PL192129B1

PL192129B1 - Wyizolowany szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, układ gospodarz-wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, oczyszczony polipeptyd, oligonukleotyd, sposób otrzymywania przeciwciał, przeciwciała, zastosowanie kwasu nukleinowego, zastosowanie przeciwciał, sposób oznaczania związku chemicznego, kompozycja, zastosowanie kompozycji, sposób skriningu płynów ustrojowych i szczepionka

Info

Publication number: PL192129B1
Application number: PL345573A
Authority: PL
Inventors: Chong Jin Oon; Gek Keow Lim; Yi Zhao; Wei Ning Chen
Original assignee: Government Of The Republic Of Singapore
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2006-09-29
Also published as: PL345573A1; NZ508890A; IL140364A0; TR200003777T2; IS5778A; KR20010106129A; HUP0103409A3; JP2002518014A; AU7795198A; YU80600A; CA2330935A1; HUP0103409A2; US6558675B1; UA73476C2; AU756866B2; BR9815913A; MY118955A; AR020093A1; CA2330935C; MXPA00012720A

Abstract

1. Wyizolowany szczep wirusa zapalenia w atroby typu B, okre slony jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia w atroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoni- n e), zdeponowany pod numerami dost epu P97121501, P97121502 i P97121503 w European Col- lection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r. 2. Wyizolowany kwas nukleinowy koduj acy polipeptyd, który jest zmutowanym g lównym an- tygenem powierzchniowym wirusa zapalenia w atroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencj e aminokwasów, która ró zni si e od sekwencji aminokwasów g lównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia w atroby typu B tym, ze aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina. 56. Kompozycja, znamienna tym, ze zawiera polipeptyd, który jest zmutowanym g lównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia w atroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencj e aminokwasów, która ró zni si e od sekwencji aminokwasów g lównego antygenu po- wierzchniowego wirusa zapalenia w atroby typu B typu dzikiego tym, ze aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przy czym ilo sci takiego polipeptydu s a sku- teczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwcia l u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny no snik. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wyizolowany szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, układ gospodarz-wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, oczyszczony polipeptyd, oligonukleotyd, sposób otrzymywania przeciwciał, przeciwciała, zastosowanie kwasu nukleinowego, zastosowanie przeciwciał, sposób oznaczania związku chemicznego, kompozycja, zastosowanie kompozycji, sposób skriningu płynów ustrojowych i szczepionka.

W szczególności wynalazek dotyczy genomu ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowanego z raka wątrobowo-komórkowego (HCC), z mutacją w reszcie aminokwasu 133 w głównym antygenie powierzchniowym, jego sekwencji nukleotydów, wydedukowanej sekwencji aminokwasów czterech głównych białek, antygenu, przeciwciała, układów detekcji, opracowania skutecznych szczepionek i środków przeciwwirusowych.

HCC jest jednym z najczęstszych ludzkich nowotworów, szczególnie w Azji, gdzie, co roku stwierdza się 70% nowych przypadków z całego świata. Na ogół powstaje w marskich wątrobach jako powikłanie przewlekłej choroby wątroby. Kliniczne objawy pacjentów z HCC są niespecyficzne z objawami i oznakami pojawiającymi się w późniejszych stadiach raka.

Jedną z głównych przyczyn przewlekłej choroby wątroby jest zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B. Wirus ten został wykryty po raz pierwszy w 1963 r. jako wirus ludzki, który jest przekazywany pozajelitowo. Przewlekłe zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B jest na ogół najbardziej powszechnie implikowane w serologicznie niezdefiniowanej patogenezie HCC. Mimo faktu, że wirus zapalenia wątroby typu B nie wykazuje cech całkowitego onkogenu wirusowego, jego udział w rozwoju HCC można przypisać różnym aspektom jego oddziaływania z hepatocytowymi komórkami gospodarza. Obejmuje to różnorodną aktywność transkrypcyjną najmniejszego białka wirusowego X, które wzmaga poziom ekspresji wielu docelowych genów komórkowych, w tym protoonkogenów. Natomiast wintegrowany wirusowy DNA w chromosomach gospodarza jest regularnie spotykany u pacjentów z HCC. Istnieją też dowody wskazujące na aktywną rolę głównego antygenu powierzchniowego w rozwoju HCC. Biał ko to był o wykorzystywane jako gł ówny marker do detekcji noś ników wirusa zapalenia wątroby typu B. Najbardziej antygenowym epitopem jest wysoce konserwatywny region obejmujący 23 reszty aminokwasów i zlokalizowany od pozycji aminokwasu 124 do 147 głównego antygenu powierzchniowego. Ten mały region określany jako specyficzna determinanta grupowa „a jest spotykany we wszystkich podtypach i izolatach genomów wirusa zapalenia wątroby typu B. Jego właściwości antygenowe wydają się wynikać z jego proponowanej struktury podwójnej pętli, do której wiąże się indukowane przez szczepionkę neutralizujące przeciwciało.

Dane epidemiologiczne wskazują, że główny antygen powierzchniowy typu dzikiego znaleziono u wię kszości pacjentów z HCC. Co więcej obserwacje wskazują, że szereg wariantów głównego antygenu powierzchniowego od pacjentów z HCC może brać udział w patogenezie HCC. Bezpośrednia analiza sekwencyjna wykazała, że 24 z 63 pacjentów z HCC (około 38%) niesie różne mutacje w epitopie „a głównego antygenu powierzchniowego. Gdy połączy się zarówno przypadki typu dzikiego, jak i warianty, udział wariantowego wirusa niosą cego mutację w reszcie aminokwasu 133, zlokalizowanej w pierwszej pę tli epitopu „a gł ównego antygenu powierzchniowego (metionina na treoninę ) wynosi aż 12,7% u 63 pacjentów z HCC z obszaru Azji Południowo-Wschodniej, i ta mutacja występuje w 5 lokalnych przypadkach HCC. Jednakże tę samą mutację spotyka się tylko u 2% nosicieli wirusa zapalenia wątroby typu B w populacji losowej (ponad 100 przypadków). Znaczenie tego wariantu w reszcie aminokwasu 133 jest jeszcze bardziej wzmocnione przez fakt, że udział wariantowego wirusa z mutacją w reszcie aminokwasu 145 (glicyna na argininę ), lepiej znanego jako mutant indukowany przez szczepionkę i zlokalizowanego w drugiej pętli epitopu „a, pozostaje stały na poziomie 8% u nosicieli wirusa zapalenia wątroby typu B w losowej próbce populacji.

Choć ten wariantowy szczep wirusa zapalenia wątroby typu B niosący mutację w pozycji reszty aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego u pacjentów z HCC może pojawiać się inaczej od indukowanych przez szczepienie (czyli z mutacją w pozycji reszty aminokwasu 145 głównego antygenu powierzchniowego), ten szczep ma podobną charakterystykę, jako że oba są stabilne i opisano przypadki pionowego przekazywania tych szczepów, mimo skutecznej profilaktyki przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B i stosowania immunoglobuliny wirusa zapalenia wątroby typu B (HBIG).

Powstanie wariantu ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, niosącego mutację w epitopie „a głównego antygenu powierzchniowego w HCC, stanowi poważny problem. Wysoki udział zmutowanego

PL 192 129 B1 wirusa z podstawieniem w reszcie aminokwasu 133 głównego antygenu powierzchniowego jest szczególnie interesująca, jako że może wykazywać na bliski związek z patogenezą HCC. Ta korelacja wymagałaby więc w sposób naglący opracowania specyficznych systemów detekcji, jak i skutecznych profilaktycznych i terapeutycznych szczepionek i środków przeciwwirusowych. Określenie sekwencji nukleotydów tego zmutowanego wirusa stanowi pierwszy krok do osiągnięcia tych celów i na pewno będzie pomocne w opracowywaniu wymienionych powyżej schematów diagnostycznych i terapeutycznych.

Wynalazek dotyczy wyizolowanego szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, określonego jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), zdeponowanego pod numerami dostępu P97121501, P97121502 i P97121503 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r.

Wynalazek dotyczy również wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.

Szczególnie jest to kwas nukleinowy, w przypadku którego polipeptyd jest kodowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO: 1, a zwłaszcza wyizolowany kwas nukleinowy zawierający nukleotydy „ATG w pozycjach 551 - 553 zamiast „ACG.

Ten wyizolowany kwas nukleinowy stanowi DNA lub RNA, a zwłaszcza cDNA lub genomowy DNA.

Szczególnie jest to również kwas nukleinowy, w przypadku którego polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zasadniczo identyczną z resztami aminokwasów 174 - 400 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

Wynalazek dotyczy także wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.

Wynalazek dotyczy także wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

Wynalazek dotyczy również wektora zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, i jest funkcjonalnie połączony z promotorem transkrypcji RNA.

Wynalazek dotyczy również wektora zawierającego wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.

W przypadku obu wyżej określonych wektorów, każdy z nich szczególnie zawiera wirusowy DNA.

Wynalazek dotyczy również układu gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu, który to układ zawiera każdy z wektorów określonych powyżej.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania polipeptydu, zgodnie z którym układ gospodarz-wektor hoduje się w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu, przy czym hoduje się układ gospodarz-wektor określony powyżej i odzyskuje się tak wytworzony polipeptyd.

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania polipeptydu w postaci oczyszczonej, polegającego na tym, że:

(a) wprowadza się wektor określony powyżej do komórki gospodarza;

(b) hoduje się powstałą komórkę gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskuje się polipeptyd wytworzony w etapie (b); i (d) oczyszcza się tak odzyskany polipeptyd.

Wynalazek dotyczy ponadto oczyszczonego polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.

Wynalazek dotyczy ponadto oczyszczonego polipeptydu otrzymanego sposobem określonym powyżej.

PL 192 129 B1

Wynalazek dotyczy ponadto oczyszczonego polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów obejmującą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

Wynalazek dotyczy ponadto oligonukleotydu o długości co najmniej 15 nukleotydów, zdolnego do specyficznej hybrydyzacji z unikatową sekwencją nukleotydów w obrębie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, bez hybrydyzowania do jakiejkolwiek sekwencji nukleotydów w obrębie kwasu nukleinowego, który koduje główny antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego.

W szczególności ten oligonukleotyd zawiera nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.

