FI116727B

FI116727B - Ny användning för kvistnötsextrakt

Info

Publication number: FI116727B
Application number: FI20031642A
Authority: FI
Inventors: Suvi Pietarinen; Bjarne Holmbom; Christer Eckerman; Jarl Hemming; Anna Sundberg; Stefan Willfoer
Original assignee: Arbonova Ab Oy
Priority date: 2003-11-12
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2006-02-15
Also published as: EP1682631A1; DE602004029075D1; ATE480606T1; CA2541768C; CA2541768A1; FI20031642A0; FI20031642A; EP1682631B1; WO2005047423A1; NO20061326L

Description

NY ANVÄNDNING FÖR KVISTNÖTSEXTRAKT OMRÄDE FÖR UPPFINNINGEN

5 Uppfiimingen avser ett forfarande for användning av extrakt av kvistnötsmateri; härur utvunnen fraktion eller enskilt amne som antioxidant. Ytterligare avses m uppfinningen användningen av finfördelat kvistnötsmateri ai som antioxidant.

BAKGRUND TILL UPPFINNINGEN

10

Publikationema och annat material som används i denna ansökan för att illustre bakgrunden tili denna uppfinning, och ett speciellt fall som ger ytterligare infor gällande de praktiska detaljeina, inkluderas som referenser.

15 Kvistar pä träd har sin bas inne i stammen. Denna inre del av en kvist kallas föi eller inre kvist. Kvistnöttema hos Picea abies och Pirtus syhestris innehäller e> höga halter av bioaktiva fenoliska ämnen (1,2). Mängden av extraherbara fenol

: i kvistnötens kämved, kort kvistnötsmaterial, i P. abies kan uppgätili nästan 3C

* * .·[ men är i medeltä! ungefär 15 vikts-% (1). Mängden fenoliska ämnen i kvistnöti * ! ! *. 20 vanligtvis 50-100 gänger högre än i stammens normala ved. I kvistnötsmaterial * · » • ·* ....: sylvestris kan mängden extraherbara fenoliska ämnen vara sk hög som 10 vikts flera gänger högre än i stamveden (2). Kvistnötsmaterial av Salix caprea har oc « · .***. innehälla 2-10 gänger större mängder av fenoliska ämnen än vad som finns i st *** (3). I nyligen gjord forskning vid värt laboratorium har vi tunnit att kvistnötsm; ··· 25 flera olika arter, bäde bland lövträd och bland barrträd, i regel innehäller större • · « · fenoliska ämnen jämfört med stamveden.

2 och som fria aglykoner. Graden av glykosylering päverkar den antioxidativa efl fenoliska änmen. Den antioxidativa effekten av glykosider av kuercetin och my till exempel funnits vara lägre än for deras motsvaiande aglykoner (9)* De hydr ämnena i kvistnötter frän barrträd innehäller främst fria aglykoner av lignaner, 5 oligolignaner, stilbener, och flavonoider (1,2,10). Ett eller ett fätal fenoliska äm dominerar i extrakt frän kvistnötsmaterial frän de fiesta barrträdsarter. Mer än h hydrofila extraktivämnena frän P. abies kvistnötsmaterial är tili exempel lignan resten i huvudsak är oligolignaner; ytterligare bestär lignanema tili 70 % av tvä av hydroximatairesinol (1,10). Hydroximatairesinol, extraherad och renad frän 10 kvistnötsmaterial, har funnits vara en mycket stark antioxidant in vitro (11).

Det är möjligt att separera största delen av kvistnötsmaterialet frän den överstoi massa- och pappersbruk (12). Detta kunde göras för att utnyttja extraktivämnen i kvistnötsmaterialet, och pä samma gäng forbättra massans kvalitet dä kvistnöt 15 har en skadlig inverkan pä massa- och pappersframställning. De fenoliska ämne extraheras (13) och, ifall nödvändigt, renas med kromatografiska metoder.

Vissa fenoliska ämnen har tidigare föreslagits kunna användas som antioxidant* terapeutiska ändamäl eller som tillsats i livsmedel. Som exempel kan lignanen 20 hydroximatairesinol nämnas, vars antioxidativa verkan visas i WO 00/59946. O *· lignaner, sä som matairesinol, har föreslagits som antioxidanter i mediciner och 9 99 9 9 9999 9 9 9 *··’ Oss veterligen har användningen av extrakt av kvistnötsmaterial, eller fraktione extrakt, som antioxidanter inte tidigare föreslagits. Ytterligare har inte användni * · i 25 enskilda lignaner eller andra fenoliska ämnen, eller juvabioner föreslagits som * * * ‘' antioxidanter i tekniska tillämpningar.

9 99 9 9 i« n

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN

9 3 För det andra behandlar denna uppfmning användningen av ett extrakt, erhället extrahera kvistnötsmaterial med ett polärt lösningsmedel och tillvarata extraktel antioxidant.

5 För det tredje behandlar denna uppfinning användningen av en fraktion av ett e] viiket har erhällits genom att extrahera kvistnötsmaterial med ett polärt lösningi tillvarata extraktet, foljt av avlägsnande av ätminstone ett ämne, som en antioxi För det fjärde behandlar denna uppfmning användningen av ett enskilt fenoliski 10 juvabion, som erhällits frän ett extrakt, som i sin tur har erhällits genom att extr kvistnötsmaterial med ett polärt lösningsmedel och tillvarata extraktet, och eftei rening av extraktet, som en teknisk antioxidant för att förhindra oxidativ nedbr) förorsakad av värme, ljus eller syre i elastiska polymerer, plaster, bensin, bio-ol stabilisering av smöijmedel mot oxidation, som antioxidant i lim, förpacknings] 15 mälfärg och dispersioner, samt som biocider, speciellt fungicider, baktericider, insekticider och som skyddsmedel för ved eller i papper för att förhindra eftergi

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN

* * : : 20 Som grund för denna uppfmning stär en undersökning där vi bestämde de antio ...T egenskapema hos 13 väldefinierade hydrofilaextrakt av kvistnötsmaterial eller :.: av extrakten, erhällna frän kommersiellt viktiga trädslag, med tre olika testmetc * * antioxidativa egenskapema av extrakten eller fraktioner av extrakt jämfördes m ·· i • * * * * * antioxidativa egenskapema för rena vedbaserade fenoliska ämnen, befanns extr • * * · * · * 25 fraktioner av extrakt överraskande ha starkare antioxidativa egenskaper än de ei fenoliska ämnena.

«·« «»· • * # m *" En metod för isolerine av fenoliska ämnen eller iuvahioner aenom extraktinn ät 4

Termen ’’kvistnötsmateriaT skall förstäs omfatta ’’kvistnötter”, dvs. inre delen a som finns i stammen samt grenar som sträcker sig utät frän stammen.

5 Industriellt viktiga och tillgängliga källor för kvistnötsmaterial är överstor flis e härav som är rik pä kvistnötsmaterial. Ytterligare kan vissa rester frän förädling mekaniska träprodukter, som är lika pä kvistnötsmaterial, användas. Sädana res inkluderar tili exempel bitar frän fanerindustrin som innehäller kvistnötter och s och ersätts med motsvarande bitar av normal faner innan fanerskivoma limmas 10 den färdiga produkten. Andra exempel är bitar av plankor och skivor som inneh mycket kvistnötsmaterial och därför förkastas av olika skäl i byggnader och konstruktioner, i möbelindustrin och liknande. Ocksä sägspän är ett exempel pä restprodukt.

