KR20000069709A - 사람 또는 동물의 소화관에서 산화질소를 방출시킬 수 있는 프로피오니박테리아를 함유하는 피흡수성 조성물 - Google Patents
사람 또는 동물의 소화관에서 산화질소를 방출시킬 수 있는 프로피오니박테리아를 함유하는 피흡수성 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 생리학적으로 현저한 양의 산화질소를 사람 또는 동물의 소화관으로 방출시킬 수 있는 프로피오니박테리아를 함유하는 피흡수성 식품 조성물 또는 피흡수성 식이 또는 의약 조성물에 관한 것이다.
Description
수십년간, 산화질소가 생명 및 생명 유지에 있어서 필수적인 요소중 하나라는 사실이 완전히 무시되어 왔으며; 그 결과, 4년 또는 5년전까지, 연구자들은 의약, 영양 또는 생리학에 있어서 상기 산화물의 존재와 관련된 잇점에 대해 거의 주의하지 않았다.
엄청난 수의 생리학적 기능이 산화질소로부터 기인되며 상기 가스가 동맥압, 대식구의 비-특이적 세포독성 기능, 혈소판 응집 및 신경전달 조정, 또는 소화관의 운동성 조정과 같이 다양한 기능에 연루될 수 있다는 가설이 매우 최근에야 도출되었다.
상기 가정으로부터 출발하여, 산화질소와 관련된 연구가 확산되었으며 이 가스의 중요성이 확인될 수 있었다.
매우 불안정한 (생물학적 시스템중에서의 반감기가 5초 미만임) 산화질소는 사람 또는 동물체내에서 L-아르기닌으로부터 NO-신타제 (NOS)로 공지된 효소군에 의한 생합성에 의해 생산되는 것으로 공지되어 있는데, 상기 NO-신타제는 두가지 주요 타입으로 존재한다; 즉, 한편으로, 특히 내피 세포, 혈소판 및 뉴우런에서 발현되는 구성적 NOSs와, 다른 한편으로, 주로 면역 시스템의 특정 세포 (대식구 및 특히 다형핵의 백혈구), 혈관 평활근 및 내피 세포에 의해 발현되는 유발성 NOSs가 있다.
유발성 NOSs에 의한 NO의 생산량은 구성적 NOSs에 의한 NO의 생산량 보다 수배 정도 더 크지만, 어떤 경우에는, 상기 생산량이 상대적으로 작게 유지됨을 인지하여야 한다.
본 발명은 생리학적으로 현저한 양의 산화질소를 사람 또는 동물의 소화관으로 방출시킬 수 있는 프로피오니박테리아를 함유하는 피흡수성의 식품 조성물 또는 피흡수성 식이 또는 의약 조성물에 관한 것이다.
도면 1은 Bran-Luebbe 자동 분석 라인상에서 하기에 대해 수득한 비색 프로필이다:
(1) 10시간 동안 배양시킨 후의 비피도박테리아 컬쳐 배지,
(2) 표준 아질산염 용액,
(3) 한외여과시킨, 상기 (3)과 동일한 용액,
(4) 한외여과시키고 C18 수지에 통과시킨, 상기 (3)과 동일한 용액.
도면 2는 Bran-Luebbe 자동 분석 라인상에서 하기에 대해 수득한 비색 프로필이다:
(1) 37 ℃에서 10시간 동안 배양시킨 후의 락토바실러스 컬쳐 배지,
(2) (3) 아질산염 410 ㎍/ℓ를 함유하는 표준 용액,
(4) (5) 아질산염 820 ㎍/ℓ를 함유하는 용액을 수득하기위하여 공지된 양의 아질산염을 첨가한, 37 ℃에서 10시간 동안 배양시킨후의 락토바실러스 컬쳐 배지.
도면 3은 배양 시간 (시간으로) (?)의 함수로서 생산된 아질산염의 양 (㎍/컬쳐 100 ㎖)에서의 변화와, 한편으로, 배양 시간 (○)의 함수로서 혼탁도 (λ=650 nm에서의 흡광도)에서의 변화를 나타낸다.
도면 4는 각 균주에 대한 배양 결과를 나타낸다.
도면 5는 상이한 프로피오니박테리아에 의해 생산될 수 있는 아질산염의 양에 대한 연구 결과를 나타낸다.
도면 6은 헬륨 대기하에서 균주 TL223에 의한 NO 생산량의 예비 측정 시험 결과를 나타낸다.
도면 7A는 배지의 혼탁도의 함수로서 시험관의 대기중 NO의 축적량에 있어서의 변화를 나타내고, 도면 7B는 배양 시간의 함수로서 상기 축적량에 있어서의 변화를 나타낸다.
도면 8A는 시간의 함수로서 NO의 축적량에서의 변화를 나타내며, 도면 8B는 시간의 함수로서 혼탁도에서의 변화를 나타내고, 도면 8C는 시간의 함수로서 동위원소 비 [질량 31/질량 30+31)]에서의 변화를 나타내며, 도면 8D는 혼탁도의 함수로서 NO의 생산량에서의 변화를 나타낸다.
