PL187302B1

PL187302B1 - Zastosowanie bakterii propionowych i wchłanialna kompozycja dietetyczna lub lecznicza, zawierająca bakterie propionowe zdolne do wydzielania tlenku azotu

Info

Publication number: PL187302B1
Application number: PL97334277A
Authority: PL
Inventors: Edmond D. Roussel; Charles G. Legrand; Marc H. Legrand; Nathalie Roland
Original assignee: Standa Lab Sa
Priority date: 1996-12-24
Filing date: 1997-12-23
Publication date: 2004-06-30
Also published as: DE69711084T2; BR9714179A; CN1126553C; CN1245432A; EP0951290B1; AU5669098A; CA2275367A1; DK0951290T3; FR2764802A1; IL130619A; JP2001507015A; IL130619A0; WO1998027991A1; DE69711084D1; KR100399362B1; EP0951290A1; CA2275367C; TR199901447T2; KR20000069709A; PL334277A1

Abstract

1. Zastosowanie bakterii propionowych zdolnych do wydzielania tlenku azotu w zna- czacej fizjologicznie ilosci do przewodu pokarmowego ludzi lub zwierzat do otrzymania wchlanialnej kompozycji dietetycznej lub leczniczej. PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania bakterii propionowych i wchłanialnej kompozycji dietetycznej albo leczniczej, zawierającej bakterie propionowe, zdolne do wydzielania monotlenku azotu w ilości znaczącej fizjologicznie do przewodu pokarmowego ludzi lub zwierząt.

W ciągu wielu dziesięcioleci całkowicie ignorowano fakt, że monotlenek azotu stanowi jeden z koniecznych elementów życia i jego utrzymania, wskutek tego aż do tych czterech lub pięciu ostatnich lat badacze nie zastanawiali się nad dobrodziejstwem związanym z obecnością tego tlenku, jeśli chodzi o medycynę, odżywianie lub fizjologię.

W ostatnich badaniach przypisano monotlenkowi azotu wiele funkcji fizjologicznych i postawiono hipotezę, ze ten gaz może być zaangażowany w pierwszym rzędzie w funkcjach tak różnych, jak kontrola ciśnienia tętniczego, działanie cytotoksyczne niespecyficzne makrofagów, skupianie się płytek i przekaźnictwo nerwowe lub też kontrola motoryczności przewodu pokarmowego.

Wychodząc z tego założenia zwielokrotniono badania dotyczące monotlenku azotu i jego znaczenie mogło zostać potwierdzone.

187 302

Wiadomo, ze monotlenek azotu, który jest gazem bardzo nietrwałym (okres półtrwania poniżej 5 sekund w układach biologicznych), jest wytwarzany w organizmie ludzkim lub zwierzęcym przez biosyntezę z L-argininy za pomocą grupy enzymów nazwanych NO-syntazami (NOS), obejmującej dwa główne typy, mianowicie z jednej strony NOS podstawowe, wykazujące ekspresję zwłaszcza w komórkach śródbłonka, płytkach krwi i neuronach oraz z drugiej strony NOS pobudzające, które wykazują ekspresję głównie w pewnych komórkach układu odpornościowego (zwłaszcza makrofagach i wielojądrowych), w mięśniu gładkim naczyń i komórkach śródbłonka.

Należy zauwazyć, ze produkcja NO przez NOS pobudzające jest większa o kilka rzędów wielkości od produkcji NO przez NOS podstawowe, ale we wszystkich wypadkach ta produkcja pozostaje względnie mała.

Ze względu więc na wspomnianą korzystną rolę monotlenku azotu, byłoby pożądane mieć możność zwiększenia tej produkcji, w szczególności stosując naturalną drogę metabolizmu pożywienia.

Jednak aż dotąd nie proponowano środków, pozwalających na osiągnięcie tego rezultatu.

Celem wynalazku jest wypełnienie tej luki.

Zgodnie z wynalazkiem można było osiągnąć poszukiwany cel, stwierdzając w sposób zaskakujący, że szczególny typ bakterii, bakterie propionowe, są zdolne do produkowania monotlenku azotu i że wśród tych bakterii pewne gatunki i pewne szczepy wśród tych gatunków produJkują go w dużych ilościach.

Chodzi tu o bakterie propionowe, które chociaż nie należą do grupy bakterii mlekowych lub bakterii dwudzielnych (bifidobakterii), klasycznie wprowadzanych do organizmu przez mleczne desery lub inne fermentowane produkty mleczne, są tym niemniej obecne w żywieniu ludzi od wieków, są w istocie tymi, które umożliwiają otrzymanie dziur podczas produkcji sera nazwanego „emmental”, który w końcu oczyszczania zawiera około 10⁹ komórek/g, bakterii propionowych.

Trzeba zauważyć, że fermentacja tych bakterii produkuje między innymi kwas propionowy, kwas octowy i dwutlenek węgla.

Wspomniane stwierdzenie jest tym bardziej zaskakujące, gdyż można było sprawdzić, że bakterie mlekowe, bakterie dwudzielne i/lub drożdże stosowane powszechnie w dziedzinie rolno-spozywczej, nie produkują monotlenku azotu.

Wynalazek dotyczy zatem zastosowania bakterii propionowych do otrzymania wchłanialnej kompozycji dietetycznej albo leczniczej, zdolnej do wydzielania monotlenku azotu w ilości znaczącej fizjologicznie do przewodu pokarmowego ludzi lub zwierząt oraz wchłanialnej kompozycji dietetycznej albo leczniczej.

Zgodnie z wynalazkiem kompozycja ta może stanowić opracowany preparat i/lub występować w postaci ciekłej (w szczególności cieczy sfermentowanej), w postaci odwodnionej lub o wilgotności pośredniej.

Bardziej dokładnie, trzeba zauważyć, że nie wychodząc z ram wynalazku, kompozycja może występować:

- albo w postaci specyficznego preparatu uzasadnionego swym jedynym zakończeniem fizjologicznym, a mianowicie zażyciem bakterii propionowych zdolnych do wydzielania monotlenku azotu w ilości znaczącej fizjologicznie,

- albo w postaci opracowanego preparatu spożywczego, mającego równolegle inne zakończenie, dokładniej energetyczne lub funkcjonalne; w tym ostatnim wypadku bakterie propionowe można dodać lub włączyć do samego pożywienia, zwłaszcza do serów, do włókien spozywczych, takich jak płatki zbożowe, lub tez do mleka fermentowanego, kremów deserowych, ciast i/lub napojów zdrowotnych itd.