15 Med den ’’överstora flisfraktionen” avses den fraktion som blir avfall efter sälin flis som används för massatillverkning. Denna överstora flisfraktion, vilken utg 1 tili 5 % av den totala mängden flis, kan inte användas som sädan i massatillverkningsprocessen. Fram tili idag har denna fraktion ätercirkulerats ti flishuggningen eller tagits ut frän processen för forbränning. Denna Överstora fl 20 bestär, förutom av kvistnötsmaterial, ocksä av ’’normal ved”, dvs. ved som kan • » i » « *· " massatillverkningen. Mängden kvistnötsmaterial i den överstora flisfraktionen l • · * ·*** trädslaget och kvaliteten pä veden som används, och uppskattas vara ungeför 1 ( • * « • Λ « * i * .. . Trots att det är möjligt att använda den överstora flisfraktionen som sädan för e: * * · 25 fenoliska änmen eller juvabioner, kan det vara ändamälsenligt att först separera • « (dvs. den överstora flisfraktionen) i en kvistnötsrik fraktion och en kvistnötsfatt a;' och att använda den kvistnötsrika fraktionen för extraktion. Den ’’kvistnötsfattig

t · * · a fraktionen”, dvs. den ’’normala veden” kan äterföras tili massatillverkningen. D

• · ··· . , M . il » * 5 1 Pä grand av den höga koncentrationen av fenoliska ämnen eller juvabioner i kvistnötsmaterial, speciellt i den kvistnötsrika fraktionen av Överstor flis, kan ei altemativ fint mald kvistnötsmaterial användas som sädant som antioxidant.

5 Det ’’polära lösningsmedlet” är antingen ett enskilt polärt ämne eller en blandni eller flera polära ämnen, vars sagda polära ämne eller ämnen har en dielektrisk bestämd vid 25 grader Celsius, som är större än 3. Som exempel pä polära lösni kan nämnas enbart rent vatten, blandningar av vatien och aceton, och blandning och alkohol, säsom vatten och etanoL

10

Extraktionen kan utföras pä torkad ved eller pä färskt vedmaterial.

Trots att extraktionen fysiskaliskt kan integreras med användningen av ved vid av massa eller mekaniska vedprodukter, är det ocksä möjligt att utfora extraktic 15 skild process, eftersom kvistnötsmaterialet, speciellt den kvistnötsrika fraktione överstor flis, lätt kan transporteras och lagras för senare användning.

Mängden fenoliska ämnen eller juvabioner i kvistnötsmaterial varierar kraftigt, pä det önskade fenoliska ämnet och tradslaget som används.

20 • ♦ • 1 4 *· ' I det fall att ytterligare rening krävs, avgörs vilken metod som ska användas pä • 1 1; substans som ska isoleras och den önskade renhetsgraden. Exempel pä användb • i är kromatografi och kristallisation.

* a a • 1 1 25 Exempel pä viktiga trädslag som kunde användas för isolering av kvistnötsextri • a • a abies, Betula pendula, Pinus sylvestris, Abies sibirica, Pinus sibirica, Abies bai . Thuja occidentalis, Pinus cembra, Pseudotsuga menziesii, Larix decidua, Picea # *···, Picea mariana, Piceapungens, Abiespectinata, Abies lasiocarpa, Pinus banksi • a 4 k# b · rtttinnan Inrir Inririrmn TrrrW cihirinn Thuin rilinntn RVimir P/m1//# 6 konidendrin, pinoresinol, dimetylpinoresinol, monometylpinoresinol, oxomataii lariciresinol, monometyllariciresinol, dimetyllariciresinol, liovil, isolariciresinol secoisolariciresinol, picearesinol, konidendrinsyra, hinokiresinol och nortrachel Tertnen "lignaner” är dock inte begränsad till dessa ämnen.

5 ’Oligolignaner” är änmen som innehäller 3 till 6 fenylpropanenheter som är ko beta-beta bindningar istället för vanliga lignaner, som bestär av tvä beta-beta ke fenylpropanenheter. Oligolignaner utgör en viktig grupp av lignaner i extrakt a\ kvistnötsmaterial. Som exempel pä oligolignaner kan följande ämnen nämnas: 10 secoisolariciresiolguaiacylglyceryleter, liovilguaiacylglyceryleter, hydroximatairesinolguaiacylglyceryleter, lariciresinolguaiacylglyceryleter, 5-5-secoisolariciresinol, 5-5-bis-isolariciresinol, 5-5-bis-lariciresinol, lariciresinolki secoisolariciresionolkumarat.

15 Som exempel pä flavonoider, som kan isoleras enligt de metoder som presenter uppfinning, kan följande ämnen nämnas: pinocembrin, dihydrokaempferol, pin< naringenin, katekin, 2,4,6-trihydroxikalkon, aromadendrin och taxifolin.

Som exempel pä stilbener kan följande ämnen nämnas: pinosylvin, pinosylvin 20 monometyleter, dihydropinosylvin, dihydropinosylvin monometyleter, metylpii • * · * / metyldihydropinosylvin och resveratrol.

»<· • · · * • I · • · *

Som exempel pä juvabioner kan följande ämnen nämnas: epijuvabion, dehydroj * * .. , dihydroepijuvabion och epijuvabionsyra, 25 « « • «

Termen "antioxidant” eller ”antioxidativt ämne” skall i denna text förstäs omfai ,;, som har kapacitet att fänga radikaler.

» f·* • » • » • » · 7 1 herbicider, baktericider eller insekticider och som skyddsmedel for ved eller i pi ait förhindra eftergulning. Användningsomrädena är dock inte begränsade till d( nämnts i ovanstäende lista.

5 Det är ocksä möjligt att använda en fraktion av det totala extraktet, som erhällib extraktion av kvistnötter, som antioxidant

Med en sädan fraktion avses, enligt en omfattnmg, det totala extraktet av kvistn frän vilket en eller flera ämnen (dvs. fenoliska ämnen eller juvabioner) har avlä; 10 förutsatt att äterstoden innehäller minst tvä ämnen (dvs. tvä fenoliska ämnen oc juvabioner).

Enligt en annan omfattning, avses med fraktionen en blandning bestäende av m ämnen (fenoliska och/eller juvabioner) som har isolerats frän kvistnötsextraktet 15 fraktion av en sädan isolation är, tili exempel, oligolignaner.

Frakdoneringen av kvistnötsextraktet kan utföras enligt kända metoder. Separat göras, tili exempel, genom utfällning eller med kromatografiska metoder. Flera har samma molmassa eller liknande löslighet i bestämda lösningsmedel kan lätt 20 gruppvis.

« · » • ** * 1 » '‘ 1 1 Användningen av det totala extraktet av kvistnötsmaterial eller en fraktion av e: • · Λ • # « * 1 1. inte tidigare föreslagits som antioxidant. Användningen av sädana blandningar 1 * 1 ;, fördel pä grund av en starkare effekt och för att tidskrävande och arbetskrävand * 1 \. I 25 reningssteg kan undvikas. Sädana blandningar är speciellt värdefulla som antio: * ΐ tekniska applikationer.