도면 9는 아질산염 또는 질산염 농도의 함수로서 NO 생산량에서의 변화를 나타내는 것으로, 도면 9A는 72시간 동안 배양후 YEL 배지상에서 배양시킨 균주 TL223에 의한, 초기 질산염 농도의 함수로서 NO 생산량에서의 변화 및 혼탁도에서의 변화를 나타내고, 도면 9B는 72시간 동안 배양후 YEL 배지상에서 배양시킨 TL223에 의한, 초기 아질산염 농도의 함수로서 NO 생산량에서의 변화 및 혼탁도에서의 변화를 나타내며, 도면 9C는 초기 질산염 농도의 함수로서, 질산염의 NO로의 전환도에서의 변화를 나타내고, 도면 9D는 초기 아질산염 농도의 함수로서, 아질산염의 NO로의 전환도에서의 변화를 나타낸다.
도면 10은 550 μM의 질산염의 존재하에 YEL 배지상에서 배양시킨, 균주 TL223 및 12개의 다른 프로피오니박테리아 균주에 의한 시간의 함수로서 NO의 축적량에서의 변화를 나타낸다.
도면 11은 550 μM 질산염의 존재하에 YEL 배지상에서 배양시킨, 13개의 프로피오니박테리아 균주에 대해 혼탁도의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타낸다.
도면 12는 550 μM 질산염의 존재하에 YEL 배지상에서 배양시킨, 분석된, 13개의 프로피오니박테리아 균주에 대해 시간의 함수로서 혼탁도 (650 ㎚에서의 OD)에서의 변화를 나타낸다.
도면 13은 L. farciminis를 37 ℃에서 24시간 동안 배양후 아질산염이 보충된 YEL 배지중에서 NO의 생산에 있어서, pH의 함수로서, 변화를 나타낸다.
도면 14는 L. 파르치미니스 및 이. 콜리에 의한 NO 생산의 비교 시험 결과를 나타내는 것으로, 도면 14A는 배양 시간의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타내며, 도면 14B는 배지의 혼탁도의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타낸다.
도면 15는 락테이트를 함유하는 인산염 완충액으로 pH를 6.5로 조정한 휴지기 세포 형태의 세균에 대해 수행된 시험 결과로, 도면 15A는 배양 시간의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타내고, 도면 15B는 혼탁도의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타낸다.
도면 16 및 17은 휴지기 세포 형태의 프로피오니박테리아에 의한 NO 생산에서의 변화에 대한 시험 결과를 나타내는 것으로, 도면 16A는 배양 시간의 함수로서 30 ℃에서 휴지기 세포에 의한 NO 생산에서의 변화를 나타내고, 도면 16B는 배지의 혼탁도의 함수로서 30 ℃에서의 휴지기 세포에 의한 NO 생산에서의 변화를 나타내며, 도면 17A는 배양 시간의 함수로서 37 ℃에서 휴지기 세포에 의한 NO 생산에서의 변화를 나타내고, 도면 17B는 배지의 혼탁도의 함수로서 37 ℃에서의 휴지기 세포에 의한 NO 생산에서의 변화를 나타낸다.
이제, 산화질소의 상기 언급한 유익한 역할에 대해, 상기 생산량을 특히 천연 경로의 식품 대사작용을 사용하여 증가시킬 수 있는 것이 바람직하다.
그러나, 상기 결과를 성취하기위한 수단은 지금까지 보고된 바 없었다.
놀랍게도, 본 발명에 따라서, 특정 타입의 세균중 하나인, 프로피오니박테리아 (propionibacteria)가 산화질소를 생산할 수 있으며, 이들 세균중에서, 특정 종 및 특정 균주가 산화질소를 다량으로 생산한다는 것을 관찰함으로써 바람직한 목적을 달성할 수 있었다.
이들은 프로피오니박테리아로, 통상적으로 우유-기재 후식 또는 기타 발효 유제품을 통하여 체내로 도입되는 유산균 또는 비피도박테리아 군에는 속하지 않지만, 그럼에도 불구하고 수세기동안 사람의 식품중에 존재한다: 사실, 숙성후, 약 109개의 세포/g의 프로피오니박테리아를 함유하는 "에멘탈"로 공지된 치즈의 제조중 구멍을 발생시키는 세균이다.
이들 세균의 발효로 특히 프로피온산, 아세트산 및 이산화탄소가 생산됨을 인지하여야 한다.
상기 언급한 발견은 모두 농식품 분야에서 통상적으로 사용되는, 유산균, 비피도박테리아 및(또는) 효모가 일산화탄소를 생산하지 않음을 확인할 수 있기 때문에 더욱 놀라운 것이다.
따라서, 본 발명은 생리학적으로 현저한 양의 산화질소를 사람 또는 동물의 소화관으로 방출시킬 수 있는 통상의 피흡수성 식품 조성물 또는 피흡수성 식이 또는 의약 조성물을 생산하기위한 프로피오니박테리아의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르는, 상기 조성물은 정교한 제제로 이루어질 수 있으며(있거나) 액체형 (특히 발효된 액체), 탈수된 형태 또는 중간 습윤 함량의 형태로 제공될 수 있다.
그러나, 더욱 상세하게는, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않고, 본 조성물이
- 하나의 생리학적 목적, 즉 생리학적으로 현저한 양의 산화질소를 방출시킬 수 있는 프로피오니박테리아의 섭취를 목적으로 만든 특정 제제의 형태,
- 또는 다른 더욱 엄격한 에너지 또는 기능적 목적을 갖는 정교한 식품 제제의 형태일 수 있으며, 식품 제제의 형태의 경우, 프로피오니박테리아를 식품 자체내에, 특히 치즈, 씨리얼 플레이크와 같은 식이성 섬유중에, 또는 발효유, 디저트 크림, 케이크 및(또는) 강장 드링크 등에 첨가하거나 혼입시킬 수 있다.
