PL199892B1 - Hydroksymatairezinol do zastosowania w profilaktyce, preparat farmaceutyczny, dodatek do produktu spożywczego, produkt spożywczy, sposób zwiększania trwałości produktów spożywczych i zastosowanie hydroksymatairezinolu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest hydroksymatairezinol do zastosowania w profilaktyce nowotworów, niektórych nienowotworowych chorób hormonozale znych i/lub chorób sercowo-naczyniowych u pa- cjentów. Przedmiotem wynalazku jest równie z hydroksymatairezinol do zastosowania w sposobie podnoszenia poziomu enterolaktonu lub innego metabolitu hydroksymatairezinolu w osoczu pacjentów w celu profilaktyki nowotworów lub niektórych nienowotworowych chorób hormonozale znych u pacjen- tów. Ponadto wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego, dodatku do produktu spo zywczego, produktu spo zywczego zawieraj acego hydroksymatairezinol, sposobu zwi ekszania trwa lo sci produk- tów spo zywczych oraz zastosowania hydroksymatairezinolu. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest hydroksymatairezinol do zastosowania w profilaktyce, preparat farmaceutyczny, dodatek do produktu spożywczego, produkt spożywczy, sposób zwiększania trwałości produktów spożywczych i zastosowanie hydroksymatairezinolu.

Publikacje i inne materiały zastosowane w niniejszym opisie w celu zilustrowania stanu techniki dla tego wynalazku w szczególności ujawniają dodatkowe szczegóły dotyczące praktyki, włączone są niniejszym jako odnośniki literaturowe.

Lignany są zdefiniowane jako klasa związków fenolowych posiadających szkielet 2,3-dibenzylobutanowy. Utworzone są one poprzez sprzężenie jednostek monomerycznych zwanych prekursorami, takich jak kwas cynamonowy, kwas kawowy, kwas ferulowy, kwasy kumarynowy i galusowy (Ayers i Loike, 1990). Lignany są szeroko rozpowszechnione w roślinach. Można je znaleźć w różnych ich częściach (korzeniach, liściach, pniach, łodygach, nasionach, owocach) lecz na ogół w niewielkich ilościach. W wielu źródłach (nasionach, owocach) lignany można znaleźć jako konjugaty (sprzężenia) glikozydowe połączone ze składnikiem włóknistym roślin. Najbardziej rozpowszechnionym źródłem dietetycznym prekursorów ssaczych lignanów są nieoczyszczone produkty zbożowe. Najwyższe stężenia w roślinach jadalnych znaleziono w siemieniu lnianym, a następnie w nieoczyszczonych produktach zbożowych, zwłaszcza w życie. Wytwarzanie ssaczych lignanów z różnych pokarmów roślinnych przedstawiono w tabeli 1.

Znaczne ilości lignanów można również znaleźć w drzewach iglastych. Ten typ lignanów różni się u poszczególnych gatunków, przy czym ilość lignanów jest różna w zależności od różnych części drzew iglastych. Typowymi lignanami z drewna twardzieli świerku (Pinea abies) są hydroksymatairezinol (HMR), α-konidendryna, kwas konidendrynowy, metairezinol, izolaricirezinol, sekoizolaricirezinol, liovile, picearezinol, laricirezinol oraz pinorezinol (Ekman 1979). Dalece najbardziej zasobnym składnikiem lignanów u świerka jest HMP, stanowi on około 60% całkowitych lignanów i występuje głównie w wolnej postaci niesprzężonej. Stężenie lignanów w grubych korzeniach wynosi 2-3%. Duża zasobność w lignany pojawia się w drewnie twardzieli gałęzi (5-10%) oraz w skrzywieniach i zwłaszcza w węzłach, gdzie ilość lignanów może być większa niż 10% (Ekman, 1976 i 1979). Takie stężenia są około stukrotnie wyższe w porównaniu ze sproszkowanym lnem gruntowym, znanym jako materiał bogaty w lignany.

Struktura chemiczna hydroksymatairezinolu jest następująca:

Lignany można wyodrębniać na przykład z włókien prasowanego drewna. Takie włókna pochodzą z prasowanego drewna z pni i węzłów (frakcja wiórów ponadwymiarowych) pogorszającego jakość papieru (Ekman, 1976).

Lignany roślinne takie jak matairezinol i sekoizolaricirezinol przekształcane są przez mikroflorę jelitową w lignany ssacze, enterolakton i enterodiol, odpowiednio (Axelson et al. 1982). Podlegają one obiegowi wątrobowo-jelitowemu i wydalane są razem z moczem jako konjugaty glukuronidu (Axelson i Setchel, 1981). Jako doświadczalny dowód działania chemioprofilaktycznego lignanów stwierdzono, że uzupełnienie wysokotłuszczowej diety mączką z siemienia lnianego o wysokiej zawartości lignanów (5% lub 10%) lub lignanami z siemienia lnianego (sekoizolaricirezinol/diglikozyd, SDG) zapobiegało rozwojowi raka piersi wrażliwego na przeciwestrogeny wywołanego przez DMBA u szczurów (Serraino

PL 199 892 B1 i Thompson 1991 i 1992; Thompson et al. 1996a i 1996b). Zmniejszał y one proliferację komórek nabłonkowych, ilość aberracji jądrowych, wzrost guzów, oraz zmniejszały rozwój nowych guzów. Przyjmowanie lignanów w dużych ilościach może również chronić przeciwko wywoływanym doświadczalnie rakom prostaty i okrężnicy. Żyto dietetyczne (zawierające lignany) zapobiegało we wczesnych stadiach wzrostowi przeszczepionego gruczolakoraka prostaty Dunning R3327 u szczurów (Zhang et al. 1997; Landstrom et al. 1998). Procent zwierząt noszących wyczuwalne dotykiem guzy, objętości guzów oraz prędkości ich wzrostu były znacznie obniżone. Ponadto, uzupełnienie diety siemieniem lnianym lub SDG inhibowało tworzenie się wywoływanych chemicznie odchylających się od normy krypt w okrężnicy u szczurów (Serraino i Thompson 1992; Jenab i Thompson 1996). Działanie przeciwnowotworowe może być zatem wywoływane przez słabe własności typu estrogenowo-przeciwestrogenowego i/lub inne mechanizmy, które nie są jeszcze dobrze zrozumiane.

Wydalanie z moczem oraz stężenia w surowicy enterolaktonu są niskie u kobiet ze zdiagnozowanym rakiem piersi (Ingram et al. 1997; Hulten et al. 1998) co sugeruje, że lignany mają działanie chemioprofilaktyczne. Ssacze lignany (enterolakton i enterodiol) są hipotetycznie uważane za substancje modulujące nowotwory powiązane z hormonami, takie jak rak piersi, z powodu ich strukturalnego podobieństwa do estrogenów. Enterolakton wykazywał słabe działanie estrogenowe w komórkach MCF-7 (Mousavi i Adlercreutz 1992), lecz nie wykazywał odpowiedzi estrogenowej w masie macicy u mysz (Setchell et al. 1981). Jako przejaw działania typu estrogenowego, podawanie SDG podczas ciąży i laktacji u szczurów zwiększało masę macicy po odstawieniu, lecz wpływ taki nie był oczywisty w późniejszych etapach (Tou et al. 1998). Możliwy efekt przeciwnowotworowy był również powiązany z ich działaniem przeciwestrogenowym (Waters i Knowler, 1982). Inhibicja aromatazy przez ssaczy lignan, enterolakton, mogłaby sugerować mechanizm, za pomocą którego spożywanie pokarmów z roślin bogatych w lignany mogłoby mieć swój udział w zmniejszaniu chorób estrogenozależnych, takich jak rak piersi (Adlercreutz et al. 1993, Wang et al. 1994). Potencjalne działanie przeciwutleniające lignanów może także mieć swój udział w mechanizmie powiązanym z działaniem profilaktycznym lignanów w rozwoju nowotworów. Ponadto wykazano, że ssacze lignany inhibują przekształcanie testosteronu w 5a-dihydrotestosteron (DHT), potencjalny wewnątrzkomórkowy androgen, przy stężeniach, jakie można uzyskać u ludzi (Evans et al. 1995). Zmniejszanie stężenia DHT mogłoby modyfikować ryzyko wystąpienia raka prostaty (PC) oraz dobrotliwego rozrostu prostaty (BPH).