* • # · * 1 1! .··. Användningen av vissa lignaner och flavonoider som antioxidanter i mediciner • » 1·1 into1 Λ J a1 La« Χλ1Αι<·1π#**^α A η«τ λ44 Λμ nlrl 1 jJ ^αμαΙΙαΙι^ aIIam «ibvm 8 WO 03/059340). Pä grand av dessa nya uppfinningar är inte tillgängen av enski längre en begränsande faktor för att de ska kunna anvandas i stor skala. Därför uppfinning ocksä pä användningen av ett enskilt fenoliskt ämne eller juvabion, extrakt, som erhällits av extraktion av kvistnötsmaterial med ett polärt lösningsi 5 tillvaratagning av extraktet, och rening av extraktet tili en teknisk antioxidant fi förhindra oxidativ nedbrytning förorsakad av värme, ljus (synligt eller UV ljus) elastiska plaster, plaster, bensin, bio-oljor; för stabilisering av smöqmedel mot som antioxidanter i lim, livsmedel, kosmetika, papper och förpackningsmateria för att förhindra lukt, mälfarg och dispersioner samt som biocider speciellt som 10 pesticider, herbicider, baktericider eller insekticider och som skyddsmedel för \ papper för att förhindra eftergulning.

Denna uppfinning kommer att illustreras i efterföljande icke-begränsande Expe del.

15 EXPERIMENTED DEL Material och metoder

Kemikalier. Taxifolin ((±)-3,3’,4\5,5-pentahydroxifIavanon) erhölls frän Sign :/·: 20 Chemie GMBH. (Steinhem, Tyskland); Trolox (6-hydroxi-2,5,7,8-tetrametylkn a karboxylsyra) och butylerad hydroxianisol (BHA) frän Aldrich Chemical Co. (] !.:.1· WI, USA). Alla andra kemikalier som användes var av högsta tillgängliga kvali a * a i« * i · * VedmateriaL Prov av kvistnötsmaterial insamlades frän fullvuxna träd av elva a ·· a a ***** 25 trädarter: Picea abies (gran, 71 ärsringar vid 1,5 m höjd, prov av flera kvistnött insamlade vid 14,5 m höjd), Betula pendula (värtbjörk, 28 ärsringar, prov av en a·· *;;; frän 4,2 m höjd), och Pinus sylvestris (tali, prov frän flera kvistnötter) frän Ekei j · M’ Finland: Abies sibirica föichtasran. 30 ärsringar. en kvistnöt frän 2.5 m höidt oi 9 höjd (träd 1); 54 ärsringar, 6 kvistoötter frän 20 m höjd (träd 2)), och Larix deci (europeisk lärk, 62 ärsringar, tvä kvistnötter frän 15 m höjd) frän Solböle, Broir Finland; Pinus contorta (contortatall, 22 ärsringar, tvä kvistnötter frän 1,9 m hö Sävar, Sverige. P. sibirica och P. cembra är väsentligen samma trädslag. En tili 5 kvistnötter frän ett träd togs frän samma höjd och blandades sä att ett homogent erhölls, förutom för P. menziesii, där tvä olika träd valdes ut. Alla kvistnötter vi och friska, förutom kvistnöttema frän B. pendula, som innehöll en svart inre del ett skilt prov togs. Kämveden frän kvistnöttema höggs tili stickor som frystorka maldes.

10

Framställning av kvistnötsextrakt. Sekventiell extraktion utfördes med en ”A Solvent Extractor” apparat (Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA) enligt Willför De lipofila extraktivämnena extraherades först med hexan, och därefter extrahei hydrofila extraktivämnena med en blandning av aceton och vatten (95:5 v/v). E 15 förvarades vid -18 °C. Den totala mängden hydrofilt extrakt, bestämd gravimeti uttryckt i % av torr ved, var 20 % för Abies balsamea, 18 % för A. sibirica, 17 * abiesy 10 % (träd 1) och 15 % (träd 2) för Pseudosuga menziesiiy 11 % för Thuj occidentalism 3 % för Pimut contortay 16 % för P. sibirica och 20 % för Larix di 20 Framställning av oligolignaner frän Picea abies. Ett extrakt frän kvistnötsma • i • s a *· ** P. abies fraktionerades enlig metoden beskriven av Willfor m.fl. (10) pä en non i ·* ···· kiselgel kolonn med ”flash”-kromatografi och ’’medium-performance” vätskeki * * *

Som resultat erhölls ett extrakt som innehöll främst oligolignaner med nägra lig ’ den främsta föroreningen. Oligolignanema bestod främst av seskvilignaner och j i * \t\ 25 Oligolignanematorkades och förvarades kalit.

a * * i **« a^ Framställning av en fraktion av Araucaria extrakt. Fraktionen av Araucaria * var äterstoden efter isolering av secoisolariciresinol frän A. angustifolia kvistnö • »

* ΓνΑ^ΙΛΜΑη Air av+wib+at 4Λΐ·1τΑ/ΐΔβ ΛλΚ ItaIU

10 1 acetonextraktet med hexan. Äterstoden, som främst iimehöll stilbener, torkades forvarades kalit.

Framställning av en fraktion av Betula penduia extrakt. Fraktionen av B. pe\ 5 extraktet framställdes frän ett hydrofilt extrakt av den morka inre delen av kvist genom flashkromatografi pä en normal-fas kiselgel kolotin (15 cm x 40 mm inn och som eluent användes diklormetan:etanol. Fraktionen av extraktet torkades o forvarades kalit.

10 Framställning av hydroximatairesinol. Hydroximatairesinol framställdes frän kvistnötsmaterial frän P. abies genom extraktion med aceton i en stor Soxhlet a Hydroximatairesinol isolerades frän det hydrofila extraktet genom flashkromatc normal-fas kiselgel kolonn genom att använda diklormetanietanol som eluent.

15 Framställning av secoisolariciresinoL Secoisolaricitesinol framställdes frän kvistnötsmaterial av A. angustifolia genom extraktion med aceton i en stor Soxl Secoisolariclresinol fraktionerades frän extraktet med flashkromatografi pä en r kiselgel kolonn genom att använda diklormetanietanol som eluent Secoisolaric: renades ytterligare genom äterkristallisation frän utspädd 2-propanol.

20 : *· “ Framställning av nortrachelogenin. Nortrachelogenin framställdes frän kvisti a*· *·.· frän P. sylvestris genom extraktion först med hexan och sedan med aceton i en! aa apparat. Nortrachelogenin isolerades frän det hydrofila extraktet genom flashkri pä en normal-fas kiselgel kolonn genom att använda diklormetanietanol som eli a · * * 25

Ui • « • 4 *** Framställning av lariciresinol. Lariciresinol framställdes frän kvistnötsmateri; c ^ balsamea genom extraktion med aceton i en stor Soxhlet apparat. Lariciresinol !!! fraktionerades frän det hydrofila extraktet genom flashkromatografi pä en norm • ^ a l^-i aaI /vaI ΙτλΙλμη αδιιληιι att AntfSn/ift Hi If Ιλιηματαμ >ava«ia1 ι*/\μλ aIhahI Τ AwA«*An4MAl π 1

Preparerrog av extrakt och ämnen for antioxidativa test och analyser. Extr; ämnen lostes upp i 5-12 mL etanol, vilket gav en koncentxation av 3-26 mg/mL. filtrerades sedan med ett 0,2 pm sprutfilter. Alikvoter pa 300 pL togs for kemisl karakterisering.

