NO332110B1

NO332110B1 - Hydroksymatairesinol for forebygging av ikke-kreft, ostrogenavhengig sykdom

Info

Publication number: NO332110B1
Application number: NO20101701A
Authority: NO
Inventors: Christer Eckerman; Risto Santti; Markku Ahotupa; Lauri Kangas; Sari Makela; Niina Saarinen; Anni Warri
Original assignee: Hormos Medical Oy
Priority date: 1999-03-30
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2012-06-25
Also published as: CZ301725B6; HUP0200530A2; CN1345315A; NO331188B1; MXPA01009714A; EE200100507A; BG105856A; KR20070027770A; RU2241453C2; CA2650297C; KR100741724B1; PL199892B1; ZA200104440B; ES2189738T3; AU3169200A; KR20010108434A; HK1045992A1; CA2371839C; SK287749B6; NO20014639D0

Abstract

Denne oppfinnelse angår fremgangsmåter for forebygging av kreftsykdommer, visse hormomavhengige ikkekreft-sykdommer og/eller kardiovaskulære sykdommer hos en person, basert på administrering av hydroksymatairesinol til personen. Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for øking av nivået av enterolakton eller en annen metabolitt av hydroksymatairesinol i en persons serum, hvorved det forårsakes forebygging av kreft eller en viss hormonavhengig ikkekreft-sykdom hos en person, basert på administrering av hydroksymatairesinol til personen. Denne oppfinnelse angår dessuten farmasøytiske preparater, matvaretilsetningsstoffer og matvareprodukter omfattende hydroksymatairesinol.

Description

Denne oppfinnelse angår hydroksymatairesinol eller en geometrisk isomer eller en stereoisomer derav for anvendelse for forebygging av ikke-kreft, østrogen-avhengig sykdom.

Lignaner er definert som en klasse fenolforbindelser som har et 2,3-dibenzylbutan-skjelett. De er dannet ved kopling av monomere enheter kalt forløpere så som kanelsyre, koffein-, ferulin-, kumarin- og gallussyre (Ayres og Loike, 1990). Lignaner er alminnelig utbredt i planter. De kan finnes i forskjellige deler (røtter, blader, stengler, frø, frukter), men hovedsakelig i små mengder. I mange kilder (frø, frukter) finnes lignaner som glykosid-konjugater forbudnet med plante-fiberkomponenter. De mest alminnelige kostkilder for pattedyr-lignanforløpere er uraffinerte kornprodukter. De høyeste konsentrasjoner i spiselige planter er blitt funnet i linfrø, fulgt av uraffinerte kornprodukter, spesielt rug. Pattedyrlignan-fremstilling fra forskjellige plantematvarer er oppført i tabell 1.

Det finnes også betydelige mengder lignaner i bartrær. Lignantypene er forskjellige i forskjellige arter, og mengdene av lignaner varierer i forskjellige deler av trærne. De typiske lignaner i kjerneved i gran (Picea abies) er hydroksymatairesinol (HMR), a-conidendrin, conidendrinsyre, matairesinol, isolariciresinol, secoisolariciresinol, liovil, picearesinol, lariciresinol og pinoresinol (Ekman 1979). Den langt mest rikelige enkeltkomponent i lignaner i gran er HMR, ca. 60% av den totale mengde lignaner, som hovedsakelig finnes i ukonjugert fri form. Lignankonsentrasjonen i tykke røtter er 2-3%. Rikelige mengder av lignaner finnes i kjerneveden i grener (5-10%) og smågrener og spesielt i kvistene («knots»), hvor mengden av lignaner kan være større enn 10% (Ekman, 1976 og 1979). Disse konsentrasjoner er omtrent hundre ganger større enn i malt linpulver, som er kjent som et lignanrikt materiale.

Hydroksymatairesinols kjemiske struktur er

Lignaner kan isoleres f.eks. fra tennarfiber. Disse fibrer, som stammer fra tennarved i stammer og kvister (grovflisfraksjon), gjør kvaliteten av papir dårligere (Ekman, 1976).

Plantelignaner så som matairesinol og secoisolariciresinol omdannes av tarmens mikroflora til tilsvarende pattedyrlignaner, enterolakton og enterodiol (Axelson et al. 1982). De gjennomgår en enterohepatisk sirkulasjon og utskilles i urinen som glukuronidkonjugater (Axelson og Setchell, 1981). Som et eksperimentelt bevis på de kjemopreventive virkninger av lignaner, forhindret supplering av en diett med høyt fettinnhold, med lignanrikt linfrømel (5% eller 10%) eller linfrølignaner (secoisolariciresinol-diglykosid, SDG) utviklingen av anti-østrogenfølsom DMBA-indusert brystkreft hos rotte (Serraino og Thompson 1991 og 1992; Thompson et al. 1996a og 1996b). De reduserte epitelcelle-proliferasjonen, kjerne-avvik, vekst av tumorer og utvikling av nye tumorer. Høyt lignaninntak kan også beskytte mot eksperimentell prostata- og tykktarmskreft. Daglig inntak av rug (inneholdende lignaner) forhindret i tidlige trinn veksten av transplanterte prostata-adenokarsinomer av typen Dunning R3327 i rotter (Zhang et al. 1997; Landstrom et al. 1998). Prosentandelen av dyr som bar palperbare tumorer, samt tumorvolumet og veksthastigheten, var betydelig lavere. Videre inhiberte linfrø- eller SDG-supplering dannelsen av kjemisk induserte avvikende krypter i rotte-tykktarm (Serraino og Thompson 1992; Jenab og Thompson 1996). Antitumor-virkningen kan derfor skyldes svake østrogen-antiøstrogen-liknende egenskaper og/eller andre mekanismer, som ikke er godt kjente.

