki według wynalazku w powiązaniu z ich właściwościami jako środków hamujących łaknienie, to należy zauważyć że określenie ”środek hamujący łaknienie - stosuje się w niniejszym opisie w celu wskazania czynności zmierzającej do ograniczenia łaknienia i/lub

PL 201 487 B1 zwiększenia uczucia nasycenia, zatem w celu zmniejszenia całkowitej kaloryczności przyjmowanego pożywienia, co z kolei przeciwdziała otyłości. Zatem niniejszy wynalazek umożliwia leczenie, zapobieganie lub zwalczanie otyłości u człowieka lub zwierzęcia przez podawanie temu człowiekowi lub zwierzęciu leczącej, zapobiegającej lub zwalczającej otyłość ilości środka lub ekstraktu zawierającego związek o wzorze (1).

Stosowane w niniejszym opisie określenie ”zwierzę obejmuje, lecz nie ogranicza się do zwierząt towarzyszących, np. zwierząt domowych i zwierząt oswojonych; bez ograniczenia się do tych przykładów obejmuje bydło, owce, fretki, świnie, wielbłądy, konie, drób, ryby, króliki, kozy, psy i koty.

Środek anorektyczny lub do leczenia otyłości lub jej zapobiegania u człowieka, środek według wynalazku, korzystnie podaje się takiemu człowiekowi w dawce w ilości od około 0,01 mg/kg/dzień do około 10 mg/kg/dzień. Korzystny zakres dawek wynosi 0,05 mg/kg/dzień do 0,5 mg/kg/dzień. W przypadku użycia ekstraktu w postaci suszonego rozpyłowo proszku korzystny zakres dawek wynosi od 0,1 mg/kg/dzień do 20 mg/kg/dzień; a zwłaszcza wynosi od 0,5 mg/kg/dzień do 5 mg/kg/dzień.

Claims (26)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania ekstraktu z rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, zawierającego skuteczną do hamowania łaknienia ilość hamującego łaknienie glikozydu steroidowego o wzorze (1) znamienny tym, że na materiał roślinny działa się rozpuszczalnikiem dla ekstrakcji frakcji o czynności hamowania łaknienia, oddziela się roztwór ekstrakcyjny od reszty materiału roślinnego, usuwa się rozpuszczalnik z roztworu ekstrakcyjnego i wyodrębnia się ekstrakt.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roślinę rodzaju Trichocaulon wybraną z grupy obejmującej gatunek Trichocaulon piliferum i Trichocaulon officinale i roślinę rodzaju Hoodia wybraną z grupy obejmującej gatunek Hoodia currorii, Hoodia gordonii i Hoodia lugardii.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że ekstrakt ekstrahuje się z rośliny wybranej z grupy obejmującej gatunek Hoodia currorii, Hoodia gordonii i Hoodia lugardii.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że zatęża się substancję czynną w wyekstrahowanym materiale drogą dalszej ekstrakcji rozpuszczalnikiem.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik w etapie ekstrakcji rozpuszczalnikiem lub w etapach ekstrakcji rozpuszczalnikiem stosuje się jeden lub większą liczbę rozpuszczalników wybranych z grupy obejmującej chlorek metylenu, wodę, metanol, heksan, octan etylu i ich mieszaniny.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że zatęża się substancję czynną w wyekstrahowanym materiale drogą rozdzielania chromatograficznego.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w etapie rozdzielania chromatograficznego jako eluent stosuje się jeden lub większą liczbę rozpuszczalników wybranych z grupy obejmującej chloroform, metanol, octan etylu, heksan i ich mieszaniny.
8. 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że prowadzi się rozdzielanie chromatograficzne w kolumnie, zbiera się eluat we frakcjach z kolumny, ocenia się frakcje dla określenia ich czynności hamowania łaknienia i wybiera się co najmniej jedną frakcję zawierającą substancję hamującą łaknienie.

   PL 201 487 B1
9. 9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że ekstrakt poddaje się obróbce z wytworzeniem sypkiego proszku.
10. 10. Ekstrakt roślinny zawierający środek hamujący łaknienie, znamienny tym, że jest wytworzony sposobem określonym w zastrz. 1-9.
11. 11. Ekstrakt według zastrz. 10, do stosowania jako lek o czynności hamowania łaknienia.
12. 12. Ekstrakt według zastrz. 10, do stosowania jako lek do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.
13. 13. Środek o czynności hamowania łaknienia, znamienny tym, że zawiera ekstrakt określony w zastrz. 10.
14. 14. Środek według zastrz. 13, znamienny tym, że jest zmieszany z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.
15. 15. Środek według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że jest sformułowany w jednostkową postać dawkowaną.
16. 16. Środek według zastrz. 13, znamienny tym, że środkiem jest produkt żywnościowy lub napój.
17. 17. Sposób wytwarzania ekstraktu roślinnego z rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, zawierającego skuteczną do hamowania łaknienia ilość hamującego łaknienie glikozydu steroidowego o wzorze (1) znamienny tym, że prasuje się materiał roślinny, oddziela się sok od stałego materiału roślinnego i wyodrębnia się sok wolny od stałego materiału roślinnego z wytworzeniem ekstraktu.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że ekstrakt suszy się z wytworzeniem sypkiego proszku.
19. 19. Ekstrakt roślinny zawierający środek hamujący łaknienie, znamienny tym, że jest wytworzony sposobem określonym w zastrz. 17 albo 18.
20. 20. Ekstrakt według zastrz. 19, do stosowania jako lek o czynności hamowania łaknienia.
21. 21. Ekstrakt według zastrz. 19, do stosowania jako lek do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.
22. 22. Środek o czynności hamowania łaknienia, znamienny tym, że zawiera ekstrakt według zastrz. 19.
23. 23. Środek według zastrz. 22, znamienny tym, że jest zmieszany z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.
24. 24. Środek według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że jest sformułowany w jednostkową postać dawkowaną.
25. 25. Środek według zastrz. 22, znamienny tym, że środkiem jest produkt żywnościowy lub napój.
26. 26. Zastosowanie ekstraktu według zastrz. 19, do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.