5

Analys med gaskromatografi (GC) och GC-mass spektroskopi (MS). Ligna stilbener, flavonoider och juvabioner analyserades pä en 25 m x 0,20 mm (inre ι 0,11 pm HP-1 kapillärkolonn belagd med tvärbunden metylpolysiloxan (Agilen Technologies, Palo Alto, CA, USA). Gaskromatografen var ett Perkin Elmer Ai 10 XL instrument (Perkin Elmer, Boston, MA, USA). Ugnens temperaturprogram - 6 °C/min - 300 °C (10 min); som bärgas användes H2 (20 mL/min); injektione "split injector” (1:20) och temperaturen var 260 °C; som detektor användes FID °C; volymen som injicerades var 1 pL. Etanolen indunstades och extraktivämne silyterades genom tillsats av SO pL bis-(trimetylsilyl)-trifluoracetamid, 20 pL 15 trimetylklorsilan och 20 pL pyridin. Reaktionen fullbordades genom att hälla pi ugn vid 70 °C i en timme. Heneikosansyra och betulinol användes som inre star Metoden som användes är beskriven av Ekman och Holmbom (15). En korrekti pä 1,2 användes för lignanema som beräknades mot betulinol (1). Oligolignanei kvantifierades pä en kort 6 m x 0,53 mm (inre diameter), 0,15 pm HP-1 kolonn 20 kolesterylheptadekanoat och l,3-dipalmitoyl-2-oleylglycerol som inre standard Gaskromatografen var ett Varian 3400 instrument (Varian Inc., Palo Alto, CA, Ugnens temperaturprogram var: 100 °C (1,5 min), 12 °C/min - 340 °C (5 min);

« β I

användes H2 (20 mL/min); injektom var en SPI (Septum equipped Programmab ^ 80 ÖC (0,5 min) - 200 °C/min - 340 °C (18 min); som detektor användes FID vid • * * *\/m' 25 volymen som injicerades var 0,4 pL. Identifikation av de enskilda ämnena gjorc • » *'·* GC-MS analys av de silylerade ämnena med ett HP 6890-5973 GC-quadrupole- . instrument. Som kolonner användes en liknande 25 m HP-1 GC kolonn som be: • * * '!!! ovan och en 15 m x 0,25 mm (inre diameter), 0,1 pm MXT-65TG kolonn (Rest ♦ · ITSA\ viU^Ati rtov pIiiArinn ¢117 ciIvIaio/Ia AliArrAlimiarkAi· /1 (\\ 12 potential att inhibera ^-butylhydroperoxid(/-BuOOH)-inducerad lipidperoxiderii rättlever mikrosomer in vitro (17) och genom att mätä deras kapacitet att fänga: (syreradikal) och peroxylradikaler, uppskattad genom en metodologi som baser; kemiluminiscens (17). Lipidperoxideringen mattes genom luminol-stimulerad 5 kemiluminiscens. De testade ämnena eller extrakten, sattes till inkubationsblanc smä volymer (2 % av inkubationsvolymen), och potentialen att inhibera lipidperoxideringen jämfördes med potentialen hos bäraren (etanol). Prövningei BuOOH-initierade lipidperoxideringen utfÖrdes enligt följande: 0,8 mL av buffi lösningen (50 mM natriumkarbonat, pH 10,2, med 0,1 mM EDTA) pipetterades 10 luminiscensmätarens kyvett 20 pL av de utspädda rittlevermikrosomema (slutl koncentrationen var 1,5 pg protein/mL) tillsattes, foljt av 6 pL luminol (0,5 mg/ testkemikaliema. Reaktionen initierades av 0,05 mL av 0,9 mM f-BuOOH vid 3 Kemiluminicensen mättes under 45 min i 1 minuts cykler. Testen repeterades t\ ganger under skilda dagar. Variationen mellan analysema var < 10 %.

15

Uppskattning av kapaciteten lor infängning av fria radikaler. Kapacitet för fraktioner av extrakten, och de rena ämnena att fanga superoxid- (syreradikal) o peroxylradikaler, uppskattades genom en metodologi som baserar sig pi kemilt (17). Superoxidanjoner producerades genom ett xanthine-xanthine-oxidas syste: 20 följande: 20 pL av xanthineoxidas (420 mU/mL), 0,02 mL av 5 mM lucigenin, \**: 200 mM linolsyra lösta i 50 mM KOH, 0,78 mL av 50 mM kalciumfosfat buffe « ...Γ och testkemikaliema pipetterades i kyvetter. Reaktionen initierades genom en a ^ * L * tillsats av 0.11 mL av 1,45 mM xanthine (slutlig volym 1,0 mL). Kemiluminisc “ ' parallella prov vid 35 °C mättes under 6 minuter i 1 minuts cykler. Peroxylradil ***** ·' 25 genererades genom termisk nedbrytning av 2,2’-azobis(2-amidinopropan)-hydr « « ***** enligt följande. 0,45 mL av 0,1 M natriumfosfat buffer, pH 7,4, innehällande 0,! 0,02 mL av 120 mM linolsyra, 0,05 mL av luminol (0,5 mg/mL) och testämnen 4 ·· 'III i en kyvett. Testet initierades genom tillsats av 0,05 mL ABAP (83 mg/mL).

• * • *

VemilnminicAAneen mätfee ΐ fro KniAffar ιή/1 17 fillcp ^Af ΚΛαΜα -fX*· imi 13 1

Totala mängden hydrofila extrakdvämnen. Den totala mängden av hydrofilt kvistnötsmaterial var avsevärd. Frän de fiesta undersökta trädslagen var mängd extrakt 10-20 % av den torra veden. Mängden var mindre frän kvistnötsmateria contorta, frän vilken endast 3 % erhölls. Det bör noteras att dessa resultat baser 5 endast nägra kvistnötter i ett träd. Det har dock kunnat konstaterats att kvistnöt generellt innehäller exceptionellt höga halter av hydrofila extraktivämnen, trots naturliga variationen mellan olika kvistnötter och olika träd kan vara stor (1-3).

Kemisk sammansättning av de hydrofila extrakten och fraktionerna. Lign< 10 oligolignaner (huvudsakligen seskvilignaner och diiignaner) var de domineranc extrakt av Abies, Picea och Larix och i fiaktionen av Araucaria-exträktet, och i minst hälften av extrakten (Tabell 1). Lignanema dominerade ocksä i ett av de extrakten av Pseudotsuga och i extraktet av Thuja, medan flavonoider eller stil dominerade i de andra extrakten. Stilbener farms endast i extrakt av Pinus.

15 Nägra fä lignaner dominerade i alla extrakt (Tabell 1; Schema 1). Kvistnotsmal Picea abies innehöll främst hydroximatairesinol, ungefar 7 vikt-%, medan kvistnötsmaterial av Abies och Larix innehöll mycket secoisolariciresinol. De r förekommande lignanema i kvistnötsmaterial av Thuja occidentalis var nagot s 20 di de innehöll extra metoxyl- och hydroxylgrupper i sin struktur (18), jämfort i lignanema i de andra extrakten. Oligolignaner var en grupp av ämnen, huvudsa m ··.! bestiende av guaiacylglyceroletrar av de mest förekommande lignanema i extr * « «

*•2·* Abies, Picea, Larix, och Pinus sibirica. Ett exempel pä en oligolignan visas i S

·>··! | Sidana ämnen har nyligen karakteriserats i kvistnötsextrakt av Picea abies och * ·*· • ·' 25 sylvestris (1,2,10). Inga liknade ämnen kunde däremot detekteras i extrakten a\ * *· a 9 * * · Pseudosuga eller Pinus contorta, trots att elueringstiden vid GC-analysen indil . oligomera ämnen farms i extrakten. Oligomerema i extrakten av Thuja kunde h