Wynalazek dotyczy także sposobu otrzymywania przeciwciał dla polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, a nie dla głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, przy czym ten sposób polega na tym, że:

(a) otrzymuje się polipeptyd w postaci oczyszczonej;

(b) immunizuje się organizm zdolny do wytwarzania przeciwciał przeciw oczyszczonemu polipeptydowi;

(c) zbiera się wytworzone przeciwciała;

(d) łączy się wytworzone przeciwciała z oczyszczonym polipeptydem do wytworzenia kompleksu; i (e) ustala się, które wytworzone przeciwciała tworzą kompleks z oczyszczonym polipeptydem, z otrzymaniem przeciwciał dla polipeptydu.

W szczególności otrzymuje się polipeptyd kodowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO: 1.

W innej postaci, polipeptyd ma sekwencję zasadniczo identyczną z resztami aminokwasów 174 - 400 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

W szczególności immunizuje się organizm królika lub myszy.

Wynalazek dotyczy też sposobu otrzymywania przeciwciał dla polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów obejmującą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3, przy czym ten sposób polega na tym, że:

(a) otrzymuje się polipeptyd w postaci oczyszczonej;

(c) zbiera się wytworzone przeciwciała;

W szczególności immunizuje się organizm królika lub myszy.

Wynalazek dotyczy ponadto przeciwciał, korzystnie przeciwciał monoklonalnych, otrzymanych sposobem określonym powyżej.

Wynalazek dotyczy ponadto przeciwciał zdolnych do wykrywania polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, i niezdolnych do wykrywania głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego.

Wynalazek dotyczy ponadto przeciwciał zdolnych do wykrywania polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas

PL 192 129 B1 w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, do ustalania czy osobnik jest zakażony szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.

Gdy próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, etap ustalania (b) obejmuje:

(i) kontaktowanie mRNA z oligonukleotydem określonym powyżej, w warunkach umożliwiających wiązanie mRNA z oligonukleotydem, do wytworzenia kompleksu;

(ii) izolację tak wytworzonego kompleksu, i (iii) identyfikację mRNA w wyizolowanym kompleksie, dla ustalenia czy mRNA stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.

Ponadto, gdy próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, etap ustalania (b) obejmuje:

(i) translację mRNA w warunkach otrzymywania sekwencji aminokwasów; i (ii) porównanie sekwencji aminokwasów etapu (i) z sekwencją aminokwasów kodowaną przez wyizolowany kwas nukleinowy określony powyżej, dla ustalenia czy próbkę kwasu nukleinowego stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.

W opisanym powyżej zastosowaniu zazwyczaj etap ustalania (b) obejmuje:

(i) amplifikację kwasu nukleinowego obecnego w próbce w etapie (a); i (ii) wykrywanie obecności polipeptydu w otrzymanym zamplifikowanym kwasie nukleinowym.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, do ustalania czy osobnik jest zakażony szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania z przeciwciałami określonymi powyżej, dla ustalenia czy osobnik jest zakaż ony.

W szczególności wyizolowany kwas nukleinowy, oligonukleotyd lub przeciwciało są znakowane wykrywalnym markerem, który stanowi zwłaszcza radioaktywny izotop, fluorofor lub enzym.

W szczególności uzyskana próbka to krew, surowice lub tkanka, taka jak tkanka wątroby.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B,

PL 192 129 B1 który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, do ustalania predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego, przy czym takie ustalanie obejmuje:

W opisanym powyżej zastosowaniu zazwyczaj etap ustalania (b) obejmuje:

(i) amplifikację kwasu nukleinowego obecnego w próbce w etapie (a); i (ii) wykrywanie obecności polipeptydu w powstałym zamplifikowanym kwasie nukleinowym.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, do ustalania predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego, przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania z przeciwciałami określonymi powyż ej, dla ustalenia predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do leczenia zakażenia przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B,

PL 192 129 B1 określany jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), który to sposób polega na tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, ż e aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny hamuje polipeptyd, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do leczenia zakażenia przez szczep wirusa 'S'-133 Oon.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do zapobiegania zakażeniu przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), który to sposób polega na tym, że:

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny hamuje polipeptyd, dla zidentyfikowania związku chemicznego który jest zdolny do zapobiegania zakażeniu przez szczep wirusa 'S'-133 Oon.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do leczenia raka wątrobowo-komórkowego, przy czym ten sposób polega na tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny hamuje polipeptyd, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do leczenia raka wątrobowo-komórkowego.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu, przy czym ten sposób polega na tym, że:

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny hamuje polipeptyd, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji, która zawiera polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przy czym ilości takiego polipeptydu są skuteczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwciał u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

PL 192 129 B1

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji, która zawiera polipeptyd mający sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 330 SEQ ID NO: 3, przy czym ilości takiego polipeptydu są skuteczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwciał u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji, która zawiera związek chemiczny zidentyfikowany sposobem określonym powyżej, w ilości skutecznej do leczenia raka wątrobowo-komórkowego, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji, która zawiera związek chemiczny zidentyfikowany sposobem określonym powyżej, w ilości skutecznej do zapobiegania rakowi wątrobowokomórkowemu, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji, która zawiera związek chemiczny zidentyfikowany sposobem określonym powyżej, w ilości skutecznej do leczenia zakażenia przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako ludzki wirus zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji, która zawiera związek chemiczny zidentyfikowany sposobem określonym powyżej, w ilości skutecznej do zapobiegania zakażeniu szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę ), oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kompozycji określonej powyżej do leczenia osobnika zakażonego szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę).

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kompozycji określonej powyżej do zapobiegania zakażeniu szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zakażenią wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę) u osobnika.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kompozycji określonej powyżej do wytwarzania leku do leczenia osobnika z rakiem wątrobowo-komórkowym.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania kompozycji określonej powyżej do wytwarzania leku do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu u osobnika.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu skriningu płynów ustrojowych od osobnika pod kątem szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, określanego jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), który to sposób polega na tym, że:

(a) uzyskuje się próbkę płynu ustrojowego od osobnika; i (b) ustala się obecność polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, w próbce z etapu (a) dla potwierdzenia ewentualnej obecnoś ci tego szczepu.

W szczególności jako płyn ustrojowy stosuje się krew, surowice lub próbkę kwasu nukleinowego z krwi lub surowic.

Wynalazek dotyczy ponadto szczepionki na wirusowe zapalenie wątroby typu B, która to szczepionka zawiera zmutowany główny antygen powierzchniowy szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.

Korzystnie ta szczepionka zawiera ponadto adiuwant.

Wynalazek umożliwia realizację sposobu leczenia osobnika z rakiem wątrobowo-komórkowym lub zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu, przez podawanie skutecznej ilości opisanych powyżej kompozycji.

W opisanych powyżej kompozycjach konkretna skuteczna ilość będzie zależała od wielkości polipeptydu, zdolności polipeptydu do biodegradacji, bioaktywności polipeptydu i biodostępności polipeptydu. Jeśli polipeptyd nie ulega szybko degradacji, jest biodostępny i wysoce aktywny, wymagana skuteczna ilość będzie mniejsza. Skuteczna ilość będzie znana fachowcom, będzie też zależała od postaci polipeptydu, wielkości polipeptydu i bioaktywności polipeptydu. Tak np. dzięki użyciu adiuwantu można

PL 192 129 B1 zmniejszyć wymaganą ilość polipeptydu. Fachowiec mógłby rutynowo wykonać empiryczne testy aktywności, aby określić bioaktywność w biooznaczeniach i w ten sposób określić skuteczną ilość.

Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki są dobrze znane fachowcom i należą do nich, ale nie wyłącznie, 0,01 - 0,1 M, korzystnie 0,05 M bufor fosforanowy lub 0,8% roztwór soli. Ponadto takie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą stanowić roztwory, zawiesiny i emulsje wodne lub niewodne. Do przykładowych niewodnych rozpuszczalników należą glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak olej oliwkowy i estry organiczne do wstrzyknięć, takie jak oleinian etylu. Do wodnych nośników należą woda, roztwory alkoholowo/wodne, emulsje lub zawiesiny, w tym sól fizjologiczna i buforowane ośrodki. Do nośników pozajelitowych należą roztwory chlorku sodu, dekstroza Ringera, dekstroza i chlorek sodu, mleczanowy roztwór Ringera lub utwardzone oleje. Do nośników dożylnych należą uzupełniacze płynu i składników odżywczych, uzupełniacze elektrolitów, takie jak oparte na dekstrozie Ringera itp. Mogą być też obecne konserwanty i inne dodatki, takie jak np. środki przeciwdrobnoustrojowe, przeciwutleniacze, związki chelatujące, obojętne gazy itp.

W całym opisie odnoś niki do konkretnych nukleotydów dotyczą nukleotydów obecnych na nici kodującej kwasu nukleinowego. Dla określenia konkretnych nukleotydów w całym opisie stosowane są następujące standardowe skróty: C - cytozyna, A - adenozyna, T - tymidyna, G - guanozyna.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono sekwencję nukleotydów genomu ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowanego z raka wątrobowo-komórkowego (HCC), który niesie mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego, złożonego z 3215 nukleotydów (fig. 3) kodujących 4 zachodzą ce na siebie białka przedstawione na fig. 4-7.

W szczególności ujawniono sekwencje czterech głównych białek wirusa obejmujących polimerazę DNA, antygen powierzchniowy duży/średni/główny, rdzeniowe i transaktywujący X. Te białka mogą być wytwarzane z zastosowaniem techniki rekombinacji technologii i stosowane w opracowaniu przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych.

Wynalazek zapewnia także układ diagnostyczny ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, specyficzny w stosunku do mutacji w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego, z wykorzystaniem opisanych powyżej sekwencji nukleotydów lub białek albo przeciwciał.

Poniżej opisano figury rysunku dla dokładniejszego przedstawienia wynalazku.

Figura 1. Struktura czterech otwartych ramek odczytu genomu ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowanego z HCC (z mutacją metionina na treoninę w reszcie aminokwasu 133 głównego antygenu powierzchniowego, zaznaczoną gwiazdką). Główne białka wirusowe: polimeraza DNA, antygen powierzchniowy duży/średni/główny, przedrdzeniowy, rdzeniowy i transaktywujący X są określone odpowiednio jako PreS 1/PreS2/S, PreC, C i X.