본 발명에 따라서, 프로피오니박테리아를 바이오매스 (biomass)의 형태로 또는 동일계에서 배가될 수 있는 발효소의 형태로 도입시킬 수 있다.
탈수시킬 경우, 본 발명의 조성물은 정기적으로 흡수시킬 필요가 있는 투여량의 세균을 함유하는 각 분획물의 형태인 것이 유리하다.
이들 분획물은 직접 섭취하거나 액체중에 미리 희석할 수 있다; 이들은 흡수를 용이하게하는 형태, 예를들면 정제, 과립 분말의 색 (sachets), 액제 등의 형태로 포장될 수 있다.
+4 ℃에서 1년간 보관한 프로피오니박테리아의 농축 탈수 제제는 로그 단위 보다 적게 농도가 떨어진다.
실험으로, 위액내성일 수 있거나 아닐수 있는 젤라틴 캡슐은 특히 유리한 포장 타입인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 다른 특성에 따르면, 각각의 분획은 수많은 세균, 바람직하게는 109개의 세균을 함유한다.
여러가지 실험 (하기 요약되어 있슴)으로, 먼저 아질산 이온 NO2를 직접 측정한 다음, 혐기성 배지중에서 질량 분광분석을 직접 수행하여 배양중 NO를 생산할 수 있는 상이한 프로피오니박테리아 균주의 특이적 능력을 확인하였다.
이들 실험중, 아르기닌-풍부 및 질산염-부족한 (50 μM) 배지중에서의 아질산염 농도를 연구하는데, 제1 단계로, 아르기닌이 NO의 관찰된 생산에 있어서 결정적인 인자가 아니라는 것이 밝혀졌다.
제2 단계로, 질산염-보충된 배지를 조사하였다. 이 경우 수득한 결과로 산화질소의 생산의 질산염-의존성이 밝혀졌다.
1 - 1차 비교 시험
여러가지 세균 균주 (요구르트 종균, 비피도박테리아, 락토바실러스)를 효모 추출물 (10 g/ℓ)이 보충된 재구성된 우유 배지 (100 ㎖)의 존재하에서 배양시킨다.
시간에 따라 아질산염 축적량을 측정한다.
이들 1차 시험은 다음 조건하에서 수행한다:
● 37 ℃에서 0, 4, 7 에서 10시간 동안 배양,
● 3 회 반복,
● Bran-Lueb 시스템으로 아질산염 평가.
분석할 추출물의 성질을 고려하여, 샘플의 정제 단계를 계속해서 이중 원심분리법 (2 x 10 분, 4 ℃, 15,000 rpm)으로 수행한 다음, Miniprep 10 카트릿지상에서 한외여과하고 (MW > 10 kD인 단백질의 체류), 이어서 샘플을 Waters C18 수지 (55-105 ㎛)에 통과시켜 부분적으로 정제한다.
이 방법을 표준 아질산염 샘플에 대해 (도면 1), 제1 단계로 시험한 다음, 공지된 양의 아질산염을 첨가하거나 첨가하지 않고, 7시간 동안 배양시킨 락토바실러스 (Lactobacillus) 컬쳐 추출물에 대해 (도면 2) 시험한다.
도면 1은 Bran-Luebbe 자동 분석 라인상에서 하기에 대해 수득한 비색 프로필이다:
(1) 10시간 동안 배양시킨 후의 비피도박테리아 컬쳐 배지,
(2) 표준 아질산염 용액,
(3) 한외여과시킨, 상기 (3)과 동일한 용액,
(4) 한외여과시키고 C18 수지에 통과시킨, 상기 (3)과 동일한 용액.
도면 2는 Bran-Luebbe 자동 분석 라인상에서 하기에 대해 수득한 비색 프로필이다:
(1) 37 ℃에서 10시간 동안 배양시킨 후의 락토바실러스 컬쳐 배지,
(2) (3) 아질산염 410 ㎍/ℓ를 함유하는 표준 용액,
(4) (5) 아질산염 820 ㎍/ℓ를 함유하는 용액을 수득하기위하여 공지된 양의 아질산염을 첨가한, 37 ℃에서 10시간 동안 배양시킨후의 락토바실러스 컬쳐 배지.
이들 샘플을 상기한 조건하에서 원심분리-한외여과 및 C18 수지에 통과시킴으로써 정제한다.
이들 시험에 따라서, 요구르트 접종균, 비피도박테리아 또는 락토바실러스를 사용할 경우, 배양 시간 (0, 4, 7 또는 10 시간)과는 상관없이, 아질산염의 축적을 검출할 수 없었다.
2 - 프로피오니박테리아 컬쳐에 의한 아질산염 축적의 증명
YEL 배지 제조시 질산염 또는 아질산염의 존재 가능성이 이전에 비색계 검정법으로 조사되었다 (Boehringer 키트): 따라서 상기 배지의 제조에 사용되는 효모 추출물로부터 기원할 수 있는 상기 배지중의 감지가능한 양의 질산염 (약 50 내지 100 μM의 농도)의 존재를 증명할 수 있다; 한편, YEL 배지는 아질산염이 전혀 없는 것으로 확인되었다.
