KR20010106129A

KR20010106129A - 하나의 돌연변이 인체 ｂ형 간염 바이러스 균주 및 그용도

Info

Publication number: KR20010106129A
Application number: KR1020007014456A
Authority: KR
Inventors: 총 진 오온; 젝 쿄우 림; 이 쟈오; 웨이 닝 첸
Original assignee: 추후제출; 싱가폴 공화국 정부
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1998-06-19
Publication date: 2001-11-29
Also published as: MY118955A; TR200003777T2; CN1322251A; BR9815913A; NZ508890A; WO1999066048A1; KR100498118B1; AU756866B2; IS5778A; JP2002518014A; PL345573A1; HUP0103409A2; IL140364A0; US6558675B1; AR020093A1; NO20006456L; NO20006456D0; BG105066A; HUP0103409A3; UA73476C2

Abstract

본 발명은 그 구성 바이러스 게놈이 1997.12.15.자로 ECCC에 기탁번호 P97121501, P97121502 및 P121503로 기탁된 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 분리 균주, B형 간염 바이러스의 하나의 돌연변이 표면 항원으로서, 위치번호 133번의 아미노산 잔기가 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 잔기와 상이한 하나의 아미노산 잔기를 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 분리 핵산, 서열번호 1의 뉴클레오티드 527 내지 595를 포함하여 구성되는 하나의 핵산 분자에 의해 엔코드된 펩티드를 엔코드하는 하나의 분리 핵산, 상기 분리 핵산과 펩티들을 이용하는 다양한 방법, 나아가, 상기 분리핵산, 폴리펩티드와 펩티드 및 항체들을 이용하는 다양한 용도를 제공한다.

Description

하나의 돌연변이 인체 Ｂ형 간염 바이러스 균주 및 그 용도{A MUTANT HUMAN HEPATITIS B VIRAL STRAIN AND USES THEREOF}

본 발명은 간세포암(HCC)으로부터 분리되고, 주 표면 항원(the major surface antigen)내 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에서 하나의 돌연변이를 갖는 인체 B형 간염 바이러스 게놈, 그것의 뉴클레오티드 서열, 4개의 주요 추론(deduced) 단백질 서열, 항원, 항체, 검출시스템, 효과적인 백신의 개발 및 항바이러스제에 관한 것이다.

HCC는 가장 일반적인 인체 간염의 하나로, 특히 매년 전세계 케이스의 70%가 아시아에서 발견되고 있다. 그것은 주로 만성 간 질환의 합병증으로서 간경변을 일으킨다. HCC 환자들의 임상 증상 발현은 암이 말기에나 나타나기 때문에 알 수가 없다.

만성 간질환을 일으키는 주요한 원인 중 하나는 B형 간염 바이러스이다. B형 간염 바이러스는 비경구적으로 전염되는 인체 바이러스로서 1963년에 최초로 발견되었고, 만성 간염 B형 바이러스 감염은 HCC의 밝혀지지 않은 혈청학적 병인론에 가장 일반적으로 관련되어 있다. B형 간염 바이러스가 하나의 완전한 바이러스 암유전의 특징을 나타내지 않는다 할 지라도, HCC의 증상에 그것이 포함되어 있는 것은 숙주 간세포 세포들과의 다양한 상호작용 때문이라고 여겨진다. 이들은 원종양 유전자(proto-oncogenes)를 포함하는 많은 세포 목표의 표현 레벨을 증진시키는 가장 작은 바이러스 단백질인 X의 무차별한 전사 활성을 포함한다. 반면에, HCC 환자에서 숙주 염색체에서의 결합 바이러스 DNA가 규칙적으로 발견되었다. 또한, 주 표면 항원에 의한 HCC의 발생에서 하나의 활성 역할에 대한 증거가 있다. 이러한 단백질은 B형 간염 바이러스의 담체들에 대한 주요 검출 표지로 사용되었다. B형 간염 바이러스의 주요 항원 에피토프(epitope)는 23개의 아미노산 잔기에 걸친 하나의 고도의 보존 지역으로, 주 표면 항원의 아미노산 위치 124부터 147까지 위치한다. 군 특유 결정인자(group specific determinant) "a"로서 지정된 이러한 소지역은 B형 바이러스 게놈의 모든 아형(subtypes) 및 분리균(isolates)에서 발견된다. 그것의 항원 특성들은 백신-유도 무력화 항체 (vaccine-induced neutralizing antibody binds)에 결합하는 제안된 이중 루프 구조(double loop structure)에 기인한 것으로 보여진다. 본 발명자들의 병의학적 데이터(epidemiological data)는 야생형 주 표면 항원이 대부분 HCC 환자들에서 발견됨을 나타낸다. 또한, 관찰은 HCC 환자들로부터 주 표면 항원의 다양한 변형체가 HCC의 발병원에 포함될 수 있음을 나타낸다. 직접 시퀀싱 분석은 63명의 HCC 환자들 중 24명(약 38%)이 주 표면 항원의 "a" 에피토프에서 다양한 돌연변이를 가지고 있다는 것을 나타내었다. 야생형과 변형체 케이스들 모두가 조합되어 있는 경우, 주 표면 항원의 "a" 에피토프의 첫번째 루프에 위치하는 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에서 하나의 돌연변이를 가지는 변형체 바이러스의 비율이 동남아시아 지역의 HCC 환자의 경우 12.7%이고, 국내 HCC의 경우 5명의 케이스를 나타내었다. 그러나, 무작위 인구(100 케이스 이상)에서는 B형 간염 바이러스 담체들의 단지 2%에만 동일한 돌연변이가 발견되었다. 아미노산 잔기 133에서의 이러한 변형체들의 의의는 하나의 백신-유도 돌연변이이고 "a" 에피토프의 두번째 루프에 위치한다라고 더 잘 알려진 아미노산 잔기 145(글리신 에서 아르기닌으로)에서의 변형체 바이러스의 비율이 무작위 인구 샘플에서 B형 간염 바이러스 담체들의 8%를 일정하게 유지한다는 사실에 의해 더 강조된다.

HCC 환자에 있어 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에서 하나의 돌연변이를 가지는 이러한 변형체 B형 간염 바이러스 균주가 나중에 예방접종으로 유도된 것들(즉, 주 표면 항원의 아미노산 잔기 145에서 하나의 돌연변이를 갖는 것)과 다르다고 할지라도, 둘다 안정하기 때문에 이러한 균주는 유사한 특징들을 갖고, 효과적인 B형 간염 바이러스 예방 및 B형 간염 면역 글로블린(HBIG)이 사용됨에도 불구하고, 이들 균주들의 수직 전파의 경우가 보고되고 있다.

HCC에서 주 표면 항원의 "a" 에피토프내 돌연변이들을 운반하는 변형체 인체 B형 간염 바이러스의 출현은 관심의 대상이다. 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133에서 하나의 치환체를 갖는 돌연변이 바이러스의 높은 비율이 HCC의 발병원인과 가깝다고 주목되기 때문에 특히 관심의 대상이다. 따라서, 이러한 상관관계가 효과적인 예방과 치료 백신 및 항바이러스제는 물론 특정 검출 시스템의 시급한 개발을 필요로 한다. 이러한 돌연변이 바이러스의 뉴클레오티드 서열 결정이 이들 목적들에 다가가기 위한 첫걸음으로서, 상술한 진단 및 치료 계획에 분명히 도움이 될 것이다.

본 출원에서 다양한 참고문헌이 괄호안에 인용되는데, 그들 모두가 본 발명이 속하는 기술분야를 더 완벽하게 설명하기 위한 문헌으로서 본 출원의 일부를 구성한다.

발명의 개요

본 발명은 그 구성 바이러스 게놈이 1997년 12월 15일자로 ECCC(European Collection of Cell Culture)에 기탁번호 P97121501호, P97121502호 및 P97121503호로 기탁된, 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(Oon Strain)(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 분리균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 위치번호 133의 아미노산이 메티오닌이 아닌 트레오닌점에서 하나의 야생형(a wild type) B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖고, 하나의 B형 간염 바이러스 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원인 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는, 하나의 분리 핵산을 제공한다.

본 발명은 폴리펩티드를 생성하는 하나의 방법 및 위치번호 133의 아미노산이 메티오닌이 아닌 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖고, 하나의 B형간염 바이러스 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원인 하나의 정제 폴리펩티드를 회수(recover)하기 위해 정제 형태로 폴리펩티드를 얻는 방법을 제공한다.