Figura 2. Strategia klonowania i określania sekwencji tego samego genomu wirusa zapalenia wątroby typu B.

Figura 3. Pełna sekwencja nukleotydów ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowanego z HCC, niosącego mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego (SEQ ID NO: 1). Mutacja jest przedstawiona w kwasach nukleinowych oznaczonych 551 - 553.

Figura 4. Wydedukowana sekwencja aminokwasów polimerazy DNA z sekwencji nukleotydów fig. 3 (SEQ ID NO: 2).

Figura 5. Wydedukowana sekwencja aminokwasów dużego antygenu powierzchniowego z sekwencji nukleotydów fig. 3 (SEQ ID NO: 3). Zmutowana reszta aminokwasu (M na T) ma numer 307.

Figura 6. Wydedukowana sekwencja aminokwasów białka rdzenia z sekwencji nukleotydów fig. 3 (SEQ ID NO: 4).

Figura 7. Wydedukowana sekwencja aminokwasów transaktywującego białka X z sekwencji nukleotydów fig. 3 (SEQ ID NO: 5).

Figura 8. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca miejscu inicjacji regionu kodującego polimerazy DNA, w pozycji 2307 genomu wirusa, która odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny) (SEQ ID NO: 6).

Figura 9. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca pozycji 250 sekwencji nukleotydów wirusa, która odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny) (SEQ ID NO: 7).

Figura 10. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca pozycji 250 sekwencji nukleotydów wirusa, która odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny) (SEQ ID NO: 8).

PL 192 129 B1

Figura 11. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca kodonowi stop regionu kodującego polimerazy DNA, w pozycji 1623 genomu wirusa, która odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny) (SEQ ID NO: 9).

Figura 12. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca pozycji 1420 genomu wirusa, która odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny) (SEQ ID NO: 10).

Figura 13. Sekwencja oligonukleotydów odpowiadająca pozycji 2340 genomu wirusa, która odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny) (SEQ ID NO: 11).

Niniejszy wynalazek zilustrowano w poniższej części opisu dotyczącej przeprowadzonych doświadczeń, dla przedstawienia i lepszego zrozumienia wynalazku, bez ograniczania jego zakresu.

W sposobie opisanym poniż ej wyizolowano ludzki wirus zapalenia wą troby typu B niosą cy mutację w pozycji aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego i okreś lono jego sekwencję nukleotydów.

Próbkę surowicy (5194) uzyskano od 63-letniej chińskiej pacjentki będącej nośnikiem antygenu powierzchniowego. Następnie potwierdzono, że to pacjentka z HCC, za pomocą biopsji. Wirus zapalenia wątroby typu B z jej surowicy niósł mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) w głównym antygenie powierzchniowym, jak wykazano przez uprzednią analizę sekwencyjną epitopu „a. Wirusowy DNA wyekstrahowano przed określeniem jego sekwencji w opisany sposób.

Jak opisano w przykładach poniżej, genom tego zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B z HCC, niosą cego mutację w reszcie aminokwasu 133 gł ównego antygenu powierzchniowego skł ada się z 3215 nukleotydów, i jest identyczny z genomem wirusa typu dzikiego, tego samego podtypu (adr). Otwarte ramki odczytu (ORF) kodujące główne białka wirusowe znajdują się w odpowiadających pozycjach, przy porównywaniu z wirusem typu dzikiego. Pozycja 1 w genomie zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B jest określana według wirusa typu dzikiego.

Struktura różnych ORF w genomie zmutowanego ludzkiego wirusa jest tu opisana i przedstawiona na fig. 1. Pozycje wskazane są w sposób następujący.

- Gen polimerazy DNA rozpoczyna się w pozycji 2307 i kończy się w pozycji 1623, tak więc składa się z 2532 nukleotydów i koduje 843 reszty aminokwasów;

- Gen dużego antygenu powierzchniowego rozpoczyna się w pozycji 2848 i kończy w pozycji 835, składa się więc z 1203 nukleotydów i koduje 400 reszt aminokwasów. Ten duży antygen powierzchniowy zachodzi na średni antygen powierzchniowy, który zaczyna się w pozycji 3205 i główny antygen powierzchniowy, który zaczyna się w pozycji 155. Zarówno średni (złożony z 281 reszt aminokwasów) i główny (złożony z 226 reszt aminokwasów) antygen powierzchniowy kończy się w tej samej pozycji jak duży antygen powierzchniowy;

- Gen rdzeniowy zaczyna się w pozycji 1814 i koń czy w pozycji 2452, zawiera wię c 639 nukleotydów i koduje 212 reszt aminokwasów.

- Gen transaktywują cy X zaczyna się w pozycji 1374 i koń czy się w pozycji 1838, zawiera wię c 465 nukleotydów i koduje 154 reszty aminokwasów.

Co więcej, analiza sekwencyjna ustaliła, że ten zmutowany wirus zapalenia wątroby typu B należy do podtypu adr, na co wskazuje reszta lizyny i reszta argininy, odpowiednio w pozycjach 122 i 160 w gł ównym antygenie powierzchniowym. Zgodnie z uprzednią analizą epitopu „a przez bezpośrednie sekwencjonowanie mutacja (metionina na treoninę) znajduje się w reszcie 133 aminokwasu głównego antygenu powierzchniowego.

W porównaniu z dzikim wirusem zapalenia wą troby typu B zdeponowanym w bazie danych Genbank (numer dostępu D16665), identyczność tego szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B wynosi 90,3% dla sekwencji nukleotydów. Identyczność różnych białek wirusowych obecnego zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B w porównaniu z jego odpowiednikiem wirusem typu dzikiego wynosi 95,8%, 97,5%, 95,1% i 94,8%, odpowiednio dla białek polimerazy DNA (PIR - numer dostępu Protein Identification Resources S434951), dużego antygenu powierzchniowego (PIR numer dostępu JQ2107), rdzenia (PIR numer dostępu S43490) i transaktywującego X (PIR numer dostępu S35529). Odwrotnie, liczne podstawienia aminokwasów są obecne w każdym z białek wirusa w porównaniu z ich dzikimi odpowiednikami, przy czym obejmują one: 5 mutacji w polimerazie DNA, 5 w dużym antygenie powierzchniowym (obejmując zmianę metionina na treoninę dla kodonu inicjacyjnego głównego antygenu powierzchniowego), 5 w rdzeniu i 4 w transaktywującym białku X.

Genom ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowany z HCC i niosący mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę ) gł ównego antygenu powierzchniowego moż na stosować jako materiał do zaprojektowania oligonukleotydów specyficznych dla zmutowanego

PL 192 129 B1 genomu wirusa. Te oligonukleotydy można stosować jako materiał do wysoce specyficznych środków diagnostycznych, które wykrywają wirus pochodzący z HCC, niosący mutację w reszcie aminokwasu 133 głównego antygenu powierzchniowego.

Genom ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, z mutacją w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego można stosować jako materiał do wytwarzania białek zgodnych z wynalazkiem przez ekspresję wektora, który niesie odpowiedni region kodujący i może namnażać się w komórkach gospodarza takiego jak Escherichia coli, drogą standardowej techniki rekombinacji DNA.

Białka zgodne z wynalazkiem są użyteczne jako materiał do wysoce specyficznych środków diagnostycznych zdolnych do detekcji wirusa zapalenia wątroby typu B z HCC niosącego mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę ) gł ównego antygenu powierzchniowego. Stosują c znane metody takie same białka można stosować do wytwarzania poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał.

Poliklonalne i monoklonalne przeciwciała można stosować jako materiał do środków diagnostycznych do detekcji z wysoką specyficznością antygenów wirusa zapalenia wątroby typu B z HCC z mutacją w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę ) gł ównego antygenu powierzchniowego.

Układ detekcji, w którym stosuje się każde białko zgodne z wynalazkiem lub białka z częściowym zastąpieniem aminokwasów i układ detekcji, w którym stosuje się monoklonalne lub poliklonalne przeciwciała na takie białka, są użyteczne jako wysoce specyficzne środki diagnostyczne zdolne do detekcji ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z HCC, do detekcji tego wirusa u pacjentów, którzy są nosicielami antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B, a więc mogą być wówczas zagrożeni rozwojem HCC. Białka lub przeciwciała takich białek można stosować jako materiał dla rozwoju profilaktycznych i terapeutycznych szczepionek przeciw temu szczepowi wirusa.

Dobrze wiadomo, że jeden lub większa liczba nukleotydów w sekwencji DNA może być podstawionych innymi nukleotydami i wytwarzać takie samo białko. Możliwe są także takie zmiany nukleotydów, że kodowane białka są zgodne z wynalazkiem. Wiadomo równie dobrze, że jeden lub większa liczba aminokwasów w sekwencji białka może być zastąpionych przez inne analogiczne aminokwasy, zdefiniowane przez ich właściwości hydrofilowe lub ładunki, z wytworzeniem analogu sekwencji aminokwasów. Można stosować dowolne analogi białek zgodnych z wynalazkiem, obejmujące zastąpienia, delecje, izostery (zmodyfikowane aminokwasy, które wykazują bliskie podobieństwo strukturalne i przestrzenne do aminokwasów białek) lub addycje aminokwasów, o ile wynikaj ące sekwencje wywołują powstanie przeciwciał rozpoznających wirus zapalenia wątroby typu B z HCC z mutacją w aminokwasie 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego.

P r z y k ł a d y

Sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B wyizolowanego z HCC i niosącego mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego, określono w sposób następujący.

1. Izolacja wirusowego DNA

Wirusowy DNA wyizolowano z próbki surowicy (5194) pobranej od 63-letniej chińskiej pacjentki będącej nośnikiem antygenu powierzchniowego. Następnie potwierdzono, że jest to pacjentka z HCC, za pomocą biopsji. Wirus zapalenia wątroby typu B z jej surowicy niósł mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) w głównym antygenie powierzchniowym, jak wykazano drogą uprzedniej analizy sekwencyjnej epitopu „a”.

Stosowano następującą metodę izolacji.

Dodano 200 μΐ próbki surowicy z 400 μΐ buforu do lizy (chlorek Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM i dodecylosiarczan sodu 2%) i 25 μl proteinazy K (20 mg/ml) i prowadzono inkubację w 65°C przez 3 godziny. Wirusowy DNA następnie wyekstrahowano za pomocą fenolu/chloroformu i strącono etanolem.