»M

[Hl identifieras, med dessa var troligen oligolignaner som var derivat av tujalignan • ♦ A Am - - ^ ^ - -

14 V

(Tabell 1; Schema 4). Nägra juvabioner förekom i extrakten av Abies och i ett \ hän Pseudotsuga (Tabell 1; Schema 2). Fraktionen av Araucaria-extraktet inn< en norlignan, hinokiresinol, vilken inte hittades i nigot annat extrakt. Fraktione extraktet av Betula pendula innehöll ämnen harledda frän stilbener. Den exakte 5 för denna ämnesgrupp skall ännu bestammas. Extrakten innehöll inga betydanc av polymera ämnen,

Sammansättning av de isolerade och syntetiserade ämnena. Τνέ partier av 1 hydroximatairesinol, lariciresinol, secoisolariciresinol och nortrachelogenin isc 10 ett parti av matairesinol syntetiserades. Den kemiska sammansättningen av de i eller syntetiserade lignanema, samt det inköpta taxifolinet, bestämdes med gaskromatografi. GC-renheten av ämnena var högre än 95 %, förutom för andr secoisolariciresinol, vilken hade en GC-renhet pä ungeför 92 %. Den huvudsak föroreningen, vilken uppgick till ungefar 4 % av extraktet, var 15 monometylsecoisolariciresinol. Den isolerade hydroximatairesinolen bestod av epimerer, 7S, 8R, 8 tf-hydroximatairesinol (92 %) och 7R, SR, 8 'Ä-allo-hydroxiir (8 %). Strukturen hos dessa epimerer har nyligen entydigt faststallts (19).

Inhlbering av lipidperoxidering in vitro. Extraktens antioxidativa potential b 20 enligt ett altemativ, ρέ deras potential att inhibera r-BuOOH-inducerad lipidpei • ♦ • * · *» ” rättlevermikrosomer in vitro. 11 av de 13 testade kvistnotsextrakten hade en he 9 9 99 • * antioxidativ potential än den syntetiska antioxidanten BHA (IC50 198 pg/L), m * « » **··' extrakten av Thuja och ett av extrakten av Pseudotsuga hade en lägre antioxidi / (Tabell 2). Speciellt hög var den antioxidativa potentialen för kvistnötsextrakt: * * * 25 contorta, men ocksä extrakten frän de Abies och ett av extrakten frän Pse\ i » • · *" vilket hade en potential nästan identisk med potentialen för Trolox (IC50 5,0 pg . isolerade lignanema och taxifolin hade alla en hög antioxidativ potential, närä ] 9 *1»! för Trolox och högre än potentialen för BHA. Den antioxidativa potentialen ho ··* * . P , . ... , , * ..... . Λ 15 1

Den höga antioxidativa potentialen för nägra av kvistnötsextrakten tyder pä att < synergistiska effekter mellan de olika fenoliska ämnena, dä den antioxidativa pc för flera av extrakten var högre an för de ämnen som dominerade i extrakten (Ti Det är dock möjligt att smä mängder av icke-analyserade och oidentifierade am 5 grad bidrog tili den antioxidativa potentialen. KvistnÖtsextrakt frän Pinus conto pinocembrin och pinobanksin, vilka är ämnen av flavanontyp, samt pinosylvinmonometyleter och pinosylvin som huvudämnen (Tabell 1). Ämnen j flavanontyp, sä som taxifolin, samt pinosylvin och närbesläktade ämnen har vis goda inhibitorer av lipidperoxidering in vitro (20-22). Huvudämnen i extrakt 1 i 10 Pseudotsuga menziesii var taxifolin, medan extrakten av Abies inneholl lignane: secoisolariciresinol och lariciresinol, och nägra oligolignaner. Dessa tre extrakt de enda extrakten som innehöll juvabioner. Trots att mängden juvabioner var lit inte uteslutas att dessa ämnen avsevärt bidrog tili den antioxidativa potentialen. intressant att notera den relativa läga antioxidativa potentialen hos stilbener fräi 15 cernbra och extraktet frän P. sibirica (Tabell 2). Detta tyder pä att ämnen av pii inte är effektiva inhibitorer av lipidperoxidering i detta specifika test, trots att di ämnen tidigare har visats vara goda inhibitorer av lipidperoxidering in vitro (23 heller var ämnen av tujalignantyp eller lignanen isolariciresinol, som dominerac av Thuja occidentalis och extrakt 2 av Pseudotsuga menziesii, goda inhibitorer 20 lipidperoxidering i dessa test.

• >

• I B

i ii * * * ♦ * » ···; Infängning av superoxidradikaler in vitro. Kapaciteten för extrakten och de r * * * att fänga superoxidradikaler uppskattades med en metodologi som baserar sig p av kemiluminiscens. Alla extrakt, förutom extrakten av Pinus sibirica och frakt * * * 25 Araucaria-extietetet, var ätminstone tillfredsställande goda som superoxidradik< * *** detta test (Tabell 3). Stilbener frän Pinus cembra (IC50 0,84 pg/L) och oligolign . Picea abies (IC50 0,93 pg/L) var tili och med starkare superoxidradikalfängare i * " ’ * , BHA (IC50 2,7 pg/L) och Trolox (IC50 6,3 pg/L). Av de rena ämnen var taxifoli • ^ 1 A nnrlTQpliΑίΛηαηίη λλVi CAAAicnlatiAirACinAl mar AffiaWii/Q ra/lilralfanrraM äm 16 11 främst bestod av ämnen av typen stilbener och oligolignaner de mest effektiva radikalfangama (Tabell 3). Infängningskapaciteten var dock lägre än väntat för frin Pinus sibirica (IC50171 pg/L), när man beaktar att huvudämnet i extraktet stilbener liknande de stilbener som fanns i Pinus cembra. Den Stora skillnaden i S kapaciteten för lignanema hydroximatairesinol, nortrachelogenin och matairesii överraskande, dä strukturen för dessa ämnen är snarlik (Schema 1).

Infängning av peroxylradikaler in vitro. Kapaciteten av extrakten och de rena fänga peroxylradikaler uppskattades med en metodologi som baserar sig pä mäl 10 kemiluminiscens. Kvistnötsextrakt frän Pinus contorta var en effektiv peroxylradikalfängare (inflngningskapacitet 47 mmol/g) jämfört med Trolox (infängningskapacitet 8,0 mmol/g), medan kapaciteten hos de fiesta andra extra samma storleksordning som för Trolox (Tabell 4). Endast extrakten av Thuja oc och extrakt 2 av Pseudotsuga memiesii hade en läg infängningskapacitet av 15 peroxylradikaler (infängningskapacitet 2,4 mmol/g respektive 1,1 mmol/g). Av ämnena var taxifolin den effektivaste peroxylradikalfängaren (stökiometrisk fa1 mol/mol), men secoisolariciresinol var ocksä en effektiv radikalfängare (stökioi faktor 3,1-4,0 mol/mol). Effekten av de andra lignanema var av samma storleks som för Trolox (stökiometrisk faktor 1,7-2,0 mol/mol).