본 발명은 특히 B형 간염 바이러스의 돌연변이 바이러스 균주의 서열과만 하이브리드(hybridizing)할 수 있는 적어도 15개의 뉴클레오티드로 구성된 하나의 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 폴리펩티드 및 생성된 항체들에 대한 항체를 얻는 하나의 방법을 제공한다.

본 발명은 피검자가 상술한 바이러스 균주로 감염되었는가를 판단하기 위한 앞서 설명한 핵산, 폴리펩티드, 펩티드 또는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 피검자가 간세포암에 대한 소질을 갖는지를 결정하기 위한 앞서 설명한 핵산, 폴리펩티드, 펩티드 또는 항체의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 앞서 설명한 B형 간염 바이러스의 돌연변이 균주에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 하나의 백신은 물론 간세포암을 예방 및 치료하는 하나의 백신을 제공한다.

본 발명은 간세포암을 예방 또는 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법 및 그러한 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 앞서 설명한 돌연변이 균주에 의한 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하는 하나의 방법 및 그러한 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 출원서에서 특정 뉴클레오티드에 대한 인용은 핵산의 코딩 스트랜드에 나타나는 뉴클레오티드에 대한 것이다. 하기 표준 약어들은 특정 뉴클레오티드를 나타내기 위하여 본 명세서에서 전반적으로 사용된다.

C=사이토신 A=아데노신

T=티미딘 G=구아노신

본 발명은 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로) 하나의 돌연변이를 가지고 있고, 도 4 내지 7에서 도시한 4개의 중복(overlapping) 바이러스 단백질들을 코딩하는 3215개의 뉴클레오티드(도 3)로 구성되고, 간세포 암(HCC)로부터 분리된 인체 B형 간염 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

본 발명은 4개의 주요 바이러스 단백질들의 아미노산 서열을 제공하는 것으로, 이들은 DNA 중합효소, 큰/중간/주 표면 항원, 코어 및 트랜스-액티베이팅 X를 포함한다. 이들 단백질들은 재조합 기술을 이용하여 생산될 수 있고, 다중클론 또는 단일클론항체(polyclonal or monoclonal antibodies) 개발에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 명세서에서 설명되는 뉴클레오티드 또는 단백질 서열 또는 항체들을 이용하여, 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)의 돌연변이에 특히 적합한 하나의 B형 간염 바이러스 진단 시스템을 제공한다.

본 발명은 그 구성 바이러스 게놈의 기탁번호 P97121501, P97121502 및 P97121503으로 기탁되고, 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 분리 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드의 133번 위치에서 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖고 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원인 하나의 폴리펩티드를 엔코딩 하는 하나의 분리 핵산을 제공한다. 하나의 특정 실시예에서, 폴리펩티드가 서열번호 1로 지정된 핵산 서열의 뉴클레오티드 155 내지 835에 의해 엔코드되는데, 특히, "ACG"의 대신에 551-553 위치의 뉴클레오티드 "ATG"를 포함하여 구성된다.

이러한 분리 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 특별히 cDNA 또는 게놈 DNA 일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 174 내지 400과 실질적으로 동일한 하나의 아미노산 서열을 갖는다.

추가로, 본 발명은 하나의 펩티드를 엔코드하는 하나의 분리 핵산을 제공하며, 그 펩티드는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 527 내지 595를 포함하여 구성되는 하나의 핵산 분자에 의해 엔코드된다.

또한, 본 발명은 하나의 펩티드를 엔코드하는 하나의 분리핵산을 제공하며, 그 펩티드는 서열 번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명은 또한, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서, 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는, 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 분리 핵산을 포함하여 구성되고, 하나의 RNA 전사의 프로모터(promoter)에 효과적으로(operatively) 연결되는 하나의 벡터(vector)를 제공한다.

또한, 본 발명은 하나의 펩티드를 엔코드하는 하나의 분리핵산을 포함하여 구성되는 하나의 벡터를 제공하며, 그 펩티드는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 527 내지 595를 포함하여 구성되는 하나의 핵산 분자에 의해 엔코드된다.

특별히, 벡터들은 모두 바이러스 DNA를 포함하여 구성될 수 있다.

또한, 본 발명은 하나의 적합한 숙주내에 상술한 벡터들을 포함하여 구성되는 하나의 폴리펩티드를 생산하는 하나의 숙주 벡터시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드 또는 펩티드의 생산을 허용하는 적당한 조건하에서 상기 숙주 벡터 시스템을 증식시키는(growing) 단계와 그렇게 생성된 폴리펩티드 또는 펩티드를 회수(recover)하는 단계를 포함하여 구성되는 폴리펩티드의 생산방법을 제공한다.

본 발명은, (a)하나의 적합한 숙주 세포내로 상기 벡터들을 주입하는 단계;(b) 수득된 숙주 세포를 폴리펩티드를 생산하기 위해 배양하는 단계;(c) (b)단계에서 생성된 폴리펩티드를 회수하는 단계; 그리고 (d)그와 같이 회수된 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하여 구성되는, 정제된(purified) 폴리펩티드 또는 펩티드를 수득하는 하나의 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는, 그러한 하나의 정제 폴리펩티드를 제공한다. 특별히, 누구나 폴리펩티드 또는 펩티드를 얻는 수단은 앞서 설명한 방법에 의한다.

또한, 본 발명은 하나의 정제된 펩티드를 제공하며, 그 펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명은 또한, 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원을 엔코드하는 하나의 핵산내에 있는 뉴클레오티드들의 여하한 서열에 대하여 하이브리드하지 않고, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원인 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산내에 있는 뉴클레오티드들의 하나의 유일한(unique)서열과 특별히(specially) 하이브리드할 수 있는 적어도 15개의 뉴클레오티드들을 가지는 하나의 올리고뉴클레오티드를 제공하는데, 그 폴리펩티드는 위치번호 133번에 있는 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한,하나의 아미노산 서열을 갖는다. 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호1의 뉴클레오티드 527 내지 595를 포함하여 구성된다.

본 발명은 또한,하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원이 아닌 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니고 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드에 대한 항체들을 얻는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (a)하나의 정제된 형태의 폴리펩티드를 얻는 단계; (b)정제된 폴리펩티드에 대한 항체들을 생성할 수 있는 하나의 유기체(organism)를 면역화(immunizing)하는 단계;(c)생성 항체들을 수집하는 단계; (d)하나의 복합체(complex)를 형성하기 위한 조건하에서 생성된 정제 폴리펩티드를 조합(combine)하는 단계; 그리고 (e)폴리펩티드에 대한 항체들을 얻기 위해 어느 생성된 항체들이 정제 펩티드와 하나의 복합체를 형성하는가를 판단하는 단계를 포함하여 구성된다. 특히, 폴리펩티드는 서열 번호 제1의 핵산 서열의 뉴클레오티드 155 내지 835에 의해 엔코드되는 것이다. 다른 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 174 내지 400과 실질적으로 동일한 하나의 아미노산 서열을 갖는다.

누구나 토끼나 쥐를 이용하여 앞서 설명한 잘 알려진 방법을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나의 펩티드에 대한 항체들을 얻는 방법을 제공하는데, 그 방법은, (a)하나의 정제된 형태로 펩티드를 얻는 단계; (b)정제 펩티드에 대한 항체들을 생성할 수 있는 하나의 유기체를 면역화하는 단계; (c)생성된 항체들을 수집하는 단계;(d) 생성된 항체들과 정제 펩티드를 하나의 복합체를 형성하기 위한 조건하에서 조합하는 단계;그리고 (e) 펩티드에 대한 항체들을 수득하기 위해, 어느 생성된 항체들이 정제된 폴리펩티드와 하나의 복합체를 형성하는가를 판단하는 단계를 포함하여 구성된다.

또한, 본 발명은 앞서 설명한 방법들로부터 얻은 항체, 특히 단일 클론항체들을 제공한다.

본 발명은 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 검출할 수 있고, 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원을 검출할 수 없는 항체들을 제공한다.

본 발명은 서열 번호 3으로 지정된 아미노산 서옆의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나의 펩티드를 검출할 수 있는 항체들을 제공하는 것이다.