2. Amplifikacja wirusowego DNA drogą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Genom wirusa według wynalazku zamplifikowano drogą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z użyciem 3 zestawów zachodzących na siebie oligonukleotydów, które zaprojektowano na podstawie wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego. Włączono różne miejsca restrykcyjne, aby ułatwić klonowanie produktów PCR. Pozycję tych oligonukleotydów przedstawiono na fig. 2 i wskazano w sposób następujący:

- Flag 1 (ATAAGCTTATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGA) (SEQ ID NO: 6) rozpoczyna się przy miejscu inicjacji regionu kodującego polimerazy DNA w pozycji 2307 sekwencji nukleotydów

PL 192 129 B1 wirusa i odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne Hindlll;

- Xba3 (GAGTCTAGACTCTGCGGTATTGTGA) (SEQ ID NO: 7) rozpoczyna się przy wewnętrznym miejscu restrykcyjnym Xbal w pozycji 250 sekwencji nukleotydów wirusa i odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne Xbal;

- Xba5 (GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCT) (SEQ ID NO: 8) rozpoczyna się przy wewnętrznym miejscu Xbal w tej samej pozycji jak miejsce startu oligonukleotydu Xba3, ale odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne Xbal;

- Common 3 (TGAGAATTCTCACGGTGGTCTCCATGCGACGT) (SEQ ID NO: 9) rozpoczyna się przy kodonie stop polimerazy DNA w pozycji 1623 sekwencji nukleotydów wirusa i odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne EcoRI;

- V11 (TTTGTTTACGTCCCGT) (SEQ ID NO: 10) rozpoczyna się blisko miejsca inicjacji genu X w pozycji 1420 sekwencji nukleotydów wirusa i odpowiada nici kodującej (oligonukleotyd sensowny);

- HindlllADW3 (CTAAGCTTAGTTTCCGGAAGTGTTGAT) (SEQ ID NO: 11) rozpoczyna się blisko miejsca inicjacji polimerazy DNA w pozycji 2340 i odpowiada nici komplementarnej (oligonukleotyd antysensowny). Podkreślono dodatkowe miejsce restrykcyjne Hindlll.

Zastosowano wirusowy DNA jako matrycę i przeprowadzono PCR w termocyklerze do DNA (Perkin-Elmer, Cetus) przez 35 cykli z użyciem polimerazy Pfu (Stratagene, USA), przy czym każdy cykl trwał 1,5 minuty w temperaturze denaturującej 94°C, 2 minuty w temperaturze hybrydyzacji 53°C i 4 minuty w temperaturze elongacji 72°C. Zastosowano następujące połączenia oligonukleotydów: Flag1/Xba3, Xba5/Common 3 i V11/HindIIIADW3 i otrzymano produkty amplifikacji odpowiednio o wielkości odpowiednio 1,2 kb, 1,4 kb i 1,1 kb.

3. Klonowanie fragmentów zamplifikowanego wirusowego DNA

Zamplifikowany fragment wirusowego DNA z Flag1/Xba3 (1,2 kb) poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Xbal przed klonowaniem w plazmidzie Bluescript potraktowanym wstępnie takimi samymi enzymami restrykcyjnymi. Podobne trawienie Xbal i EcoRI zastosowano w przypadku produktu PCR z Xba 5/Common 3 (1,4 kb), przed sklonowaniem w plazmidzie Bluescript trawionym Xbal i EcoRI. Natomiast fragment DNA zamplifikowany z V11 i HindlllADW (1,1 kb) wklonowano bezpośrednio do plazmidu Zero-Blunt, opracowanego przez InvitroGen (USA) do klonowania fragmentów o tępych końcach.

4. Określenie sekwencji nukleotydów

Sekwencję nukleotydów ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B wyizolowanego z HCC i opisanego powyżej określono na matrycy z plazmidowego DNA za pomocą inhibitorów terminujących łańcuch, z użyciem zestawu Sequenase DNA Sequencing Kit (United States Biochemical Corp.). Aby ułatwić procedury sekwencjonowania opracowano różne oligonukleotydy wewnętrzne (od V1 do V16) według cech wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego i ich pozycje wskazano na fig. 2.

Na podstawie analizy opisanej powyżej, określono sekwencję nukleotydów pełnej długości wirusa zapalenia wątroby typu B wyizolowanego z HCC i niosącego mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego, jak przedstawiono na fig. 3. Wydedukowane sekwencje aminokwasów kodujące główne białka wirusowe przedstawiono na fig. 4-7: polimeraza DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (fig. 4), duży antygen powierzchniowy obejmujący średni antygen i główny antygen powierzchniowy (fig. 5), białko rdzenia (fig. 6) i transaktywujące białko X (fig. 7).

Porównanie sekwencji wirusa według wynalazku z innymi sekwencjami wirusa zapalenia wątroby typu B dostępnymi w bazie danych GenBank wykaże specyficzne różnice sekwencji, które z kolei można wykorzystać do zaprojektowania sond DNA. Można wówczas opracować układ detekcji z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Takie reakcje PCR będą obejmowały połączenia oligonukleotydów specyficznych w stosunku do ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, określonego w opisie, z mutacją w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego, co umożliwia wysoce specyficzną detekcję tego zmutowanego wirusowego DNA. Pokrótce, wirusowy DNA można wyekstrahować w sposób podany w opisie. Można przeprowadzić reakcje PCR stosując specyficzne oligonukleotydy i podobne warunki cykli jak opisane powyżej. Wyniki można następnie zanalizować po rozdziale produktów PCR w 1% żelu agarozowym.

Zgodnie ze znanymi procedurami immunologicznymi można określić epitopy z sekwencji białek, takich jak te na fig. 4-7. Określenie tych epitopów specyficznych dla ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z HCC i niosących mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego

PL 192 129 B1 antygenu powierzchniowego umożliwi syntezę peptydów znanymi metodami inżynierii genetycznej, syntezę białek, wytwarzanie przeciwciał specyficznych dla tych epitopów, opracowanie specyficznych odczynników diagnostycznych, opracowanie profilaktycznych i terapeutycznych szczepionek i środków przeciwwirusowych.

Można opracować układ detekcji dla przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B wyizolowanemu z HCC i niosącemu mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego, stosując poliwinylowe płytki do mikromianowania i metodę typu „sandwich. Pokrótce, 50 μΐ peptydu w stężeniu 5 μg/ml z wirusa zapalenia wątroby typu B wyizolowanego z HCC i niosącego mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego można umieścić w każdej studzience płytek do mikromianowania i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w celu konsolidacji. Podobną procedurę można zastosować do białka oczyszczonego z komórek gospodarza, takiego jak Escherichia coli. Płytki do mikromianowania można przemyć 5 razy fizjologicznym roztworem soli, zawierającym 0,05% Tween 20. Dla pokrycia można do każdej studzienki dodać 100 μl buforu NaCl zawierającego 30% (obj.) surowicy cielęcej i 0,05% Tween 20 (bufor CS) w każdej studzience, i usunąć po inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Aby określić przeciwciała specyficzne dla zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B (metionina na treoninę w reszcie aminokwasu 133 głównego antygenu powierzchniowego) w surowicy można przeprowadzić reakcję podstawową tak, że można umieścić 50 μl buforu CS i 10 μl próbki surowicy w każdej studzience płytki do mikromianowania i prowadzić inkubację z użyciem wibratora do mikropłytek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przeprowadzeniu reakcji podstawowej płytki do mikromianowania przemywa się pięć razy jak opisano powyżej.

W reakcji wtórnej 1 ng monoklonalnych mysich, przeciwludzkich przeciwciał IgG, znakowanych peroksydazą chrzanową, rozpuszczonych w 50 μl surowicy cielęcej, można rozmieścić w każdej studzience mikropłytek i inkubować z użyciem wibratora do mikropłytek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu można przemyć studzienki pięć razy w taki sam sposób. Po dodaniu nadtlenku wodoru (jako substratu) i 50 μl roztworu O-fenylenodiaminy (do wywołania barwy) do każdej studzienki i po inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej można dodać 50 μl 4 M kwasu siarkowego do każdej studzienki, aby zapobiec dalszemu pogłębianiu się barwy i odczytać absorbancję przy 490 nm.

Wynalazek umożliwia detekcję zmutowanych wirusów zapalenia wątroby typu B, w szczególności tych, które niosą mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego. Wynalazek zapewnia także układy zdolne do wysoce specyficznej i czułej detekcji we wczesnym stadium infekcji lub rozwoju HCC, gdy HCC można leczyć i wyleczyć.

Dodatkowo te cechy pozwalają na dokładną diagnozę pacjenta we wczesnym stadium w HCC, a także ułatwiają hamowanie z wyższą skutecznością zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B.

Białka i ich przeciwciała według wynalazku można stosować do opracowania szczepionek profilaktycznych i terapeutycznych, a także farmaceutyków immunologicznych. Informacje o sekwencji strukturalnych genów tych zmutowanych wirusów będą pomocne w opracowywaniu układów detekcji odnośnych antygenów białkowych i przeciwciał.

Kompleksy antygen-przeciwciało można wykrywać znanymi sposobami. Specyficzne przeciwciała monoklonalne i poliklonalne można uzyskać przez immunizację zwierząt, takich jak myszy i króliki, peptydami lub białkami, specyficznymi w stosunku do zmutowanych wirusów zapalenia wątroby typu B z HCC. Można zaprojektować hamujące środki przeciwwirusowe i ukierunkować je na te białka i cząsteczki w hodowli komórkowej lub in vivo.

Wynalazek jest oparty na badaniach genomu ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B, wyizolowanego z HCC i niosącego mutację w reszcie aminokwasu 133 (metionina na treoninę) głównego antygenu powierzchniowego. Wynalazek umożliwia wysoce specyficzną detekcję zmutowanego wirusa zapalenia wątroby typu B z HCC i zapewnia materiał, taki jak białko, poliklonalne i monoklonalne przeciwciała, do opracowania takich układów detekcji.

PL 192 129 B1

Pozycje literaturowe

1. Oon, C-J., „Viral hepatitis B in Singapore; epidemiology, prevention and control-monitoring the hepatitis B programme and management of carriers J. Royal College Physic. London (1997), w druku.