프로피오니박테리아 컬쳐 (동결건조물 1 g/YEL 배지 100 ㎖)를 시험한다.
이들 시험을 다음 조건하에서 수행한다:
● 30 ℃에서 24, 48 또는 72시간 동안 배양,
● 비등시켜 배양을 중단시킴,
● 원심분리 및 추출물을 C18 수지에 통과시켜 생성물을 정제함,
● Bran-Luebbe 시스템상에서 분석하여 배지중 아질산염을 검정함.
YEL 배지상에서 세균의 배양 시간의 함수로서 아질산염 축적의 카이네틱스 (kinetics)를 확립하기위하여 프로피오니박테리아에 의해 축적되는 아질산염을 검정한다.
도면 3은 배양 시간 (시간으로) (?)의 함수로서 생산된 아질산염의 양 (㎍/컬쳐 100 ㎖)에서의 변화와, 한편으로, 배양 시간 (○)의 함수로서 혼탁도 (λ=650 nm에서의 흡광도)에서의 변화를 나타낸다.
도면 3에서는 아질산염의 양은 24시간에서 최대이고 이어서 배양 48 및 72시간후 현저히 감소됨을 나타낸다.
이런 감소는 아질산염 리덕타제에 의해 아질산염이 NO, N2O 또는 다른 화합물로 환원되는 것으로부터 발생하는것으로 생각함이 타당할 수 있다.
본 발명에 따라서, NO2의 축적이 사용되는 프로피오니박테리아종 또는 균주에 따른다는 것을 증명할 수 있다.
이런 상황은 하기 요약된 시험으로 확인되었다:
3 - 4가지 상이한 프로피오니박테리아종의 균주 9개의 경우에서 컬쳐 배지중 아질산염 축적의 증명 및 비교
본 시험에 따라서, 피. 프로이덴라이치 (P. freudenreichii)종의 균주 P20, P23, 2408, 2410, 2500 및 2501과 각각, 피. 토에니 (P. thoenii), 피. 아시디프로피오니치 (P. acidipropionici) 및 피. 옌세니 (P. jensenii)종에 속하는 균주 TL221, Tl223 및 TL207을 연구하였다.
TL (technologie laitiere [dairy technology]) 균주가 INRA-LRTL에 속하는 균주인 반면, 균주 P23 (또는 ITG23)은 1996년 12월 18일자로 번호 I-1804로 파스퇴르 연구소의 다음 기관에 등록되어 있음을 인지하여야 한다: Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes [National Collection of Microorganism Cultures] (CNCM).
여러가지 프로피오니박테리아 균주 (동결건조물 1 g 또는 신선한 컬쳐 5 ㎖)를 다음 조건하에서 약 5 μM의 질산염을 함유하는 YEL 배지 100 ㎖상에서 배양시킨다:
● 30 ℃에서 12, 24, 36 또는 48시간 동안 배양,
● 3회 반복,
● 비등시켜 배양을 중단시킴,
● 생성물을 원심분리시키고 C18 수지에 통과시켜 정제함,
● 배지중 아질산염의 축적량을 Bran-Luebbe 시스템상에서 분석하여 측정함,
● 650 ㎚에서의 흡광도를 판독하여 측정함으로써, 각 컬쳐의 발효를 평가함.
각 균주에 대해 수득한 결과를 도면 4에 나타낸다.
이는 각 경우, 배양 시간의 함수로서 컬쳐 배지의 아질산염의 축적량 (?) 및 혼탁도 (○)에서의 변화를 나타낸다. 각각의 수치는 n=3에 대한 평균 ± 표준편차에 대응한다.
아질산염 축적량의 스케일은 균주 P23 및 TL223의 경우 25배 더 크다는 것을 인지하여야 한다.
이들 결과는 컬쳐의 혼탁도에서의 변화로부터 산정된, 세균 성장이 연구된 모든 균주에 대해 유사한데, 2일후 혼탁도가 0.6 OD에 달하는 균주 TL221을 제외하고, 모든 균주의 혼탁도가 48시간 동안 배양시킨후 약 2 내지 2.5 OD에 달하였다.
한편, 시간의 함수로서 아질산염의 축적량의 경우 크게 현저한 차가 있다.
상술하면, 균주 2500, 2408, γ20, 2501, 2410, TL207 및 TL221은 상대적으로 적은양의 아질산염을 축적하며, 각각 36, 12, 36, 12, 12, 24 및 24시간의 배양후 최대량 (NO2 -0.1 ㎍/㎖)에 도달하였다.
대조적으로, 균주 P23 및 TL223의 경우 훨씬 더 많은 양의 아질산염을 축적하였는데, 각각 36 및 24시간의 배양후 최대량, NO2 -1.8 ㎍/㎖으로 축적하였다.
상기 언급한 제2차 시험에서 분석한 프로피오니박테리아 균주는 최대 NO2 -축적량의 중간 위치인, 약 0.5 ㎍/㎖의 축적량을 갖는다는 것을 인지하여야 한다.
따라서, 이들 시험은 4가지 상이한 종으로부터의 상이한 프로피오니박테리아에 의해 생산될 수 있는 아질산염의 양에 있어 현저한 차이가 있으며, 이들 차이는 이들 균주의 성장과는 독립적이라고 언급할 수 있도록 한다.