Zgodnie z wynalazkiem bakterie propionowe można wprowadzać w postaci biomasy lub w postaci zaczynu zdolnego do powielenia się in situ.

Gdy jest odwodniona, kompozycja występuje korzystnie w postaci pojedynczych cząstek zawierających dawkę bakterii, która powinna być regularnie absorbowana.

187 302

Te cząstki można zjadać bezpośrednio lub po uprzednim rozcieńczeniu w płynie; mogą one być konfekcjonowane w postaci, pozwalającej na ułatwienie absorpcji: tabletek, saszetek z granulowanym proszkiem, płynu itd.

Sprawdzono, że takie odwodnione stężone preparaty bakterii propioniowych przechowywane przez rok w temperaturze 4°C wykazują obniżenie stężenia poniżej jednego log.

Doświadczenie dowiodło, ze kapsułki żelatynowe trwałe w żołądku lub nie, stanowią szczególnie korzystny typ konfekcjonowania.

Według innej charakterystyki wynalazku każda indywidualna cząstka zawiera duzą ilość bakterii, korzystnie ponad 10⁹ bakterii.

Różne doświadczenia (zestawione niżej) pozwoliły sprawdzić zdolność każdego poszczególnego z różnych szczepów bakterii propionowych do produkcji NO w czasie ich hodowli, najpierw pośrednio przez pomiar jonów azotynowych NO2, potem bezpośrednio przez analizę na drodze spektrometrii masowej w środowisku beztlenowym.

Podczas tych doświadczeń badano w pierwszym okresie stężenie azotynów w pożywkach bogatych w argininę i ubogich w azotany (50 μΜ) i uświadomiono sobie, ze arginina nie jest elementem rozstrzygającym w obserwowanej produkcji NO.

W drugim etapie eksperymentowano z pożywkami uzupełnionymi azotanami. Otrzymane wyniki w tym ostatnim wypadku odkryły charakter azotanu zależny od produkcji monotlenku azotu.

1. Wstęppe próób poróówiawczz

Różne szczepy bakteryjne (inokulum jogurtu, bakterie dwudzielne, lactobacillus) hodowano w obecności pożywki mlecznej odtworzonej (100 ml) uzupełnionej ekstraktem drożdży (10 g/litr), po czym inkubowano w temperaturze 37°C.

Akumulację azotynu mierzono z upływem czasu.

Te wstępne próby wykonano w następujących warunkach:

• inkubacja w temperaturze 37°C w ciągu 0, 4, 7 lub 10 godzin, • 3 powtórzenia, • oznaczenie azotynów systemem Bran-Luebbe.

Ze względu na charakter ekstraktów do analizy, etap oczyszczania próbek obejmował kolejno podwójne odwirowanie (2 x 10 minut, 4°C, 15 000 obrotów/minutę), następnie ultrafiltrację na wkładzie miaiorep 10 (zatrzymanie białek oPM>10 kD), potem częściowe oczyszczenie przez przepuszczenie próbki przez żywicę Waters C18 (55-105 pm).

Tę metodę testowano w pierwszym etapie na wzorcowych próbkach azotynu (fig. 1), potem na ekstraktach hodowli Lactobacillus inkubowanych przez 7 godzin, do których dodawano lub nie, znaną ilość azotynu (fig. 2).

Figura 1 przedstawia profile kolorymetryczne otrzymane przez automatyczny ciąg analityczny Bran Luebbe:

(1) pożywki hodowli bakterii dwudzielnych po 10 godzinach inkubacji, (2) standardowego roztworu azotynu, (3) tego samego roztworu po ultrafiltracji, (4) tego samego roztworu po ultrafiltracji i przejściu przez żywicę C18.

Figura 2 przedstawia profile kolorymetryczne otrzymane przez automatyczny ciąg analityczny Bran Luebbe:

(1) pożywki hodowli Lactobacillus po 10 godzinach inkubacji, w temperaturze 37°C, (2) (3) standardowego roztworu, zawierającego 410 pg azotynu/litr, (4) (5) pożywki hodowli Lactobacillus po 10 godzinach inkubacji, w temperaturze 37°C, do której dodano znaną ilość azotynu w celu otrzymania roztworu 820 j^^/litr azotynu.

Te próbki oczyszczono przez odwirowanie, ultrafiltrację i przepuszczenie przez żywicę C18 w warunkach opisanych poprzednio.

Zgodnie z tymi próbami nie można było wykryć żadnej akumulacji azotynu z inokulum jogurtu, bakterii dwudzielnych lub Lactobacillus, w jakimkolwiek czasie inkubacji (0, 4, 7 lub 10 godzin).

187 302

2. Pokazanie akumulacji azotynu przez hodowle bakterii propionowych

Zbadano wstępnie ewentualną obecność azotanu lub azotynu w preparacie pożywki YEL przez oznaczenie kolorymetryczne (zestaw Boeringer): można było w ten sposób ukazać obecność w tej pożywce niebagatelnej ilości azotanu (stężenie rzędu 50-100 pM), który mógł pochodzić z ekstraktu drożdży stosowanego do produkcji tej pożywki; w zamian sprawdzono, że pożywka YEL jest całkowicie pozbawiona azotynu.

Przetestowano hodowle bakterii propionowych (1 g liofilizatu na 100 ml pożywki YEL).

Próby te wykonano w następujących warunkach:

• inkubacja w temperaturze 30°C w ciągu 24, 48 lub 72 godzin, • 3 powtórzenia dla inkubacji w ciągu 24 godzin, • przerwanie inkubacji przez zawrzenie, • oczyszczenie produktu za pomocą odwirowania i przepuszczenia ekstraktu przez żywice C18, • oznaczenie azotynów w pożywce przez analizę systemem Bran-Luebbe.

Oznaczano azotyny nagromadzone przez bakterie propionowe w celu ustalenia kinetyki akumulacji azotynów a zależności od czasu inkubacji bakterii w pożywce YEL.

Figura 3 przedstawia z jednej strony zmiany ilości wyprodukowanego azotynu (w pg/100 ml hodowli) w zależności od czasu inkubacji (w godzinach) (□) i z drugiej strony zmiany zmętnienia (absorbancja w λ, = 650 nm) również w zależności od czasu inkubacji (O).

Ta fig. pokazuje, że ilość azotynu jest maksymalna przy 24 godzinach, potem zmniejsza się znacznie po 48 i 72 godzinach inkubacji.

Można rozsądnie uważać, ze ten spadek wynika z redukcji azotynu na NO, N2O lub inne związki przez II reduktazę azotynową.