Jest możliwe, że lignany jako prekursory enterolaktonu mogłyby również łagodzić symptomy dolnych dróg moczowych (LUTS) oraz ginekomastii. Na podstawie wyników uzyskanych na modelu zwierzęcym zasugerowano, że estrogeny odgrywają zasadniczą rolę w rozwoju zaburzeń mięśniowych powiązanych z dyssynergią cewkową obserwowanych jako dyssynergia szyi pęcherza lub pseudodyssynergia zwieracza zewnętrznego (Streng et al. obserwacje niepublikowane). Takie zmiany neuromięśniowe są przynajmniej częściowo odwracalne przez inhibitor aromatazy (MPV-2213ad) odgrywający rolę estrogenów. Ponadto rozważano ginekomastię, która jest wywoływana przez ekspozycję na działanie estrogenów lub w obecności podwyższonej proporcji estrogenu do androgenów. Ginekomastia może być skutecznie leczona za pomocą inhibitora aromatazy. Zdolność lignanów do inhibowania 5a-reduktazy i/lub aromatazy w połączeniu z ich potencjalnym działaniem przeciwutleniającym może mieć udział w mechanizmie związanym z działaniem profilaktycznym lignanów w rozwoju chorób powiązanych z hormonami u organizmów męskich.

Brak jest jakichkolwiek dostępnych danych na temat możliwego oddziaływania lignanów u ludzi. Obecne teorie na temat działania lignanów u ludzi zostały wyprowadzone z badań nad wynikami uzyskanymi po stosowaniu diet uzupełnianych produktami z siemienia lnianego (a zatem lignanami). Siemię lniane stosowane w diecie podawanej kobietom wywoływało zmiany w cyklu menstruacyjnym (Phipps et al. 1993). Podmioty badań, wszystkie kobiety normalnie miesiączkujące, wykazywały dłuższą średnią długość fazy lutealnej oraz wyższą proporcję progesteron/17e-estradiol w osoczu podczas fazy lutealnej, gdy spożywały 10 g sproszkowanego siemienia lnianego dziennie, jako dodatek do ich zwykłej diety (Phipps et al. 1993). Nie zauważono żadnych znaczących różnic pomiędzy cyklami z lnem, a cyklami grupy kontrolnej czy też stężeniami zarówno estronu jak i 17e-estradiolu. Nie zauważono również żadnych znaczących różnic pomiędzy grupą przyjmującą siemię lniane i grupą kontrolną, co do stężeń estrogenów w osoczu u kobiet pomenopauzalnych (Brzezinski et al. 1997). Uzupełnianie pożywienia siemieniem lnianym zwiększało stężenie SHBG (białko, które wiąże estradiol o wysokiej pojemności) w osoczu. Jest to typowy wpływ estrogenowy w tkance wątroby. Podwyższone stężenie SHBG z drugiej strony zmniejsza biodostępność estrogenów endogenicznych. U zdrowych młodych mężczyzn, krótkoterminowe (6 tygodni) uzupełnianie diety siemieniem lnianym (10 g dziennie

PL 199 892 B1 w bułce maślanej) nie wywoływało żadnego znaczącego wpływu na stężenia testosteronu w osoczu (Shultz et al. 1991) wskazując na brak estrogeniczności w organizmach męskich.

Podsumowując, badania te wykazują, że lignany mogą mieć słabe wpływy hormonalne, (estrogenowe i przeciwestrogenowe), jednakże mechanizm ich działania nie może być w pełni opisany przez oddziaływania hormonalne.

Konkludując, wyodrębnione ssacze lignany nie były wcześniej zdolne w wystarczającym stopniu do stosowania ich w doświadczeniach ze zwierzętami lub w próbach klinicznych, a jedyną możliwością zwiększenia przyjmowania lignanów było zwiększenie spożycia produktów spożywczych bogatych w błonnik, takich jak siemię lniane. HMR lub dowolny inny lignan, który jest skutecznie przekształcalny w enterolakton i może być produkowany/wyodrębniany w większych ilościach byłyby cenną substancją w wytwarzaniu preparatów farmaceutycznych oraz produktów spożywczych takich jak żywność funkcyjna do stosowania w chemioprofilaktyce nowotworów i innych chorób związanych z hormonami oraz chorób sercowo-naczyniowych.

Wynalazek dotyczy zastosowania lignanu, hydroksymatairezinolu (HMR), w profilaktyce nowotworów, nienowotworowych chorób hormonozależnych i chorób sercowo-naczyniowych przez dodawanie HMR do pożywienia lub przez zastosowanie go, jako preparat farmaceutyczny. Nieoczekiwanie, HMR okazał się metabolizowany in vivo do enterolaktonu, o którym uważa się, że przynajmniej w części ma swój udział w przeciwnowotworowym działaniu lignanów. Przeciwutleniające działanie HMR in vitro jest bardzo silne i ta właściwość wskazuje, że HMR może także zapobiegać chorobom sercowo-naczyniowym poprzez efekt ochronny przeciwko uszkodzeniom spowodowanym przez wolne rodniki tlenu w organizmie. Wynalazek dotyczy także zastosowania HMR jako dodatek spożywczy w celu zwiększenia trwałości żywności (to znaczy, inhibowanie utleniania lipidów i pigmentów oraz utraty witamin, które powodują utratę wartości odżywczych i powstawanie nieprzyjemnego zapachu oraz smaku pożywienia).

Przedmiotem wynalazku jest hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer lub jego stereoizomer do zastosowania w profilaktyce nowotworów, niektórych nienowotworowych chorób hormonozależnych i/lub chorób sercowo-naczyniowych u pacjentów, przy czym: nowotwory wybiera się zwłaszcza z grupy obejmującej rak piersi, rak prostaty i rak okrężnicy, nienowotworowe choroby hormonozależne wybiera się z grupy obejmującej symptomy dolnych dróg moczowych (LUTS), dyssynergię cewkową, niestabilność pęcherza, niedrożność szyi pęcherza, łagodny przerost prostaty oraz ginekomastię u mężczyzny, a choroby sercowo-naczyniowe wybiera się z grupy obejmującej choroby wywołane obecnością utlenionych lipoprotein małej gęstości LDL w osoczu.

Przedmiotem wynalazku jest również hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer do zastosowania w sposobie podwyższania poziomu enterolaktonu lub innego metabolitu hydroksymatairezinolu w osoczu pacjenta w profilaktyce nowotworów lub niektórych nienowotworowych chorób hormonozależnych u pacjentów, przy czym pacjentowi podaje się skuteczną dawkę hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru, przy czym: nowotwory wybiera się zwłaszcza z grupy obejmującej rak piersi, rak prostaty i rak okrężnicy, a nienowotworowe choroby hormonozależne, wybiera się z grupy obejmującej symptomy dolnych dróg moczowych (LUTS), dyssynergię cewkową, niestabilność pęcherza, niedrożność szyi pęcherza, łagodny przerost prostaty oraz ginekomastię u mężczyzn.

Przedmiotem wynalazku jest także preparat farmaceutyczny zawierający farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że zawiera skuteczną ilość hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru.

Przedmiotem wynalazku jest też dodatek do produktu spożywczego zawierający jadalny, nietoksyczny, płynny lub stały materiał wzbogacający charakteryzujący się tym, że materiał wzbogacający zawiera 100 mg do 1 g hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru na 100g materiału wzbogacającego.

Korzystnie produkt spożywczy wybiera się z grupy obejmującej żywność funkcyjną, dodatek odżywczy, środek odżywczy, żywność farmakologiczną, żywność odżywczo-leczniczą, zdrową żywność, żywność planowaną i inne produkty spożywcze.

Korzystnie produkt spożywczy stanowi żywność funkcyjną w postaci masła, margaryny, ciastek, chleba, ciasta, cukierków, słodyczy, jogurtu lub innych mlecznych produktów fermentowanych, lub płatki zbożowe, między innymi musli.

Przedmiotem wynalazku jest również produkt spożywczy, charakteryzujący się tym, że zawiera skuteczną ilość hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru.

PL 199 892 B1

Korzystnie produkt wybrany jest z grupy obejmującej żywność funkcyjną, dodatek odżywczy, środek odżywczy, żywność farmakologiczną, żywność odżywczo-leczniczą, zdrową żywność, żywność planowaną i inne dowolne produkty spożywcze.