본 발명은, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 하나의 피검자가 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주로 감염되었는지를 판단하기 위해 위치번호 133번의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는, 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 분리 핵산의 용도를 제공하는 것으로, 그러한 판단방법은, (a)피검자로부터 하나의 적합한 핵산 샘플을 얻는 단계와; 그리고 (b)(a)단계로부터의 핵산 샘플이 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주표면 항원으로서, 위치번호 133번의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는, 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산인지 아니면 그로부터의 유도체인지를 판단하는 단계를 포함하여 구성된다.

하나의 실시예에서, (a)단계의 핵산 샘플이 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA의 전사(transcript)에 상응하는 mRNA를 포함하여 구성되는 것이고, 상기 (b) 결정단계가 (ⅰ)하나의 복합체를 형성하기 위해 올리고뉴클레오티드에 대한 mRNA의 결합을 허용하는 조건하에서 mRNA를 앞서 설명한 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계와; (ⅱ)그와 같이 형성된 복합체를 분리하는 단계와; 그리고 (ⅲ) mRNA가 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 결정하기 위해 분리 복합체에서 mRNA를 동정하는 단계를 포함하여 구성된다.

다른 실시예에서, (a)단계의 핵산 샘플이, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주표면 항원으로서, 폴리펩티드의 133번째 위치에서 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA의 전사에 상응하는 mRNA를 포함하여 구성되고, (b)단계의 결정단계가 (ⅰ)하나의 아미노산 서열을 얻기 위한 바람직한 조건하에서 mRNA 를 해독(translating)하는 단계와; 그리고 (ⅱ) 핵산 샘플이 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하기 위해 상술한 분리 핵산에 의해 엔코드된 아미노산 서열과 (i)단계의 아미노산 서열을 비교하는 단계를 포함하여 구성된다.

또 다른 예는 (b) 결정단계가, (ⅰ)(a)단계의 샘플에 존재하는 핵산을 증폭하는 단계와; 그리고 (ⅱ)수득된 증폭 핵산내의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명은, 하나의 피검자가 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스에 감염되었는지를 판단하기 위해, B형 간염 바이러스 지정 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원인 하나의 폴리펩티드를 검출할 수 있는 항체들의 용도를 제공하는 것으로, 그러한 판단방법은, (a) 피검자로부터 하나의 적합한 샘플을 얻는 단계와;(b)피검자가 감염되었는지를 판단하기 위해 폴리펩티드를 인식하는 항체들에 샘플들을 적합한 조건하에서 접촉시킴으로써, (a) 단계로부터 수득된 샘플이 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항체로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니고 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하는 단계를 포함하여 구성된다.

앞서 설명한 용도에 있어서, 분리 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 항체는 하나의 검출가능한 표지(marker)를 붙일(labelled) 수 있다. 검출가능한 표지들의 예로는 방사성동위원소(radioactive isotpes), 형광단(fluorophors) 및 효소들을 포함한다.

실시예에서, 샘플들은 혈액, 조직 및 혈청을 포함한다.

본 발명은 피검자가 간세포암의 소질을 가지고 있는지를 판단하기 위하여, B형 간염 바이러스 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산의 용도를 제공하는 것으로, 그러한 판단방법이 (a) 피검자로부터 하나의 적합한 핵산샘플을 얻는 단계:(b) (a)단계의 핵산 샘플이 B형 간염 바이러스 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산인지 그 유도체인지를 결정하는 단계를 포함하여 구성된다.

하나의 실시예로, (a)단계의 핵산 샘플이 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA의 전사(transcript)에 상응하는 mRNA를 포함하여 구성되는 것이고, 상기 (b) 결정단계가 (ⅰ)하나의 복합체를 형성하기 위해 올리고뉴클레오티드에 대한 mRNA의 결합을 허용하는 조건하에서 mRNA를 앞서 설명한 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계와; (ⅱ)그와 같이 형성된 복합체를 분리하는 단계와; 그리고 (ⅲ) mRNA가 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 결정하기 위해 분리 복합체에서 mRNA를 동정하는 단계를 포함하여 구성된다.

다른 실시예로, (a)단계의 핵산 샘플이 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주표면 항원으로서, 위치번호 133번의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA의 전사에 상응하는 mRNA를 포함하여 구성되고, (b)단계의결정단계가 (ⅰ)하나의 아미노산 서열을 얻기 위한 바람직한 조건하에서 mRNA 를 해독(translating)하는 단계와; 그리고 (ⅱ) 핵산 샘플이 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하기 위해 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 174 내지 400과 실질적으로 동일한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 분리 핵산의 아미노산 서열과 (i)단계의 아미노산 서열을 비교하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명은, 피검자가 간세포암 소질(a predisposition for hepatocellular carcinoma)을 갖는지를 판단하기 위하여, B형 바이러스 간염의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원인 하나의 폴리펩티드를 인식하는(recognize) 하나의 항체의 용도를 제공하는데, 그러한 판단방법은 (a) 피검자로부터 하나의 적합한 핵산 샘플을 얻는 단계와;그리고 피검자가 간세포암에 대한 하나의 소질을 갖는지를 판단하기 위해 적절한 조건에서 항체들에 결합하도록 샘플을 접촉시킴으로서(b) (a)단계로부터의 핵산 샘플이 B형간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하는 단계를 포함하여 구성된다.

상술한 용도들에서, 분리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 항체는 하나의 검출가능한 표지로 표시될 수 있다. 검출 가능한 표지들의 예들은 방사성 동위원소, 형광단 및 효소들을 포함한다.

실시예들에서, 샘플은 혈액, 조직 또는 혈청을 포함한다.

본 발명은 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 치료약제(medicament)를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (a)B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 화학적 화합물과 폴리펩티드와 화학적 화합물 사이에서의 결합을 허용하는 조건하에서 접촉시키는 단계와;(b)폴리펩티드에 대한 화학적 화합물의 특정 결합을 검출하는 단계와; 그리고 (c)바이러스 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해 그 화학적 화합물이 폴리펩티드를 억제하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명은 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 감염을 예방할 수 있는 하나의 치료약제를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 그 방법은, (a)B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 폴리펩티드와 화학적 화합물의 결합을 허용하는 조건하에서 화학적 화합물과 접촉시키는 단계와;(b)폴리펩티드에 대한 화학적 화합물의 특정 결합을 검출하는 단계와; 그리고 (c)바이러스 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해 그 화학적 화합물이 폴리펩티드를 억제하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는 하나의 방법을 제공한다.

본 발명은 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 치료약제를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 그 방법은, (a)B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 폴리펩티드와 화학적 화합물의 결합을 허용하는 조건하에서 화학적 화합물과 접촉시키는 단계와;(b)폴리펩티드에 대한 화학적 화합물의 특정 결합을 검출하는 단계와; 그리고 (c)바이러스 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해 그 화학적 화합물이 폴리펩티드를 억제하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는 하나의 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 간세포암을 예방할 수 있는 하나의 치료약제를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (a) B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 폴리펩티드와 화학적 화합물 사이에서의 결합을 허용하는 조건하에서, 화학적 화합물과 접촉시키는 단계와;(b)폴리펩티드에 대한 화학적 화합물의 특정 결합을 검출하는 단계와; 그리고 (c)간세포암을 예방할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해, 그 화학적 화합물이 폴리펩티드에 결합하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명은 균주에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 유효량으로 앞서 설명한 방법에 의해 동정된 화학적 화합물을 포함하여 구성되는 하나의 조성물 및 하나의 약학적으로 효과적인 담체를 제공한다.

또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드 또는 그 유도체, 하나의 피검자에서 항체 생성을 자극 또는 증진시키는데 효과적인 폴리펩티드의 유효량 및 하나의 약학적으로 수용가능한 담체를 제공한다.

실제의 유효량은 폴리펩티드의 크기, 폴리펩티드의 생물분해성(biodegradibility), 폴리펩티드의 생물활성(bioactivity) 및 폴리펩티드의 생체이용율(bioavailability)에 기초할 것이다. 만일 폴리펩티드가 빠르게 분해되지(degrade) 않으며, 생체이용될 수 있고 고활성이면 작은 양으로도 효과적일 것이다. 유효량은 본 발명이 속하는 기술분야의 기술자들에 의해 잘 알려 있을 것이고, 또한 폴리펩티드의 형태, 폴리펩티드의 크기 및 폴리펩티드의 생물 활성에 영향을 받을 것이다. 예를 들어, 하나의 보조제를 사용함으로써 폴리펩티드의 필요량을 낮출 수 있을 것이다. 본 발명이 속하는 기술분야의 기술자들은 생물학적 분석으로 생물 활성를 결정하는 경험적 활성 시험들을 루틴하게 수행함으로서 유효량을 결정할 수 있을 것이다.