20 • * • · · ** Den relativa effekten av de olika extrakten i testema för radikalfängning var un

»M

• · *; som den relativa potentialen att inhibera /-BuOOH-inducerad lipidperoxidering • 4 * testema var extraktet frän Pinus contorta det mest effektiva (Tabell 2 och 4). St .. . * Pinus cembra och det stilbenrika extraktet frän Pinus sibirica hade en nägot lag « " * *.. I 25 radikalfängningskapacitet än Trolox (Tabell 4). De pinosylvin-besläktade stilbe • ♦ 4 · resveratrol och pterostilben har rapporterats var mer effektiva peroxylradikalfär Trolox (23).

• 4 4 4 • · 4 · * · 17 1 1 pinosylvin eller flavonoider, dominerade i vaqe extrakt. Extrakten, eller fraktion extrakten, verkar ha en synergistisk effekt dä den antioxidativa potentialen av fl( kvistnötsextrakten eller fraktioner av extrakten var högre jämfört med potentiale dominerande amnet i dessa extrakt eller fraktioner av extrakt.

5

Det skall förstas att metodema som presenterats i denna uppfinning kan integrer processer i varierande former, varav endast ett fatal beskrivits har. Det är uppenl expert, med kunskap inom omrädet, att andra former existerar och inte awiker f uppfinningen. Därfor är utföringsfonnema som beskrivs här illustrativa och bör 10 uppfattas som begränsande.

i a • * · • + a • a a a a * • · · • m a • * • a a a a a • a • · »·« • a • a «•a ··· • • a a a a a a a a a » »»« a 18 u

Schema 1 o ^ ,. 51° Ρ JL I J oh “•'VYr^ d-^0" I j I /° T T 1,0

[ HO'^ hXX T

5 1 HOx

.Me (| η fS I

X Τ'0'”6 Y^o'Me -'°YX

0H OH

S ecoi sol arid res inol Nortrachelogenin Hydroximatairesinol ^'"ΥΥΥί Me"°'XTr^ “'^ΥΎΧ™ 10 HO^X S ΗθΧ^0Χ «AVv* L·0" Χ0^ X^°XJ:

Matairesinol Liovil Isolariciresinol ? p..

Me Dune! 15 OH^w^Y^0"Me ?V o n Λ i ) U A OH X—(Xf y Me “CO" ° “

Lariciresinol ^1° Lignan A

. . 20 Schema 2 X ^ Me

: :*: YYY OH

I I .OH

•:«5 HO^ Xy

Hinokiresinol .Me

”* (norlignan) T

.:. ηο^Λ^οη • jf

«Μ» , I

• · * I

* * >vV

. r n * Me r t λ 19 1 '

Schema 3

OH OH

Λ r\

Pinosylvin Pinosylvinmonometyleter

n ho^^jQ

10 ΙμΓ s-o OH Me

Dihydropinosylvin Dihydropinosylvinmonometyle 15

Schema 4 a W W~

OH O OH O

• 4 · • « * * • * * \.2 Pinocembrin Pinobanksin

OH

fY°" rY°H

HO- ^ ,0- J HO. .O. ,>L J1 20 11

Tabell 1. Huvudsakliga ämnesgrupper och ämnen i de hydroflla kvistnotse^ och i fraktioner av extrakt

Trädslag Sammansättning* Trädslag Sammansät (% av gravimetriskt extrakt) (% av gravimetri!

Abies balsamea Lignaner 33 Pinus contorts Lignaner

Secoisdaridresind 18 Nortrachelogenin

Laridresind 9 Liovil

Oligotignaner 19 Oligomerer

Juvabioner 2 Flavondder

Pinocembrin

Abies sibirica Lignaner 33 Pinobanksin

Secdsdaridresind 21 Stilbener

Laridresinol 7 Pinosylvinmonometylei

Oligotignaner 31 Pinosylvin

Juvabioner 3

Pinus sibirica Lignaner

Picea abies Lignaner 53 Laridresinol

Hydroximatairesind 41 Isdaridresind

Secdsolaridresinol 3 Secoisdaridresind a-konidendrin 3 Oligdignaner

Oligdignaner 12 Flavonoider

Pinocembrin

Pseudotsuga mermesS 1b Lignaner 9 Stilbener

Nortrachelogenin 4 Pinosylvinmonometylei

Laridresind 2 Dihydropinosylvinmonc

Oligomerer 6 Pinosylvin

Flavonoider 42 Dihydropinosylvin

Taxifdin 41

Juvabioner 3 Lube decidua Lignaner

Secoisdaridresind

Pseudotsuga menziesti 2* Lignaner 45 Laridresind

Isdaridiesind 31 Isdaridresind

Secdsdaridresind 9 Oligdignaner

Oligomerer 7 Flavonoider

Flavonoider 1 Taxifdin

Taxifdin 1 Dihydrokaempferd

Thuja ocodentaiis Thujalignaner* 25 Pmus cembra stilbener Pinosylviner

Oligomerer 2 Pinosylvinmonometylei . . Dihydropinosylvinmonc t *. Γ Fraktior av Araucaria extrakt Lignaner 48 * t ’ Dimetylpinoresind 15 Picea abies digdignaner Oligdignaner ·;· Laridresind 15 Lignaner

* * * · Pinoresind 9 Liovil + lignan A

* Monometylpinoresinol 3 *♦!.* Hinoklresind (noriignan) 3

Monomety (laridresind 2 * · Dimetyllaridresind 1

e· I

* * Komponentgrupper och huvudkomponent vars hart Sr 1 % eller mer.

4-.-e b Tvä dika träd c Flera ddentifierade lignaner, trdigen besiäktade med thujapricatin och 40-demetyiyatein + smä mängder av matairesind och lignan A.

• * ·· « * * e *

• · A

* · e e 4#* Φ 21

Tabell 2. Inhibering av lipidperoxidering in vitro, uttryckt som IC50 värdet koncentrationen av extrakt som inhiberar 50 % av lipidperoxideringen) vi kvisfootsextrakt, fraktioner, tvä olika serier av lignaner, taxifolin och refe]

Prov_ICsofrg/L) ICso(pM)

Trolox (referens) 5.0

Pinus contorts 8.1

Abies sibirica 16

Abies baisamea 18

Pseudotsuga menziesii 1 18

Fraktion av Betula penduia extrakt 32

Picea abies 45

Picea abies oligolignaner 52

Larix decidua 57

Fraktion av Araucaria extrakt 97

Pinus cembra stilbener 132

Pinus sibirica 132 BHA (referens) 198

Pseudotsuga menziesii 2 219

Thuja occidentalis 447 _Serie 1"_

Trolox (referens) 5.0 0,02

Secoisolaricireslnol 37 0,10

Taxifolin 46 0,15

Nortrachelogenin 53 0,14

Hydroximatairesinol 58 0,15

Matairesinol 99 0,28

Laridresinol 126 0,38 . e BHA (reference) 198 1,1 » · « 0 «· \u _Serie 2a_ ··; Trolox (referens) 46 0,18

Se:]s Secoisolariciresinol 54 0,15

Laridresinol 63 0,17

Hydroximatairesinol 67 0,18 :*·’· Nortrachelogenin 70 0,19 • * 5 a Tester I olika serier « « t* 4 • 444 • 44 4 4 4 4 • 44 22

Tabell 3. Infängning av superoxidradikaler in vitro, uttryckt som IC50 värd den koncentrationen av extrakt som fangar 50 % av radikalerna), vid tilLsa kvistnotsextrakt, fraktioner, lignaner, taxifoiin och referensämnen.