Korzystnie produkt stanowi żywność funkcyjna w postaci masła, margaryny, ciastek, chleba, ciasta, cukierków, słodyczy, jogurtu lub innych mlecznych produktów fermentowanych, lub płatki zbożowe, między innymi musli.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób zwiększania trwałości produktów spożywczych, charakteryzujący się tym, że obejmuje etap, w którym dodaje się skuteczną ilość hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru.

Korzystnie wytwarza się produkt spożywczy o zmniejszonym stopniu utlenienia lipidów, witamin i barwników przyczyniają cego się do utraty wartoś ci odż ywczych i powstawania nieprzyjemnego zapachu i smaku.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru, wzbogacającego stały lub ciekły materiał, jako dodatek do produktów spożywczych.

Korzystnie produkt spożywczy wybrany jest z grupy obejmującej żywność funkcyjną, dodatki odżywcze, środki odżywcze, żywność farmakologiczną, żywność odżywczo-leczniczą, zdrową żywność, żywność planowaną i inne dowolne produkty spożywcze.

Korzystnie produkt spożywczy stanowi żywność funkcyjna w postaci masła, margaryny, ciastek, chleba, ciasta, cukierków, słodyczy, jogurtu lub innych mlecznych produktów fermentowanych, lub płatki zbożowe, między innymi musli.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia wykres zależności inhibicji aromatazy w komórkach JEG-3 przez lignany w funkcji ich stężenia.

Fig. 2 przedstawia wartości proliferacji komórek MCF-7 w obecności i pod nieobecność HMR.

Fig. 3 przedstawia wartości względnej masy macicy u niedojrzałych szczurów leczonych za pomocą HMR oraz za pomocą inhibitora aromatazy.

Fig. 4 przedstawia działanie przeciwnowotworowe HMR wobec guzów gruczołów mlekowych u szczurów pł ci ż e ń skiej wywoł ywanych przez DMBA.

Fig. 5 przedstawia wydalanie enterolaktonu z moczem u szczurów, którym podawano różne dawki HMR.

Wynalazek jest szczególnie skuteczny w profilaktyce nowotworów takich jak rak piersi, rak prostaty i rak okrężnicy, w profilaktyce nienowotworowych chorób hormonozależnych takich jak symptomy dolnych dróg moczowych, dyssynergia cewkowa, niestabilność pęcherza, niedrożność szyi pęcherza, dobrotliwy rozrost prostaty oraz ginekomastia u mężczyzn, oraz w profilaktyce chorób sercowo-naczyniowych wynikających z obecności utlenionych lipoprotein małej gęstości (LDL) w osoczu.

Preparat farmaceutyczny, według wynalazku korzystnie jest w postaci preparatu doustnego. Wymagane ilości substancji czynnej (HMR) będą się zmieniały w zależności od poszczególnych stanów poddawanych profilaktyce. Zwykła dawka mieści się w zakresie od około 10 do około 100 mg dziennie dla osoby dorosłej.

W produkcie stosowanym, jako dodatek spożywczy, według wynalazku materiałem, który ma być wzbogacany za pomocą HMR może być jadalny, nietoksyczny, stały lub płynny materiał nadający się do domieszania z HMR bez naruszania własności HMR. Rolą tego materiału jest głównie ułatwienie dokładnego dawkowania HMR. Odpowiednim stężeniem jest przykładowo 100 mg do 1 g HMR na 100 g materiału wzbogaconego.

Odpowiednim stężeniem w takim produkcie spożywczym jest przykładowo 1 do 20 mg HMR na 100 g produktu spożywczego.

Dodatek hydroksymatairezinolu jest szczególnie przydatny do zwiększania trwałości produktów spożywczych poprzez inhibowanie utleniania lipidów, witamin i barwników, co prowadzi do strat wartości odżywczych i powoduje powstawanie nieprzyjemnego zapachu i smaku żywności. Odpowiednim stężeniem HMR dla tego zastosowania jest przykładowo około 0,1%.

Dla zastosowań w niniejszym wynalazku HMR można wyodrębniać z frakcji wiórów ponadwymiarowych (zawierającej gałęzie, skrzywienia, węzły) z drewna prasowanego, a następnie HMR można używać w profilaktyce chorób takich jak rak i choroby sercowo-naczyniowe.

PL 199 892 B1

Właściwości HMR badano w siedmiu różnych próbach:

1. Pomiary zdolności przeciwutleniających in vitro;

2. Pomiary zdolności inhibowania aromatazy w komórkach JEG-3;

3. Pomiary działania estrogenowego i przeciwestrogenowego w kulturach komórkowych MCF-7;

4. Oznaczanie działania estrogenowego i przeciwestrogenowego poprzez wzrost macicy w próbie biologicznej;

5. Pomiary działania estrogenowego i przeciwestrogenowego u dorosłych szczurów płci męskiej;

6. Badanie działania przeciwnowotworowego u szczurów na modelu raka gruczołu mlekowego wywołanego przez DMBA;

7. Analiza metabolitów w moczu szczurów po podawaniu im różnych dawek HMR.

Wyodrębnianie i oczyszczanie HMR w ilościach wystarczających do testów biologicznych dotychczas było niemożliwe, gdyż związek ten jest składnikiem lignanów drewna, które pozostawały stosunkowo słabo scharakteryzowane. Dopiero zrozumienie rozkładu HMR w różnych częściach świerka (Ekman 1976 i 1979) umożliwiło rozpoczęcie szczegółowych badań nad lignanami, a zwłaszcza HMR.

Stwierdzono istnienie liniowej zależności pomiędzy dawkami HMR a ilościami enterolaktonu w moczu. Enterolakton jest dobrze znanym lignanem ssaczym wytwarzanym przez bakterie jelitowe z matairezinolu lub przez utlenianie enterodiolu (Axelson i Setchell 1981; Axelson et al. 1982). Jedynie znikome ilości niezmetabolizowanego HMR i innych jego metabolitów (enterodiol i 7-hydroksyenterolakton) znaleziono w moczu. Ich ilości pozostawały niezmienione nawet, gdy zwiększano dzienną dawkę HMR. Takie wyniki sugerują, że HMR jest metabolizowany do enterolaktonu, a następnie enterolakton pochodzący z HMR na drodze etapów demetylacji i dehydroksylacji jest przekształcany w enterodiol. Na podstawie struktury HMR można by oczekiwać , że 7-hydroksyenterolakton będzie głównym metabolitem HMR, lecz nie uzyskano takich wyników. Grupa hydroksylowa jest eliminowana na drodze metabolizmu. Metabolizm HMR różni się od metabolizmu SDG. SDG jest metabolizowany do enterodiolu, który częściowo jest utleniany do enterolaktonu (Rickard et al. 1996; Lampe et al. 1994). A zatem HMR ma do zaoferowania korzyść wobec SDG, gdyż stanowi on bezpośredni prekursor enterolaktonu.

HMR wykazuje bardzo słabe lub żadne działanie estrogenowe w macicach szczurów lub w organizmach szczurów płci męskiej. HMR wykazuje słabe lecz niewiele znaczące działanie typu estrogenowego w komórkach MCF-7. Nie wykazano żadnego działania przeciwestrogenowego dla HMR. Dlatego też zaskoczenie stanowi fakt, że HMR posiada tak wysoce znaczące działanie przeciwnowotworowe u szczurów na modelu guza wywołanego przez DMBA, jak pokazano na Fig. 2. To działanie HMR może być spowodowane przez HMR, jako taki lub przez enterolakton. Jednakże nie stwierdzono żadnej zależności od wysokości dawki przy działaniu chemioprofilaktycznym HMR, gdy był on podawany w dwóch różnych dawkach (3 i 15 mg/kg) szczurom po potraktowaniu ich DMBA. A zatem HMR nie musi być przekształcany w enterolakton, aby posiadał działanie przeciwnowotworowe lub mniejsze dawki tych lignanów są wystarczające do wykazania maksymalnego efektu chemioprofilaktycznego.

Jak wykazano w Tabelach 2 i 3 HMR jest bardzo skutecznym przeciwutleniaczem. Jest on jednym z najsilniejszych znanych inhibitorów nadutleniania lipidów i doskonałym inhibitorem utleniania lipoprotein małej gęstości (LDL). Inhibowanie utleniania LDL jest uważane za szczególnie ważne dla ludzi, gdyż podwyższone stężenie utlenionych LDL w osoczu jest uważane za jeden z lepszych wskaźników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych takich jak arterioskleroza. HMR może służyć jako dodatek spożywczy, w celu zwiększania trwałości pożywienia (poprzez inhibowanie utleniania lipidów, witamin i barwników, które powoduje straty wartości odżywczych i powoduje powstawanie nieprzyjemnego zapachu i smaku żywności), ponieważ HMR okazał się dużo lepszym czynnikiem zmiatającym wolne rodniki w postaci anionu nadtlenkowego i w postaci rodnika peroksylowego, niż dobrze znane przeciwutleniacze takie jak butylowany hydroksyanizol (BHA), czy butylowany hydroksytoluen (BHT), które powszechnie stosuje się do zwiększania trwałości żywności.