약학적으로 수용가능한 담체들은 본 발명이 속하는 기술분야의 기술자들에게 알려져 있고, 0.01 내지 0.1M, 바람직하게는 0.05M 인산 완충액 또는 0.8% 식염수를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적으로, 그러한 약학적으로 수용가능한 담체들은 수용성 또는 비수용성 용액, 현탁액 및 유화액일 수 있다. 비수용성 용액의 예들은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성유 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 수용성 담체들은 식염수 및 완충 배지를 포함하는 물, 알콜/수용성 용액, 유화액, 현탁액이다. 비경구 부형제(vehicles)들은 염화나트륨 용액, 링거스 덱스트로오스, 덱스트로오스및 염화나트륨, 젖산 링거스(lactated Ringer's) 또는 불휘발성오일이다. 정맥부형제들은 링거스 덱스트로오스에 기초하는 것들과 같은 체액, 영양 보충액, 전해질등을 포함한다. 방부제와 다른 첨가제들로는 예를 들어, 항균제, 산화방지제, 킬레이트제, 불활성 가스 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 아미노산 서열번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나의 펩티드 또는 그 유도체를 포함하여 구성되는 하나의 조성물, 피검자내 항체 생성을 자극 또는 증진하는 펩티드의 유효량 및 하나의 약학적으로 수용가능한 담체를 제공한다.

본 발명은 나아가, 간세포암을 예방 또는 치료하는데 유효량으로 앞서 설명한 방법에 의해 동정된 화학적 화합물을 포함하여 구성되는 조성물 및 하나의 약학적으로 수용가능한 담체를 제공한다.

또한, 본 발명은 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위하여 유효량으로 앞서 설명한 방법에 의해 동정된 화학적 화합물을 포함하여 구성되는 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의해 감염된 피검자를 치료하기 위한 앞서 설명한 조성물의 용도를 제공한다.

또한,본 발명은 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의해 감염된 피검자를 예방하기 위한 앞서 설명한 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 간세포암을 치료 또는 예방하기 위한 앞서 설명한 조성물의용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 대한 하나의 피검자로부터의 조직들과 체액을 스크리닝하는 하나의 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은, (a) 피검자로부터 적합한 채액 샘플을 얻는 단계와;(b) 균주용 샘플을 스크린하기 위해, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 아미노산이 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드의 존재를 (a)단계의 샘플에서 판단하는 단계를 포함하여 구성된다. 특별히, 체액은 혈액, 혈청, 또는 혈액 이나 혈청의 하나의 핵산 샘플을 포함한다.

나아가, 본 발명은 이러한 바이러스 균주에 의해 감염된 피검자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 이러한 바이러스 균주에 대한 조직 및 체액을 스크린하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 B형 간염의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는, B형 간염 바이러스의 표면 항원의 하나의 돌연변이 형태를 포함하여 구성되는 하나의 간염 백신을 제공한다.

본 발명은 앞서 설명한 백신 및 하나의 보조제를 제공한다.

본 발명을 아래의 실험 세부사항에서 설명하기로 한다. 이들 부분들은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 기재된 것일 뿐, 이후에 첨부되는 청구항들에 기재된 발명을 제한하도록 의도되거나 해석되어서는 안된다.

실험 세부사항

이하에서 설명될 방법에서, 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로) 돌연변이를 가지고 있는 B형 간염 바이러스가 분리되었고, 그것의 뉴클레오티드 서열이 판단되었다.

표면 항원 담체의 63세 여성 중국 환자로부터 혈청 샘플(5194)를 얻었다. 그녀는 연속 생검법에 의해 HCC 환자로 판명되었다. "a" 에피토프의 사전 서열 분석에 의해 나타난 것과 같이, 그녀의 혈청으로부의 B형 간염 바이러스가 주 표면 항원내 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에서 하나의 돌연변이주를 운반하였다. 본 발명에서 그 서열의 판단전에 바이러스 DNA를 추출하였다.

아래 실시예에서 설명하는 바와 같이, 주표면 항원의 아미노산 잔기 133에 하나의 돌연변이를 가지고 있는 HCC로부터의 이러한 B형 간염 바이러스의 게놈은 동일한 아형(adr)의 야생형 바이러스의 것과 동일하게 3215개로 구성된다. 주 바이러스 단백질에 대하여 코딩하는 개방 판독 프레임들(ORF)은 야생형 바이러스와 비교할때 상응하는 위치에서 발견된다. 돌연변이 B형 간염 바이러스 게놈에서 위치 1은 야생형 바이러스의 그것에 상응한다.

보고된 돌연변이 바이러스 게놈의 상이한 ORFs의 구조가 도 1에 요약되어 있는데, 그들의 위치는 아래와 같이 정의된다;

-DNA 중합효소 유전자가 2307위치에서 시작해서 1623 위치에서 끝나기 때문에, 2532개의 뉴클레오티드로 구성되고, 843개의 아미노산 잔기에 대해 코딩한다;

-큰 표면 항원 유전자는 2848위치에서 시작해서 835위치에서 끝나기 때문에, 1203개의 뉴클레오티드로 구성되고, 400개의 아미노산 잔기에 대해 코딩한다. 이러한 큰 표면 항원은 3205위치에서 시작하는 중간 표면 항원과 155 위치에서 시작하는 주 표면 항원을 겹치게 한다. 중간 표면 항원(281개의 아미노산 잔기로 구성) 및 주 표면 항원(226개의 아미노산 잔기로 구성)들이 큰 표면 항원과 동일한 위치에서 끝난다;

-코어 유전자는 1814 위치에서 시작해서 2452 위치에서 끝나기 때문에, 639개의 뉴클레오티드로 구성되고, 212개의 아미노산 잔기에 대해 코딩한다; 그리고

-트랜스-액티베이팅 X 유전자는 1374 위치에서 시작해서 1838 위치에서 끝나기 때문에, 465개의 뉴클레오티드로 구성되고 154개의 아미노산 잔기에 대해 코딩한다.

더욱이, 서열 분석은, 주 표면 항원의 122와 160의 위치에 있는 하나의 라이신 잔기(a lysine residue)에 의해 표시된 것과 같이, B형 간염 바이러스가 adw 아형에 속하는 것을 입증했다. 직접적인 시퀀싱에 의한 "a" 에피토프의 앞서의 분석과 일치하게, 돌연변이(메티오닌에서 트레오닌까지)가 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133에서 발견된다.

유전자은행 데이터 베이스에 기탁되어 있는 (기탁번호 D16665) 야생형 B형 간염 바이러스와 비교하면, B형 간염 바이러스 균주의 동일성(identity)은 뉴클레오티드 시퀀스에 대해 90.3%이다. 본 돌연변이 B형 간염 바이러스의 상이한 바이러스 단백질들의 동일성은, 그것의 야생형 타입 상대(counterpart)들과 비교할 때, DNA 중합효소(PIR-Protein Identification Resources accession number): 단백질 동정원 기탁번호-S43491), 큰 표면 항원(PIR-기탁번호 JQ2107), 코어(PIR 기탁번호 S43490) 및 트랜스-액티베이팅 X(PIR 기탁번호 S35529)단백질들 각각에 대하여 95.8%, 97.5%, 95.1% 및 94.8%이다. 역으로, 다양한 아미노산 치환체들이 야생형 상대와 비교할 때 바이러스 단백질 각각에 존재한다; DNA 단백질 중합효소내 5개의 돌연변이주, 큰 표면 항원에 5개(주 표면 항원의 개시 코돈에 대해 메티오닌에서 트레오닌으로 변화를 포함), 코어에 5개 및 트랜스-엑티베이팅 X 단백질에 4개.

주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌 에서 트레오닌)에서 하나의 돌연변이를 가지고 있는 본 발명의 B형 간염 바이러스 게놈은, 돌연변이 바이러스 게놈에 대해 특유한(specific to the mutant virus genome) 올리고뉴클레오티드를 만드는(design) 물질(material)로서 사용될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드들은, 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133에 하나의 돌연변이를 가지고 있는 바이러스를 검출하는 높은 효과의(highly specific) 진단약제를 위한 물질로 사용될 수 있다.