이들 결과는 각 균주에 대한, 혼탁도, 따라서, 대략, 세균 성장의 함수로서 컬쳐 배지의 아질산염 농도에서의 변화를 연구함으로써 확인할 수 있다.
이들 마지막 시험 결과를 도면 5에 제시하는데, 여기서 각 수치는 n=3에 대한 평균 ± 표준편차에 대응한다.
상기 언급한 시험은 연구된 균주중에서, 균주 TL223이 최대로 아질산염을 축적하며, 이들 아질산염이 12시간 후에 사라진다는 것을 정립하기위하여 고안된 것이다. 따라서 상기 균주는 혐기성 배지중에서 질량 분광계 분석으로 산화질소의 생산량을 직접 측정하는 것에 관한 상보적인 시험과 관련하여 선택한다.
4 - 헬륨 대기하에서 균주 TL223에 의한 NO 생산량의 예비 측정
이들 시험에 따라서, 약 50 μM의 질산염을 함유하는 YEL 배지 5 ㎖와 균주 TL223의 신선한 컬쳐 0.25 ㎖를 함유하는 10 ㎖ 시험관에 컬쳐를 제조한다.
상기 시험관의 대기를 100초간 헬륨으로 유동시켜 (100 ㎖/분) 즉시 배기시킨다.
이어서 시험관의 대기중 NO의 축적량을 다음 조건하에서 시간 경과에 따라 측정한다:
● 30 ℃에서 24, 48 또는 72시간 동안 배양,
● 4회 반복,
● 질량 분광계 분석으로 NO의 축적량을 측정함,
● 650 ㎚에서의 흡광도를 판독하여 측정함으로써, 각 컬쳐의 발효를 평가함.
예비 시험중에, 산화질소의 양을 증가시켜 가스 정제 시스템 (Roboprep G+) - 질량 분광계 (Twenty-Twenty)를 보정한다.
이 가스는 KI 및 H2SO4의 용액이 존재하에서 NaNO2로부터 발생한다.
산화질소의 동정과 정량은 다음 질량을 기준으로하여 수행한다:14N16O의 경우 30;15N16O 및14N17O의 경우 31. 이어서 이의 동정은 동위원서 비를 측정하여 확인한다: 31/30 = [15N16O +14N17O]/14N16O. NO에 대한 이론적 동위원소 비 31/30은17O의 오염 부재하에서 0.00367이다.
상기 예비 시험 결과를 도면 6에 제시하였는데, 여기서 좌측 부분 (A)는 산화질소를 정량하는데 사용되는 질량 분광계의 보정 곡선에 대응하는 반면, 우측 부분 (B)는 동위원소 비 31/30의 측정치에 대응한다.
상기 시험의 실제적인 결과를 도면 7에 제시하였다.
더욱 상세하게, 도면 7A는 배지의 혼탁도의 함수로서 시험관의 대기중 NO의 축적량에 있어서의 변화를 나타내는 것인 반면, 도면 7B는 배양 시간의 함수로서 상기 축적량에 있어서의 변화를 나타낸다.
수직 또는 수평 막대는 이들을 기호보다 더 넓게 만들 경우, n=4에 대한 평균의 표준편차를 나타낸다.
도면 7B (헬륨하에서 컬쳐 배지의 혼탁도에서의 시간에 따른 변화를 나타냄)를 도면 4 (공기중에서 상기 동일한 변화를 나타냄)와 비교하면, 균주 TL223의 성장이 필수적으로 헬륨으로 이루어진 대기에 의해 현저하게 영향받지 않음을 알 수 있다.
대기중 산화질소의 축적 속도는 배양 초기 약 45 시간 동안에 걸쳐 일정하고, 이후 곡선이 끝나게 되는데 (도면 7B), 이는 1.5 OD에 가까운 혼탁도에 대응함 (도면 7A)을 확립할 수 있다.
약 65시간 동안 배양시킨후 (혼탁도는 1.7 OD 이상), 약 1.5 ㎍의 NO가 컬쳐 배지 1 ㎖ 당 헬륨 대기중에 축적되었다.
수득한 크기 정도는 공기와 접촉하는 컬쳐의 배지중에서 측정된 아질산염 함량과 호환성일 수 있다.
후자의 경우, 균주 TL223이 1.5 OD의 혼탁도에 대해 최대 1.8 ㎍의 NO2 -/㎖를 축적하며, 이는 약 1.2 ㎍의 NO/㎖에 대응한다는 것이 밝혀졌다 (도면 5).
상기 균주 TL223에 의한 NO의 생산량을 예비적으로 직접 측정한 것으로부터, 본 발명에 따라서, 상기 산화질소의 합성 경로를 확인하고자 시도되었으며, 상기 합성이 아질산염 또는 질산염의 공급에 의해 자극되는지 여부를 조사하는 개념이 상기 목적으로 제안되었다.
상기와 같은 자극은 하기 요약된 시험을 사용하여 확인할 수 있다.
5 - 아질산염 또는 질산염의 공급에 의한 NO 생산의 자극에 관한 연구
프로피오니박테리아에 의한 NO의 생산이 NO2 -또는 NO3 -로부터 가능한지 여부를 조사할 목적으로, 1 mM KNO2또는 KNO3의 존재하에서 (15N으로 동위원소 표지시키거나 시키지않고) 균주 TL223에 의한 NO의 생산이 증가되는지 여부를 밝히고자하는 연구가 수행되었다.