PL 199 892 B1

Doświadczenia

Różne lignany poddano testom in vitro na ich własności estrogenowe, przeciwestrogenowe, zdolności inhibowania aromatyzacji oraz ich własności przeciwutleniające. Związki poddawane testom zakupiono z następujących źródeł: enterodiol i enterolakton z Plantech, Londyn, Wielka Brytania, a 7-hydroksyenterolakton zawierający dwa 7-OH enancjomery otrzymano od Dr. Kristiny Wahaka, Department of Applied Chemistry, University of Helsinki, Finlandia.

P r z y k ł a d 1

Ekstrakcja HMR z drewna

Ekstrakty HMR wyodrębniano z norweskiego świerka pospolitego (Picea abies) metodą opisaną w Ekaman 1976 i Ekman 1979. W skrócie, liofilizowane (odparowane ze stanu zamrożenia) gruntowe drewno twardzieli ekstrahowano metodą Sochlet, za pomocą heksanu w celu usunięcia niepolarnych lipofilowych substancji ulegających ekstrakcji. Próbki drewna ponownie ekstrahowano w tym samym aparacie za pomocą acetonu/wody (9:1 w proporcji objętościowej) otrzymując surowe lignany. Hydroksymatairezinol (HMR) i jego izomery wyodrębniono i poddano ponownej chromatografii na żywicy XAD dla dalszego oczyszczenia.

P r z y k ł a d 2

Pomiary działania przeciwutleniającego in vitro

Działanie przeciwutleniające lignanów oznaczano czterema różnymi metodami:

1) próba inhibicji nadutleniania lipidów;

2) próba inhibicji utleniania lipoprotein małej gęstości (LDL);

3) próba zmiatania anionów nadtlenkowych oraz;

4) próba zmiatania rodników peroksylowych.

Inhibicję nadutleniania lipidów oceniano na podstawie ich siły inhibowania nadutleniania lipidów wywoływanego za pomocą tert-butylohydronadtlenku w mikrosomach wątroby szczurzej in vitro ((Ahotupa et al. 1997). Próbę na t-BuOOHLP przeprowadzono w sposób następujący: Bufor (roztwór 50 mM węglanu sodowego, pH 10,2; roztwór 0,1 mM EDTA) nabrano pipetą do objętości 0,8 ml i umieszczono w kuwecie luminometra. Dodano dwadzieścia mikrolitrów rozcieńczonych mikrosomów wątrobowych, o końcowym stężeniu 1,5 mg białka/ml, po czym dodano 6 ml luminolu (0,5 mg/ml) oraz chemikalia tej próby. Do inkubowanych mieszanin dodawano związki chemiczne stosowane w tej próbie w niewielkich ilościach rozcieńczone w etanolu lub w dwumetylosulfotlenku (2% w stosunku do objętości inkubowanej mieszaniny), po czym siłę nadutleniania lipidów porównywano z wynikami uzyskanymi dla nośnika (etanol lub dwumetylosulfotlenek). Reakcję inicjowano za pomocą 0,05 ml roztworu t-BuOOH o stężeniu 0,9 mM w temperaturze 33°C. Chemioluminescencję mierzono przez około 45 minut w 1-minutowych cyklach, po czym wyliczono obszar poniżej krzywej (całka). Pomiary Chemioluminescencji prowadzono stosując urządzenie o nazwie Bio-Orbit 1251 Luminometer (Bio-Orbit, Turku, Finlandia) podłączone do osobistego komputera z oprogramowaniem przeznaczonym specjalnie do tych prób.

Inhibicję utleniania lipoprotein małej gęstości (LDL) oznaczano metodą opisaną w Ahotupa et al. 1996. W skrócie: LDL wyodrębniano przez wytrącanie za pomocą zbuforowanej heparyny. Po ich ponownym zawieszeniu w buforze fosforanowym, dodano 20 mM roztwór CuCl2 i mieszaninę inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Następnie lipidy LDL ekstrahowano za pomocą chloroform/metanol, suszono w atmosferze azotu, ponownie rozpuszczono w cykloheksanie i poddano je analizie spektrofotometrycznie przy długości fali 234 nm. Intensywność absorpcji jest miernikiem utlenienia LDL. W celu zbadania zdolności różnych związków do zapobiegania utlenianiu LDL, związki te dodawano do inkubowanej mieszaniny przed dodaniem do niej roztworu CuCl2. Wykluczono możliwość interferencji badanych związków z procedurą tej próby poprzez dokonanie pomiaru absorpcji przy długości fali 234 nm przed i po okresie inkubacji. Dla tych związków, które wykazały siłę przeciwutleniania już przy początkowym stężeniu (0,1 mM), określono wartości IC-50 (czyli stężenia, przy których badane związki inhibowały utlenianie LDL o 50%).

Metoda badania zmiatania anionów nadtlenkowych była oparta na anionach nadtlenkowych wytwarzanych w warunkach kontrolowanych przez układ ksantyna-oksydaza ksantynowa, oraz na detekcji wytworzonych reaktywnych rodników tlenu za pomocą luminometru (Ahotupa et al. 1997). Oceniano zdolność badanych związków do zmniejszania chemioluminescencji. Wyliczono wartości IC-50 (stężenia, które zapobiegały chemioluminescencji w 50%).

Próba na zmiatanie rodników nadtlenkowych była oparta na wytwarzaniu rodników nadtlenkowych przez termiczny rozkład 2,2'-azobis(2-amidynopropan) HCl i ich detekcji za pomocą chemiolumi8

PL 199 892 B1 nescencji (Ahotupa et al. 1997). Wyniki obliczano jako czynnik stechiometryczny, czyli jak dużo moli rodników nadtlenkowych może zostać zmiecionych przez jeden mol badanego związku.

P r z y k ł a d 3

Pomiary zdolności inhibowania aromatazy w komórkach JEG-3

Działanie HMR i strukturalnie podobnych lignanów (enterolakton, enterodiol oraz 7-hydroksyenterolakton) badano na tworzenie ³H-17e-estradiolu z ³H-androstenodionu w komórkach JEG-3, ludzkiej linii komórkowej nabłoniaka kosmówkowego złośliwego. Komórki nabłoniaka kosmówkowego złośliwego JEG-3 stanowią pożyteczny model aromatazy umożliwiający badania inhibicji aromatazy in vitro (Krekels et al. 1991). Komórki przetrzymywano w DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Inkubowana mieszanina zawierała 50 μΐ ³H-androst-4-eno-3,17-dionu (0,5 nM), 50 μΐ nieznaczonego androstenodionu (0,5 nM), 100 μl związków stosowanych w tej próbie, oraz 800 μl zawiesiny komórek (1 milion komórek). Po 4-godzinnym okresie inkubacji dodano nieznaczone nośniki (androstenodion, testosteron, 17e-estradiol oraz estron). Steroidy te dwukrotnie ekstrahowano za pomocą 3,0 ml dwuchlorometanu. Do wyodrębnienia i oznaczenia ilościowego radioznaczonego ³H-17e-estradiolu użyto HPLC jak to uprzednio opisano (Makela et al. 1995). Stosowany układ kolumn składał się z kolumny zabezpieczającej, za którą znajdowała się kolumna analityczna ID C18 150 x 3,9 mm (Technopak 10 C18 HPLC Technology; Wellington House, Cheshire, UK). Fazę ruchomą stanowił acetonitryl/woda (35/65) a prędkość przepływu wynosiła 1,2 ml/min. Dla dokonania detekcji radioaktywnych metabolitów wewnątrz obiegu, eluent (płyn wymywający) kolumny HPCL mieszano w sposób ciągły z ciekłym środkiem scyntylacyjnym, a następnie monitorowano go wewnątrz obiegu za pomocą detektora radioaktywności.