주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에 하나의 돌연변이를 가지는, 본 발명의 인체 B형 간염 바이러스 게놈은 연관 코딩 지역을 가지고 있는 하나의 백터를 발현함으로써 본 발명의 단백질을 생성하는 재료로 사용될 수 있고, 표준 DNA 재조합 기술을 이용하여 대장균(Escherichia Coli)과 같은 하나의 숙주 세포에서 복제할 수 있다.

본 발명의 단백질들은, 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133에 하나의 돌연변이를 가지고 있는 HCC로 부터의 B형 간염 바이러스를 검출할 수 있는 고특효 진단시약용 재료로 유용하다. 공지의 방법을 사용하여, 동일한 단백질들이 다중 및 단일 클로날 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.

다중클로날 및 단일클로날 항체들이, 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에 하나의 돌연변이를 갖는, HCC로부터의 B형 간염 바이러스의 고 특효 항원을 검출하는 진단시약을 위한 재료로 사용될 수 있다.

본 발명의 각 단백질 또는 아미노산들이 부분적으로 대체된 단백질들을 이용하는 하나의 검출 시스템과 그러한 단백질들에 단일클로날 항체 또는 다중클로날 항체를 사용하는 하나의 검출 시스템은, B형 간염 바이러스 표면 항원의 담체들을 갖고, HCC를 발전시킬 위험성이 있는 환자들로부터 이러한 바이러스를 검출하기 위해 HCC로부터의 인체 B형 간염 바이러스를 검출할 수 있는 고특정 진단시약으로 유용하다.

단백질들 또는 그러한 단백질들에 대한 항체들이 그러한 바이러스에 대한 예방약 (prophylactic)및 치료 백신을 개발하기 위한 하나의 재료로 사용될 수 있다.

하나의 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드들이 동일한 단백질을 생성하기 위해 다른 뉴클레오티드로 대체될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에서 보고된 단백질에 대해 코딩하는 그러한 뉴클레오티드 변화들과도 관련이 있다. 하나의 단백질 서열내의 하나 또는 그 이상의 아미노산은, 아미노산 서열의 하나의 유사체를 생성하기 위해 그들의 소수성 특성 또는 전하로 정의되는 바와 같이, 하나의 단백질 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산들이 다른 유사체(analogous) 아미노산들에 의해 대체될 수 있다는 것도 마찬가지로 잘 알려져 있다. 아미노산 대체물, 결실(deletions) 또는 등배체(isosteres)(단백질 아미노산과 밀접한 구조적, 공간적으로 유사성을 가지는 수정-modified- 아미노산들),아미노산 부가 또는 등배체 부가를 포함하는 본 발명의 단백질의 어떠한 유사체도 이용될 수 있고, 그것은 주 표면 항원의 아미노산 돌연변이 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에 하나의 돌연변이를 가지는 HCC로 부터 분리된 B형 간염 바이러스를 인식하는 항체들을 수득(resulting) 항체들이 유도해 내는(elicit) 것을 가정한다.

주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에서 하나의 돌연변이를 가지는 HCC로부터 분리된 B형 간염 바이러스의 추론 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열이 하기의 방법으로 판단되었다;

1. 바이러스 DNA의 분리

바이러스 DNA는, 표면 항원 담체의 63세의 중국인 여자 환자로부터 혈청 샘플(5194)를 분리하였다. 그녀는 연속적인 생검법(biopsy)에 의해 HCC 환자로 판명되었다. "a" 에피토드의 사전 서열 분석에서 보여주는 것과 같이, 주 표면 항원에서 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에서 그녀의 혈청으로부터 B형 간염 바이러스를 운반하였다.

사용된 분리 방법은 아래와 같다:

200㎕의 혈청 샘플에 400㎕의 세포용해(lysis) 완충액(트리스 클로라이드 10mM, pH7.4, EDTA 1mM및 소듐도데실 설페이트 2%) 및 25㎕의 단백질 분해효소 K(20㎎/㎖)를 첨가한 후 65℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그리고나서, 바이러스 DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다.

2. 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 바이러스 DNA의 증폭

야생형 B형 간염 바이러스에 따라 설계된 3세트의 중첩 올리고뉴클레오티드를 이용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 바이러스 게놈을 증폭하였다. 다양한 제한효소 사이트가 PCR 생성물의 클로닝을 촉진하는데 포함되었다. 이들 올리고뉴클레오티드의 위치를 도 2에 나타내었고, 아래와 같이 표시된다.:

-플랙1(Flag 1)(ATAAGCTTATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGA)(서열번호 6)은 DNA중합효소의 코딩지역 개시 사이트, 바이러스 뉴클레오티드 서열의 2307번째 위치에서 시작하여 코딩 스트랜드에 매치한다(지각 올리고뉴클레오티드). 하나의 추가적 하인드III(Hind III) 제한효소 사이트는 밑줄친 부분이다:

-Xba3(GAGTCTAGACTCTGCGGTATTGTGA)(서열번호 7)은 내부 제한 효소 사이트 XbaI, 바이러스 뉴클레오티드 서열의 250번째 위치에서 시작하여 상보 스트랜드에 매치한다(항-지각 올리고뉴클레오티드). 하나의 추가적 XbaI 제한 효소 사이트는 밑줄친 부분이다:

-Xba5(GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCT)(서열번호 8)은 내부 XbaI 사이트, Xba3 올리고뉴클레오티드와 동일한 위치에서 시작하지만 코딩 스트랜드에서 매치한다(지각 올리고뉴클레오티드). 하나의 추가적 XbaI 제한효소 사이트는 밑줄친 부분이:

-커먼3(common 3)(TGAGAATTCTCACGGTGGTCTCCATGCGACT)(서열번호 9)는 DNA 중합효소의 정지코돈, 바이러스 뉴클레오티드 서열의 1623번째 위치에서 시작해서 보상 스트랜드에 매치한다(비-지각 올리고뉴클레오티드). 하나의 추가적 EcoRI 제한 효소 사이트는 밑줄친 부분이다:

-Vll(TTTGTTTACGTCCGT)(서열번호 10)은 X 유전자의 개시 사이트 근처, 바이러스 뉴클레오티드 서열의 1420번째 위치에서 시작해서 코딩 스트랜드에서 매치한다.(지각 올리고뉴클레오티드):

-하인드IIIADW3(CTAAGCTTAGTTTCCGGAAGTGTTGAT)(서열번호 11)은 DNA 중합효소의 개시 사이트에 가까운 곳인 2340 위치에서 시작해서 보상 스트랜드에서 매치한다(비-지각 올리고뉴클레오티드). 하나의 추가적 하인드 III 제한효소 사이트는 밑줄친 부분이다.

하나의 주형(template)으로써 바이러스 DNA를 사용하여,Pfu중합효소(스트라타젠, 미합중국, Stratagene, U.S.A.)를 사용하여 35사이클 동안 하나의 DNA 열 사이클러(Perkin-Elmer.Cenfus 퍼킨-엘머, 세투스)에서 PCR을 행하는데, 각 사이클은 94°C의 변성온도에서 1.5분, 53°C의 냉각온도에서 2분 및 72°C의 연장온도에서 4분으로 구성된다. 하기 조합의 올리고뉴클레오티드가 사용되었다: 플랙1/Xba3, Xba5/커먼3과 Vll/하인드IIIADW3 및 각 1.2 Kb, 1.4Kb 와 1.1Kb의 증폭 생성물 생성

3. 증폭된 바이러스 DNA 단편들의 클로닝.

플랙1/Xba3(1.2kb)로부터 증폭된 바이러스 DNA 단편이 동일한 제한 효소들로미리 처리된 하나의 블루스크립트(Bluescript) 플라스미드에서 클로닝 하기 전에 하이드III 및 XbaI로 제한 효소 분해에 처리하였다. XbaI와 EcoRI에 의해 미처리된 하나의 블루 스크립트 플라스미드에서의 클로닝 전에 XbaI와 EoRI를 갖는 유사한 분해를 Xba5/커먼3(1.4kb)으로부터의 PCR 생성물에 적용하였다. 한편, Vll과 하인드IIIADW3(1.1kb)로 증폭된 DNA 단편이 제로 평평말단 플라스미드(ZeroBlunt Plasmid)내로 직접 클론되고 평평말단-말단 DNA 단편들을 클로닝 하기 위해 인비트로젠(InvitroGen U.S.A.)에 의해 발육시켰다.