Urinutskillelse og serumkonsentrasjoner av enterolakton er lav hos kvinner som har fått diagnosen brystkreft (Ingram et al. 1997; Hultén et al. 1998), noe som tyder på at lignaner er kjemopreventive. Det er blitt fremsatt en hypotese om at pattedyr-lignaner (enterolakton og enterodiol) modulerer hormontilknyttede krefttyper, så som brystkreft, på grunn av deres strukturelle likheter med østrogenene. Enterolakton hadde svak østrogen potens i MCF-7-celler (Mousavi og Adlercreutz 1992, men hadde ingen østrogen respons når det gjaldt muse-uterusvekt (Setchell et al. 1981). Som et tegn på østrogenliknende aktivitet økte SDG-tilføring under graviditet og diegivning hos rotter livmorvekten ved avvenning, men virkningen var ikke tydelig på senere stadier (Tou et al. 1998). Eventuelle antitumorvirkninger er også blitt forbundet med deres anti-østrogene virkninger (Waters og Knowler, 1982). Inhibering av aromatase ved pattedyrlignan, enterolakton, vil tyde på en mekanisme ved hvilken fortæring av lignanrik planteføde kan bidra til reduksjon av østrogenavhengige sykdommer, så som brystkreft (Adlercreutz et al. 1993, Wang et al. 1994). Lignaners potensielle antioksidant-aktivitet kan også representere en mekanisme som er forbundet med den preventive virkning av lignaner ved utvikling av kreft. Dessuten har pattedyr-lignaner vist seg å inhibere omdannelsen av testosteron til 5a-dihydrotestosteron (DHT), det potente intracellulære androgen, i de konsentrasjoner som er oppnåelige hos mennesker (Evans et al. 1995). Reduksjon i DHT-konsentrasjonen vil modifisere risikoen for prostatakreft (PC) og benign prostatahyperplasi (BPH).

Det er mulig at lignaner som forløpere for enterolakton også kan mildne symptomer i de nedre urinveier (LUTS) og gynekomasti. På basis av resultatene oppnådd i dyremodellen har vi antydet at østrogener spiller en vesentlig rolle ved utviklingen av den muskel-dysfunksjon som inngår ved uretra-dyssynergi som sees som blærehals-dyssynergi eller pseudo-dyssynergi hos ytre sfinktere (Streng et al. upubliserte observasjoner). Slike neuromuskulære forandringer blir i det minste delvis reversert av en atomatase-inhibitor (MPV-2213ad), noe som tyder på østrogeners rolle. Dessuten gynekomasti, som induseres ved eksponering for østrogener eller i nærvær av økt forhold mellom østrogen og androgener. Gynekomasti kan behandles med hell med en aromataseinhibitor. Lignaners evne til å inhibere 5a-reduktase og/eller aromatase kombinert med deres potensielle antioksidant-aktivitet kan representere mekanismer forbundet med den preventive virkning av lignaner ved utviklingen av hormontilknyttede sykdommer i mannlig organisme.

Det er ikke tilgjengelig noen data med hensyn til de mulige virkninger av lignaner hos mennesker. Någjeldende teorier om lignanvirkning hos mennesker stammer fra undersøkelser med henblikk på virkningene av kost supplert med linfrøprodukter (og følgelig lignaner). Linfrø i kosten for kvinner forårsaket forandringer i menstruasjonssyklusen (Phipps et al. 1993). Individene, som alle var kvinner med normal syklus, viste en lengre middel-lengde av den luteale fase og høyere progesteron/17p-østrdiol-forhold i serum under den luteale fase når de tok 10 g linfrøpulver pr. dag i tillegg til sin vanlige kost (Phipps et al. 1993). Det ble ikke funnet noen betydelige forskjeller mellom lin- og kontrollsykluser eller konsentrasjoner av verken østron eller 17|3-østradiol. Det var heller ikke noen betydelige forskjeller mellom lin- og kontrollgruppene med hensyn til konsentrasjoner av serum-østrogener hos kvinner etter menupause (Brzezinski et al. 1997). Linfrø-supplering økte SHBG- (protein som binder østradiol med høy styrke) konsentrasjonen i serum. Dette er en typisk østrogenvirkning i levervevet. Øket SHBG-konsentrasjon reduserer på den annen side biotilgjengeligheten av endogene østrogener. Hos friske unge menn hadde den kortvarige (6 uker) linfrøsupplering i kosten (10 g/d i muffins) ingen betydelig virkning på plasma-testosteronkonsentrasjonene (Shultz et al. 1991), noe som tyder på en mangel av østrogenitet i den mannlige organisme. Totalt viser disse undersøkelser at lignaner kan ha svake hormonelle (østrogene og antiøstrogene) virkninger, men deres virkningsmekanisme kan ikke beskrives fullstendig ved de hormonelle virkninger.

Det kan konkluderes med at isolerte pattedyr-lignaner tidligere ikke har vært tilgjengelige i tilstrekkelige mengder til at de har kunnet anvendes i dyreforsøk eller kliniske forsøk, og den eneste mulighet til å øke lignaninntaket har vært å øke inntaket av fiberrike matvarer så som linfrø. HMR eller et hvert annet lignan som effektivt omdannes til enterolakton og kan dannes/isoleres i store mengder, vil være verdifulle ved utviklingen av farmasøytiske preparater og matvareprodukter så som funksjonelle matvarer for kjemisk forebygging av kreft og andre hormontilknyttede sykdommer.

Denne oppfinnelse angår hydroksymatairesinol eller en geometrisk isomer eller en stereoisomer derav for anvendelse for forebygging av ikke-kreft, østrogen-avhengig sykdom, idet sykdommen er valgt fra gruppen bestående av nedre urinveissymptomer, uretra-dyssynergi, benign blæreustabilitet, blæreutløpstilstopping, benign prostata-hyperplasi og gynekomasti hos menn.

Det vises nå til tegningene.