P r z y k ł a d 4

Pomiary działania estrogenowego i przeciwestrogenowego w kulturach komórkowych MCF-7

Podstawowe kultury linii komórkowych MCF-7 (ludzkie komórki raka piersi) hodowano w środowisku RPMI wolnym od czerwieni fenolowej uzupełnionym przez 5% FCS, 100 U/ml penicyliny oraz 100 μg/ml streptomycy, 10 μg/ml insuliny oraz 1 nM 17e-estradiolu w butelkach na kultury komórkowe T-35. Środowiska zastępowano świeżymi trzy razy tygodniowo. Podstawowe kultury zbierano poprzez trypsynizację, po czym zawieszano w 10 ml roztworu wersenu wolnego od czerwieni fenolowej, i wirowano przez 5 minut przy 800 rpm (800 obrotów na minutę). Tabletkę komórkową ostrożnie ponownie zawieszono w środowisku RPMI uzupełnionym przez 5% dekstranowy węgiel drzewny drobnouwarstwiony FCS (dcFCS) i wysiano na 6 płytek z dołkami po 50 000 komórek (po 3,0 ml środowiska) na każdy dołek. Na drugi dzień prowadzenia kultury wymieniono środowisko i dodano badane związki. W celu zbadania działania estrogenowego związków lignanowych, rozcieńczono je w etanolu i dodano do kultur komórkowych przy końcowym stężeniu równym 1,0 M. W każdej próbie na proliferację stosowano 1,0 nM roztwór 17e-estradiolu w etanolu jako kontrolę pozytywną dla odpowiedzi estrogenowej. Równe ilości etanolu dodano także do dołków kontrolnych. W celu zbadania działania przeciwestrogenowego do kultur komórkowych dodawano zarówno roztwory 17e-estradiolu jak i roztwory lignanów. Komórki hodowano przez 5 do 7 dni w obecności badanych związków, a środowisko wymieniano co drugi dzień. Proliferację komórkową oznaczano ilościowo poprzez zliczanie uwolnionych zarodków za pomocą licznika Coultera.

P r z y k ł a d 5

Oznaczanie działania estrogenowego i przeciwestrogenowego w próbie uterotropowej na niedojrzałych szczurach

Działanie estrogenowe HMR oznaczano w próbie uterotropowej na niedojrzałych szczurach, którą przeprowadzono w sposób uprzednio opisany (Jordan et al. 1977), z wyjątkiem czasu leczenia, który tutaj wynosił 7 dni zamiast 3 dni, jak to opisano w powyższej publikacji. Zastosowano dłuższy czas leczenia, ponieważ spodziewano się słabego działania estrogenowego badanych związków. Jako kontrolę metodologiczną dla macicy nie stymulowanej estregenowo zastosowano traktowanie niedojrzałych szczurów za pomocą inhibitora aromatazy (MPV-2213ad).

P r z y k ł a d 6

Oznaczanie działania estrogenowego i przeciwestrogenowego u dorosłych szczurów płci męskiej

Działanie estrogenowe (przeciwandrogenowe) i przeciwestrogenowe badano na nienaruszonych oraz hipoandrogenicznych szczurach płci męskiej rasy Noble (wiek 6-9 miesięcy), odpowiednio. Przewlekły stan hipoandrogeniczny ze zmianami zarówno strukturalnymi jak i funkcyjnymi w męskim

PL 199 892 B1 układzie rozrodczym wywołano poprzez neonatalną estrogenizację (dietylostilbestrol, 10,0 μg/kg masy ciała w oleju rzepakowym podskórnie w 1-5 dniach tuż po narodzeniu).

Wiadomo, że takie zmiany są częściowo odwracalne na drodze leczenia inhibitorem aromatazy obejmującego dzienną dawkę MPV-2213 do 10-30 mg/kg masy ciała (Streng et al. badania niepublikowane).

Zwierzęta karmiono dietą podstawową pozbawioną soi (SDS, Whitham Essex, Anglia), przy czym miały one wolny dostęp do wody. Dwunastu zarówno nienaruszonym jak i hipoandrogenicznym zwierzętom podawano dożylnie dzienną dawkę 50 mg/kg masy ciała HMR w oleju rzepakowym. Innym dwunastu zwierzętom z obu modeli zwierzęcych podawano dożylnie tylko olej rzepakowy jako leczenie placebo. Po czterotygodniowym leczeniu zwierzęta uśmiercono. Zmierzono masy jąder i pomocniczych gruczołów płciowych (prostata brzuszna, pęcherzyki nasienne, gruczoł kojakulacyjny). Zmierzono poziom osoczowy badanego testosteronu oraz poziomy przysadkowe i osoczowe hormonu lutenizującego (LH) na drodze prób immunologicznych (Haavisto et al. 1993).

P r z y k ł a d 7

Badanie działania przeciwnowotworowego u szczurów na modelu raka gruczołu mlekowego wywołanego przez DMBA

Działanie przeciwnowotworowe HMR badano na raku gruczołu mlekowego u szczurów w sposób uprzednio już opisany (Kangas et al. 1986). Szczurom płci żeńskiej rasy Sprague-Dawley w wieku pięćdziesięciu dni podano dożylnie 12,0 mg DMBA (dwumetylobenz[a]antracen). Po około 6 tygodniach można było wymacać guzy, po czym rozpoczęto pomiary szerokości (w) oraz długości (1) tych guzów raz w tygodniu w celu oznaczenia objętości guzów zgodnie ze wzorem V = (nw²1)/12. Raz w tygodniu szczury również ważono. Szczury podzielono na trzy różne grupy tak, aby całkowita liczba guzów w początkowej fazie doświadczenia była podobna w każdej z tych grup: (1) Grupa kontrolna - 8 zwierząt, (2) Grupa, w której podawano HMR w ilości 3,0 mg/kg masy ciała - 7 zwierząt, oraz (3) Grupa, w której podawano HMR w ilości 15,0 mg/kg masy ciała - 7 zwierząt, przy czym jedno ze zwierząt musiało zostać uśmiercone przed końcem tego doświadczenia.

HMR podawano zwierzętom doustnie począwszy od 9 tygodnia po podaniu DMBA wywołującego nowotwór, czyli w 3 tygodnie po tym, jak pojawiły się namacalne guzy, i podawano go codziennie przez 7,5 tygodnia. Pod koniec tego doświadczenia guzy zaklasyfikowano w grupy zgodnie z ich wzorcem wzrostu:

1. Guzy wzrastające (PD - choroba postępująca);

2. Guzy stabilne, nie wzrastające (SD - choroba stabilna, brak zmian objętości guzów lub regresja w stopniu mniejszym niż 75%;

3. Guzy zmniejszające się (PR - częściowa odpowiedź, zmniejszanie się objętości guzów o więcej niż 75%);

4. Guzy znikające (CR - całkowita odpowiedź, brak guzów wyczuwalnych dotykiem).

P r z y k ł a d 8

Analiza metabolitów w moczu szczurów po podawaniu im różnych dawek HMR

Użyto dziesięciu szczurów płci męskiej rasy Sprague-Dawley (w wieku 4 miesięcy) do badań metabolizmu HMR in vivo. Podczas badań nad metabolizmem szczury przetrzymywano parami przy 12 godzinnych cyklach dzień/noc, miały wolny dostęp do wody i do podstawowej diety nie zawierającej soi (SDS, Whitham Essex, Anglia).

Szczurom podawano dożylnie HMR rozpuszczony w 10% etanolu w PEG w dawkach 3, 15, 25 i 50 mg/kg masy ciała raz dziennie przez dwa dni. Po drugim dożylnym podaniu zbierano mocz dobowy w klatkach metabolicznych w słoikach do zbierania zawierających 120 μl 0,15 M roztworu Na-azydu jako konserwant. Zmierzono objętości odwirowanego moczu i przechowywano go w temperaturze -20°C. Dla wstępnej obróbki do 3,0 ml rozmrożonych działek moczu dodano po 750 μl 0,2 M buforu octanowego (pH 4,0 ± 0,1). Do ekstrakcji moczu użyto kolumn Sep-Pak C18 (po 100 g żywicy na bazie krzemionki/na kolumnę). Kolumny wstępnie kondycjonowano za pomocą 3,0 ml H2O, 3,0 ml metanolu oraz 3,0 ml buforu octanowego. Po przefiltrowaniu moczu przez kolumnę i po przemyciu 3,0 ml buforu octanowego wymyto substancje polifenolowe za pomocą 3,0 ml metanolu. Eluat odparowano do sucha w atmosferze azotu w kąpieli wodnej o temperaturze +45°C, a suche pozostałości ponownie rozpuszczono w 3,0 ml, 0,2 M buforu octanowego. Dodano 30 μl mieszanki enzymowej Helix pomatia i roztwory inkubowano w temperaturze +37°C w celu hydrolizy zarówno glukuronidów jak i siarczanów. Do zhydrolizowanych próbek dodano po 300 μl podstawowego roztworu flawonu (100 μg/ml w EtOH). Próbki ekstrahowano w kolumnach C-18 i odparowano do sucha w wyżej

PL 199 892 B1 opisany sposób, po czym je przechowywano w temperaturze -20°C do momentu ich analizy za pomocą GC-MS.