4. 뉴클레오티드 서열의 판단.

본 발명의 HCC로부터 분리된 인체 B형 간염 바이러스의 뉴클레오티드 서열은 시쿼나아제 DNA 시퀀싱 키트(the Sequenase DNA Sequencing Kit)(미합중국 바이오케미칼 코포레이션)를 이용하여 연쇄-정지 억제제에 의해 플라스미드 DNA 주형에서 결정하였다. 시퀀싱 과정을 촉진하기 위해, 야생형 B형 간염 바이러스에 따른 다양한 내부 뉴클레오티드들이 설계되었고(V1에서 V16까지), 그들의 위치들을 도 2에서 나타내었다.

앞서 설명한 분석으로부터, 도 3에 나타낸 것과 같이 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에 하나의 돌연변이를 가지고 있고 HCC로부터 분리된 B형 간염 바이러스의 전체-길이 뉴클레오티드 서열이 판단되었다.

주 바이러스 단백질들을 위한 추론 아미노산 서열들을 도 4 내지 도 7에 나타내었다: B형 간염 바이러스 DNA 중합효소(도 4), 큰 표면 항원(도 5), 코어 단백질 (도 6) 및 트랜스-액티베이팅 X 단백질(도 7).

유전자 은행 데이터 베이스에서 입수할 수 있는 다른 B형 간염 바이러스 서열을 갖는 본 발명의 바이러스 서열의 정렬(alignment)은 특정 서열차(specific sequence differences)를 가리키게 되며, 그것은 DNA 탐침(probes)을 설계하는데 차례로 사용될 수 있다. 그리고 나서 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하는 하나의 검출시스템이 개발될 수 있다. 그러한 PCR 반응들은 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133 (메티오닌에서 트레오닌으로)에 하나의 돌연변이를 가지고, HCC로 부터 분리된 B형 간염 바이러스에 특효가 있는 올리고뉴클레오티드들의 조합들을 포함함으로써, 이들 돌연변이 바이러스 DNA들의 효과 높은 특정 검출을 가능하게 한다. 간단하게, 본 발명에서 설명한 바와 같이 바이러스 DNA가 추출될 수 있다. PCR 반응들은 앞서 설명한 유사한 사이클링 조건을 이용하여 특정 올리고뉴클레오티드를 이용하여 수행될 수 있다. 그리고 나서 1%의 아가로스 겔에 PCR 생성물들을 용해한 후 결과가 분석될 수 있다.

알려진 면역학적 절차들에 의하면, 도 4 내지 7에 도시한 것들과 같이 단백질 서열들로부터 에피토프들을 판단할 수 있다. 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133에서 돌연변이를 갖고 HCC로부터 분리된 B형 간염 바이러스에 대해 특유한 이들 에피토프들의 판단이 유전공학적 방법들을 이용하는 펩티드의 합성, 단백질합성, 항체 생성, 특정 진단 시약의 개발, 예방 및 치료 백신의 개발, 및 항바이러스제를 가능하게 한다.

주 표면 항원의 아미노산 잔기 133에 하나의 돌연변이를 가지고 HCC로부터 분리된 B형 간염 바이러스에 대한 항체 검출시스템이 폴리비닐 마이크로티터 플레이트(microtiter plate)와 샌드위치 법을 이용하여 개발될 수 있다. 간략하게, 5㎍/㎖ 농도의 본 발명에서 HCC로부터 분리되고 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에 하나의 돌연변이를 갖는 B형 간염 바이러스 펩티드 50㎕가 마이크로티터 플레이트의 각 웰(well)에 분배된 후 강화(consolidation)를 위해 실온에서 밤새 배양될 수 있다. 유사한 절차가 대장균과 같은 숙주 세포들로 부터 정제된 "s"단백질에 적용될 수 있다. 마이크로 평판 웰들을 0.05% 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 생리 식염수 용액으로 5회 수세할 수 있다. 오버코팅(Overcoating)을 위해 송아지 혈청 30%(v／v)와 트윈 20(CS 완충액)0.05%를 포함하는 염화나트륨 완충액 100㎕를 각 웰에 분배하여 실온에서 30분 동안 배양한 후 폐기할 수 있다.

혈청내 돌연변이 B형 간염 바이러스(주 표면 항원의 아미노산 잔기 133에 메티오닌에서 트레오닌으로)에 대해 특유한 항체를 판단하기 위해 1차 반응을 수행하여 각 마이크로 평판 웰에 50㎕ CS 완충액과 10㎕의 혈청 샘플을 분산하고 상온에서 1시간 동안 하나의 마이크로 평판 진동기에서 배양할 수 있다. 1차 반응을 마친후, 마이크로 평판 웰을 앞서 설명한 것과 같이 5회 수세한다.

2차 반응에서, 50㎕의 송아지 혈청에 용해된 1ng의 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표시 항-인체 IgG 마우스 단일클로날 항체를 각 마이크로 평판 배지에 분산한 후 상온에서 1시간 동안 하나의 마이크로 평판 진동기에서 배양할 수 있다. 배양이 완료되자마자, 배지들을 동일한 방법으로 5회 수세할 수 있다. 각 웰에 5㎕의 오르소-페닐렌디아민 용액(O-phenylendiamine solution)(발색제) 및 과산화수소(기질)를 첨가하고 상온에서 30분간 배양한 후 추가적 발색을 중지시키고 490㎚에서 흡광도(absorbance)를 판독하기 위해 각 웰에 4M의 황산용액 50㎕를 분산 시킬 수 있다.

본 발명은 돌연변이 인체 B형 간염 바이러스의 검출, 특히 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에 하나의 돌연변이를 가지고 있는 바이러스들을 검출할 수 있게 한다. 본 발명은 또한 HCC가 치료될 수 있는 경우 HCC의 발현 또는 감염의 초기 단계에서 효과높고, 민감하게 검출할 수 있는 검출시스템을 제공하는 것이다.

아울러, 이들 특징들은 질병의 초기단계에 있는 환자들을 정확하게 진단하게 하고, 헌혈자 혈액의 하나의 스크리닝 테스트를 통해, 돌연변이 B형 간염 바이러스로 오염된 혈액을 매우 효과적으로 제거하는데 도움을 준다.

본 발명의 단백질들과 그들의 항체들은 면역학적 약제 뿐만 아니라 예방 및 치료를 위한 백신들의 개발에 사용될 수 있다. 이들 돌연변이 바이러스들의 구조적 유전자에 대한 서열정보는 관련 단백질 항원과 항체의 검출 시스템을 개발하는데 도움을 줄 것이다.

항원-항체 복합체들은 공지 방법에 의해 검출될 수 있다. 특정 모노클로날 및 다중클로날 항체들은 HCC로부터 분리된 돌연변이 B형 간염 바이러스들에 대해 특유한 펩티드 또는 단백질로 마우스 및 토끼와 같은 동물들을 예방접종(immunige)함으로써 만들(raise) 수 있다. 억제 항 바이러스 약제들이, 세포배양으로 또는 생체내(in vivo)에서 이들 단백질들과 분자들을 목표로 설계될 수 있다.

본 발명은 주 표면 항원의 아미노산 잔기 133(메티오닌에서 트레오닌으로)에하나의 돌연변이를 가지고, HCC로부터 분리된 하나의 분리 바이러스 게놈의 연구에 기초한다. 본 발명은 이들 HCC로부터 분리된 돌연변이 B형 간염 바이러스의 효과 높은 검출을 가능하게 하고, 그러한 검출 시스템을 개발하기 위한 단백질 다중클로날 및 단일클로날 항체를 제공하는 것이다.