상기 실험은 다음 조건하에서 수행한다:
● 균주 TL223을 1%의 농도로 YEL 배지만에 (대조군) 또는 1 mM KNO2, KNO3또는15N으로 (50%의 농도로) 동위원소 표지시킨 K15NO3를 첨가하여 접종함,
● 30 ℃에서 24, 48 및 72시간 동안 배양시킴,
● 시점 및 처리 당 3회 반복함,
● 질량 분광계로 NO의 축적과 동위원소 비를 측정함,
● 650 ㎚에서의 흡광도를 판독하여 측정한 각 컬쳐의 발효 (혼탁도)를 평가함,
● 세균 배지를 회수하여, 원심분리시켜 Boehringer 키트로 측정하여 질산염 및 아질산염을 검정함.
30 ℃에서 72시간 동안 배양시킨후 (YEL 배지중 1%의 농도로 TL223을 접종시킴) NO3 -농도 (100, 150, 350, 650 및 1050 μM) 또는 NO2 -농도 (50, 100, 400, 800, 1000 μM)의 함수로서 NO의 축적량을 또한 분석한다.
분석할 샘플을 NO 분석관에 분배하는데 분배관의 내부는 헬륨으로 150초간 플러슁시켜 즉시 배기시켜 엄격한 혐기성 조건을 수득한다.
질량 분광계에 의한 NO의 가능한 검출에 대한 헬륨을 사용한 플러슁 효과를 멸균 YEL 배지에 대해 시험한다: 헬륨으로 미리 플러슁시킨 상기 YEL 배지를 30 ℃에서 72시간 동안 배양시킨다. 배양 0, 24, 48 및 72시간후, NO 생산이 검출되지 않으며 혼탁도 수치는 0에서 유지된다.
따라서, 헬륨 플러쉬의 품질, 세균성 오염의 부재 및 헬륨 플러쉬간의 상호반응의 부재 및 질량 분광계에 의한 NO의 측정을 체크할 수 있다.
상기 언급한 시험으로 아질산염 또는 질산염의 존재하에서의 NO 축적의 카이네틱스에 대햐여, 도면 8에 보고된 결과를 수득하였다.
더욱 상술하면,
- 도면 8A는 시간의 함수로서 NO의 축적량에서의 변화를 나타내며,
- 도면 8B는 시간의 함수로서 혼탁도에서의 변화를 나타내고,
- 도면 8C는 시간의 함수로서 동위원소 비 [질량 31/질량 30+31)]에서의 변화를 나타내며,
- 도면 8D는 혼탁도의 함수로서 NO의 생산량에서의 변화를 나타낸다.
이들 도면 각각은 YEL 배지 단독, 1 mM 질산염 (50% 비율로 표지된15NO3 -및 14NO3 -)의 존재하 및 1 mM 아질산염의 존재하에서 배양된 균주 TL223에 관한 것이다.
수직 막대는 이들이 기호보다 더 큰 경우 ± n=3에 대한 평균의 표준편차를 나타낸다.
이들 도면은 1 mM KNO3(질소-15로 표지시키거나 표지시키지 않은것) 또는 1 mM KNO2상에서 배양시킨 TL223에 의한 NO의 축적량이 30 ℃에서 48시간 동안 배양후 7 ㎍의 NO/㎖에 가깝고; 이 수치는 질산염 또는 아질산염이 보충되지 않은 YEL배지의 경우 NO의 생산량 보다 3.5배 더 크다는 것을 입증한다 (도면 8A). 성장 말기의 혼탁도가 YEL 배지 단독 (72시간후 4.5 OD 단위) 및 질산염 또는 아질산염이 보충된 동일한 배지상 (72시간후 약 5 OD - 도면 8B 및 8D)에서의 크기가 동일하기 때문에 이들 차이는 배지의 조성에 의해 발생된 성장 변화로 인한 것이 아니다.
도면 8C는 50%의 비율로 표지시킨 K15NO3공급으로 48 시간 동안 배양후 약 40%의 비율로 표지물을 함유하는 NO를 수득할 수 있으며; 따라서 질산염의 형태로 공급된 질량 15의 질소가 균주 TL223에 의해 합성된 NO에서 발견됨을 밝히는 것이다.
균주 TL223을 K15NO3상에서 배양시킬 때, 질량 31 (15N16O)의 피크 프로필은 표지시키지 않은 질산염을 함유하는 YEL 배지상에서 분석한 NO에 비하여 크게 증가함이 또한 관찰되는데, 이로써 상기 상황을 확인할 수 있다.
또한, 1 mM 비표지된 KNO3또는 KNO2를 첨가함으로써 동위원소 비가 0.75%인 NO가 생산되는데 (48시간 동안 배양 - 도면 8C), 이는 NO의 천연 동원원소 비 (약 0.4%)에 대한 수치에 매우 가깝다.
이들 최종 관찰은 질량 분광계로 분석한 가스가 사실 NO임을 확인시켜주는 것이다.
따라서 이들 시험은 균주 TL223이 아질산염으로부터 직접 또는 상기 질산염이 아질산염으로 환원된 후 질산염의 존재하에서 NO를 합성할 수 있다고 언급할 수 있도록한다.
50% 비율로 표지된 1 mM K15NO3이 보충된 YEL 배지상에서 수득한 동위원소 비율 수치를 기준으로하여, 질산염이 아질산염으로 전환되는 비를 추론할 수 있으며; 따라서, 공급된 K15NO3중 약 20%가 균주 TL223에 의해 질소산화물로 전환된다.