Odparowane próbki moczu rozpuszczono w pirydynie, i poddano je sililizacji przez dodanie odczynnika sililizującego BSTFA:TMCS (10:1). Przeprowadzono analizę GC-MS sililizowanych próbek stosując urządzenie do analizy GC-MS typu HP 6890-5973. Kolumnę do analizy GC stanowiła kolumna wypełniona HP-1 usieciowanym polisiloksanem metylowym (15 mm x 0,25 mm wewnętrzna średnica; 0,25 grubość cienkiej warstwy). Jako gazu nośnego użyto helu o prędkości przepływu 1 ml/min. Piec do analizy GC miał temperaturę programowaną w zakresie od 60°C do 290°C, przy prędkości ogrzewania 8°C/min. Urządzenie do wstrzykiwania stosowane do analizy GC stanowił zestaw typu dzielącego o proporcji podziału 1:15. Temperatura urządzenia do wstrzykiwania wynosiła 250°C. Związki identyfikowano na podstawie spektroskopii masowej. Wyliczenia ilościowe przeprowadzono na bazie nieskorygowanych obszarów pików dla związków docelowych w stosunku do wewnętrznego standardu.

Wyniki

Oszacowanie działania przeciwutleniającego in vitro

HMR wykazał większą zdolność do inhibowania nadutleniania lipidów niż jakikolwiek inny lignan lub flawonid poddany próbom (tabela 2). HMR został porównany z dobrze znanymi przeciwutleniaczami TROLOX, jakim jest rozpuszczalna w wodzie pochodna witaminy E, oraz BHA i BHT co do ich zdolności inhibowania nadutleniania lipidów, inhibowania utleniania lipoprotein małej gęstości (LDL), oraz zmiatania rodników nadtlenkowych i rodników peroksylowych (tabela 3). HMR okazał się generalnie silniejszym przeciwutleniaczem, bardziej skutecznym niż BHA lub BHT we wszystkich próbach, oraz silniejszym niż TROLOX we wszystkich próbach oprócz próby na inhibowanie nadutleniania lipidów, gdzie związki te były nieomal tak samo aktywne.

Zdolność do inhibowania aromatazy w komórkach JEG-3

Badano inhibicję tworzenia ³H-17e-estradiolu z ³H-androstenodionu w komórkach JEG-3 dla różnych stężeń HMR. Zdolność inhibowania HMR porównywano z enterolaktonem, 7-hydroksyenterolaktonem i enterodiolem. Enterolakton powodował zależną od wysokości dawki inhibicję aromatyzacji w zakresie stężeń od 1,0 do 10,0 μΜ. Później wykazano, że enterodiol nie miał działania inhibującego, co wskazywało na to, że pierścień laktonowy jest niezbędny dla tego typu inhibicji. &-Hydroksyenterolakton oraz hydroksymatairezinol nie dały efektów inhibicji (Fig. 1) wskazując na znaczenie liczby i lokalizacji grup hydroksylowych w cząsteczce lignanu dla inhibowania aromatazy.

Działanie estrogenowe i przeciwestrogenowe w kulturach komórkowych MCF-7

Jak pokazano na Fig. 2, HMR wykazywał bardzo słabe, bez statystycznego znaczenia działanie estrogenowe i przeciwestrogenowe w próbach na proliferację komórek MCF-7.

Ocena działania estrogenowego i przeciwestrogenowego w próbach uterotropowych na niedojrzałych szczurach

Figura 3 ilustruje wpływ HMR na wzrost macicy u niedojrzałych szczurów. HMR nie miał znaczącego wpływu estrogenowego na przyrost masy macicy u niedojrzałych szczurów. HMR nie zmniejszył również przyrostów masy wykazując w ten sposób brak działania przeciwestrogenowego. Jak oczekiwano, inhibitor aromatazy zapobiegł wzrostowi masy macicy, wskazując na to, że metoda pomiaru inhibitorów aromatazy była odpowiednia.

Ocena działania estrogenowego i przeciwestrogenowego u dorosłych szczurów płci męskiej

Po 4 tygodniowym leczeniu za pomocą HMR, nie zaobserwowano żadnych znaczących zmian w masach jąder i pomocniczych gruczołach płciowych w grupach zwierząt kontrolnych i hipoandrogenicznych (tabela 4). Nie zaobserwowano również żadnych znaczących zmian w stężeniach testosteronu i hormonu lutenizującego (LH) (tabela 5). Wyniki takie wskazują, że HMR nie jest w pełni agonistą estrogenu w organizmach męskich, ponieważ nie wykazał on typowego działania estrogenowego na osi podwzgórze - przysadka - gruczoł (inhibowanie sekrecji LH i androgenu). HMR nie jest także przeciwestrogenem, ponieważ nie odwraca on zmian wywołanych przez neonatalną estrogenizację u szczurów płci męskiej.

Badanie działania przeciwnowotworowego na szczurzym modelu raka gruczołu mlekowego wywołanego przez DMBA

Na Fig. 4 przedstawiono liczbę guzów wzrastających (PD), guzów stabilnych (SD), guzów zmniejszających się (PR) oraz guzów zanikających (CR). Stwierdzono, że działanie przeciwnowotworowe HMR jest statystycznie bardzo znaczne. W tym modelu nie stwierdzono jasnej zależności działania przeciwnowotworowego od wielkości dawki. Można zatem połączyć zarówno własności przeciwutlePL 199 892 B1 niające HMR jaki i własności zmniejszające wzrost guzów z jego działaniem przeciwnowotworowym wykazanym in vitro. Jednakże mechanizm działania przeciwnowotworowego HMR in vivo jest nadal nieznany.

Analiza metabolitów z moczu szczurów po podaniu różnych dawek HMR

Figura 5 ilustruje, że głównie wydzielanym metabolitem MHR u szczurów jest enterolakton, który może być właśnie tym biologicznie czynnym związkiem. Jest to zaskakujące biorąc pod uwagę chemiczną strukturę HMR, ponieważ można by oczekiwać, że głównym metabolitem będzie hydroksyenterolakton. Metabolizm HMR do enterolaktonu może być katalizowany raczej przez bakterie jelitowe niż przez wątrobę szczura.

Wnioski

W modelu raka piersi wywołanego przez DMBA hydroksymatairezinol (HMR) ma działanie przeciwnowotworowe zarówno jako związek niezmieniony i/lub po jego przekształceniu do enterolaktonu. HMR ma zatem potencjał do wywierania korzystnego wpływu na ludzi, u których istnieje ryzyko rozwoju raka piersi (BC), raka prostaty (PC), raka okrężnicy lub dobrotliwego rozrostu prostaty (BPH). HMR jest metabolizowany do enterolaktonu, który inhibuje aromatyzację in vitro. HMR jako prekursor inhibitora aromatazy może także zapobiegać rozwojowi symptomów dolnych dróg moczowych (LUTS), niestabilności pęcherza, niedrożności szyi pęcherza, dyssynergia cewkowej, oraz ginekomastii. HMR ma także silne działanie przeciwutleniające i dlatego może być stosowany jako dodatek spożywczy (przeciwutleniacz). HMR jako produkt farmaceutyczny lub dodatek do żywności może mieć także korzystny wpływ sercowo-naczyniowy u ludzi. Możliwe jest do przeprowadzenia dodanie HMR do żywności w celu wyprodukowania innowacyjnego, nowego pożywienia funkcyjnego, żywności odżywczo-leczniczej, zdrowej żywności, żywności farmakologicznej, żywności planowanej lub innej nowej żywności.