2. Ogata, N. i inni, „Infectivity and pathogenicity in chimpanzees of a surface gene mutant of hepatitis B virus that emerged in a vaccinated infant J. Infec. Disease (1997) 175: 511-523.

3. Oon, C-J., „Issues associated with HBV mutant strains J. Royal College Physic. London (1997), w druku.

4. Oon, C-J. i inni, „Hepatitis B surface antigen (HB-sAg) mutants - their significance Annals Acad. Med. Singapore (1997), w druku.

5. Tsai, J.F. i inni, „Additive effect modification of hepatitis B surface antigen and e antigen on the development of hepatocellular carcinoma Brit. J. Cancer (1996) 73: 1498-1502.

6. Oon, C-J., „Molecular epidemiology of hepatitis B 'a' variants and mutants: significance in immune population JAMA (1996) 12: str. 5-6.

7. Goh, K-T, „Hepatitis B immunization in Singapore Lancet (1996) 348: 1385-1386.

8. Oon, C-J. i inni, „Natural history of hepatitis B surface antigen mutants in children Lancet (1996) 348: 1524-1525.

9. Harrison, T.J., „Genetic variation in hepatitis B virus Eur. J. Gastroenter. & Hepatol. (1996) 8: str. 306-311.

10. Oon, C-J. i inni, „Molecular epidemiology of hepatitis B virus vaccine variants in Singapore Vaccine (1995) 13: 699-702.

11. Oon, C-J. i inni, „Molecular epidemiology of hepatitis B variants and mutants - significance and transmissibility Proc. 3rd Internatl. Syrop. Viral Hepatitis & HCC. Singapore (1995) str. 39-43.

12. Carman, W. i inni, „Viral genetic variation: hepatitis B virus as a clinical example Lancet (1993) 341: 349-353.

13. Harrison, T.J., „Variants of hepatitis B virus Vox Sang (1992) 63: 161-167.

14. Carman, W.F. i inni, „Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus Lancet (1990)

336: 325-329.

PL 192 129 B1

Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Tytuł wynalazku: Zmutowany szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B i jego zastosowanie (ii) Liczba sekwencji: 11 (2) Informacja o SEQ ID NO: 1: (Figura 3) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 3215 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: podwójna (D) Topologia: kolista (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1:

CTCCACAACA	ttccaccaag	CTCTGCTAGA	TGG GAGG GTG	AGGGGCCTAT	ATTTTGCTGC	60
TG3TGGCTCC	AGTTCCGGAA	CAGTAAACCC	TGTTCCGACT	ACTGCCTGTC	CCATATCGTC	12 0
AATCTTCTCG	AGGACTGGGG	ACCCTGCACC	GAACATGGAG	AACACAACAT	CAC-GATTCCT	180
AGGACCCCTG	CTCGTGTTAC	AGGCGGGGTT	TTTCTCGTTO	ACAAGAATCC	TGAGAATACC	240
GCAGAGTCTA	GACTCTGGTG	GACTTCTCTC	AKTTTTCTAG	GGGGAGCACC	CACGTGTTCC	300
TGGCCAAAAT	TCGCAGTCCC	CAACCTCCAA	TCACTCACCA	ACCTCTTGTC	CTCCAATTTG	360

TCCTGGCTAT C3CTGGAT3T GTCTGCGGCG TTTTATCATA TTCCTCTTCA TCCTGCTGCT 420

ATGCCTCATC TTCTTGTTGG TTCTTCTGGA CTACCAAGGT ATGTTGCCCG TTTGTCCTCT ASO

ACTTCCAG3A ACATCAACCA CCAGCACGGG GCCATGCAAG ACCTGCACGA CTCCTGCTCA 540

A3GAAACT Cl*	ACGTTTCCCT	CTTGTTGCTG	TACAAAACCT	TCGGACGGAA	ACTGCACTTG	600
TATTCCCATC	CCATCATCCT	GGGCTTTCGC	AAGATTCCTA	TGoGAGTGGG	CCTCAGTCCG	660
TTTCTCCTGG	CTCAGTTTAC	TAGTGCCATT	TGTTCAGTGG	TTCGTAGGGC	TTTCCCCCAC	720
TGTTTG3CTT	TCAGTTATAT	GG AT GAT GTG	t: - η 1 * Cikjts	CGAAGTCTGT	ACAACATCTT	780
GAGTCGGTTT	TTACCTCTAT	TACGAATTTT	CTT!¹ TGT CTT	TGGGTATACA	TTTAAACCCT	840
AATAAAACGA	AACGTTGGGG	CTACTGCGTT	AACTTCATGG	GATATGTAAT	TGGAAGTTGG	900
GGTACTT_AC	CGCAGGAACA	TATTGTACTA	AAACTCAAGC	AATGTTTTCG	AAAACTGCCT	S60
GTAAATAGAC	CTATTGATTG	GAAAGTATGT	CAAAGAATT 3	iii	GGGCTTTGCT	1020
GCCCCTTTTA	CACAATGTGG	CTATCCTGCC	TTGATGCCTT	TATATGCATG	TATACAATCT	1080
AAGCAGGCTT	TCACTTTCTC	GCCAACTTAC	AAGGCCTTTC	TGTGTAAACA	ATATCTGAAC	1140
CTTTACCCCG	TTGCCCGGCA	ACGGTCCGGT	CTCTGCCAAG	TGTTTGCTGA	CGCAACCCCC	1200
ACTGGATGGG	GCTTGGCCAT	AGGCCATCAG	CGCATggctg	GAACCTTTCT	GGCTCCTCTG	1260
CCGATGCATA	CTGTGGAACT	CCTAGGAGCT	TGTTTTGCTC	GCAGCCGGTC	TGGAGCAAAA	1320

PL 192 129 B1

CTTATCGGAA	CCGACAACTC	TGTTGTCCTC	TCTCGGAAAT	ACACCTCCTT	TCCATGGCTG	13S0
CTAGGCTGTG	CTGCCAACTG	GATCCTGCGC	GGGACGTCCT	TTGTCTACGT	CCCGTCGGCG	1440
CTGAATCCCG	CGGACGACCC	GTCTCGGGGC	CGTTTGGGGC	TCTACCGTCC	CCTTCTTCAT	1500
CTGCCGTTCC	GGCCGACCAC	GGGGCGCACC	TCTCTTTACG	CGGTCTCCCC	GTATGTGCCT	1560

TCTCATCTGC CGGACCSTGT GCACTTCGCT TCACCTCTGC ACGTCGCATG GAGACCACCG 1620

TGAACGCACG CCAGGTCTTG CCCAAG3TCT TATATAAGAG GACTCTTGGA CTCTCAGCAA 1660

TGTCAACGAC CGACCTTGAG GCATACTTCA AAGACTGTGT GTTTAAAGAC TGGGAGGAGT 1740

TGGGGGAGGA GATTAGGTTA AAGATTTATG TACTAGGAGG CTGTAGGCAT AAATTGGTCT 13 00

gttcaccagc	ACCATGCAAC	TTT TTC T CC T	CTGCCTAATC	ATCTCATGTT	CATGTCCTAC	1360
TGTTCAAGCC	TCCAAGCTGT	GCCTTGGGTG	GCTTTGGGAC	ATGGACATTG	ACCCGTATAA	1520
AGAATTTGGA	GCATCTGCTG	AGTTACTCTC	TTTTTTGCCT	TCTGACTTCT	TTCCGTCTAT	19Θ0
tcgagatctc	CTCGACACCG	CCTCTGCTCT	GTATCGGGAG	GCCTTAGAGT	CTCCGGAACA	2040
ttgttcgcct	CACCATACAG	CACTCAGGCA	AGCTATTTTG	TGTTGGGGTG	AGTTGATGAA	2100
TCTGGCCACC	TGGGTGGGAA	GTAATTTGGA	AGATCCAGCA	TCCAGGGAAT	TAGTAGTCAG	2160
CTATSTCAAC	GTTAATATGG	GCCTAAAACT	CAGACAAATA	TTGTGGTTTC	ACATTTCCTG	2220
TCTTACTTTT	GGAAGAGAAA	CTGTTCTTGA	GTACTTGGTA	TCTTTTGGAG	TGTGGATTCG	2290
CACTCCTACC	gcttacagac	CACCAAATGC	CCCTATCTTA	TCAACACTTC	CGGAAACTAC	2340
TGTTGTTAGA	CGACGAGGCA	GGTCCCCTAG	AAGAAGAACT	CCCTCGCCTC	GCAGACGAAG	2400
GTCTCAATCG	CCGCGTCGCA	GAAGATCTCA	ATCTCGGGAA	TCTCAACGTT	AGTATTCCTT	2460
GGACTGATAA	GGTGGGAAAC	TTTACTGGGC	TTTATTCTTC	TACTGTACCT	GTCTTTAATC	2520
CGGAGTGGCA	AATTCCTTCC	TTTCCTCACA	TTCATTTACA	AGAGGACATT	ATTAATAGAT	25Θ0
GTCAACAATA	TGTGGGCCCT	CTTACAGTTA	ATGAAAAAAG	AAGATTAAAA	TTAATTATGC	2640
CTGCTAGGTT	TTATCCTAAC	CTTACTAAAT	ATTTGCCCTT	AC ACAAAGGC	ATTAAACCGT	2700
ATTATCCTGA	ACATGCAGTT	AATCATTACT	TCAAAACTAG	GCATTATTTA	' CATACTCTGT	2760

GGAAGGCTGG CATTCTATAT AAGAGAGAAA CTACACGCAG CGCCTCATTT TGTGGGTCAC 2320 CATATTCTTG GGAACAAGAG CTACAGCATG GGAGGTTGGT CTTCCAAACC TCGACAAGGC 2 6B0 ATGGGGAGCA ATCTTGCTGT TCCCAATCCT CTGGGATTCT TTCCCGATCA CCAGTTGGAC 2340

CCTGCGTTCG GAGCCAACTC AAACAATCCA GATTGGGACT TCAACCCCAA CAAGGATCAC 300 0

TGGCCAGAGG	CAAATCAGGT	AGGAGTGGGA	GCATTCGGGC	CAGSGTTCAC	CCCACCACAC	3060
GGCGGTCTTT	TGGGGGgGALj	CCCTCAGGCT	CAGGG CAT AT	TGACAACAGT	GCCAGCAGCA	3120
CCTCCTCCTG	CCTCCACCAA	TCGGCAGTCA	GGAAGACAGC	CTACTCCCAT	CTCTCCACCT	3130
CTAAGAGACA	gtcatcctca	GGCCACGCAG	TGGAA			321Ξ