Zgodnie z wynalazkiem można było dowieść, że akumulacja NO2 zależy od użytego gatunku lub szczepu bakterii propionowych. Tę kwestię sprawdzono za pomocą prób zestawionych poniżej:

3. Pokazanie i porównanie akumulacji azotynu w pożywce hodowli w wypadku 9 szczepów z 4 różnych gatunków bakterii propionowych

Zgodnie z tą próbą zbadano szczepy P20, P23, 2408, 2410, 2500 i 2501 gatunku P.freudenreichii i szczepy TL221, TL223 i TL207 należące odpowiednio do gatunku P.thoenii, P.acidipropionici i P.jensenii.

Trzeba zaznaczyć, ze te znane szczepy TL (technologia mleczarska) są szczepami należącymi do INRA-LRTL, a szczep P23 (czyli ITG23) zarejestrowano w Narodowym Zbiorze Hodowli Mikroorganizmów (CNCM) Instytutu Pasteura pod numerem I-1804 i datą 18.12.96.

Różne szczepy bakterii propionowych (1 g liofilizatu lub 5 ml świeżej hodowli) hodowano na 100 ml pożywki YEL, zawierającej około 50 pM azotanu w następujących warunkach:

• inkubacja w temperaturze 30°C w ciągu 12, 24, 36 lub 48 godzin, • 3 powtórzenia, • przerwanie inkubacji przez zawrzenie, • oczyszczenie produktu za pomocą odwirowania i przepuszczenia ekstraktu przez żywicę C18, • akumulacja azotynu w pożywce mierzona na drodze analizy systemem BranLuebbe, • oznaczenie fermentacji każdej hodowli mierzone przez odczyt absorbancji w 650 nm.

Wyniki otrzymane dla każdego szczepu zebrano na fig. 4.

Przedstawia ona w każdym przypadku zmiany akumulacji azotynu (□) i zmętnienia pożywki hodowli (O) w zależności czasu trwania inkubacji. Każda wartość odpowiada średniej ± standardowe odchylenie dla średniej n = 3.

Należy zauważyć, że skala akumulacji azotynu jest 25 razy większa w wypadku szczepów P23 i TL223.

Te wyniki dowodzą, że wzrost bakterii, oceniany według zmiany zmętnienia pożywki hodowlanej, jest zbliżony dla zespołu badanych szczepów, osiągający około 2-2,5 DO po

187 302 godzinach inkubacji, z wyjątkiem szczepu TL221, dla którego zmętnienie osiągnęło tylko 0,6 DO po 2 dniach.

Natomiast istnieją bardzo znaczne różnice co do akumulacji azotynu w zależności od czasu.

Istotnie szczepy 2500, 2408, P20, 2501, 2410, TL207 iTL221 akumulują względnie niewielką ilość azotynu, przy czym maksimum (0,1 pg NO₂'/ml) osiągnięto odpowiednio po 36, 12, 36, 12, 12, 24 i 24 godzinach inkubacji.

Przeciwnie dużo większą akumulację azotynu otrzymano dla szczepów P23 i TL223, które maksymalnie gromadzą 1,8 pg NO₂'/ml po odpowiednio 36 i 24 godzinach inkubacji.

Trzeba zauważyć, że szczep bakterii propionowych analizowany w drugiej wspomnianej próbie (fig. 3) miał miejsce pośrednie przy maksymalnej akumulacji NO₂', około 0,5 pg/ml.

Te próby pozwoliły więc na stwierdzenie, że istnieją znaczne różnice między ilościami azotynu, które mogą być produkowane przez różne szczepy bakterii propionowych czterech różnych gatunków, przy czym te różnice są niezależne od wzrostu tych szczepów.

Te wyniki można było potwierdzić badaniem dla każdego szczepu ewolucji stężenia azotynu w pożywce hodowli w zależności od jej zmętnienia, a więc w przybliżeniu od wzrostu bakterii.

Wyniki tych ostatnich prób podano na fig. 5, na której średnia wartość odpowiada średniej ± standardowe odchylenie dla średniej p = 3.

Wspomniane próby miały charakter ustalenia, że wśród badanych szczepów, szczep TL223 najsilniej akumuluje azotyny, przy czym te azotyny znikają po 12 godzinach. Ten szczep pozostawiono więc w ramach prób uzupełniających, polegających na bezpośrednim pomiarze produkcji monotlenku azotu na drodze analizy przez spektrometrię masową w środowisku beztlenowym.

4. Wstępny pomiar produkcji NO przez szczep TL223 w atmosferze helu

Zgodnie z tymi próbami hodowle prowadzono w probówkach o 10 ml, zawierających 5 ml pożywki YEL z około 50 pM azotynu i 0,25 ml świeżej hodowli szczepu TL223.

Atmosferę w probówkach natychmiast usunięto strumieniem helu (100 ml/minutę) w ciągu 100 sekund.

Następnie zmierzono akumulację NO w atmosferze probówek przy upływie czasu w następujących warunkach:

• inkubacja w temperaturze 30°C w ciągu 24, 48 lub 72 godzin, • 4 powtórzenia, • pomiar akumulacji NO na drodze analizy przez spektrometrię masową, • oznaczenie fermentacji każdej hodowli mierzone przez odczyt absorbancji w 650 nm.

W czasie wstępnej próby skalibrowano system oczyszczania gazu (Roboprep G+) spektrometr masowy (Twenty-Twenty) rosnącymi ilościami monotlenku azotu.

Ten gaz wytworzono z NaNO2 w obecności roztworu KJ i H2SO4.

Identyfikację i ocenę ilościową monotlenku azotu wykonano za pomocą jego masy: 30 dla ^uN^I6O i 31 dla l⁵N¹⁶O oraz ^N^O. Ta identyfikacja została następnie potwierdzona pomiarem stosunku izotopów: 31/30 = [¹⁵N¹⁶O + ^N^j/^N^O. Trzeba zauważyć, że teoretyczny stosunek izotopów 31/30 NO wynosi 0,00367 w nieobecności zanieczyszczenia przez ⁿO.

Wyniki tej wstępnej próby podano w fig. 6, na której część lewa (A) odpowiada krzywej wzorcowej spektrometru masowego stosowanego do oceny ilościowej monotlenku azotu, podczas gdy część prawa (B) odpowiada pomiarowi stosunku izotopów 31/30.

Wyniki w sensie właściwym tej próby podano na fig. 7.