Fig. 1 viser den konsentrasjonstilknyttede inhibering av aromatase ved lignaner i JEG-3-celler. Fig. 2 viser proliferasjonen av MCF-7-celler i nærvær og fravær av HMR. Fig. 3 viser våtvekten av livmor fra ikke fullt utviklede rotter behandlet med HMR eller med en aromataseinhibitor. Fig. 4 viser antitumor-aktiviteten av HMR overfor DMBA-induserte brystkjerteltumorer hos hunnrotter. Fig. 5 viser utskillelsen av enterolakton i urinen hos rotter behandlet med forskjellige doser av HMR.

Denne oppfinnelse angår følgelig et lignan, hydroksymatairesinol (HMR), eller en geometrisk isomer eller en stereoisomer derav for anvendelse for

forebygging av ikke-kreft, østrogen-avhengig sykdom, idet sykdommen er valgt fra gruppen bestående av nedre urinveissymptomer, uretra-dyssynergi, benign blære-ustabilitet, blæreutløpstilstopping, benign prostata-hyperplasi og gynekomasti hos menn.

Overraskende nok metaboliseres HMR in vivo til enterolakton, som antas i det minste delvis å svare for lignanenes antitumor-egenskaper. Antioksidativ aktivitet av HMR in vitro er sterk, og denne egenskap viser at HMR også kan forebygge kardiovaskulære sykdommer ved den beskyttende virkning mot ødeleggende frie oksygenforbindelser i kroppen.

Det er mulig å danne en sammensetning av hydroksymatairesinol eller en geometrisk isomer eller en stereoisomer derav og anvende denne fortrinnsvis som en oral utformning. Den fordrede mengde av den aktive forbindelse (HMR) vil variere med den spesielle tilstand som skal forebygges. En typisk dose er i området fra ca. 10 til ca. 100 mg pr. dag for en voksen person.

Isolering av HMR for anvendelse ved denne oppfinnelse kan utføres ut fra grovflis-fraksjoner (inneholdende grener, smågrener og kvister) av tennar, samt anvendelse av HMR ved forebygging av sykdommer så som kreft og kardiovaskulære sykdommer.

HMR's egenskaper ble undersøkt ved sju forskjellige analyser:

1. Måling av antioksidativ evne in vitro

2. Måling av aromataseinhiberende evne i JEG-3-celler

3. Måling av østrogen og antiøstrogen aktivitet i MCF-7-cellekulturer

4. Evaluering av østrogen og antiøstrogen aktivitet ved livmorvekst-bioanalyse

5. Måling av østrogen og antiøstrogen aktivitet i voksne hannrotter

6. Undersøkelse av antitumor-aktiviteten i rotte-DMBA-indusert brystkreftmodell

7. Analyse av metabolitter fra rotteurin etter forskjellige doser av HMR

Isolering og rensing av HMR i tilstrekkelige mengder for biologiske tester har vært umulig tidligere på grunn av at det er en komponent i ved-lignaner, som har vært forholdsvis dårligkarakterisert. Forståelse av fordelingen av HMR i forskjellige deler av gran (Ekman 1976 og 1979) har gitt mulighet til å studere lignaner og spesielt HMR i detalj.

Det ble funnet et lineært samsvar mellom dosene av HMR og mengdene av urin-enterolakton. Enterolakton er et velkjent pattedyr-lignan dannet av intestinale bakterier fra matairesinol eller ved oksidasjon av enterodiol (Axelson og Setchell 1981; Axelson et al. 1982). Bare meget små mengder av ikke-metabolisert HMR og andre metabolitter (enterodiol og 7-hydroksyenterolakton) ble funnet i urin. Mengdene av dem forble uforandret når den daglige dose av HMR ble øket. Disse funn tyder på at HMR ble metabolisert til enterolakton, og dessuten blir ikke enterolakton som fås fra HMR ved demetylerings- og dehydroksyleringstrinn, omdannet til enterodiol. Basert på strukturen av HMR hadde man ventet at 7-hydroksy-enterolakton var hovedmetabolitten av HMR, men dette var ikke tilfellet. Denne hydroksylgruppe fjernes i metabolismen. Metabolismen av HMR er forskjellig fra metabolismen av SDG. SDG metaboliseres til enterodiol, som delvis oksideres til enterolakton (Rickard et al. 1996; Lampe et al. 1994). HMR gir følgelig en fordel fremfor SDG som en direkte forløper for enterolakton.

HMR hadde svak, hvis noen, østrogen virkning i rotte-livmor eller i den mannlige organisme. Den utøvde en svak, men ikke signifikant, østrogenliknende aktivitet i MCF-7-celler. Ingen antiøstrogen aktivitet ble påvist for HMR. Det er derfor overraskende at den hadde en meget signifikant antitumor-aktivitet i DMBA-indusert tumormodell i rotter som vist på fig. 2. Aktiviteten av HMR kan skyldes selve HMR eller enterolakton. Det ble imidlertid ikke funnet noen doseavhengighet ved HMR's kjemopreventive virkning når den ble gitt i to forskjellige doser (3 og 15 mg pr. kg) til rotter etter DMBA-behandling. HMR trenger således ikke å omdannes til enterolakton for å ha antitumor-virkning, eller mindre doser av disse lignaner er tilstrekkelig for utøvelse av de maksimale kjemopreventive virkninger.

HMR er en meget effektiv antioksidant, som vist i tabellene 2 og 3. Den er én av de mest potente kjente inhibitorer for lipid-peroksidasjon og en utmerket inhibitor for LDL-oksidasjon. Inhibering av LDL-oksidasjon anses for å være av spesiell betydning hos mennesker, siden konsentrasjonen av oksidert LDL i serum anses for å være én av de beste prediktorer for kardiovaskulære sykdommer så som aterosklerose. HMR kan tjene som et matvaretilsetningsstoff for økning av stabiliteten av matvarene (dvs. inhibering av vitamin-, lipid- og pigmentoksidasjoner som forårsaker tap av næringsverdi og utvikling av bismak i matvarer), på grunn av at HMR var et mye bedre superoksidanion-fjernende og peroksylradikal-fjernende middel enn de velkjente antioksidanter butylert hydroksyanisol (BHA) og butylert hydroksytoluen (BHT), som vanligvis anvendes for øking av matvarenes stabilitet.