(2) Informacja o SEQ ID NO: 2: (Figura 4) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 843 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa

PL 192 129 B1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 2:

Het 1

Pro '

Leu

Ser

Tyr 5

Gin

His

Phe Arg

Lys 10

Leu :

Leu

Asp 15

Asp

Glu

Ala

Gly

Pro 20

Leu

Glu

Leu 25

Pro

Arg

Leu

Ala

Asp 30

Glu

Gly

Leu

Asn

Arg 35

Arg

Val

Ala

Glu

Asp 40

Leu

Asn

Leu

Gly

Asn 45

Leu

Asn

Val

Ser

Ile 50

Pro

Trp

Thr

His

Lys 55

Val

Gly

Asn

Phe

Thr 60

Gly

Leu

Tyr

Ser

Ser 65

Thr

Val

Pro

Val

Phe 70

Asn

Pro

Glu

Trp

Gin 75

Ile

Pro

Ser

Phe

Pro BO

His

Ile

His

Leu

Gin 85

Glu

Asp

Ile

Asn 90

Arg

Cys

Gin

Tyr 95

Val

Gly

Pro

Leu

Thr 100

Val

Asn

Glu

Lys

Arg 10 5

Arg

Leu

Lys

Leu

Ile 110

Met

Pro

Ala

Arg

Phe 115

Tyr

Pro

Asn

Leu

Thr 120

Lys

Tyr

Leu

Pro

Leu 12 5

Asp

Lys

Gly

Ile

Lys 130

Pro

Tyr

Pro

Glu 135

His

Ala

Val

Asn

His 14 0

Tyr

Phe

Lys

Thr

Arg 145

His

Tyr

Leu

His

Thr 150

Leu

Trp

Lys

Ala

Gly 155

Ile

Leu

Tyr

Lys

Arg 160

Glu

Thr

Arg

Ser 165

Ala

Ser

Phe

Cys

Gly 170

Ser

Pro

Tyr

Ser

Trp 17S

Glu

Gin

Glu

Leu

Gin ISO

His

Gly

Arg

Leu

Val 13 5

Phe

Gin

Thr

Ser

Thr 190

Arg

Eis

Gly

Asp

Glu 195

Ser

Cys

Ser

Gin 200

Ser

Gly

Ile

Leu 205

Ser

Arg

Ser

Pro

Val 210

Gly

Pro

Cys

Val

Aro 215

Ser

Gin

Leu Lys

Gin 220

Ser

Arg

Leu

Gly

Leu 225

Gin

Pro

Gin

Gly 230

Ser

Leu

Ala

Arg Gly 235

Lys

Ser

Gly

Arg

Ser 240

Gly

Ser

Ile

Arg

Ala 245

Arg

Val

His

Pro

Thr Thr 250

Arg

Ser

Phe 255

Gly

Glu

Pro

Ser 260

Gly

ser

Gly

His

Ile 265

Asp Asn

Ser

Ala

Ser 270

Ser

Thr

Ser

Cys 275

Leu

His

Gin

Ser

Ala 2S0

Val

Arg Lys

Thr

Ala 285

Tyr

Ser

His

Leu

Ser 290

Thr

Ser

Lys

Arg

Gin 295

Ser

Ser Gly

His 300

Ala

Val

Glu

Leu

His 305

Asn

Ile

Pro

Ser 310

Ser

Ala

Arg

Ser Gin 315

Gly

Glu

Gly

Pro

Ile 320

Phe

Ser

Cys

Trp

Trp 325

Leu

Gin

Phe

Arg

Asn Ser 330

Lys

Pro

Cys

Ser 335

Asp

Tyr

Cys

Leu

Ser 340

Eis

Ile

Val

Asn

Leu 345

Leu Glu

Asp

Trp

C-ly 350

Pro

Cys

Thr

Glu

His 355

Gly

Glu

His

Asn

Ile 360

Arg

Ile Pro

Arg

Thr 365

Pro

Ala

Arg

Val

Thr 370

Gly

Val

Phe

Leu 37S

Vai

Asp

Lys Asn

Pro 380

His

Asn

Thr

Ala

Glu 385

Ser

Arg

Leu

Trp

Trp 390

Thr

Sar

Leu

Asn Phe 395

Leu

Gly

Ala

Pro 400

Thr

Cys

Ser

Trp

Pro

Lys

Phe

Ala

Val

Pro Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Thr

405 410 115

PL 192 129 B1

Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Len Asp Val Ser Ala

420

425

430

Ala

Phe

Tyr

His

Ile

Pro

Leu

His

Pro

Ala

Met

Pro

His

Leu

435

440

445

Val

Gly 450

Ser

Gly

Leu

Pro 4SS

Arg

Tyr

Val

Ala

Arg 460

Leu

Ser

Thr

Ser 465

Arg

Asn

Ile

Asn

His 470

Gin

His

Gly

Ala

Met 475

Gin

Asp

Leu

His

Aso 400

Ser

Cys

Ser

Arg

Lys 405

Leu

Tyr

Val

Ser

Leu 490

Leu

Tyr

Lys 495

Thr

Phe

Gly

Arg

Lys 500

Leu

His

Leu

Tyr

Ser SOS

His

Pro

Ile

Leu 510

Gly

Phe

Arg

Lys

Ile

Pro

Het

Gly

Val

Gly

Leu

Ser

Pro

Phe

Leu

Ala

Gin

515

520

52S

Phe

Thr 530

Ser

Ala

Ile

Cys

Ser 535

Val

Arg

Ala 540

Phe

Pro

His

Cys

Leu 545

Ala

Phe

Ser

Tyr

Ket 550

Asp

Val

Leu 555

Gly

Ala

Lys

Ser

Val 560

Gin

His

Leu

Glu

Ser

Leu

Phe

Thr

Ser

Ile

Thr

Asn

Phe

Leu

Ser

Ξ65

570

575

Leu

Gly

Ile

His 500

Leu

Asn

Pro

Asn

Lys 535

Thr

Lys

Arg

Trp

Gly 590

Tyr

Ser

Leu

Asn.

Phe

Ket

Gly

Tyr

Val

Ile

Gly

Ser

Trp

Gly

Thr

Leu

Pro

Gin

595

600

60S

Glu

His 610

Ile

Val

Leu

Lys

Leu 61S

Lys

Gin

Cys

Phe

Arg 620

Lys

Leu

Pro

Val

Asn 525

Arg

Pro

Ile

Asp

Tr? 630

Lys

Val

Cys

Gin

Arg 635

Ile

Val

Gly

Leu

Leu 640

Gly

Phe

Ala

Pro

Phe

Thr

Gin

Cys

Gly

Tyr

Pro

Ala

Leu

Met

Pro

645

650

655

Leu

Tyr

Ala

Cys

Ile

Gin

Ser

Lys

Gin

Ala

Phe

Thr

Phe

Ser

Pro

Thr

660

665

670

Tyr

Lys

Ala

Phe

Leu

Cys

Lys

Gin

Tyr

Leu

Asn

Leu

Tyr

Pro

Val

Ala

67 5

6S0

6SS

Arg

Gin 690

Arg

Ser

Gly

Leu

Cys 695

Gin

Val

Phe

Ala

Aso 700

Ala

Thr

Pro

Thr

Gly 705

Trp

Gly

Leu

Ala

Ile 710

Gly

His

Gin

Arg

Met 715

Ala

Gly

Thr

Phe

Leu 720

Ala

Pro

Leu

Pro

Ile

His

Thr

Ala

Glu

Leu

Ala

Cys

Phe

Ala

725

730

735

Arg

Ser

Arg

Ser

Gly

Ala

Lys

Leu

Ile

Glv

Thr

Asp

Asn

Ser

Val

740

745

750

Leu

Ser

Arg 755

Lys

Tyr

Thr

Ser

Phe 760

Pro

Trp

Leu

Gly 765

Cys

Ala

Asn

Trp

Ile

Leu

Arg

Gly

Thr

Ser

Phe

Val

Tyr

Val

Pro

Ser

Ala

Leu

770

775

700

Asn 705

Pro

Ala

Asp

Pro 790

Ser

Arg

Gly Arg

Leu 795

Gly

Leu

Tyr

Arg

Pro 800

Leu

His

Leu

Pro 005

Phe

Arg

Pro

Thr

Thr 810

Gly

Arg

Thr

Ser

Leu 815

Tyr

Ala

Val

Ser

Pro

Tyr

Val

Pro

Ser

His

Leu

Pro

Asp

Arg

Val

His

Phe

820

325

030

Ala

Ser

Pro

Leu

His

Val

Ala

Trp

Arg

Pro

835 840

PL 192 129 B1 (2) Informacja o SEQ ID NO: 3: (Figura 5) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 400 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:

Met 1

Gly

Trp

Ser 5

ser

Lys

Pro

Arg

Gin ίο

Gly

Met

Gly

Thr .

Asn 15

Leu

Ala

Val

Pro

Asn 20

Pro

Leu

Gly

Phe

Phe 25

Pro

Asp

His

Gin

Leu 30

Asp

Pro

Ala

Phe

Gly 35

Ala

Asn

Ser

Asn

Asn 40

Pro

Asp

Trp

Asp

Phe 45

Asn

Pro

Asn

Lys

Asp SO

His

Trp

Pro

Glu

Ala 55

Asn

Gin

Val

Gly

Val 90

Gly

Ala

Phe

Gly

Pro €5

Gly

Phe

Thr

Pro

Pro 70

His

Gly

Leu

Leu 75

Gly

Ser

Pro

Gin BO

Ala

Gin

Gly

Ile

Leu 65

Thr

Val

Pro

Ala 90

Ala

Pro

Ala 95

Ser

Thr

As n

Arg

Gin 100

Ser

Gly

Arg

Gin

Pro 105

Thr

Pro

Ile

Ser

Pro 110

Pro

Leu

Arg

Asp

Ser 115

His

Pro

Gin

Ala

Thr 120

Gin

Trp

Asn

Ser

Thr 125

Thr

Phe

His

Gin

Ala 130

len

Leu

Aso

Pro

Arg 135

Val

Arg

Gly

Leu

Tyr 140

Phe

Prc

Ala

Gly

Gly 145

Ser

Gly

Thr ISO

Val

Asn

Pro

Val

Pro 155

Thr

Ala

Ser

Pro ieo

Ile

Ser

Ile

Phe 165

Ser

Arg

Thr

Gly

Asp 170

Pro

Ala

Pro

Asn

Met 175

Glu

Asn

Thr

Ser iao

Gly

Phe

Leu

Gly

Pro 195

Leu

Val

Leu

Gin 190

Ala

Gly

Phe

ser 195

Leu

Thr

Arg

Ile

Leu 200

Thr

Ile

Pro

Gin

Ser 20S

Leu

Aso

Ser

Trp

Trp 210

Thr

Ser

Leu

Asn

Phe 215

Leu

Gly Gly

Ala

Pro 220

Thr

Cys

Pro

Gly

Gin 225

Asn.