참고문헌

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Claims

그 구성 바이러스 게놈이 1997.12.15.자로 ECCC(European Collection of Cell Culture)에 기탁번호 P97121501, P97121502 및 P121503로 기탁된, 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(Oon strain)(메티오닌에서 트레오닌으로;Methionine to Threonine)로 명명된 B형 간염 바이러스의 분리균주.
B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는, 분리 핵산.
제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 1로 지정된 핵산 서열의 뉴클레오티드 155 내지 835에 의해 엔코드되는, 분리 핵산.
제3항에 있어서, 위치 551-553에 있는 뉴클레오티드 "ACG"를 포함하여 구성되는, 분리 핵산.
제2항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인, 분리 핵산.
제2항에 있어서, 상기 핵산이 RNA인, 분리핵산.
제5항에 있어서, 상기 핵산이 cDNA인, 분리핵산.
제5항에 있어서, 상기 핵산이 게놈 DNA인, 분리핵산.
제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 174 내지 400과 실질적으로 동일한 하나의 아미노산 서열을 갖는, 분리핵산.
서열번호 1의 뉴클레오티드 527 내지 595를 포함하여 구성되는 하나의 핵산분자에 의해 엔코드된 하나의 펩티드를 엔코드하는, 분리 핵산.
아미노산 서열 지정 서열번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나의 펩티드를 엔코드하는, 분리 핵산.
B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한하나의 아미노산 서열을 갖는, 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 분리 핵산을 포함하여 구성되고, 효과적으로(operatively) RNA 전사(RNA transcription)의 하나의 프로모터에 연결된, 벡터.
서열번호 1의 뉴클레오티드 527 내지 595를 포함하여 구성되는 하나의 핵산 분자에 의해 엔코드되는 하나의 펩티드를 엔코딩하는 하나의 분리핵산을 포함하여 구성되는, 벡터.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 DNA를 포함하여 구성되는, 벡터.
하나의 적합한 숙주에 제12항의 벡터를 포함하여 구성되는 하나의 폴리펩티드를 생성하기 위한, 숙주 벡터 시스템.
하나의 적합한 숙주내에 제13항의 벡터를 포함하여 구성되는 하나의 펩티드를 생성하기 위한, 숙주 벡터 시스템.
폴리펩티드의 생성을 허용하기에 적합한 조건하에서 제15항의 숙주 벡터 시스템을 증식시키는 단계와 그렇게 생성된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여 구성되는, 하나의 폴리펩티드를 생성하는 방법.
폴리펩티드의 생성을 허용하기 적합한 조건하에서 제16항의 숙주 벡터 시스템을 증식시키는 단계와 그렇게 생성된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여 구성되는 하나의 펩티드를 생성하는 방법.
(a) 하나의 적합한 숙주 세포내로 제12항의 벡터를 도입하는 단계;

(b)폴리펩티드를 생성하기 위해 수득 숙주 세포를 배양하는 단계;

(c)(b)단계에서 생성된 폴리펩티드를 회수하는 단계; 그리고

(d)그와 같이 회수된 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하여 구성되는, 정제된 형태의 하나의 폴리펩티드를 얻는 방법.
(a) 하나의 적합한 숙주 세포내로 제13항의 벡터를 도입하는 단계;

(b)폴리펩티드를 생성하기 위해 수득 숙주 세포를 배양하는 단계;

(c)(b)단계에서 생성된 폴리펩티드를 회수하는 단계; 그리고

(d)그와 같이 회수된 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하여 구성되는, 정제된 형태의 하나의 폴리펩티드를 얻는 방법.
B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한하나의 아미노산 서열을 갖는, 정제 폴리펩티드.
제19항의 방법으로부터 수득된 정제 폴리펩티드.
서열번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는, 정제 폴리펩티드.
제20항의 방법으로수터 수득된, 정제 펩티드.
하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원을 엔코드하는 하나의 핵산내의 뉴클레오티드들의 여하한 서열에 대하여 하이브리드화 하지 않고; B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산내의 뉴클레오티드들의 하나의 단일 서열과 특유하게 하이브리드화(hybridizing)할 수 있는, 적어도 15개의 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드.
서열번호 1의 뉴클레오티드 527 내지 595를 포함하여 구성되는, 제 25항의 올리고뉴클레오티드.
B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드에 대한 항체들을 얻는 방법으로서,

(a)하나의 정제 폴리펩티드를 얻는 단계;

(b) 정제 폴리펩티드에 대응하는 항체들을 생성할 수 있는 하나의 유기체를 면역화하는 단계;

(c)생성된 항체들을 수집하는 단계;

(d)하나의 복합체를 형성하기 위한 조건하에서 정제 폴리펩티드와 생성된 항체들을 결합하는 단계; 그리고

(e) 폴리펩티드에 대한 항체들을 얻기 위해 어느 생성 항체들이 정제 폴리펩티드와 하나의 복합체를 형성하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는 방법.
제27항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열번호 1로 지정된 핵산 서열의 뉴클레오티드 155 내지 835에 의해 엔코드되는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 아미노산 서열 서열번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 174 내지 400과 실질적으로 동일한 하나의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 유기체가 하나의 토끼 또는 하나의 쥐를 포함하여 구성되는, 방법.
(a)하나의 정제 펩티드를 얻는 단계;

(b) 정제 펩티드에 대한 항체들을 생성할 수 있는 하나의 유기체를 면역화하는 단계;

(c)생성된 항체들을 수집하는 단계;

(d)하나의 복합체를 형성하기 위한 조건하에서 상기 정제 폴리펩티드와 생성된 항체들을 결하는 단계; 그리고

(e) 폴리펩티드에 대한 항체들을 얻기 위해 어느 생성 항체들이 정제 폴리펩티드와 하나의 복합체를 형성하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는, 서열번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나의 펩티드에 대한 항체들을 얻는 방법.
제31항에 있어서, 상기 유기체가 하나의 토끼 또는 하나의 쥐를 포함하여 구성되는 방법.
제27항 또는 제31항에서 수득된, 항체들.
제33항의 항체들의 모노클로날 항체들.
B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 검출할 수 있고, 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원을 검출할 수 없는, 항체들.
서열번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는, 하나의 펩티드를 검출할 수 있는 항체들.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주로 피검자가 감염되었는지를 판단하기 위한, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그로한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산의 용도로서, 상기 판단방법이,

(a)피검자로부터 하나의 적합 핵산 샘플을 얻는 단계; 그리고

(b)(a)단계로부터의 핵산 샘플이 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는, 용도.
제37항에 있어서, 상기 (a)단계의 핵산 샘플이, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 주 표면항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 DNA의 전사에 상응하는 mRNA를 포함하여 구성되고, (b)단계의 판단단계가,

(ⅰ)하나의 복합체를 형성하기 위해 상기 올리고뉴클레오티드에 대한 mRNA의 결합을 허용하는 조건하에서 mRNA를 제 25항의 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계;

(ⅱ)그와 같이 형성된 복합체를 분리하는 단계; 그리고

(ⅲ) 상기 mRNA가 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하기 위해 분리 복합체내의 mRNA를 동정하는 단계를 포함하여 구성되는, 용도.
제37항에 있어서, (a)단계의 핵산 샘플이, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 DNA의 전사에 상응하는 mRNA를 포함하여 구성되고, (b)단계의 판단단계가

(ⅰ)하나의 아미노산 서열을 얻기 위한 바람직한 조건하에서 상기 mRNA 를 해독하는 단계; 그리고

(ⅱ)핵산 샘플이 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하기 위해 상기 (i)단계의 아미노산 서열을 제9항의 분리핵산에 의해 엔코드된 아미노산 잔기와 비교하는 단계를 포함하여 구성되는, 용도.
제37항에 있어서, (b)단계의 판단단계가;

(ⅰ)(a)단계의 샘플에 존재하는 핵산을 증폭하는 단계; 그리고

(ⅱ)수득된 증폭 핵산에서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 단계를 포함하여 구성되는, 용도.
피검자가 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 균주에 감염되었는지를 결정하기 위한, 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원인 하나의 폴리펩티드를 검출할 수 있는 항체들의 용도를 제공하는 것으로, 상기 판단방법이,

(a) 피검자로부터 하나의 적합한 샘플을 얻는 단계와;

(b) 피검자가 감염되었는가를 결정하기에 적합한 조건하에서 제35항 또는 제36항의 항체들에 샘플을 접촉시킴으로써 (a) 단계에서 얻은 샘플이, B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항체로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니고 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 결정하는 단계를 포함하여 구성되는, 용도.
제 37항, 제 38항 또는 제41항에 있어서, 상기 분리 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 항체가 하나의 검출가능한 표지(marker)로 표시되는, 용도.
제42항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 하나의 방사성동위원소, 하나의 형광단 또는 하나의 효소인, 용도.
제37항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 조직 또는 혈청을 포함하여 구성되는, 용도.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 치료약제(medicament)를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법으로서,