FORSØK

Kjemikalier

Forskjellige lignaner ble testet in vitro med henblikk på sin østrogenitet, antiøstrogenitet, sin evne til å inhibere aromatisering og sine antioksidative egenskaper. Testforbindelsene ble anskaffet fra følgende kilder: enterodiol og enterolakton fra Plantech, London, England, og 7-hydroksyentero-lakton inneholdende to 7-OH-enantiomerer var en velvillig gave fra Dr. Kristina Wåhålå, Avdeling for Anvendt Kjemi, Helsinki Universitet, Finland.

Ekstraksjon av HMR fra tre

HMR-ekstrakter ble isolert fra norsk gran (Picea abies) som beskrevet av Ekman, 1976, og Ekman, 1979. Frysetørket malt kjerneved ble kort Soxhlet-ekstrahert med heksan under fjerning av upolart lipofilt ekstraktmateriale. Vedprøven ble ekstrahert på nytt i samme apparat med aceton/vann (9:1 på volumbasis) under oppnåelse av rå lignaner. Hydroksymatairesinol (HMR) og dens isomer ble isolert og kromatografert på nytt med XAD-harpiks for ytterligere rensing.

Måling av antioksidativ evne in vitro

Lignaners antioksidative evne ble vurdert ved hjelp av fire forskjellige metoder: 1) inhibering av lipid-peroksidasjon, 2) inhibering av oksidasjon av lavdensitets-lipoprotein (LDL), 3) superoksidanion-fjernings- og 4) peroksylradikalfjerningsanalyse.

Inhibering av lipid-peroksidasjon ble vurdert på basis av deres evne til å inhibere tert.-butylhydroperoksid-indusert lipid-peroksidasjon (t-BuOOH-LP) i rottelever-mikrosomer in vitro (Ahotupa et al. 1997). Testen med henblikk på t-BuOOH-LP ble utført som følger: Bufferen (50 mM natriumkarbonat, pH 10,2, med 0,1 mM EDTA) ble pipettert i et volum på 0,8 ml i luminometer-kyvetten. Tjue mikroliter fortynnede lever-mikrosomer, sluttkonsentrasjon 1,5 mg protein pr. ml, ble tilsatt, fulgt av 6 ml luminol (0,5 mg/ml) og testkjemikalier. Testforbindelsene ble tilsatt til inkuberingsblandingene i et lite volum fortynnet i etanol eller dimetylsulfoksid (2% av inkuberingsvolumet), og lipidperoksidasjonsevnen ble sammenliknet med evnen hos bærermaterialet (etanol eller dimetylsulfoksid). Reaksjonen ble igangsatt ved hjelp av 0,05 ml 0,9 mM t-BuOOH ved 33°C. Kjemiluminescens ble målt i ca. 45 minutter i 1 minutts sykluser, og arealet under kurven (integralet) ble beregnet. Kjemiluminescensmålinger ble utført under anvendelse av et Bio-Orbit 1251 Luminometer (Bio-Orbit, Åbo, Finland) knyttet til en personlig computer under anvendelse av passende programvare for analysene.

Inhibering av LDL-oksidasjon ble vurdert som beskrevet av Ahotupa et al., 1996. Kort angitt ble LDL isolert ved utfelling med bufret heparin. Etter gjenoppslemming i fosfatbuffer, ble 20 mM CuCI2tilsatt, og blandingen ble inkubert i 3 timer ved +37°C. Deretter ble LDL-lipider ekstrahert med kloroform-metanol, tørket under nitrogen, oppløst på nytt i cykloheksan og analysert spektrofotometrisk ved 234 nm. Intensiteten av absorbansen viser LDL-oksidasjonen. For testing av forskjellige forbindelsers evne til å forhindre LDL-oksidasjon ble forbindelsene tilsatt til inkubasjonsblandingen før tilsetting av CuCI2. Eventuell interferens av testforbindelser med analyseprosessen ble utelukket ved måling av absorpsjonen ved 234 nm før og etter inkubasjons-tidsrommet. For de forbindelser som viste antioksidativ evne i utgangs-konsentrasjonen (0,1 M), ble IC-50-verdiene (dvs. konsentrasjoner ved hvilke testforbindelsen inhiberte LDL-oksidasjonen med 50%) bestemt.

Superoksidanion-fjerningsmetoden var basert på superoksid-antionet dannet ved regulerte betingelser ved xantin-xantin-oksidasesystemet og påvisning av de dannede reaktive oksygenforbindelser ved hjelp av luminometer (Ahotupa et al., 1997). Testforbindelsenes evne til å redusere kjemiluminescensen ble vurdert. IC-50-konsentrasjonen (konsentrasjonen som forhindret kjemiluminescensen med 50%) ble beregnet.

Peroksylradikalfjerningsanalysen var basert på dannelse av peroksylradikaler ved termisk spaltning av 2,2'-azobis(2-amidinopropan)HCI og påvisning av dem ved kjemiluminescens (Ahotupa et al., 1997). Resultatene ble beregnet som den støkiometriske faktor, dvs. hvor mange mol peroksylradikaler som kan fjernes med ett mol av testforbindelsen.