Bardziej dokładnie, fig. 7A przedstawia zmiany akumulacji NO w atmosferze probówek w zależności od zmętnienia pożywki, podczas gdy fig. 7B przedstawia zmiany tej akumulacji w zależności od czasu inkubacji.

Kreski pionowe lub poziome wskazują, gdy są one szersze niż symbol, standardowe odchylenie dla średniej n = 4.

Porównanie fig. 7B (która przedstawia zmiany z upływem czasu zmętnienia pożywki hodowli w atmosferze helu) z fig. 4 (która przedstawia te same zmiany w powietrzu) pokazu187 302 je, że atmosfera utworzona głównie z helu nie oddzialywuje znacząco na wzrost szczepu TL223.

Można było tez ustalić, że prędkość akumulacji monotlenku azotu w atmosferze jest stała podczas około pierwszych 45 godzin inkubacji, potem dalej załamuje się (fig. 7B, co odpowiada zmętnieniu bliskiemu 1,5 DO (fig. 7A).

Po około 65 godzinach inkubacji (zmętnienie większe od 1,7 DO), w atmosferze helu nagromadziło się około 1,5 pg NO na 1 ml pożywki hodowli.

Otrzymany rząd wielkości jest zgodny z zawartościami azotynu mierzonymi w pożywce dla hodowli stykających się z powietrzem.

W tym ostatnim przypadku istotnie można było stwierdzić (fig. 5), ze szczep TL223 zgromadził maksymalnie 1,8 pg NO2^_/ml przy zmętnieniu 1,5 DO, co odpowiada około 1,2 pg NO/ml.

Wychodząc z tego wstępnego bezpośredniego pomiaru produkcji NO przez szczep TL223 poszukiwano zgodnie z wynalazkiem stwierdzenia drogi syntezy tego monotlenku azotu i w tym celu powzięto myśl zbadania, czy jest ona stymulowana przez dodatek azotynu lub azotanu.

Taką stymulację można było sprawdzić dzięki próbom zestawionym poniżej:

5. Badanie stymulowania produkcji NO przez dodatek azotynu lub azotanu

W celu zbadania, czy jest możliwa produkcja NO przez bakterie propionowe z NO2' lub NO3' badano, czy obserwuje się zwiększenie produkcji NO przez szczep TL223, gdy znajduje się on w obecności 1 mM KNO2 lub KNO3 (ze znaczonym izotopem ¹⁵N lub bez niego).

To doświadczenie wykonano w następujących warunkach:

• 1% szczepu TL223 posiano w pożywce YEL samej (kontrola) lub z dodatkiem 1 mM KNO2, KNO3 lub K1⁵NO3 ze znaczonym 50% izotopem ¹⁵N, • inkubacja w temperaturze 30°C w ciągu 24, 48 lub 72 godzin, • 3 powtórzenia przez umieszczenie punktowe i traktowanie, • akumulacja NO i oznaczenie stosunku izotopowego na drodze spektrometrii masowej, • oznaczenie fermentacji każdej hodowli (zmętnienie) zmierzone przez odczyt absorbancji w 650 nm, • oznaczenie azotanu i azotynu po odzyskaniu pożywek bakteryjnych, odwirowaniu i pomiarze zestawem Boerhingera.

Analizowano też akumulację NO w zależności od stężenia NO3 (100, 150, 350, 650 i 1050 pM) lub NO2’ (50, 100, 400, 800, 1000 pM) po inkubacji przez 72 godziny w temperaturze 30°C (1% TL223 posiany w pożywce YEL).

Próbki do analizy rozłożono do probówek do analizy NO, w których atmosferę natychmiast usunięto strumieniem helu (przepłukanie helem) w ciągu 150 sekund w celu otrzymania ścisłych warunków beztlenowych.

Wpływ przepłukania helem na ewentualne wykrycie NO przez spektrometrię masową przetestowano na sterylnej pożywce YEL: tę pożywkę YEL uprzednio przepłukaną helem inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 72 godzin. Po 0, 24, 48 i 72 godzinach inkubacji (3 powtórzenia) nie wykryto żadnej produkcji NO i wielkość zmętnienia pozostała zerowa.

Można było w ten sposób sprawdzić jakość przepłukania helem, nieobecność każdego zanieczyszczenia bakteryjnego i brak interakcji między przepłukaniem helem i pomiarem NO na drodze spektrometrii masowej.

Wymienione próby pozwoliły na otrzymanie wyników podanych na fig. 8, jeśli chodzi o kinetykę akumulacji NO w obecności azotynu lub azotanu.

Dokładniej:

- fig. 8A przedstawia zmiany akumulacji NO w zależności od czasu,

- fig. 8B przedstawia zmiany zmętnienia w zależności od czasu,

- fig. 8C przedstawia zmiany stosunku izotopowego [masa 31/(masy 30 + 31) w zależności od czasu,

- fig. 8D przedstawia zmiany produkcji NO w zależności od zmętnienia.

187 302

Każda z tych figur dotyczy szczepu TL223 hodowanego na samej pożywce YEL w obecności 1 mM azotanu (1⁵NO3' - znaczony w 50% i ^MNO3’) i obecności 1 mM azotynu.

Kreski pionowe przedstawiają ± standardowe odchylenie średniej dla n = 3, gdy są większe niż symbol.

Te figury dowodzą, że akumulacja NO u TL223 hodowanego na 1 mM KNO3 (znaczonego azotem 15 lub nie znaczonego) lub na 1 mM KNO2 jest bliska 7 pg NO/ml po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 30°C; ta wielkość jest 3,5 razy wyższa od produkcji NO w wypadku pożywki YEL nie uzupełnionej azotanem lub azotynem (fig. 8A). Te różnice nie są związane ze zmianami wzrostu spowodowanymi składem pożywki, ponieważ zmętnienie w końcu wzrostu jest tego samego rzędu w samej pożywce YEL (4,5 jednostek DO po 72 godzinach) i w tej samej pożywce z dodatkiem azotanu lub azotynu (około 5 jednostek DO po 72 godzinach - fig. 8B i 8D).

Figura 8C pokazuje, że dodatek K^NOb znaczonego w 50%, pozwala na otrzymanie NO znaczonego wokoło 40% po 48 godzinach inkubacji: azot o masie 15 dodany w postaci azotanu jest odnajdowany w NO syntetyzowanym przez szczep TL223.

Obserwowano ponadto, że gdy szczep TL223 jest hodowany na K1⁵NO3, profil piku masy 31 (1⁵N^O) zwiększa się bardzo silnie w stosunku do NO analizowanego w pożywce YEL, zawierającej azotan nie znaczony, co pozwala na potwierdzenie tego stanu.