Ser

Gin

Ser

Pro 230

Thr

Ser

Asn

His

Ser 235

Pro

Thr

Ser

Cys

Pro 240

Pro

Ile

Cys

Pro

Gly 245

Tyr

Arg

Trp

Asn

Cys 250

Leu

Arg

Phe

Ile 255

Ile

Phe

Leu

Phe

Ile 250

Leu

Cys

Leu 26S

Ile

Phe

Leu

Val 270

Leu

Asp

Tyr

Gin 275

Gly

Met

Leu

Pro

Val 2S0

Cys

Pro

Leu

Pro 295

Gly

Thr

Ser

Thr

Thr 290

Ser

Thr

Gly

Pro

Cys 295

Lys

Thr

Cys

Thr

Thr 300

Pro

Ala

Gin

Gly

Asn 305

Ser

Thr

Phe

Pro

Ser 310

Cys

Thr

Lys 315

Pro

Ser

Asp

Gly

Asn 320

Cys

Thr

Cys

Ile

Pro 325

Ile

Pro

Ser

Trp 33C

Ala

Phe

Ala

Arg

Phe 335

Leu

PL 192 129 B1

Trp

Glu

Trp

Ala 340

Ser

Val

Arg

Phe

Ser 345

Trp

Leu

Ser

Leu

Leu 350

Val

Pro

Ehe

Val

Gin 355

Trp

Phe

Val

Gly

Leu 3GC

Ser

Pro

Thr

Val

Trp 365

Leu

Ser

Val

Tle

Trp 3-70

Met

Trp

Tyr

Trp 375

Gly Arg

Ser

Leu

Tyr 360

Asn

Ile

Leu

Ser

Pro 3B5

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu 390

Pro

Ile

Phe

Cys 395

Leu

Trp

Val

Tyr

Ile 400

(2) Informacja o SEQ ID NO: 4: (Figura 6) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 212 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4:

Met Gin 1	Leu Phe	Leu Leu Cys Leu Ile Ile Ser	Cys	Ser	Cys	Pro Thr 15
5	10
Val Gin	Ala Ser	Lya Leu Cys Leu Gly	Trp Leu	Trp	Asp	Met	Asp Ile
	20	25				30
Asp Pro	Tyr Lys	Glu Phe Gly Ala Ser	Ala Glu	Leu	Leu	Ser	Phe Leu
	35	40			45
Pro ser	Asp Phe	Phe Pro ser Ile Arg	Asp Leu	Leu	Asp	Thr	Ala Ser
SO		55		GO
Ala Leu	Tyr Arg	Glu Ala Leu Glu Ser	Pro Glu	His	Cys	Ser	Pro Eis
65		70	75				BO
Eis Thr	Ala Leu	Aro Glu Ala Ile Leu	Cys Tm	Gly	Glu	Leu	Met Asn
		05	90 '				95
Leu Ala	Thr Trp	Val Gly Ser Asn Leu	Glu Asp	Pro	Ala	Ser	Arg Glu
	100	105				110
Leu Val	Val Ser	Tyr Val Asa Val Asn	Met Gly	Leu	Lys	Leu	Arg Gin
	115	120			125
Tle Leu	Trp Phe	His Ile Ser Cys Leu	Thr Phe	Gly	Arg	Glu	Thr Val
13 0		135		140
Leu Glu	Tyr Leu	Val Ser Phe Gly Val	Trp Ile	Arg	Thr	Pro	Thr Ala
145		150	155				IGO
Tyr Arg	Pro Pro	Asn Ala Pro Ile Leu	Ser Thr	Leu	Pro	Glu	Thr Thr
		IG 5	170				175
Val Val	Arg Arg	Arg Gly Arg Ser Pro	Arg Arg	Arg	Thr	Pro	Ser Pro
	130	IBS				190
Arg Arg	Arg Arg	Ser Gin Ser Pro Arg	Arg Arg	Arg	Ser	Gin	Ser Arg
	13S	200			205
Glu Ser	Gin Arg
210
Informacja o SEQ ID NO: 5:	(Figura	7)

(i) Charakterystyka sekwencji

PL 192 129 B1 (A) Długość: 154 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 5:

Ket 1

Ala

Arg

Val S

Cya

Cys

Gin

Leu

Asp 10

Pro

Ala

Arg

Asp

Val 15

Leu

Cya

Leu

Arg

Pro 20

Val Gly

Ala

Glu

Ser 25

Arg

Gly

Arg

Pro

Val 30

Ser

Gly

Pro

Phe

Gly 35

Ala

Leu

Pro

Ser

Pro 40

Ser

Ala

Val 45

Pro

Ala

Asp

His

Gly 50

Ala

His

Leu

Ser

Leu 55

Arg

Gly

Leu

Pro

Val 60

Cys

Ala

Phe

Ser

Ser 65

Ala

Gly

Pro

Cys

Ala 70

Leu

Arg

Phe

Thr

Ser 75

Ala

Arg

Met

Glu 60

Thr

Val

Asn

Ala 85

Arg

Gin

Val

Leu

Pro 90

Lys

Val

Leu

Tyr

Lys 95

Arg

Thr

Leu

Gly

Leu 100

Ser

Ala

Met

Ser

Thr 105

Thr

Asp

Leu

Glu

Ala no

Tyr

Phe

Lys

Asp

Cys 115

Val

Phe

Lys

Asp

Trp 12 0

Glu

Leu

Gly

Glu 125

Glu

Ile

Arg

Leu

Lys 13 0

Ile

Tyr

Val

Leu

Gly Gly 135

Cys

Arg

His

Lys 140

Leu

Val

Cys

Ser

Pro

Ala

Pro

Cys

Asn

Phe

Ser

Ala

145 ISO (2) Informacja o SEQ ID NO: 6: (Figura 8) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 36 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:

ATAAGCTTAT GCCCCTATCT TATCAACACT TCCGSA (2) Informacja o SEQ ID NO: 7: (Figura 9) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 25 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

PL 192 129 B1 (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7:

GAGTCTAGAC TCTGCGGTAT TGTGA _2S (2) Informacja o SEQ ID NO: 8: (Figura 10) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 25 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 8:

GAGTCTAGAC TCGTGGTGGA CTTCT 2S (2) Informacja o SEQ ID NO: 9: (Figura 11) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 32 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 9:

TGAGAATTCT CACGGTGGTC TCCATGCGAC GT 32 (2) Informacja o SEQ ID NO: 10: (Figura 12) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 16 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 10:

TTT5TTTACG TCCCGT

PL 192 129 B1 (2) Informacja o SEQ ID NO: 11: (Figura 13) (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 36 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 11:

ATAAGCTTAT GCCCCTATCT TATCAACACT TCCGGA

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyizolowany szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określony jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), zdeponowany pod numerami dostępu P97121501, P97121502 i P97121503 w European Collection of Cell Culture 15 grudnia 1997 r.
2. Wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.
3. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, w przypadku którego polipeptyd jest kodowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO: 1.
4. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 3, zawierający nukleotydy „ACG w pozycjach 551 - 553.
5. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, który to kwas nukleinowy stanowi DNA.
6. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, który to kwas nukleinowy stanowi RNA.
7. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 5, który to kwas nukleinowy stanowi cDNA.
8. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 5, który to kwas nukleinowy stanowi genomowy DNA.
9. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 2, w przypadku którego polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zasadniczo identyczną z resztami aminokwasów 174 - 400 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
10. Wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.
11. Wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
12. Wektor zawierający wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, i jest funkcjonalnie połączony z promotorem transkrypcji RNA.
13. Wektor zawierający wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który to polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.
14. Wektor według zastrz. 12 albo 13, który to wektor zawiera wirusowy DNA.
15. Układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 12.

PL 192 129 B1
16. Układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu, znamienny tym, że zawiera wektor określony w zastrz. 13.
17. Sposób wytwarzania polipeptydu, w którym układ gospodarz-wektor hoduje się w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się układ gospodarzwektor określony w zastrz. 15 i odzyskuje się tak wytworzony polipeptyd.
18. Sposób wytwarzania polipeptydu, w którym układ gospodarz-wektor hoduje się w warunkach umożliwiających wytwarzanie polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się układ gospodarzwektor określony w zastrz. 16 i odzyskuje się tak wytworzony polipeptyd.
19. Sposób wytwarzania polipeptydu w postaci oczyszczonej, znamienny tym, że:

(a) wprowadza się wektor określony w zastrz. 12 do komórki gospodarza;

(b) hoduje się powstałą komórkę gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskuje się polipeptyd wytworzony w etapie (b); i (d) oczyszcza się tak odzyskany polipeptyd.
20. Sposób wytwarzania polipeptydu w postaci oczyszczonej, znamienny tym, że:

(a) wprowadza się wektor określony w zastrz. 13 do komórki gospodarza;

(b) hoduje się powstałą komórkę gospodarza do wytworzenia polipeptydu;

(c) odzyskuje się polipeptyd wytworzony w etapie (b); i (d) oczyszcza się tak odzyskany polipeptyd.
21. Oczyszczony polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.
22. Oczyszczony polipeptyd otrzymany sposobem określonym w zastrz. 19.
23. Oczyszczony polipeptyd, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów obejmującą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
24. Oczyszczony polipeptyd otrzymany sposobem określonym w zastrz. 20.
25. Oligonukleotyd o długości, co najmniej 15 nukleotydów, zdolny do specyficznej hybrydyzacji z unikatową sekwencją nukleotydów w obrę bie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, bez hybrydyzowania do jakiejkolwiek sekwencji nukleotydów w obrębie kwasu nukleinowego, który koduje główny antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego.
26. Oligonukleotyd według zastrz. 25, zawierający nukleotydy 527 - 595 SEQ ID NO: 1.
27. Sposób otrzymywania przeciwciał dla polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, a nie dla głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, znamienny tym, że:

(a) otrzymuje się polipeptyd w postaci oczyszczonej;

(b) immunizuje się organizm zdolny do wytwarzania przeciwciał przeciw oczyszczonemu polipeptydowi;

(c) zbiera się wytworzone przeciwciała;

(d) łączy się wytworzone przeciwciała z oczyszczonym polipeptydem do wytworzenia kompleksu; i (e) ustala się, które wytworzone przeciwciała tworzą kompleks z oczyszczonym polipeptydem, z otrzymaniem przeciwciał dla polipeptydu.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że polipeptyd jest kodowany przez nukleotydy 155 - 835 sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako SEQ ID NO: 1.
29. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że polipeptyd ma sekwencję zasadniczo identyczną z resztami aminokwasów 174 - 400 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
30. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że immunizuje się organizm królika lub myszy.
31. Sposób otrzymywania przeciwciał dla polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów obejmującą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3, znamienny tym, że:

PL 192 129 B1 (a) otrzymuje się polipeptyd w postaci oczyszczonej;

(b) immunizuje się organizm zdolny do wytwarzania przeciwciał przeciw oczyszczonemu polipeptydowi;

(c) zbiera się wytworzone przeciwciała;

(d) łączy się wytworzone przeciwciała z oczyszczonym polipeptydem do wytworzenia kompleksu; i (e) ustala się, które wytworzone przeciwciała tworzą kompleks z oczyszczonym polipeptydem, z otrzymaniem przeciwciał dla polipeptydu.
32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że immunizuje się organizm królika lub myszy.
33. Przeciwciała, korzystnie przeciwciała monoklonalne, otrzymane sposobem określonym w zastrz. 27 albo 31.
34. Przeciwciała zdolne do wykrywania polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, i niezdolne do wykrywania głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego.
35. Przeciwciała zdolne do wykrywania polipeptydu, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 320 sekwencji aminokwasów określonej jako SEQ ID NO: 3.
36. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, do ustalania czy osobnik jest zakażony szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.
37. Zastosowanie według zastrz. 36, w którym próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przy czym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) kontaktowanie mRNA z oligonukleotydem określonym w zastrz. 25, w warunkach umożliwiających wiązanie mRNA z oligonukleotydem, do wytworzenia kompleksu;

(ii) izolację tak wytworzonego kompleksu, i (iii) identyfikację mRNA w wyizolowanym kompleksie, dla ustalenia czy mRNA stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.
38. Zastosowanie według zastrz. 36, w którym próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przy czym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) translację mRNA w warunkach otrzymywania sekwencji aminokwasów; i (ii) porównanie sekwencji aminokwasów etapu (i) z sekwencją aminokwasów kodowaną przez wyizolowany kwas nukleinowy określony w zastrz. 9, dla ustalenia czy próbkę kwasu nukleinowego stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.

PL 192 129 B1
39. Zastosowanie według zastrz. 36, w którym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) amplifikację kwasu nukleinowego obecnego w próbce w etapie (a); i (ii) wykrywanie obecności polipeptydu w otrzymanym zamplifikowanym kwasie nukleinowym.
40. Zastosowanie przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, do ustalania czy osobnik jest zakażony szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania z przeciwciał ami okreś lonymi w zastrz. 34 albo 35, dla ustalenia czy osobnik jest zakaż ony.
41. Zastosowanie według zastrz. 36, 37 albo 40, w którym wyizolowany kwas nukleinowy, oligonukleotyd lub przeciwciało są znakowane wykrywalnym markerem.
42. Zastosowanie według zastrz. 41, w którym wykrywalny marker stanowi radioaktywny izotop, fluorofor lub enzym.
43. Zastosowanie według zastrz. 36, w którym próbkę stanowią krew, surowice lub tkanka, taka jak tkanka wątroby.
44. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, do ustalania predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego, przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.
45. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przy czym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) kontaktowanie mRNA z oligonukleotydem określonym w zastrz. 25, w warunkach umożliwiających wiązanie mRNA z oligonukleotydem, do wytworzenia kompleksu;

(ii) izolację tak wytworzonego kompleksu, i (iii) identyfikację mRNA w wyizolowanym kompleksie, dla ustalenia czy mRNA stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.
46. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym próbka kwasu nukleinowego w etapie (a) zawiera mRNA odpowiadający transkryptowi DNA kodującemu polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przy czym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) translację mRNA w warunkach otrzymywania sekwencji aminokwasów; i

PL 192 129 B1 (ii) porównanie sekwencji aminokwasów etapu (i) z sekwencją aminokwasów kodowaną przez wyizolowany kwas nukleinowy określony w zastrz. 9, dla ustalenia czy próbkę kwasu nukleinowego stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna tego kwasu nukleinowego.
47. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym etap ustalania (b) obejmuje:

(i) amplifikację kwasu nukleinowego obecnego w próbce w etapie (a); i (ii) wykrywanie obecności polipeptydu w powstałym zamplifikowanym kwasie nukleinowym.
48. Zastosowanie przeciwciał, które rozpoznają polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, do ustalania predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowokomórkowego, przy czym takie ustalanie obejmuje:

(a) uzyskanie próbki kwasu nukleinowego od osobnika; i (b) ustalenie czy próbkę kwasu nukleinowego z etapu (a) stanowi kwas nukleinowy kodujący polipeptyd lub pochodna kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przez skontaktowanie próbki w warunkach wiązania z przeciwciał ami okreś lonymi w zastrz. 34 albo 35, dla ustalenia predyspozycji do zachorowania na raka wątrobowo-komórkowego.
49. Zastosowanie według zastrz. 45, 46 albo 48, w którym wyizolowany kwas nukleinowy, oligonukleotyd lub przeciwciało są znakowane wykrywalnym markerem.
50. Zastosowanie według zastrz. 49, w którym wykrywalny marker stanowi radioaktywny izotop, fluorofor lub enzym.
51. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym próbkę stanowią krew, surowice lub tkanka, taka jak tkanka wątroby.
52. Sposób oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do leczenia zakażenia przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny hamuje polipeptyd, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do leczenia zakażenia przez szczep wirusa 'S'-133 Oon.
53. Sposób oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do zapobiegania zakażeniu przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny hamuje polipeptyd, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do zapobiegania zakażeniu przez szczep wirusa 'S'-133 Oon.
54. Sposób oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny do leczenia raka wątrobowo-komórkowego, znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu

PL 192 129 B1 dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny hamuje polipeptyd, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do leczenia raka wątrobowo-komórkowego.
55. Sposób oznaczania związku chemicznego do stosowania do wytwarzania leku, który jest zdolny zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu, znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, ze związkiem chemicznym w warunkach umożliwiających wiązanie polipeptydu ze związkiem chemicznym;

(b) wykrywa się specyficzne wiązanie związku chemicznego z polipeptydem; i (c) ustala się czy związek chemiczny hamuje polipeptyd, dla zidentyfikowania związku chemicznego, który jest zdolny do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu.
56. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera polipeptyd, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, przy czym ilości takiego polipeptydu są skuteczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwciał u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
57. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera polipeptyd mający sekwencję aminokwasów zawierającą reszty aminokwasów 298 - 330 SEQ ID NO: 3, przy czym ilości takiego polipeptydu są skuteczne do stymulacji lub wzmagania wytwarzania przeciwciał u osobnika, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
58. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera związek chemiczny zidentyfikowany sposobem określonym w zastrz. 54, w ilości skutecznej do leczenia raka wątrobowo-komórkowego, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
59. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera związek chemiczny zidentyfikowany sposobem określonym w zastrz. 55, w ilości skutecznej do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
60. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera związek chemiczny zidentyfikowany sposobem określonym w zastrz. 52, w ilości skutecznej do leczenia zakażenia przez szczep wirusa zapalenia wątroby typu B, określany jako ludzki wirus zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
61. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera związek chemiczny zidentyfikowany sposobem określonym w zastrz. 53, w ilości skutecznej do zapobiegania zakażeniu szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
62. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 56 albo 57 do leczenia osobnika zakażonego szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę).
63. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 60 do leczenia osobnika zakażonego szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę).
64. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 56 albo 57 do zapobiegania zakażeniu szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę) u osobnika.
65. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 61 do zapobiegania zakażeniu szczepem wirusa zapalenia wątroby typu B, określanym jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę) u osobnika.
66. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 56 albo 57 do wytwarzania leku do leczenia osobnika z rakiem wątrobowo-komórkowym.
67. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 58 do wytwarzania leku do leczenia osobnika z rakiem wątrobowo-komórkowym.

PL 192 129 B1
68. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 56 albo 58 do wytwarzania leku do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu u osobnika.
69. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 59 do wytwarzania leku do zapobiegania rakowi wątrobowo-komórkowemu u osobnika.
70. Sposób skriningu płynów ustrojowych od osobnika pod kątem szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, określanego jako szczep ludzkiego wirusa zakażenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym 'S'-133 Oon (metionina na treoninę), znamienny tym, że:

(a) uzyskuje się próbkę płynu ustrojowego od osobnika; i (b) ustala się obecność polipeptydu, który jest zmutowanym głównym antygenem powierzchniowym szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B typu dzikiego tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina, w próbce z etapu (a) dla potwierdzenia ewentualnej obecności tego szczepu.
71. Sposób według zastrz. 70, znamienny tym, że jako płyn ustrojowy stosuje się krew, surowice lub próbkę kwasu nukleinowego z krwi lub surowic.
72. Szczepionka na wirusowe zapalenie wątroby typu B, znamienna tym, że zawiera zmutowany główny antygen powierzchniowy szczepu wirusa zapalenia wątroby typu B, który to polipeptyd ma sekwencję aminokwasów, która różni się od sekwencji aminokwasów głównego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B tym, że aminokwas w pozycji 133 takiego polipeptydu stanowi treonina, a nie metionina.
73. Szczepionka według zastrz. 72, znamienna tym, że zawiera ponadto adiuwant.