Måling av aromataseinhiberende evne i JEG-3-celler

Virkningene av HMR og strukturelt beslektede lignaner (enterolakton, enterodiol og 7-hydroksyenterolakton) ble undersøkt ved dannelse av<3>H-17p-østradiol fra 3H-androstenedion i JEG-3-celler, human choriokarsinom-cellelinje. JEG-3-choriokarsinomcellene er en egnet atomatasemodell som muliggjør undersøkelse av aromataseinhibering in vitro (Krekels et al 1991). Cellene ble holdt i DMEM inneholdende 10% føkalt kalveserum (FCS). Inkuberingsblandingen inneholdt 50^l<3>H-androst-4-en, 3,17-dion (0,5 nM), 50^l umerket androstenedion (0,5 nM), 100^l testforbindelser (10 mM) og 800^l cellesuspensjon (1 million celler). Etter inkubering i 4 timer ble det tilsatt umerkede bærere (androstenedion, testosteron, 17p-østradiol og østron). Steroidene ble ekstrahert to ganger med 3,0 ml diklormetan. HPLC ble anvendt for separasjon og kvantifisering av den radiomerkede<3>H-17p-østradiol som beskrevet tidligere (Måkelå et al., 1995). Kolonnesystemet besto av en beskyttelseskolonne fulgt av en C18 150 x 3,9 mm ID analytisk kolonne (Technopak 10 C18 HPLC Technology; Wellington House, Cheshire, England). Den mobile fase var acetonitril/vann (35/65), og strømningshastigheten var 1,2 ml pr. minutt. For påvisning av de radioaktive metabolitter i systemet («in-line») ble elueringsmidlet for HPLC-kolonnen kontinuerlig blandet med scintillasjonsvæske og deretter overvåket med radioaktivitetsdetektor i systemet.

Måling av østrogen og antiøstrogen aktivitet i MCF-7-cellekulturer

MCF-7-cellelinje-(humane brystkreftceller)-forrådskulturene ble dyrket i fenolrødt-fritt RPMI-medium supplert med 5% FCS, 100 E penicillin pr. ml og 100 ug streptomycin pr. ml, 10^g insulin pr. ml og 1 nM 17p-østradiol i T-75-celledyrkningsflasker. Mediet ble erstattet med friske medier tre ganger pr. uke. Forrådskulturene ble høstet ved trypsinering, oppslemmet i 10 ml fenolrødt-fri versenoppløsning og sentrifugert i 5 minutter ved 800 omdr. pr. min. Celle-klumpen ble forsiktig gjenoppslemmet i RPMI-medium supplert med 5% dekstran-trekullavdrevet FCS (dcFCS) og utsådd på 6 brønns-plater med 50 000 celler / 3,0 ml medium / brønn. På den andre dag av dyrkningen ble mediet skiftet, og testforbindelser ble tilsatt. For testing av lignanforbindelsenes østrogenitet ble de fortynnet i etanol og tilsatt til cellekulturer i sluttkonsentrasjon på 1,0 M. I hver proliferasjonsanalyse ble det anvendt 1,0 nM 17p-østradioloppløsning i etanol som positiv kontroll for østrogen-respons. Like mengder etanol ble tilsatt til kontrollbrønnene. For testing av antiøstrogeniteten ble både 17p-østradiol- og lignanoppløsninger tilsatt til cellekulturene. Cellene ble dyrket i 5-7 dager i nærvær av testforbindelser, og mediet ble skiftet hver annen dag. Celle-proliferasjonen ble kvantifisert ved telling av de frigjorte kjerner med Coulter-teller.

Evaluering av østrogen og antiøstrogen aktivitet i en uterotropin-test for ikke fullt utviklede rotter

HMR's østrogenitet ble evaluert ved uterotropin-analysen i ikke fullt utviklede rotter, som ble utført som beskrevet tidligere (Jordan et al., 1977), med unntak av behandlingstiden, som var 7 dager i stedet for 3 dager i referanse-undersøkelsen. Behandlingstiden var lengre på grunn av den ventede svake østrogenitet hos testforbindelsen. Behandlingen av ikke fullt utviklede rotter med en aromataseinhibitor (MPV-2213ad), som forhindrer biosyntese av østradiol, ble anvendt som metodekontroll for ikke-østrogen-stimulert uterus.

Evaluering av østrogen og antiøstrogen aktivitet hos voksne hannrotter

Østrogene (antiandrogene) og antiøstrogene virkninger av HMR ble undersøkt for henholdsvis intakte og hypoandrogene hannrotter av Noble-stammen (alder 6-9 måneder). Den kroniske hypoandrogene tilstand med både strukturelle og funksjonelle forandringer i forplantningssystemet hos hanner ble

indusert ved neonatal østrogenisering (dietyIstiIbestrol, 10,0^g pr. kg kroppsvekt i rapsolje s.c. på postnatal-dager 1-5). Disse forandringer er kjent for å være delvis reversible ved aromataseinhibitor-behandling bestående av daglig dose av MPV-2213 med 10-30 mg pr. kg kroppsvekt (Streng et al., upubliserte observasjoner).

Dyrene ble foret med den soyafrie basaldiett (SDS, Whitham Essex, England), og de hadde fri tilgang til vann. Tolv av både intakte og hypoandrogene dyr ble tilført («cavaged in») en daglig dosering av HMR på 50 mg pr. kg kroppsvekt i rapsolje. Ytterligere tolv dyr fra begge dyremodeller ble tilført bare rapsolje som placebo-behandling. Etter fire ukers behandling ble dyrene avlivet. Vekten av testis og aksessoriske kjønnsorganer (ventral prostata, seminalvesikler og koaguleringskjertel) ble målt. Testosteron-nivået i serum og testis, samt nivået av luteiniserende hormon (LH) i hypofyse og serum ble målt ved hjelp av immunanalyser (Haavisto et al., 1993).

Undersøkelse av antitumor-aktiviteten i DMBA-indusert rotte-brystkreftmodell

Antitumor-aktiviteten av HMR i brystkreft hos rotter ble undersøkt som beskrevet tidligere (Kangas et al., 1986). Femti dager gamle hunnrotter av typen Sprague-Dawley ble gitt 12,0 mg DMBA (dimetylbenz[a]antracen) ved «cavage». Etter ca. 6 uker kunne det påvises palperbare tumorer, hvoretter bredden (w) og lengden (I) av tumorene ble målt én gang i uken for bestemmelse av tumorvolumene i henhold til formelen V = (ttw<2>l)/12. Rottene ble også veid én gang i uken. Rottene ble fordelt i 3 forskjellige grupper slik at det totale antall tumorer i begynnelsen av forsøket var likt i hver gruppe: (1) Kontrollgruppe 8 dyr, (2) HMR 3,0 mg/kg 7 dyr, og (3) HMR 15,0 mg/kg 7 dyr, hvorav ett måtte avlives før forsøkets slutt.