멸균 YEL 배지중에 처음부터 존재하는 질산염은 TL223에 의해 관찰된 NO 생산량을 설명한다 (72시간 동안 배양후 약 2 ㎍의 NO/㎖ - 도면 7).
아질산염 또는 질산염 농도의 함수로서 NO 생산량에서의 변화를 도면 9에 제시하였다. 더욱 상술하면 다음과 같다:
- 도면 9A는 72시간 동안 배양후 YEL 배지상에서 배양시킨 균주 TL223에 의한, 초기 질산염 농도의 함수로서 NO 생산량에서의 변화 및 혼탁도에서의 변화를 나타내고,
- 도면 9B는 72시간 동안 배양후 YEL 배지상에서 배양시킨 TL223에 의한, 초기 아질산염 농도의 함수로서 NO 생산량에서의 변화 및 혼탁도에서의 변화를 나타내며,
- 도면 9C는 초기 질산염 농도의 함수로서, 질산염의 NO로의 전환 정도에서의 변화를 나타내고,
- 도면 9D는 초기 아질산염 농도의 함수로서, 아질산염의 NO로의 전환 정도에서의 변화를 나타낸다.
이들 도면에서, 질산염 농도는 단독 YEL 배지중 약 50 μM 질산염의 존재를 고려하여 보정되었으며, 다음과 같다: 100, 150, 350, 550, 650 및 1050 μM.
아질산염 농도는 다음과 같다: 50, 100, 400, 800 및 1000 μM.
이들 도면은 선택된 범위에 대해, 균주 TL223에 의한 산화질소의 생산량이 YEL 배지중 질산염 (도면 9A) 또는 아질산염 (도면 9B)의 초기 농도에 비례함을 나타낸다. 이 관계는 선형이다.
두 경우에 있어서, 정체기가 관찰되지 않았는데, 이는 사용되는 질산염 또는 아질산염 농도가 프로피오니박테리아 TL223에 의한 최대 수준의 NO의 축적량을 수득할 수 있도록하는 것이 아니라는 추측을 하도록한다.
72시간에서의 혼탁도 수치는 시험된 모든 농도에 대해 매우 유사하다는 점에서, 고농도의 질산염 또는 아질산염의 존재가 세균 성장에 영향을 주지 않는다는 것을 또한 인지하여야 한다.
또한, 도면 9A 및 9B에서 수득한 곡선은 포개질 수 있는데, 이는 생산된 NO가 아질산염으로부터 직접 또는 아질산염으로의 환원을 통하여 질산염으로부터 유래됨을 증명하는 것임을 지적하여야 한다.
또한, 이들 결과는 균주 TL223의 경우, 질산염의 아질산염으로의 환원 단계가 상기 실험에서 선택된 질산염 농도에 대해 제한되지 않음을 나타낸다.
NO3 -(도면 9C) 및 NO2 -(도면 9D)의 전환 정도는, NO3 -또는 NO2 -농도가 1000에서 100 μM로 변화될 때 20에서 60%로 변화되는, 유용가능한 기질의 양의 함수로서 변화됨을 지적하는 것이 또한 중요하다.
이는 NO의 생산이 강력하게 조절되며 질소 합성의 경우 아질산계 질소를 사용하는 것보다 우세함을 제시하는 것이다.
상기 언급한 결론으로부터, NO의 생산을 두가지 상이한 종의 프로피오니박테리아 균주 12개에서 연구하였다. 이들 시험의 결과를 하기에 요약한다:
6 - 상이한 프로피오니박테리아 균주에 의한 NO의 생산 연구
이 시험에 따라서, 선택된 프로피오니박테리아 균주는 다음과 같다:
P. freudenreichii: LS410, LS2501, LS2502, ITG 23, CNRZ89, CNRZ277, CNRZ81.
P. acidopropionici: TL223, NCDO1072, PR75, CNRZ80, CNRZ86, CNRZ287.
균주 CNRZ80, CNRZ81, CNRZ89, CNRZ277 및 CNRZ287은 INRA-CNRZ 공개 콜렉션에 속하는 반면, 균주 NCDO1072는 영국 기탁기관 "National Collection of Dairy Organisms"에 속하며; 다른 균주는 개인 콜렉션에 속함을 인지하여야 한다.
550 μM 질산염의 존재하에 YEL 배지상에 접종시킨후, 세균 컬쳐를 즉시 밀봉된 관에 5 ㎖ 단위로 분배하여 헬륨으로 플러슁한다 (혐기성 조건). 다음, 다음과 같은 실험 조건에서서 프로피오니박테리아 균주를 시험한다:
● 30 ℃에서 24, 48 및 72 시간 동안 배양,
● 3회 반복,
● 질량 분광계로 대기중 NO의 축적량 및 동위원소 비를 측정함,
● 650 ㎚에서의 흡광도를 판독하여 측정한 각 컬쳐의 발효를 평가함,
● 세균 배지 회수하여, 원심분리시켜 Boehringer 키트로 측정하여 질산염 및 아질산염을 검정함.
도면 10은 550 μM의 질산염의 존재하에 YEL 배지상에서 배양시킨, 균주 TL223 및 12개의 다른 프로피오니박테리아 균주에 의한 시간의 함수로서 NO의 축적량에서의 변화를 나타낸다. 균주 TL223은 비교용으로 각 경우에 제공된다.