Ponadto dodanie 1 mM KNO3 lub KNO2 nie znaczonego pociąga za sobą produkcję NO ze stosunkiem izotopowym 0,75% (48 godzin inkubacji - fig. 8C), co jest bardzo bliskie wartościom naturalnego stosunku izotopowego NO (około 0,4%).

Te ostatnie obserwacje potwierdzają bardzo wyraźnie, ze gazem analizowanym na drodze spektrometrii masowej jest rzeczywiście NO.

Próby te pozwoliły na stwierdzenie, że szczep TL223 jest zdolny do syntezy NO bezpośrednio z azotynu lub w obecności azotanu po redukcji go do azotynu.

Na podstawie wartości stosunku izotopowego otrzymanego w pożywce YEL z dodatkiem 1 mM K^[5nO3 znaczonego w 50%, można wywnioskować stopień konwersji azotanu w azotyn: około 20% wniesionego K1⁵NO3 jest przekształcone w monotlenek azotu przez szczep TL223.

Azotan początkowo obecny w jałowej pożywce YEL, wyjaśnia produkcję NO obserwowaną u TL223 (rzędu 2 pg NO/ml po 72 godzinach inkubacji - fig. 7).

Zmiany produkcji NO w zależności od stężenia azotynu lub azotanu są przedstawione na fig. 9.

Dokładniej:

- fig. 9A przedstawia zmiany produkcji NO i rozwój zmętnienia w zależności od początkowego stężenia azotanu, u szczepu TL223 hodowanego na pożywce YEL po 72 godzinach inkubacji,

- fig. 9B przedstawia zmiany produkcji NO i rozwój zmętnienia w zależności od początkowego stężenia azotynu, u szczepu TL223 hodowanego na pożywce YEL po 72 godzinach inkubacji,

- fig. 9C przedstawia zmiany stopnia konwersji azotanu w NO w zależności od początkowego stężenia azotanu,

- fig. 9D przedstawia zmiany stopnia konwersji azotynu w NO w zależności od początkowego stężenia azotynu.

Na tych figurach stężenia azotanu zostały skorygowane z uwzględnieniem obecności około 50 pM azotanu w samej pożywce YEL i są następujące: 100, 150, 350, 550, 650 i 1050 pM.

Stężenia azotynu są następujące: 50, 100, 400, 800 i 1000 pM.

Te figury pokazują, ze dla wybranego zakresu produkcja monotlenku azotu przez szczep TL223 jest proporcjonalna do stężenia początkowego azotanu (fig. 9A) lub azotynu (fig. 9B) pożywki YEL. Ta zależność jest liniowa.

W obu wypadkach nie obserwuje się żadnej fazy płaskiej, co pozwala przypuszczać, że stosowane stężenia nie pozwalają na otrzymanie poziomu maksymalnego akumulacji NO przez bakterie propionowe TL223.

187 302

Trzeba tez zauważyć, ze obecność dużych stężeń azotanu lub azotynu nie wpływa na wzrost bakterii, gdyż wielkości zmętnienia po 72 godzinach są bardzo bliskie dla wszystkich stężeń, które zostały przetestowane.

Należy poza tym podkreślić, że proste otrzymane na fig. 9A i 9B są nakładalne, co pozwala dowieść, ze produkowany NO pochodzi bezpośrednio z azotynu lub azotanu poprzez jego redukcję do azotynu.

Ponadto te wyniki pokazują, że w szczepie TL223 etap redukcji azotanu w azotyn nie jest limitujący dla stężeń azotanu wybranych do tego doświadczenia.

Ważne jest tez podkreślenie, ze stopień konwersji NO3' (fig. 9C) i NO2’ (fig. 9D) zmienia się w zależności od ilości dostępnego substratu, przechodząc od 20 do 60%, gdy stężenie NO3' lub NO2’ przechodzi od 1000 do 100 μΜ.

To sugeruje, że produkcja NO jest silnie regulowana i że jest uprzywilejowana w stosunku do wykorzystania azotu jako takiego (azote nitrique) do syntez związków azotu.

Na podstawie wymienionych wniosków, badano produkcję NO u 12 szczepów bakterii propionowych z dwóch różnych gatunków. Wyniki tych prób zestawiono poniżej:

6. Badanie produkcji NO przez różne szczepy propionowe

Zgodnie z tą próbą pozostawiono następujące szczepy bakterii propionowych:

P.freudenreichii: LS410, LS2501, LS2502, ITG 23,

CNRZ89, CNRZ277, CNRZ81.

P.acidipropionici: TL223, NCD01072, PR75, CNRZ80,

CNRZ86, CNRZ287.

Trzeba zauważyć, ze szczepy CNRZ80, CNRZ81, CNRZ86, CNRZ89, CNRZ277 i CNRZ287 należą do publicznego zbioru INRA-CNRZ, podczas gdy szczep NCDO1072 należy do brytyjskiego zbioru National Collection of Dairy Organisms: inne szczepy należą do zbiorów prywatnych.

Po posianiu na pożywce YEL w obecności 550 μΜ azotanu, hodowle bakteryjne rozłozono natychmiast po 5 ml do szczelnych probówek i przepłukano helem (warunki beztlenowe). Następnie szczepy propionowe poddano następującym warunkom doświadczalnym:

• inkubacja w temperaturze 30°C w ciągu 24, 48 i 72 godzin, • 3 powtórzenia, • akumulacja NO w atmosferze i oznaczenie stosunku izotopowego na drodze spektrometrii masowej, • oznaczenie fermentacji każdej hodowli mierzone przez odczyt absorbancji w 650 nm, • oznaczenie azotanu i azotynu po odzyskaniu pożywek bakteryjnych, odwirowaniu i pomiarze zestawem Boerhingera.

Figura 10 przedstawia zmiany akumulacji NO w zależności od czasu u szczepu TL223 i 12 innych szczepów bakterii propionowych hodowanych na pożywce YEL w obecności 550 μΜ azotanu. Szczep TL223 przedstawiono w każdym przypadku dla porównania.

Ta figura pokazuje istnienie dużych rozbieżności między szczepami propionowymi.