HMR ble gitt per os, med start 9 uker etter DMBA-induksjonen, dvs. 3 uker etter at palpable tumorer fremkom, og ble gitt daglig i TA uke. Ved slutten av forsøket ble tumorene klassifisert i grupper i henhold til sitt vektsmønster: 1. Voksende tumorer (PD = progressiv sykdom); 2. Ikke-voksende, stabiliserte tumorer (SD = stabilisert sykdom, ingen forandring i tumorvolum eller regresjon på under 75%; 3. Tilbakegående tumorer (PR = partial respons, regresjon av tumorvolum med mer enn 75%); 4. Forsvunne tumorer (CR = komplett respons, ingen palpabel tumor).

Analyse av metabolitter i urin fra rotte som fikk forskjellige doser av HMR

Ti hannrotter av typen Sprague-Dawley (alder 4 måneder) ble anvendt til undersøkelse av metabolismen av HMR in vivo. Dyrene ble oppbevart i par med 12 timers lys:mørke-syklus og hadde fri tilgang til vann og soyafri basaldiett (SDS, Whitham Essex, England) under metabolismeundersøkelsen.

Rottene ble tilført («cavaged with») HMR oppløst i 10% etanol i PEG i doser 3,15, 25 og 50 mg pr. kg kroppsvekt én gang daglig i to dager. Etter den andre tilføring («cavaging»), ble 24 timers-urinen oppsamlet i metabolisme-bur i oppsamlingskrukker inneholdende 120fal 0,56 M askorbinsyre og 120fal 0,15 M Na-azid som konserveringsmidler. De sentrifugerte urinvolumer ble målt og oppbevart ved -20°C. For for-behandling ble det tilsatt 750fal 0,2 M acetatbuffer (pH 4,0 ± 0,1) til 3,0 ml tinte urinporsjoner. Sep-Pak C18-kolonner (100 mg silikabasert harpiks pr. kolonne) ble anvendt for urinekstrasjon. Kolonnene ble for-kondisjonert med 3,0 ml H20, 3,0 ml metanol og 3,0 ml acetatbuffer. Etter at urin var blitt filtrert gjennom kolonnen og vasket med 3,0 ml acetatbuffer, ble polyfenol-forbindelser eluert med 3,0 ml metanol. Eluatet ble inndampet til tørrhet under nitrogen i vannbad på +45°C, og tørkede residuer ble oppløst på nytt i 3,0 ml 0,2 M acetatbuffer. 30fal Helix-«pomatia»-enzymblanding ble tilsatt, og oppløsningene ble inkubert ved +37°C for hydrolysering av både glukuronider og sulfater. 300fal flavon-forrådsoppløsning (100 fag/ml i EtOH) ble tilsatt til hydrolyserte prøver. Prøvene ble ekstrahert i C-18-kolonner, inndampet til tørrhet som beskrevet ovenfor og oppbevart ved -20°C til de ble analysert med GC-MS.

De inndampede urinprøver ble oppløst i pyridin og silylert ved tilsetting av BSTFA:TMCS (10:1)-silyleringsreagens. GC-MS-analysene av de silylerte prøver ble utført med et GC-MS-instrument av typen HP 6890-5973. GC-kolonnen var en kolonne av typen HP-1 med tverrbundet metylpolysiloksan (15 m x 0,25 mm i.d., 0,25 jam filmtykkelse). Helium ble anvendt som bærergass med en strømning på 1 ml/min. GC-ovnen ble temperaturprogrammert til fra 60°C til 290°C, med en oppvarmingstid på 8°C pr. minutt. GC-injektoren ble innstilt til spaltningsmodus med et spaltningsforhold på 1:15. Injektortemperaturen var250°C. Forbindelses-identifikasjonene var basert på massespektra. Mengdeberegningene var basert på ikke-korrigerte topparealer av målkomponenter i forhold til den indre standard.

RESULTATER

Vurdering av antioksidativ evne in vitro

HMR har sterkere lipidperoksidasjonsevne enn et hvert annet lignan eller flavonoid i våre tester (tabell 2). HMR ble sammenliknet med velkjente antioksidanter TROLOX, som er et vannløselig vitamin E-derivat, og BHAog BHT med henblikk på evnen til inhibering av lipid-peroksidasjon, inhibering av LDL-oksidasjon og fjerning av superoksid og peroksylradikaler (tabell 3). HMR var som helhet den sterkeste antioksidant, mer effektiv enn BHA eller BHT i alle analyser, og sterkere enn TROLOX i alle analyser, bortsett fra lipidperoksidasjons-inhiberingsanalyse, hvor forbindelsene var nesten like aktive.

Aromataseinhiberende evne i JEG-3-celler

Inhibering av<3>H-17p-østradioldannelse ut fra<3>H-androstenedion i JEG-3-celler ble testet ved forskjellige konsentrasjoner av HMR. HMR's inhiberende evne ble sammenliknet med enterolakton, 7-hydroksyenterolakton og enterodiol. Enterolakton forårsaket en doseavhengig inhibering av aromatisering i konsentrasjonsområdet fra 1,0 og 10,0^M. Det ble videre vist at enterodiol var ikke-inhiberende, noe som viser at laktonringen er avgjørende for inhiberingen. 7-Hydroksyenterolakton og hydroksymatairesinol hadde ingen inhiberende virkninger (fig. 1), noe som viser betydningen av antallet og lokalisasjonen for hydroksylgrupper i lignanmolekylet for aromataseinhiberingen.