Należy rozumieć, że wynalazek może mieć postać różnych przykładów realizacji, z których tylko kilka zostało niniejszym ujawnione. Będzie oczywistym dla specjalisty w tej dziedzinie, że istnieją także inne przykłady wykonania tego wynalazku nie odbiegające od jego istoty. A zatem, opisane przykłady wykonania mają jedynie charakter ilustracyjny i nie powinny być uważane za ograniczające.

T a b e l a 1

Wytwarzanie ssaczych lignanów z różnego pożywienia roślinnego na drodze fermentacji in vitro z użyciem ludzkiej flory fekalnej

	μg/100g
Mączka z siemienia lnianego	68 000
Ziarno soi	170
Otręby zbożowe: pszenica	570
owies	650
Całe ziarno: żyto	160
Ziemniaki	80
Marchew	350
Cebula	110

Thompson et al. Nutrition and Cancer 16: 43-52, 1991

PL 199 892 B1

T a b e l a 2

Własności przeciwutleniające lignanów i niektórych podobnych flawonidów in vitro w próbie na inhibowanie nadutleniania lipidów

Związek	Zdolność do przeciwutleniania (t-BuOOH-LP) IC50 (μΜ)
FLAWONIDY: kaempferol (3,4',5,7-tetrahydroksyflawon)	0,9
kwercetyna (3,3',4', 5,7-pentahydroksyflawon)	0,4
kaempferyd (3,5,7-trihydroksy-4'-metoksyflawon)	0,5
LIGNANY: enterolakton 2,3-bis-(3'-hydroksybenzylo)-butyrolakton	15,9
enterodiol 2,3-bis-(3'-hydroksybenzylo)-butano-1,4-diol	12,7
hydroksymatairezinol	0,08

T a b e l a 3

Porównanie działania przeciwutleniającego HMR i znanych przeciwutleniaczy in vitro. Przedstawiono stężenia IC-50, z wyjątkiem próby na zmiatanie rodników peroksylowych, gdzie przedstawiono współczynnik stechiometryczny (czyli ilość moli rodników peroksylowych, jaką może zmieść jeden mol badanego związku)

	HMR1	TROLOX2	BHA3	BHT4
Inhibowanie nadutleniania lipidów	0,06 μM	0,02 μM	1,1 μM	15,3 μM
Inhibowanie utleniania LDL	2,0 μM	2,7 μM	nie oznaczano
Zmiatanie rodników nadtlenkowych	5,6 μM	2,5 μM	15 μM	>1 μM
Zmiatanie rodników peroksylowych	1:4	1:2	nie oznaczano

¹ hydroksymatairezinol.

² rozpuszczalna w wodzie pochodna witaminy E.

³ butylowany hydroksyanizol (syntetyczny przeciwutleniacz).

⁴ butylowany hydroksytoluen (syntetyczny przeciwutleniacz). Metody oznaczania zostały opisane w tekście.

T a b e l a 4

Wpływ czterotygodniowego podawania HMR na masę względną narządów rozrodczych u szczurów płci męskiej

	Leczenie	n	Masa ciała	jądra	Prostata brzuszna	Pęcherzyki nasienne	Gruczoł kojakulacyjny
Zwierzęta nietknięte			g	mg/kg masy ciała
placebo	12	426±28	4362±170	909±146	412±43	223±49
HMR 50 mg/kg	12	447±38	4223±304	938±148	419±59	204±48
Zwierzęta	placebo	12	481±29	3340±509	333±188	249±63	69±49
hipoandro- geniczne	HMR 50 mg/kg	12	455±36	3276±327	378±198	266±49	70±30

Dane wyrażono jako wartości średnie ± odchylenie standardowe (mg/kg masy ciała). Masy względne po leczeniu za pomocą HMR nie są znacząco różne od wyników uzyskanych dla grup kontrolnych przyjmujących placebo.

PL 199 892 B1

T a b e l a 5

Wpływ czterotygodniowego podawania HMR na stężenia testosteronu i LH u szczurów płci męskiej

	Leczenie	n	Testosteron w jądrach (ng/jądra)	Testosteron w osoczu (ng/ml)	LH w przysadce ^g/przys.)	LH w osoczu (ng/ml)
Zwierzęta	placebo	12	97,6±46,3	2,405±1,122	6,747±2,479	1,804±1,294
nietknięte	HMR 50 mg/kg	12	112,9±58,5	2,770±1,421	6,838±2,061	1,088±0,352
Zwierzęta	placebo	12	63,5±25,9	1,197±0,663	8,673±2,224	0,712±0,371
hipoandro- geniczne	HMR 50 mg/kg	12	48,0±15,2	0,939±0,431	7,530±2,286	0,854±0,333

Dane wyrażono, jako wartości średnie ± odchylenie standardowe. Stężenia hormonów po leczeniu za pomocą HMR nie są znacząco różne od wyników uzyskanych dla grup kontrolnych przyjmujących placebo.

Literatura

Adlercreutz H, Bannwart C, Wahala K, Makela T, Brunow G, Hase T, Arosemena PJ, Kellis JT, Vickery LE: Inhibition of human aromataze by mammalian lignans and isoflavonid phytoestrogens. J Steroid Biochem Mol Biol, 44: 147-153, 1993.

Ahotupa M, Ruutu M, Mantyla E: Simple methods of quantifying oxidation products and antioxidant potential of low density lipoproteins. Clin Biochem, 29: 139-144, 1996.

Ahotupa M, Mantyla E, Kangas L: Antioxidant properties of the triphenylethylene antiestrogen drug toremifene. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, 356: 297-302, 1997.

Axelson M, Setchell KDR: The exretion of lignans in rats - evidence for an intestinal bacterial source for this new group of compounds. FEBS lett, 123: 337-342, 1981.

Axelson M, Sjovall J, Gustafsson BE, Setchell KDR: Origin of lignans in mammals and Identification of a precursor from plants. Nature, 298: 659-660, 1982.

Ayres D, Loike, J. Lignans: Chemical, biological and clinical properties. Cambridge University Press, 1990.

Brzezinski A, Adlercreutz H, Shaoul R, Rosler A, Shmueli A, Tanos V, Schenker JG: Short-term effects of phytoestrogenrich diet on postmenopausal women. Menopause (The Journal of the North American Menopause Society), 4: 89-94, 1997.

Ekman R: Analysis of lignans in Norway spruce by combined gas chromatography-mass spectrometry. Holzforschung, 30: 79-85, 1976.

Ekman R: Distribution of lignans in Norway spruce. Acta Academiae Aboensis, Ser B, 39: 1-6, 1979.

Evans BA, Griffiths K, Morton MS: Inhibition of 5a-reductase in genitak skin fibroblasts and prostatę tissue by dietary lignans and isoflavonoids. J Endocrinol, 147: 295-302, 1995.

Haavisto A-M, Petterson K, Bergendahl M, Perheentupa A, Roser JF, Huhtaniemi IA: Supersensitive immunofluorometric assay for rat luteinizing hormone. Endocrinology, 132: 1687-1691, 1993.

Hulten K, Adlercreutz H, Winkvist A, Lenner P, Hallmans G, Agren A. Low levels of phyto-estrogens in blood as risk factor for breast cancer. In: COST 916 Workshop „Phyto-oestrogens: exposure, bioavailability, health benefits and safety concerns”, 1998.

Ingram D, Sanders K, Kolybaba M, Lopez D. Case-control study of phyto-oestrogens and brest cancer. Lancet, Oct 4; 350(9083): 990-994, 1997.

Jenab M, Thompson LU. The influence of flaxseed and lignans on colon carcinogenesis and beta-glucuronidase activity. Carcinogenesis, Jun; 17(6): 1343-1348, 1996.

Jordan L, Nieminen A-L, Blanco G, Gronroos M, Kallio S, Karjalainen A, Perila M, Sedervall M, Toivola R: A new triphenylethylene compound, Fc-1157a, II Antitumor effects. Cancer Chemother Pharmacol, 17: 109-113, 1996.

Lampe JW, Martini MC, Kurzer MS, Adlercreutz H, Slavin JL: Urinary lignan and isoflavonoid excretion in premenopausal women consuming flaxseed powder. Am J Clin Nutr, 60: 122-8, 1994.

PL 199 892 B1

Landstrom M, Zhang JX, Hallams G, Aman P, Bergh A, Damber JF, Mazur W, Wahala K, Adlercreutz H: Inhibitory effects of soy and rye diets on the development of Dunning R3327 prostateadenocarcinoma in rats. Prostate, Aug 1; 36(3): 151-161, 1998.