Prov_ICso (μθ/L) IC50 (nM)

Pinuscembra stilbener 0,84

Picea abies oligolignaner 0,93 BHA (referens) 2,7

Trolox (referens) 6,3

Abies sibirica 15

Pseudotsuga menziesii 2 22

Picea abies 23

Pseudotsuga menziesii 1 31

Thuja occidentalis 33

Fraktion av Betuia pendula extrakt 34

Larix decidua 35

Pinus contorta 51

Abies balsamea 57

Fraktion av Araucaria extrakt 74

Pinus sibirica 171 _Serie 1_

Taxifoiin 0,16 0,51

Nortrachelogenin 0,53 1,4

Secoisolariciresinol 1,8 4,8 BHA (referens) 2,7 15

Trolox (referens) 6,3 25

Lariciresinol 13 35

Matairesinol 14 40 5 Hydroxi matairesinol 81 217 i * ^ • « ♦ e «· a * • ««« • i 99 » e ♦ · · • e e • * i * • * ·* · • 1 « e * • e «*· « * * * * i * » * * «««· ··· • e • a » »* a 23 1

Tabeil 4. Infängning av peroxylradlkaler in vitroy uttryckt som infängningsl (dvs. mmol av peroxylradikalerna som infängats per gram av extrakt) och s stokiometrisk faktor (dvs. mmol av peroxylradlkaler som infängats per mol ämnet), vid tillsats av kvistnötsextrakt, fraktioner, tvä serier av lignaner, ta 5 referensämnen

Prov Infängningskapacitet Stokiometrisk faktor _(mmol/g)_(moi/mol)_

Pinus contorta 47

Abies sibirica 15

Pseudotsuga menziesii 1 12

Abies balsamea 9,6

Fraktion av Betula pendula extrakt 8,2

Trolox (referens) 8,0

Larix decidua 6,4

Fraktion av Araucaria extrakt 5,9

Picea abies 4,8

Pinus cembra stilbener 4,2

Picea abies oligolignaner 4,2

Pinus sibirica 3,2

Thuja occidentafis 2,4

Pseudotsuga menziesii 2 1,1

Serie 1a

Taxifolin 16 4,7

Secoisolariciresinol 8,5 3,1

Trolox (referens) 8,0 2,0

Nortrachelogenin 5,9 2,2

Hydroximatairesinol 5,6 2,1

Matairesinol 2,9 1,0

Lariciresinol 2,7 1,0 m e · · e : _Serie 2a_ \\\ Secoisolarici resinol 11 4,0

Hydroximatairesinol 7,3 2,7

Lariciresinol 7,3 2,6 *..· Trolox (referens) 6,8 1,7 \.. 1 Nortrachelogenin 5,3 2,0

Tester i olika serier a • ·« • »1 1 mew m m « ♦ • · v a 24 1

REFERENSER

(1) Willfijr, S.; Hemming, J.; Reunanen, M.; Eckerman, C.; Holmbom, I and lipophilic extractives in Norway spruce knots and stemwood. Holzforschung 2003,57,27-36.

5 (2) Willfor, S.; Hemming, J.; Reunanen, M.; Holmbom, B. Phenolic and extractives in Scots pine knots and stemwood. Holzforschung 2003, 372.

(3) Pohjamo, S.P.; Hemming, J.E., Willfor, S.M.; Reunanen, M.H.T.; H B.R. Phenolic extractives in Salix caprea wood and knots. Phytochei 10 2003, 63,165-169.

(4) Kähkönen, M.P.; Hopia, A.I.; Vuorela, H.J.; Rauha, J.-P.; Pihlaja, K T.S.; Heinonen, M. Antioxidant activity of plant extracts containing compounds. J. Agric. Food Chem. 1999,47, 3954-3962.

(5) Chang, S.-T.; Wu, J.-H.; Wang, S.-Y.; Kang, P.-L.; Yang, N.-S.; Sh) 15 Antioxidant activity of extracts from Acacia confusa bark and heartv

Agric. Food Chem. 2001,49,3420-3424.

(6) Shimizu, K; Kondo, R.; Sakai, K. Antioxidant activity of heartwooc Papua New Guinea woods. J. WoodSci. 2002,48,446-450.

(7) Arima, Y.; Hatanaka, A.; Fujimoto, K.; Fukuda, K; Sakurai, H. Sea1 20 activity of α-, β- and y-thuijaplicin against active oxygen species. C)

Pharm. Bull 1997,45,1881-1886.

(8) Kai, Y. Chemistry of extractives. In Wood and Cellulosic Chemistry edition; Hon, D.N.-S., Shiraishi, N, Eds.; Marcel Dekker: New York 1990; pp. 215-255.

25 (9) Hopia, A.I.; Heinonen, M. Antioxidant activity of flavonol aglycone • j*· glycosides in methyl linoleate. J. Am. Oil Chem. Soc. 1999, 76,139- ···

’!' *i (10) Willfor, S.; Reunanen, M.; Eklund, P.; Sjöholm, R.; Kronberg, L.; F

Pohjamo, S.; Holmbom, B. Oligolignans in Norway spruce and Scot *..; knots and Norway spruce stemwood. Submitted to Holzforschung.

I « * ♦

30 (11) Saarinen, N.M.; Warn, A.; Mäkelä, S.I.; Eckerman, C.; Reunanen, I

Ahotupa, M.; Salmi, S.M.; Franke, A.A.; Kangas, L.; Santti, R. Hydroxymatairesinol, a novel enterolactone precursor with antitumo from coniferous tree (Picea abies). Nutr. Cancer 2000,36,207-216.

#44 25 1 1 (14) Eklund, P.; Lindholm, A.; Mikkola, J.-P.; Smeds, A.; Lehtilä, R.; Sjö Synthesis of (-)-matairesinol, (-)-enterolactone, and (-)-enterodiol fr< natural lignan hydroxymatairesinol. Org. Lett. 2003,5,491-493.

(15) Ekman, R.; Hohnbom, B. Analysis by gas chromatography of the wo 5 extractives in pulp and water samples from mechanical pulping of sp

Pulp Pap. Res. J 1989,4,16-24.

(16) Örsä, F; Holmbom, B. A convenient method for the determination of extractives in papermaking process waters and effluents. J Pulp Pap 20, J361-J366.

10 (17) Ahotupa, M.; Mäntylä, E.; Kangas, L. Antioxidant properties of the triphenylethylene antiestrogen drug toremifene. Naunyn-Schmiederbi Pharmacol., 1997,356,297-302.

(18) Kawai, S.; Sugishita, K.; Ohashi, H. Identification of Thuja occidenh and its biosynthetic relationship. Phytochemistry 1999,57,243-247.

15 (19) Eklund, P.C.; Sillanpää, R.; Sjöholm, R.E. Synthetic transformation ( hydroxymatairesinol from Norway spruce (Picea abies) to 7-hydroxysecoisolariciresinol, (+)-lariciresinol and (+)-cyclolariciresin Chem. Soc., Perkin Trans. /2002,16,1906-1910.

(20) Kolhir, V.K.; Bykov, V.A.; Baginskaja, A.I.; Sokolov, S.Y.; Glazova

20 Leskova, T.E.; Sakovich, G.S.; Tjukavkina, N.A.; Kolesnik, Yu.A.; I

I. A. Antioxidant activity of a dihydroquercetin isolated from Larix gi (Rupr.) Rupr. wood. Phytother. Res., 1996,10,478-482.