Østrogen og antiøstrogen aktivitet i MCF-7-cellekulturer

HMR hadde en meget svak, ikke statistisk signifikant østrogen eller antiøstrogen aktivitet i MCF-7-celleproliferasjonsanalyser som vist på fig. 2.

Evaluering av østrogen og antiøstrogen aktivitet i uterotropintest for ikke fullt utviklede rotter

Fig. 3 illustrerer virkningene av HMR på uterusveksten i de ikke fullt utviklede rotter. HMR hadde ingen signifikant østrogen effekt på vektøkningen av uterus i de ikke fullt utviklede rotter. HMR reduserte heller ikke vektøkningene, noe som viser at det ikke var noen antiøstrogen virkning. Aromataseinhibitor hindret

økningen av uterusvekten, som ventet, noe som viser at fremgangsmåten for målingen av aromatase-inhibitorene var hensiktsmessig.

Evaluering av østrogen og antiøstrogen aktivitet hos voksne hannrotter

Etter en 4 ukers behandling med HMR ble det ikke observert noen signifikante forandringer i vekten av aksessoriske kjønnskjertler og testis i kontroll-og hypoandrogene dyr (tabell 4). Det var heller ingen signifikante forandringer i testosteron- eller LH-konsentrasjon (tabell 5). Disse resultater viser at HMR ikke er en fullstendig østrogen-agonist i mannlig organisme, på grunn av at den ikke utøver den typiske østrogene aktivitet på hypotalamus - hypofyse - gonade - aksen (inhibering av LH- og androgen-utskillelse). HMR er heller ikke et antiøstrogen på grunn av at den ikke reverserer forandringene indusert ved neonatal østrogenering i hannrotten.

Undersøkelse av antitumor-aktiviteten i rotte-DMBA-indusert pattedyr-kreftmodell

Antall voksende (PD) sammenstilt med stabile (SD) tumorer, tumorer under tilbakegang (PR) og forsvunne (CR) tumorer er vist på fig. 4. Antitumorvirkningen av HMR ble funnet å være statistisk meget signifikant. Det var ingen klar doseavhengighet av antitumorvirkningen i denne modell. Både antioksidative egenskaper og tumorvekst-tilbakegangsegenskaper hos HMR kan derfor knyttes til antitumoraktiviteten in vivo. Mekanismen for antitumoraktivitet av HMR in vivo er fremdeles ukjent.

Analyse av metabolitter fra rotteurin etter forskjellige doser av HMR

Fig. 5 illustrerer at hoved-utskillelsesmetabolitten av HMR i rotter er enterolakton, som kan være den biologisk aktive forbindelse. Dette er overraskende på bakgrunn av HMR's kjemiske struktur, på grunn av at man vil vente at hydroksyenterolakton er hovedmetabolitten. Metabolismen av HMR til enterolakton kan være katalysert av bakterieintestinalflora snarere enn av rotteleveren.

KONKLUSJONER

Hydroksymatairesinol (HMR) har antitumor-aktivitet enten som uforandret forbindelse og/eller etter omdannelse til enterolakton i DMBA-indusert brystkreftmodell. HMR har derfor et potensial til å ha fordelaktige virkninger hos mennesker som har risiko for å utvikle brystkreft (BC), prostatakreft (PC), tykktarmskreft eller benign prostata-hyperplasi (BPH). HMR metaboliseres til enterolakton som inhiberer aromatisering in vitro. HMR kan som en forløper for aromataseinhibitor også forhindre utviklingen av symptomer i nedre urinveier (LUTS), blære-ustabilitet, blæreutgangs-tilsnøring, uretra-dyssynergi og gynekomasti. HMR har også sterk antioksidativ aktivitet og kan derfor anvendes som matvaretilsetningsstoff (antioksidant). HMR som farmasøytisk produkt eller kostsupplement kan ha fordelaktige kardiovaskulære virkninger hos mennesker. Tilsetting av HMR til matvarer for å lage innovativ ny funksjonell mat, nutraceutika, helsekost, farmasøytiske matvarer, «designer»-mat eller ny mat er mulig.

REFERANSER

Adlercreutz H, Bannwart C, WShaTa" K, Makela T, Branow G, Hase T, Arosemena PJ, KelHs JT, and Vickery LE: Inhibition of human aromatase by mammalian lignans and isoflavonoidphytocstrogens. J Steroid BiochemMol BioL 44:147-153,1993.

Ahotupa M, Ruutu M, and MSntyla" E: Simple methods of quantifying oxidation products and antioxkiant potential of low density Kpoproteins. din Biochem, 29:139-144,1996.

Ahotupa M, MantylS E, and Kangas L: Antioxidant properties of the triph<e>n<y>leth<y>lene antiestrogen drug toremifene. Naunyn-Schmiedeberg<*>s Arch Phannacol, 356:297-302,1997.

Axelson M and Setchell KDR: The excretion of lignans in rats - evidence far an intestinal bactérial source far mis new group of compounds. FEBS lett, 123:337-342, 1981.

Axelson M, Sjøvoll J, Gustafsson BE and Setchell KDR: Origin of lignans in nummials and identification of a precursor from plants. Nature, 298:659-660,1982.

Ayres D, and Loike, J. Lignans: Chemical, bilogical and clinical properties. Cambridge university press, 1990.

Brzezinski A, Adlercreutz H, Shaoul R, Rosler A, Shmueli A, Tanos V and Schenker IG: Short-tenn effects of phytoestrogen-iich diet on postmenopausal women. Menopause (The Journal of the Norm American Menopause Society), 4: 89-94,1997.

Ekman R: Analysis of lignans in Norway spruce by combined gas chromatography-mass spectrometry. Holzforschung, 30:79-85,1976.

Ekman R: Distribution of lignans in Norway spruce. Acta Academiae Aboensis, Ser B, 39:1-6,1979.

Evans BA, Griffims K and Morton MS. Inhibition of Sa-rednctase in genital skin fibroblasts and prostate tissue by dietary lignans and isoflavonoids. J Endocrinol, 147: 295-302,1995.