Mousavi Y, Adlercreutz H: Enterolactone and estradiol inhibit each other's proliferative effect on MCF-7 breast cancer cells in culture. J Steroid Biochem Mol Biol, 41: 615-619, 1992.

Mattinen J, Sjoholm R, Ekman R. NMR-spectroscopic study of hydroxymatairesinol, the major lignan in Norway spruce (Picea abies) heartwood. ACH models in chemistry, 135(4): 583-590, 1998.

Makela S, Poutanen M, Lehtimaki J, Kostian M-L, Santti R, Vihko R. Estrogen-specific 17e-hydroxysteroid oxidoreductase type 1 (E.C.1.1.1.62) as a possible target for the action of phytoestrogens. P.S.E.B.M., 208: 51-59, 1995.

Phipps WR, Martini MC, Lampę JW, Slavin JL, Kurzer MS. Effect of flax seed ingetsion on the menstrual cycle. J Clin Endocrinol Metab, 77(5): 1215-1219, 1993.

Rickard SE, Orcheson LJ, Seidl MM, Luyengi L, Fong HHS, Thompson LU: Dose-dependent production of mammalian lignans in rats and in vitro from the purified precursor secoisolariciresinol diglycoside in flaxseed. J Nutr, 126: 2012-2019, 1996.

Shultz TD, Bonorden WR, Seaman WR. Effect of short-time flaxseed consumption on lignana and sex hormone metabolism in men. Nutrition Research, 11: 1089-1010, 1991.

Serraino M, Thompson LU: The effect of flaxseed sopplementation on early risk markers for mammary carcinogenesis. Cancer Letters, 60: 135-142, 1991.

Serraino M, Thompson LU: Th eeffect of flaxseed supplementation on the initiation and promotional stages of mammary tumorigenesis. Nutr Cancer, 17: 153-159, 1992.

Setchell KDR, Borriello SP, Gordon H, Lawson AM, Harkness R, Morgan DML. Lignan formation in man - microbial involvement and possible roles in relation to cancer. Lancet, 4: 4-7, 1981.

Streng T, Talo A, Santti R. Unpublished observations.

Thompson LU, Robb P, Serraino M, Cheung F. Mammalian lignan production from yarious foods. Nutr Cancer, 16: 43-52, 1991.

Thompson LU, Seidi MM, Rickard SE, Orcheson LJ, Fong HHS: Antitumorigenic effect of a mammalian lignan precursors from flaxseed. Nutr Cancer, 26: 159-165, 1996a

Thompson LU, Rickard SE, Orcheson LJ, Seidi MM: Flaxseed and its lignan and oil components reduce mammary tumor growth at a late stage of carcinogenesis. Carcinogenesis, 17: 13731376, 1996b.

Tou JCL, Chen J, Thompson LU. Flaxseed and its lignan precursor, secoisolariciresinol diglycoside, affect pregnacy outcome and reproductive development in rats. J Nutr, 128: 1861-1868, 1998.

Wang C, Makela T, Hase T, Adlercreutz H, Kurzer MS: Lignans and flavonids inhibit aromatase enzyme in human adipocytes. J Steroid Biochem Molec Biol, 50: 205-212, 1994.

Waters AP, Knowler JT. Effect of a lignan (HPMF) on RNA synthesis in the rat uterus. J Reprod. Fert, 66: 379-381, 1982.

Zhang J-X, Hallmans G, Landstrom M, Bergh A, Damber J-E, Aman P, Adlercreutz H. Soy and rye diets inhibit the development of Dunning R3327 Prostatic adenocarcinoma in rats. Cancer Letters, 114: 313-314, 1997.

Claims (19)

1. Hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer lub jego stereoizomer do zastosowania w profilaktyce nowotworów, niektórych nienowotworowych chorób hormonozależnych i/lub chorób sercowo-naczyniowych u pacjentów.

2. Hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer według zastrz. 1, do zastosowania w profilaktyce nowotworów u pacjentów, przy czym nowotwory wybiera się z grupy obejmującej rak piersi, rak prostaty i rak okrężnicy.

3. Hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer według zastrz. 1, do zastosowania w profilaktyce niektórych nienowotworowych chorób hormonozależnych u pacjentów, przy czym nienowotworowe choroby hormonozależne wybiera się z grupy obejmującej symptomy dolnych dróg moczowych (LUTS), dyssynergię cewkową, niestabilność pęcherza, niedrożność szyi pęcherza, łagodny przerost prostaty oraz ginekomastię u mężczyzn.

PL 199 892 B1

4. Hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer wedł ug zastrz. 1, do zastosowania w profilaktyce chorób sercowo-naczyniowych u pacjentów, przy czym choroby sercowo-naczyniowe wybiera się z grupy obejmującej choroby wywołane obecnością utlenionych lipoprotein małej gęstości LDL w osoczu.

5. Hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer do zastosowania w sposobie podwyż szania poziomu enterolaktonu lub innego metabolitu hydroksymatairezinolu w osoczu pacjenta w profilaktyce nowotworów lub niektórych nienowotworowych chorób hormonozależnych u pacjentów, przy czym pacjentowi podaje się skuteczną dawkę hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru.

6. Hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer do zastosowania wedł ug zastrz. 5, przy czym nowotwory wybiera się z grupy obejmującej rak piersi, rak prostaty i rak okrężnicy.

7. Hydroksymatairezinol lub jego geometryczny izomer do zastosowania wedł ug zastrz. 5, przy czym nienowotworowe choroby hormonozależne, wybiera się z grupy obejmującej symptomy dolnych dróg moczowych (LUTS), dyssynergię cewkową, niestabilność pęcherza, niedrożność szyi pęcherza, łagodny przerost prostaty oraz ginekomastię u mężczyzn.

8. Preparat farmaceutyczny zawierający substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera skuteczną ilość hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru.

9. Dodatek do produktu spoż ywczego zawierają cy jadalny, nietoksyczny, pł ynny lub stał y materiał wzbogacający, znamienny tym, że materiał wzbogacający zawiera 100 mg do 1 g hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru na 100 g materiału wzbogacającego.

10. Dodatek według zastrz. 9, znamienny tym, że produkt spożywczy wybiera się z grupy obejmującej żywność funkcyjną, dodatek odżywczy, środek odżywczy, żywność farmakologiczną, żywność odżywczo-leczniczą, zdrową żywność, żywność planowaną i inne produkty spożywcze.

11. Dodatek według zastrz. 9, znamienny tym, że produkt spożywczy stanowi żywność funkcyjna w postaci masła, margaryny, ciastek, chleba, ciasta, cukierków, słodyczy, jogurtu lub innych mlecznych produktów fermentowanych, lub płatki zbożowe, między innymi musli.

12. Produkt spożywczy, znamienny tym, że zawiera skuteczną ilość hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru.

13. Produkt według zastrz. 12, znamienny tym, że wybrany jest z grupy obejmującej żywność funkcyjną, dodatek odżywczy, środek odżywczy, żywność farmakologiczną, żywność odżywczo-leczniczą, zdrową żywność, żywność planowaną i inne dowolne produkty spożywcze.

14. Produkt według zastrz. 13, znamienny tym, że stanowi go żywność funkcyjna w postaci masła, margaryny, ciastek, chleba, ciasta, cukierków, słodyczy, jogurtu lub innych mlecznych produktów fermentowanych, lub płatki zbożowe, między innymi musli.

15. Sposób zwiększania trwałości produktów spożywczych, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym dodaje się skuteczną ilość hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że wytwarza się produkt spożywczy o zmniejszonym stopniu utlenienia lipidów, witamin i barwników przyczyniającego się do utraty wartości odżywczych i powstawania nieprzyjemnego zapachu i smaku.

17. Zastosowanie hydroksymatairezinolu lub jego geometrycznego izomeru lub jego stereoizomeru, wzbogacającego stały lub ciekły materiał, jako dodatek do produktów spożywczych.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że produkt spożywczy wybrany jest z grupy obejmującej żywność funkcyjną, dodatki odżywcze, środki odżywcze, żywność farmakologiczną, żywność odżywczo-leczniczą, zdrową żywność, żywność planowaną i inne dowolne produkty spożywcze.

19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że produkt spożywczy stanowi żywność funkcyjna w postaci masła, margaryny, ciastek, chleba, ciasta, cukierków, słodyczy, jogurtu lub innych mlecznych produktów fermentowanych, lub płatki zbożowe, między innymi musli.