Ogólnie biorąc przy porównaniu poziomów produkcji NO po 72 godzinach inkubacji, można zaszeregować szczepy do trzech kategorii:

• szczepy zdolne do produkcji 4-4,5 pg NO/ml: TL223, CNRZ80, NCD01072 i PR75. Stosunek izotopowy NO produkowanego przez te szczepy wynosi 2-2,5% (T = 72 h), • szczepy zdolne do produkcji około 2 pg NO/ml: CNRZ81, CNRZ86, CNRZ89, CNRZ277, LS2502, ITG23. Stosunek izotopowy NO produkowanego przez te szczepy wynosi 4-5,5% (T = 72 h), • szczepy produkujące poniżej 1 pg NO/ml: LS410, LS2501 i CNRZ287. Mimo obecności 550 μΜ azotanu w pożywce hodowli te 3 szczepy produkowały tylko bardzo małe ilości NO i stosunek izotopowy był rzędu 10-13% (T = 72 h). Te

187 302 wielkości sugerują, ze piki mas 30 i 31 wykryte u tych bakterii mogły nie odpowiadać monotlenkowi azotu.

Należy zauważyć, że u szczepów należących do dwóch pierwszych kategorii, produkowany NO nie zmniejsza się w końcu wzrostu i że wobec tego nie wydaje się być powtórnie używany przez bakterie propionowe: istnieje więc akumulacja NO.

Figura 11 przedstawia zmiany produkcji NO w zależności od zmętnienia u wymienionych 13 szczepów bakterii propionowych, hodowanych na pożywce YEL w obecności 550 μΜ azotanu. Szczep TL223 przedstawiono w każdym przypadku dla porównania.

Figura 12 przedstawia zmiany zmętnienia (DO w 650 nm) w zależności od czasu u analizowanych 13 szczepów bakterii propionowych, hodowanych na pożywce YEL w obecności 550 μΜ azotanu.

Szczep TL223 przedstawiono w każdym przypadku dla porównania.

Wszystkie szczepy produkujące najwięcej NO (TL223, CNRZ80, NCD01072 i PR75) osiągają podwyższone wielkości zmętnienia (4-5 jednostek DO po 72 godzinach inkubacji).

Należy zauważyć, ze wśród tych szczepów bakterie NCDO1072 i PR75 rosną wolniej niż TL223, ale są zdolne do bardzo szybkiego akumulowania dużych stężeń NO.

Tak więc PR75 produkuje 2,8 g NO/ml przy zmętnieniu 0,5 jednostek DO. Maksimum produkcji NO zarejestrowano dla wielkości zmętnienia około 1,5 jednostki DO u NCDO1072 i PR75, wobec 3,4 jednostek DO dla TL223.

Dla „oczyszczenia” tych wyników analizowano zmiany stężeń NO, azotanu i azotynu w pożywkach hodowli 13 szczepów bakterii orooionowych badanych w zależności od czasu inkubacji. Otrzymane wyniki zebrano w tabeli poniżej, w której stężenia wyrażono w μΜ. Dla każdego szczepu pomiary prowadzono w probówce po usunięciu bakterii przez odwirowanie.

	Stężenie NO₃'	Stężenie NO₂'	Produkcja NO
	24h	48h	72h	24h	48h	72h	24h	48h	72h
P freudeereιzhii
LS410	674	638	596	0	5	22	13	18	23
LS2501	645	649	406	6	13	215	12	26	35
LS2502	338	0	0	176	122	16	12	53	72
ITG23	441	218	24	11	246	278	10	36	62
CNRZ89	595	160	42	16	171	154	10	38	74
CNRZ277	559	435	246	17	3	85	12	42	66
CNRZ 81	0	0	0	400	12	0	26	66	71
P. acidloóroireizl
TL223	0	0	0	271	0	0	71	149	152
NCD01072	0	2	0	370	3	0	50	148	146
PR75	11	2	0	185	1	0	91	147	146
CNRZ 80	0	0	0	146	0	0	93	136	140
CNRZ 86	594	491	0	14	41	405	19	28	62
CNRZ 287	624	570	646	0	0	5	9	20	29

Tabela ta pozwala na następujące stwierdzenia:

187 302

- szczepy produkujące 4 pg NO/ml są zdolne do całkowitego zredukowania dostępnego azotanu (czyli 550 pM) po 24 godzinach inkubacji. Ponadto mogą one całkowicie zredukować azotyn otrzymany podczas 48 pierwszych godzin inkubacji,

- szczepy LS410 i CNRZ287 bardzo mało produktywne, jeśli chodzi o NO, nie są zdolne do znaczącego absorbowania azotanu obecnego w pożywce.

- u szczepów wykazujących pośrednią akumulację NO można zaobserwować bardzo różne zmiany zawartości azotanu i azotynu, przejawiające się bardzo różnymi prędkościami absorpcji NO3' i/lub redukcji NO3' i NO2*. A więc szczep CNRZ81 jest zdolny do całkowitej redukcji azotanu po 24 godzinach inkubacji. Po 48 godzinach CNRZ81 również redukuje całość NO2' otrzymanego przez redukcję NO3'. Przeciwnie CNRZ277 wykazuje jeszcze 246 pM NO₃’ i 85 pM NO2' po 72 godzinach inkubacji.

Próby zestawione wyżej pokazują tez, że niektóre szczepy propionowe są zdolne do zredukowania azotanu w pożywce hodowli i dostarczenia w ten sposób azotynu potrzebnego do syntezy NO.

Trzeba zauwazyć, ze szczepy propionowe, które produkują najwięcej NO (TL223, CNRZ80, NCD01072 i PR75) należą wszystkie do gatunku P. acidipropionici i wszystkie posiadają poza tym aktywność reduktazy azotanowej.

Przeciwnie szczepy produkujące prawdopodobnie mniej, a nawet wcale, NO (granica wykrywalności spektrometru masowego) są również bakteriami, które nie posiadają poznanej aktywności reduktazy azotanowej (LS410, LS2501 i CNRZ287).

Wydaje się, ze dla pewnych szczepów propionowych kinetyka produkcji NO nie jest bezpośrednio związana z aktywnością reduktazy azotanowej.

Biorąc pod uwagę te wyniki wynalazek odnosi się tez do wchłanialnej kompozycji dietetycznej lub leczniczej, charakteryzującej się tym, ze stanowi ona preparat zawierający dużą ilość, korzystnie ponad 109 komórek/g, szczepu bakterii propionowych dobranych w zalezności od ich zdolności wydzielania i/lub akumulowania monotlenku azotu w ilości co najmniej 1 pg/ml pożywki YEL zawierającej 550 pM azotanu.

Według innej charakterystyki wynalazku ta kompozycja zawiera bakterie propionowe należące do co najmniej jednego ze szczepów TL223, CNRZ80, CNRZ86 i NCD01072 z gatunku P. acidipropionici.