Haavisto A-M, Petterson K, Bergendahl M, Perheentupa A, Roser JF, and Huhtaniemi I A. Supersensitive immunofluorometric assay for rat luteinizing harmane. Eridbcrinology, 132:1687-1691,1993.

Hultén K, Adlercreutz H, Winkvist A, Lenner P, Halhnans G and Ågren Å. Low levels of phyto-estrogens in blood as risk factor for breast cancer. In: COST 916 Workshop 'Phyto-oestrogens: exposure, bioavailability, health benefits and safety concerns', 1998

Ingram D, Sanders K. Kolybaba M and Lopez D. Case-control study of phyto-oestrogens and breast cancer. Lancet, Oet 4350(9083): 990-994,1997.

Jenab M and Thompson LU. The influence of flaxseed and lignans on colon caicinogenesis and beta-glucuromdase activity. Carcinogenesis, Jun;17(6):1343-1348, 1996

Jordan VC, Collins MM, Rowsby L, Prestwich G: A monohydroxylated metabolite of tamoxifen with potent antiestrogenic activity. J Endocrinol, 75:305-316,1977.

Kangas L, Nieniinen A-L, Blanco G, Grdnroos M, Kallio S, Kaijalainen A, Perila M, Sodervall M and Toivola R: A new triphenylethylene compound, Fc-1157a. II Antitumor effects. Cancer Chemother PharmacoL 17:109-113,1986.

Lampe JW, Martini MC, Kurzer MS, Adlercreutz H and Slavin JL: Urinaiy lignan and isoflavondd excretion in premenopausal women corisuming flaxseed powder. Am J Clin Nutr, 60:122-8,1994.

Landstrcm M, Zbang JX, Hal lmans G, Aman P, Bergh A, Damber JE, Mazur W, WahalaK and Adlercreutz H. Inhibitory effects of soy and rye diets on the development of Danning R3327 prostateadencrarcinama in rats. Prostate, Aug 1; 36(3): 151-161,1998

Mousavi Y and Adlercreutz H: Enterolactone and estradiol inhibit each ornats proliferative effect on MCF-7 breast cancer cells in culture. J Steroid Biochem Mol BioL 41:615-619,1992.

Mattinen J, Sjoholm R and Ekman R. NMR-spectroscopic study of hydroxymatairesinoL the major lignan in Norway spruce (Picea abies) heartwood ACH models in chemistry, 135(4):583-590,1998.

MakelM S, Poutanen M, I^timMki J, Kostian M-L, Santti R and Vihko R. Estrogen-specific npVhydroxysteroid oxidoreductase type 1 (E.C.1.1.1.62) as a possible target for the action of phytoestrogens. P.SJ2J3JYI., 208:51-59,1995.

Phipps WR, Martini MC, Lampe JW, Slavin JL and Kurzer MS. Effect of flax seed ingestion on the menstrual cycle. J din Endocrinol Metab, 77(5):1215-1219,1993.

Rickard SE, Orcheson LJ, Seidl MM, Luyengi L, Fong HHS and Thompson LU: Dose-dependent production of mammalian lignans in rats and in vitro from the purified precursor secoisolairciresinol diglycoside in flaxseed. J Nutr, 126:2012-2019, 1996.

Snutes TD, Bonarden WR and Seaman WR. Effect of short-time flaxseed consumption on lignan and sex hormone metabolism in men. Nutrition Research, 11:1089-110,1991..

Serraino M and Thompson LU: The effect of flaxseed supplementation on early risk markers for mammary carcinogenesis. Cancer Letters, 60:135-142,1991.

Serraino M and Thompson LU: The effect of flaxseed supplementation on the initiation and promotional stages of mammary tumørigenesis. Nutr Cancer, 17:153-159,1992.

Setchell KDR, Borriello SP, Gordon H, Lawson AM, Harkness R and Morgan DML. Lignan formation in man - microbial involvement and possible roles in relation to cancer. Lancet, 4:4-7,1981

Streng T, Talo A and Santti R. Unpublished observations.

Thompson LU, Robb P, Serraino M and Cheung F. Mammalian lignan production from various foods. Nutr Cancer, 16:43-52,1991

Thompson LU, Seddl, MM, Rickard SE, Orcheson, LJ, and Fong HHS: Antiuimorigenic effect of a mammalian lignan precursors from flaxseed. Nutr Cancer, 26:159-165,1996a.

Thompson LU, Rickard SE, Orcheson LJ and Seidl MM: Flaxseed and its lignan and oil components reduce mammary tumor growth at a late stage of carcinogenesis. Carcinogenesis, 17:1373-1376,1996b.

Tou JCL, Chen J and Thompson U. Flaxseed and its lignan precursor, secoisolariciresinol diglycoside, affect pregnancy outcome and reproductive development in rats. J Nutr, 128:1861-1868,1998.

Wang C, MSkelft T, Hase T, Adlercreutz H and Kurzer MS: Lignans and flavonoids inbibit aromatase enzyme in human adipocytes. J Steroid BiocfaemMolec Biol, 50: 205-212,1994.

Waters AP and Knowler JT. Effect of a lignan (HPMF) on RNA synthesis in the rat uterus. J Reprod. Fert, 66:379-381,1982.

Zhang J-X, Halhnans G, Landstrom M, Bergh A, Damber J-E, Åman P and Adlercreutz H. soy and rye diets inbibit the development of Dimning R3327 prostatic aføccarcmomainrats. Cancer Letters, 114:313-314,1997.

Claims

1. Hydroksymatairesinol eller en geometrisk isomer eller en stereoisomer derav for anvendelse for forebygging av ikke-kreft, østrogen-avhengig sykdom, idet sykdommen er valgt fra gruppen bestående av nedre urinveissymptomer, uretra-dyssynergi, benign blæreustabilitet, blæreutløpstilstopping, benign prostata-hyperplasi og gynekomasti hos menn.