(a)B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 폴리펩티드와 화학적 화합물 사이에서의 결합을 허용하는 조건하에서 화학적 화합물과 접촉시키는 단계;

(b)상기 화학적 화합물의 폴리펩티드에 대한 특정 결합을 검출하는 단계; 그리고

(c)바이러스 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해, 상기 화학적 화합물이 상기 폴리펩티드에 결합하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는, 방법.
제45항에 있어서, 상기 (a)단계의 핵산 샘플이, B형 간염 바이러스의 하나의균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염바이러스의 주 표면항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 mRNA를 포함하여 구성되고, (b)단계의 판단단계가

(ⅰ)하나의 복합체를 형성하기 위해 mRNA를 올리고뉴클레오티드에 mRNA의 결합을 허용하는 조건하에서 제25항의 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계;

(ⅱ)그와 같이 형성된 복합체를 분리하는 단계; 그리고

(ⅲ) 상기 mRNA가 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하기 위해 분리 복합체내 mRNA를 동정하는 단계를 포함하여 구성되는 방법.
제45항에 있어서, 상기 (a)단계의 핵산 샘플이 B형 간염 바이러스의 하나의 숙주의 하나의 돌연변이 주표면 항원으로서, 위치번호 133번의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아니라 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코딩하는 mRNA를 포함하여 구성되고, (b)단계의 판단단계가,

(ⅰ)하나의 아미노산 서열을 얻기 위해 적합한 조건하에서 mRNA를 해독하는 단계; 그리고

(ⅱ)상기 핵산 샘플이 상기 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 판단하기 위해 제9항의 분리 핵산에 의해 엔코드된 아미노산서열과 비교하는 단계를 포함하여 구성되는 방법.
제45항에 있어서, 상기 (b)단계가

(ⅰ)(a)단계의 샘플에 존재하는 핵산을 증폭하는 단계; 그리고

(ⅱ)수득된 증폭 핵산에서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 단계를 포함하여 구성되는 방법.
(a)피검자로부터 하나의 적합한 핵산 샘플을 얻는 단계; 그리고

(b)피검자가 간세포암 소질을 갖는지를 결정하기 위해 제35항 또는 제36항의 항체들에 결합하기에 적합한 조건하에서 상기 샘플들을 접촉시킴으로써, (a)단계의 핵산 샘플이 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주표면 항원으로, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를 엔코드하는 하나의 핵산인지 아니면 그 유도체인지를 결정하는 단계를 포함하여 구성되는 방법에 의해, 하나의 피검자가 간세포암 소질을 갖는지를 판단하기 위한 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원인 하나의 폴리펩티드를 인식하는 하나의 항원의 용도.
제46항,제47항 또는 제49항의 방법에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는항체가 하나의 검출가능한 표지로 표시되는 방법.
제50항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 하나의 방사성동위원소, 형광단 또는 하나의 효소인 방법.
제45항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 조직 또는 혈청을 포함하여 구성되는 방법.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 치료약제를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법으로서,

(a)B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133번의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 폴리펩티드와 화학적 화합물 사이에서의 결합을 허용하는 조건하에서 화학적 화합물과 접촉시키는 단계;

(b)상기 폴리펩티드에 대한 상기 화학적 화합물의 특정 결합을 검출하는 단계; 그리고

(c)바이러스 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해 상기 화학적 화합물이 상기 폴리펩티드와 결합하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는, 방법.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 감염을 예방할 수 있는 하나의 치료약제를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법으로서,

(a)B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133번의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 폴리펩티드와 화학적 화합물 사이에서의 결합을 허용하는 조건하에서 화학적 화합물과 접촉시키는 단계;

(b)상기 폴리펩티드에 대한 상기 화학적 화합물의 특정 결합을 검출하는 단계; 그리고

(c)바이러스 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해 상기 화학적 화합물이 상기 폴리펩티드와 결합하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는, 방법.
간세포암을 치료할 수 있는 하나의 치료약제를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법으로서,

(a)B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133번의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 폴리펩티드와 화학적 화합물 사이에서의 결합을 허용하는 조건하에서 화학적 화합물과 접촉시키는 단계;

(b)상기 폴리펩티드에 대한 상기 화학적 화합물의 특정 결합을 검출하는 단계; 그리고

(c)바이러스 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해 상기 화학적 화합물이 상기 폴리펩티드와 결합하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는, 방법.
간세포암을 예방할 수 있는 하나의 치료약제를 제조하기 위한 하나의 화학적 화합물을 동정하는 방법으로서,

(a)B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133번의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드를, 폴리펩티드와 화학적 화합물 사이에서의 결합을 허용하는 조건하에서 화학적 화합물과 접촉시키는 단계;

(b)상기 폴리펩티드에 대한 상기 화학적 화합물의 특정 결합을 검출하는 단계; 그리고

(c)바이러스 균주에 의한 감염을 치료할 수 있는 하나의 화학적 화합물을 동정하기 위해 상기 화학적 화합물이 상기 폴리펩티드와 결합하는지를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는, 방법.
B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서, 위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 간염 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드 또는 그 유도체의, 피검자에서 항체 생성을 자극 또는 증진시키는 유효량 및 하나의 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하여 구성되는 조성물.
서열번호 3으로 지정된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 298 내지 320을 포함하여 구성되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 하나의 펩티드 또는 그 유도체의, 피검자에서 항체 생성을 자극 또는 증진시키는 유효량 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하여 구성되는 조성물.
간세포암을 치료하는데 유효량으로 제55항의 방법에 의해 동정된 화학적 화합물 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하여 구성되는 조성물.
간세포암을 예방하는데 유효량으로 제56항의 방법에 의해 동정된 화학적 화합물 및 약학적으로 효과적인 담체를 포함하여 구성되는 조성물.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주를 치료하는데 효과적인 양으로 제53항의 방법에 의해 동정된 화학적 화합물 및 약학적으로 효과적인 담체.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 감염을 예방하는데 효과적인 양으로 제54항의 방법에 의해 동정된 화학적 화합물을 포함하여 구성되는 조성물.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 피검자의 감염을 치료하기 위한 청구항 제57항 또는 제58항의 조성물의 용도.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 피검자의 감염을 치료하기 위한 제61항의 조성물의 용도.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 피검자의 감염을 예방하기 위한 제57항 또는 제58항 조성물의 용도.
인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 의한 피검자의 감염을 예방하기 위한 제62항 조성물의 용도.
간세포암을 갖는 피검자를 치료하기 위한 제57항 또는 제58항의 조성물의 용도.
간세포암을 갖는 피검자를 치료하기 위한 제59항의 조성물의 용도.
피검자의 간세포암 예방을 위한 제57항 또는 59항의 조성물의 용도.
피검자의 간세포암 예방을 위한 제60항의 조성물의 용도.
(a) 피검자로부터 적합한 체액 샘플을 얻는 단계와;

(b) 균주용 샘플을 스크린하기 위해 (a)단계의 샘플에서 B형 간염 바이러스의 하나의 균주의 하나의 돌연변이 주 표면 항원으로서,위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 하나의 야생형 B형 바이러스의 하나의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 갖는 그러한 하나의 폴리펩티드의 존재를 판단하는 단계를 포함하여 구성되는, 인체 B형 간염 바이러스 표면 항원-'S'-133 오온 균주(메티오닌에서 트레오닌으로)로 명명된 B형 간염 바이러스의 하나의 균주에 대한 하나의 피검자의 체액을 스크리닝하는 방법.
제71항에 있어서, 상기 체액이 혈액, 혈청 또는 혈액 또는 혈청의 하나의 핵산 샘플을 포함하여 구성되는, 방법.
위치번호 133의 아미노산이 하나의 메티오닌이 아닌 하나의 트레오닌인 점에서 B형 간염 바이러스의 주 표면 항원의 아미노산 서열과 상이한 하나의 아미노산 서열을 가지는, 폴리펩티드가 B형 간염 바이러스의 표면 항원의 하나의 돌연변이 형태를 포함하는, 간염 백신.
제73항에 있어서, 하나의 보조제를 추가적으로 포함하여 구성되는 백신.