Wśród tych szczepów szczep TL223 okazuje się szczególnie korzystny.

Trzeba tez zauważyć, że szczep CNRZ80 wykazuje całkiem szczególną zaletę z punktu widzenia „produktywności”, ze względu na to, że jest on zdolny do bardzo szybkiego akumulowania dużego stężenia NO (dla względnie małych wielkości zmętnienia).

Według innej charakterystyki wynalazku kompozycja ta zawiera bakterie propionowe należące do co najmniej jednego ze szczepów ITG23, CNRZ81, CNRZ89, CNRZ277 i LS 2 5 02 z gatunku P. freudenreichii.

Należy zauwazyć, że zgodnie z inną charakterystyką wynalazku kompozycja może tez zawierać inne bakterie, takie jak bakterie dwudzielne (bifidobakterie) i/lub bakterie mlekowe.

Dla uzupełnienia wyników otrzymanych powyżej przeprowadzono testy na dwóch typach bakterii niepropionowych: E.coli i Lactobacillus farciminis, znanych z ich zdolności do redukcji azotynów. Wyniki tych testów zestawiono poniżej:

7. Badanie produkcji NO przez szczepy E.coii i L . farcimims

Te uzupełniające testy prowadzono głównie ze względu na istnienie publikacji „Hemedependent and heme-independent nitrite reduction by lactic acid bacteria results in different N-containing products” Gudrun Wolf, Elke K.Arendt, Ute Pfahler and Walter P.Hammes International Journal of Food Microbiology, 10(1990)323-330), która podawała, ze pewne bakterie mlekowe (L. farciminis) są zdolne do produkowania monotlenku azotu z azotynu.

Wstępne doświadczenia pokazały, że po 5 godzinach 30 minutach wzrostu szczepu L. farciminis w MRS z dodatkiem 1 mM azotanu, nie wykryto juz azotanu ani azotynu w pożywce hodowli.

To samo stwierdzenie zrobiono odnośnie szczepu E.coli po 7 godzinach 30 minutach wzrostu w pożywce BHI z dodatkiem 1 mM azotanu.

187 302

Wiadomo, że podczas swego wzrostu szczep L. farciminis zakwasza pożywkę MRS (do pH około 5 po 5-6 godzinach hodowli).

Otóż można było stwierdzić z prób wykonanych w pożywce YEL, ze azotyny przekształcają się w NO w środowisku kwaśnym.

Próby te wykonano w następujących warunkach doświadczalnych:

- zakwaszenie pożywki YEL przez HC1,

- wniesienie azotynu o stężeniu 400 μΜ,

- autoklawowanie pożywek,

- trzy powtórzenia.

Otrzymane wyniki pokazano na fig. 13, która przedstawia zmiany produkcji NO w zależności od pH w pożywce YEL z dodatkiem azotynów po inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 24 godzin.

Ta figura dowodzi iż istnieje znaczna produkcja NO z azotynu z pożywki, gdy jest ona kwaśna, przy czym ta produkcja zwiększa się, gdy pH się zmniejsza.

Wobec tego wykonano testy porównawcze produkcji NO przez L. farciminis i E.coli, którą uważa się za nie produkującą NO (T.Brittain, R.Blackmore, C.Greenwood & Thomson AJ(1992) - Bacterial nitrite - reducing enzymes -Eur.J.Bio.Chem.,209,793-802).

Wykonano te testy w następujących warunkach:

- inkubacja w temperaturze 37°C w pożywce BHI (E.coli) lub MRS (L. farciminis),

- wniesienie azotanu do pożywki o stężeniu 1 mM,

- przepłukanie atmosfery każdej probówki helem w ciągu 100 sekund,

- trzy powtórzenia,

- pomiar zmętnienia w końcu inkubacji.

Próby te pozwoliły na otrzymanie wyników podanych na fig. 14.

Dokładniej:

- fig. 14A przedstawia zmiany produkcji NO w zależności od czasu inkubacji,

- fig. 14B przedstawia zmiany produkcji NO w zależności od zmętnienia pożywki.

Trzeba zauważyć, ze wszystkie wielkości otrzymane dla produkcji NO są znacznie nizsze od progu 1 pg/ml, który uważano powyżej jako znaczący: wynika stąd, ze nie ma akumulacji NO w probówkach hodowli.

Te wyniki wskazują więc, że nieobecność azotanu i azotynu obserwowana we wstępnym doświadczeniu po odpowiednio 5 godzinach 30 minutach (L. farciminis) i 7 godzinach 30 minutach (E. coli) nie jest skompensowana akumulacją NO, która mogłaby być albo pochodzenia chemicznego (związanego z zakwaszeniem pożywki) albo pochodzenia bakteryjnego.

Te wyniki zostały w wypadku szczepu L. farciminis potwierdzone testami wykonanymi na bakteriach, znajdujących się w postaci komórek w spoczynku przy pH doprowadzonym do 6,5 buforem fosforanowym, zawierającym mleczan w następujących warunkach operacyjnych:

- inkubacja w temperaturze 37°C,

- wniesienie azotanu o stężeniu 400 jiM,

- przepłukanie atmosfery każdej probówki helem w ciągu 100 sekund,

- trzy powtórzenia,

- pomiar zmętnienia w końcu inkubacji.

Ta analiza pozwoliła na otrzymanie wyników podanych na fig. 15:

- fig. 15A przedstawia zmiany produkcji NO w zależności od czasu inkubacji,

- fig. 15B przedstawia zmiany produkcji NO w zalezności od zmętnienia.

Te wyniki potwierdzają wyniki otrzymane poprzednio, mianowicie że ilości wyprodukowanego NO są zbyt małe, aby być znaczące, a więc szczep L. farciminis nie jest zdolny do gromadzenia monotlenku azotu. Jednakże jest możliwe, że ten szczep produkował monotlenek azotu na początku wzrostu, ale ze ewentualnie produkowany NO był powtórnie wykorzystany przez bakterię.

Wykonano próby uzupełniające na szczepach TL223 i CNRZ80 w postaci komórek w spoczynku po inkubacji w temperaturze 30°C, a także w temperaturze 37°C.

187 302

8. Ewolucja produkcji NO przez bakterie propionowe w postaci komórek w spoczynku

To doświadczenie przeprowadzono w następujących warunkach:

- komórki w spoczynku zawieszono w buforze fosforanowym, zawierającym mleczan przy pH 6,5,

- inkubacja w temperaturze 30°C lub w temperaturze 37°C,

- wniesienie azotanu o stężeniu 400 filM,

- przepłukanie atmosfery każdej probówki helem w ciągu 100 sekund,

- trzy powtórzenia,

- pomiar zmętnienia w końcu inkubacji.