(21) Saarinen, N.; Joshi, S.C.; Ahotupa, M.; Li, X.; Ämmälä, J.; Mäkelä,! R. No evidence for the in vivo activity of aromatase-inhibiting flavor , , 25 SteroidBiochem. Mol Biol, 2001, 75, 231-239.

• a » .:. (22) Stojanovic, S.; Sprinz, H.; Brede, O.; Efficiency and mechanism of tl •••j antioxidant action of ira/w-resveratrol and its analogues in the radica ί.!,! oxidation. Arch. Biochem. Biophys., 2001,391,79-89.

• • ' (23) Rimando, A.M.; Cuedent,M.; Desmarchelier, C.; Mehta, R.G.; Pezzu :1·1: 30 Duke, S.O. Cancer chemopreventive and antioxidant activities of ptei *··· a naturally occurring analogue of resveratrol. J. Agric. Food Chem. 2 3453-3457.

m » «»·· • 1 » • 1 * ·

Claims

26 Ί -
1. Användning av (i) finfordelat kvistnÖtsmaterial, eller 5 (ii) ett extrakt, som erhällits genom extraktion av kvistnÖtsmaterial med ett poli lösningsmedel, samt tillvaratagande av extraktet, som en antioxidant.
2. Användningen enligt patentkravet 1 väri kvistnötsmaterialet är (i) en översto 10 flisfraktion, erhällen genom sällning av vedflis, eller (ii) en kvistnöts-rik under: sagda Överstora flisfraktion, eller (iii) kvistnÖtsmaterial, erhället som rest frän t av mekaniska träprodukter.
3. Användningen enligt patentkravet 1 eller 2, väri kvistnötsmaterialet härstami 15 nägot av följande trädslag: Picea abies, Betula pendula, Pinus sylvestris, Abies Pinus sibirica, Abies balsamea, Thuja occidentalis, Pinus cembra, Pseudotsugt Larix decidua, Picea glauca, Picea mariana, Picea pungens, Abies pectinata, /. lasiocarpa, Pinus banksiana, Pinus resinosa, Larix lariciana, Larix sibirica, Tl Fagus sylvatica, Populus tremula, Populus tremulus, Tsuga heterophylla eller i : 20 contorta.. • ♦♦ • · ·*·
4. Användningen enligt nägot av patentkraven 1-3, väri antioxidanten används: • *· •: · · * teknisk antioxidant for att förhindra oxidativ nedbrytning förorsakad av värme, syre i elastiska plaster, plaster, bensin, biooljor; for stabilisering av smöijmedel 25 oxidation, som antioxidanter i lim, livsmedel, kosmetika, papper och förpacknii speciellt for att förhindra lukt, i mälfarg och dispersioner, samt i biocider, speci • · * fungicider, pesticider, herbicider, baktericider eller insekticider eller som skydd * * :: ved eller i papper för att förhindra eftergulning. 27 11
6. Användningen enligt patentkravet 5 väri tvä eller flera änrnen har avlägsnats kvistnötsextraktet.
7. Användningen enligt patentkravet 6 väri 5 (i) den avlägsnade blandningen, innehällande tvä eller flera ämnen, eller (ii) äterstoden av kvistnötsextraktet används som antioxidant.
8. Användningen enligt patentkravet 7 väri den isolerade blandningen främst in 10 oligolignaner.
9. Användningen enligt nägot av patentkraven 5-8 väri antioxidanten används teknisk antioxidant för att förhindra oxidativ nedbiytning förorsakad av värme, syre i elastiska plaster, plaster, bensin, bio-oljor; för stabilisering av smöijmede 15 oxidation, som antioxidanter i lim, livsmedel, kosmetika, papper och förpacknii speciellt för att förhindra lukt, i malfärg och dispersioner, samt i biocider, speci fungicider, pesticider, herbicider, baktericider eller insekticider eller som skydd ved eller i papper för att förhindra eftergulning. • * • · * • * * • ♦ »·· • • 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 • 9 99 9 9 9 9 • 9 • 9 9 99 9 9 9 9 • 99 9 9 9 9 9 9 9 9 •99 9 •99 • 9 • 9 9 99 28 Ί 1. (i) Hienoksi jaetun oksapuumateriaalin, tai (ii) uutteen Joka on saatu oksapuumateriaalia uuttamalla polaarisella liuottimel 5 talteenotolla, käyttö antioksidanttina.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, jossa oksapuumateriaali on (i) jae yl hakkeita, joka on saatu puuhakkeiden lajittelussa, tai (ii) mainitun ylisuuria hak 10 käsittävän jakeen alafraktio, tai (iii) oksapuumateriaalia, joka on saatu mekaani puutuotteiden valmistuksen jäännöksenä.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen käyttö, jossa oksapuumateriaaii on lähi jostakin seuraavista puulajeista: Picea abies, Betula pendula, Pinus sylvestris, / 15 sibirica, Pinus sibirica, Abies balsamea, Thuja occidentalis, Pinus cembra, Pse menziesii, Larix decidua, Picea glauca, Picea mariana, Picea pungens, Abies p Abies lasiocarpa, Pinus banksiana, Pinus resinosa, Larix lariciana, Larix sibin plicata, Fagus sylvatica, Populus tremula, Populus tremulus, Tsuga heterophyl contorta. 20 . 1. J 4, Jonkin patenttivaatimuksista 1 -3 mukainen käyttö, jossa antioksidanttia käyt< * · v teknisenä antioksidanttina lämmön, valon tai hapen aiheuttaman oksidatiivisen »III : estämiseksi elastisissa muoveissa, muoveissa, bensiinissä, bioöljyissä; voiteluai »M ·:··: stabiloimiseksi hapettumista vastaan, antioksidantteina liimoissa, elintarvikkeis j 1 · |; 25 kosmeettisissa tuotteissa, paperissa ja pakkausmateriaaleissa, erityisesti hajun e • # · maaleissa, dispersioissa, sekä biosiideissä, erityisesti fungisiideissä, herbisiideis bakterisiideissä tai insekitisiideissa tai suoja-aineena puussa tai paperissa • · · jälkikellastumisen estämiseksi. m • · i · 29 ^ 1
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö Jolloin kaksi tai useampia aineita oi oksapuu-uutteesta.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen käyttö Jossa 5 (i) poistettua seosta, johon sisältyy kaksi tai useampia aineita, tai (ii) oksapuu-uutteen jäännöstä käytetään antioksidanttina.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö, jossa talteenotettu seos sisältää eriri 10 oligolignaaneja.
9. Jonkin patenttivaatimuksista 5-8 mukainen käyttö Jossa antioksidanttia käyt teknisenä antioksidanttina lämmön, valon tai hapen aiheuttaman oksidatiivisen estämiseksi elastisissa muoveissa, muoveissa, bensiinissä, bioöljyissä; voitelua 15 stabiloimiseksi hapettumista vastaan, antioksidantteina liimoissa, elintarvikkei; kosmeettisissa tuotteissa, paperissa ja pakkausmateriaaleissa, erityisesti hajun < maaleissa, dispersioissa, sekä biosiideissä, erityisesti fungisiideissä, herbisiidei bakterisiideissä tai insekitisiideissä tai suoja-aineena puussa tai paperissa jälkikellastumisen estämiseksi. 20 • ♦ • · ♦ • M ft ft • M» ft «•«ft ♦ • ft ft ft ft ft • •ft • ft · M ft • · ft ft · • ft ft ·· ft ft ft ft • ftft ft ft ft ft ft ft ft ft • •ft ft 1 •ft ft ft ft ft