Należy zauwazyć, ze podczas testów z inkubacją w temperaturze 30°C, zbadano poza szczepami TL223 i CNRZ80, szczep CNRZ81 z podwojonym stężeniem bakterii.

To doświadczenie pozwoliło na otrzymanie wyników podanych na fig. 16 i 17.

Dokładniej:

- fig. 16A przedstawia zmiany produkcji NO przez komórki w spoczynku w temperaturze 30°C w zalezności od czasu inkubacji,

- fig. 16B przedstawia zmiany produkcji NO przez komórki w spoczynku w temperaturze 30°C w zależności od zmętnienia pożywki,

- fig. 17A przedstawia zmiany produkcji NO przez komórki w spoczynku w temperaturze 37°C w zależności od czasu inkubacji,

- fig. 17B przedstawia zmiany produkcji NO przez komórki w spoczynku w temperaturze 37°C w zależności od zmętnienia pożywki.

Te wyniki dowodzą iż istnieje znaczna produkcja NO przez komórki w spoczynku nie tylko w wypadku obu szczepów z gatunku P. acidipropionici (TL223 i CNRZ80), ale też w wypadku szczepu z gatunku P. freudenreichii (CNRZ81). Szczep TL223 jest najbardziej produktywny.

Ogólnie biorąc w takich samych stężeniach bakterii, produkcja NO przez komórki w spoczynku jest tego samego rzędu, jak obserwowana w wypadku bakterii hodowanych w pożywce YEL.

Produkcja NO przez komórki w spoczynku ma miejsce zasadniczo podczas pierwszych pięciu godzin inkubacji; poza tym okresem produkcja jest mała.

Tak więc można było zaobserwować, że w temperaturze 37°C produkcja NO jest taka sama (TL223) lub nieco wyzsza (CNRZ80) jak w temperaturze 30°C.

Korzyści związane z przyjmowaniem bakterii propionowych zostały poza tym potwierdzone przez badania wykonane in vivo u zdrowego człowieka.

9. Badanie efektu przyjęcia bakterii propionowych na przejście zawartości jelitowej u zdrowego człowieka.

Badanie to wykonano w warunkach szpitalnych wCHU w Caen na grupie 19 pacjentów, zdrowych ochotników płci męskiej.

Na początku tego testu podano codziennie każdemu ochotnikowi do wchłonięcia 10 markerów nieprzepuszczalnych dla promieni rentgenowskich, podczas kolejnych 8 dni, zgodnie z protokołem opisanym w publikacjach P.Arhan, G.Devroede, B.Jehannin i in., Dis Colon Rectum, 1981; 24:625-9, i M.Bouchoucha, G.Devroede, P.Arhan i in., Dis Colon Rectum, 1992;35:773-82.

Według tego protokołu badanie przejścia wykonano przez liczenie markerów, nieprzepuszczalnych dla promieni rentgenowskich, wchłoniętych przez różne pola jamy brzusznej rozłożone na zdjęciu brzucha z przodu. Te pola (okrężnica prawa, okrężnica lewa oraz odbytnica i esica) są określone umownymi liniami łączącymi 5-ty krąg lędźwiowy z zarysem jamy miednicy. Czas przejścia oblicza się według równania T = 1/N.n.At; N jest równy 10 markerów, n oznacza ilość markerów policzonych w regionie i At jest równa 24 godziny.

Następnego dnia po tym przyjęciu, to znaczy 9-tego dnia wykonano ochotnikom radiografię brzucha z przodu bez preparatu.

Począwszy od następnego dnia, to znaczy od 10-tego dnia codziennie podawano do zjedzenia każdemu ochotnikowi, przez 2 tygodnie, kapsułkę żelatynową zawierającą 5-10¹⁰ bak14

187 302 terii propionowych pochodzących z banku szczepów używanych w przemyśle serowarskim, a więc zupełnie nieagresywnych wobec człowieka.

Wykonano drugie badanie czasu przejścia podobne do pierwszego w ciągu drugiego tygodnia przyjmowania bakterii propionowych, to znaczy od 17-tego do 26-tego dnia.

To badanie ujawniło znaczące spowolnienie czasu przejścia z okrężnicy lewej (p < 0,05 zgodnie z testem statystycznym Wilcoxona Matched-Paired Signed-Ranks Test); czasy przejścia z okrężnicy prawej oraz z odbytnicy i esicy nie został znacząco zmieniony przez przyjęcie bakterii propionowych.

To badanie pozwoliło więc dowieść, ze przyjęcie bakterii propionowych ma wpływ na mobilność jelitową; można przypuszczać, że te wyniki są związane z syntezą monotlenku azotu przez bakterie propionowe.

Claims

1. Zastosowanie bakterii propionowych zdolnych do wydzielania tlenku azotu w znaczącej fizjologicznie ilości do przewodu pokarmowego ludzi lub zwierząt do otrzymania wchłanialnej kompozycji dietetycznej lub leczniczej.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja jest w postaci preparatu odwodnionego.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że kompozycja występuje w postaci indywidualnych frakcji zawierających dawkę bakterii, które powinny być wchłaniane regularnie.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że każda indywidualna frakcja zawiera więcej niż 10⁹ bakterii.

5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja może być w postaci preparatu ciekłego sfermentowanego lub nie.

6. Wchłanialna kompozycja dietetyczna lub lecznicza, znamienna tym, że zawiera ponad 109 komórek/g, szczepów bakterii propionowych dobranych w zależności od ich zdolności do wydzielania i/lub akumulowania tlenku azotu w ilości co najmniej 1 pg/ml pożywki YEL, zawierającej 550 pM azotanu.

7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera bakterie propionowe, należące do co najmniej jednego ze szczepów TL223, CNRZ80, CNRZ86 i NCD01072 z gatunku P. acidipropionici.

8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera bakterie propionowe, należące do szczepu TL223 z gatunku P. acidipropionici.

9. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera bakterie propionowe, należące do szczepu CNRZ80.

10. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera bakterie propionowe, należące do co najmniej jednego ze szczepów ITG23, CNRZ81, CNRZ89, CNRZ277 i LS2502 z gatunku P. freudenreichii.

11. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że może zawierać ponadto inne bakterie, takie jak bakterie dwudzielne (bifidobakterie) i/lub bakterie mlekowe.