수직 막대는 이들이 기호보다 더 큰 경우 ± n=3에 대한 평균의 표준편차를 나타낸다.
도면 10은 프로피오니박테리아 균주간에 큰 차이가 존재함을 나타낸다.
전체적으로, 72시간 동안 배양후 NO의 생산 수준을 비교함으로써, 균주를 3가지 카테고리로 분류할 수 있다:
● 4 내지 4.5 ㎍의 NO/㎖를 생산할 수 있는 균주: TL223, CNRZ80, NCDO1072 및 PR75. 이들 균주에 의해 생산된 NO에 대한 동위원소 비는 2 내지 2.5%이다 (T = 72시간);
● 약 2 ㎍의 NO/㎖를 생산할 수 있는 균주: CNRZ81, CNRZ86, CNRZ 89, CNRZ277, LS2502 및 ITG23. 이들 균주에 의해 생산된 NO에 대한 동위원소 비는 4 내지 5.5%이다 (T = 72시간);
● 1 ㎍ 미만의 NO/㎖를 생산할 수 있는 균주: LS410, LS2501 및 CNRZ287. 컬쳐 배지중 550 μM 질산염의 존재에도 불구하고, 이들 3개의 균주는 매우 적은 양의 NO만을 생산하였으며 동위원소 비는 약 10 내지 13%였다 (T = 72시간). 이들 수치는 이들 세균에서 검출된 질량 30 및 31의 피크가 산화질소에 대응하지 않을 수 있음을 제시한다.
첫번째 및 두번째 카테고리에 속하는 균주에서, 생산된 NO가 성장 말기에 감소되지 않으며 따라서 프로피오니박테리아에 의해 재사용되는 것으로 나타나지 않으며; 따라서 NO가 축적된다는 것을 인지하여야 한다.
도면 11은 550 μM 질산염의 존재하에 YEL 배지상에서 배양시킨, 상기 언급한 13개의 프로피오니박테리아 균주에 대해 혼탁도의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타낸다. 균주 TL223은 각 경우 비교용으로 제공된다.
수직 막대는 이들이 기호보다 더 큰 경우 ± n=3에 대한 평균의 표준편차를 나타낸다.
도면 12는 550 μM 질산염의 존재하에 YEL 배지상에서 배양시킨, 분석된, 상기 언급한 13개의 프로피오니박테리아 균주에 대해 시간의 함수로서 혼탁도 (650 ㎚에서의 OD)에서의 변화를 나타낸다.
균주 TL223은 각 경우 비교용으로 제공된다.
수직 막대는 이들이 기호보다 더 큰 경우 ± n=3에 대한 평균의 표준편차를 나타낸다.
최대량의 NO를 생산하는 균주 (TL223, CNRZ80, NCDO1072 및 PR75)는 모두 높은 혼탁도 수치에 도달한다 (72시간 배양후 4 내지 5 OD).
이들 균주중에서, 세균 NCDO1072 및 PR75는 TL223 보다 덜 신속하게 성장하지만 높은 농도의 NO를 매우 신속하게 축적할 수 있다.
따라서, PR75는 혼탁도 0.5 OD 유니트의 경우 2.8 ㎍의 NO/㎖를 생산한다. 최대 NO 생산량은 TL223의 경우 3.4 OD 유니트와 비교하여, NCDO1072 및 PR75의 경우 약 1.5 OD 단위의 혼탁도 수치에 대해 기록되어 있다.
이들 결과를 "세밀히 구분하기" 위하여, 배양 시간의 함수로서 연구된, 13개의 프로피오니박테리아에 대해 컬쳐 배지의 NO, 질산염 및 아질산염 농도에서의 변화를 분석하였다.
수득한 결과를 하기 표에 나열하였는데, 여기서 농도는 μM로 표시된다. 각 균주의 경우, 원심분리로 세균을 제거한 후 시험관상에서 측정한다.
| NO3의 농도 | NO2의 농도 | NO의 농도 | |||||||
| 24H | 48H | 72H | 24H | 48H | 72H | 24H | 48H | 72H | |
| P.freudenreichii | |||||||||
| LS410 | 674 | 638 | 596 | 0 | 5 | 22 | 13 | 18 | 23 |
| LS2501 | 645 | 649 | 406 | 6 | 13 | 215 | 12 | 26 | 35 |
| LS2502 | 338 | 0 | 0 | 176 | 122 | 16 | 12 | 53 | 72 |
| ITG23 | 441 | 218 | 24 | 11 | 246 | 278 | 10 | 36 | 62 |
| CNRZ89 | 595 | 160 | 42 | 16 | 171 | 154 | 10 | 38 | 74 |
| CNRZ277 | 559 | 435 | 246 | 17 | 3 | 85 | 12 | 42 | 66 |
| CNRZ81 | 0 | 0 | 0 | 400 | 12 | 0 | 26 | 66 | 71 |
| P. acidipropionici | |||||||||
| TL223 | 0 | 0 | 0 | 271 | 0 | 0 | 71 | 149 | 152 |
| NCDO1072 | 0 | 2 | 0 | 370 | 3 | 0 | 50 | 148 | 146 |
| PR75 | 11 | 2 | 0 | 185 | 1 | 0 | 91 | 147 | 146 |
| CNRZ80 | 0 | 0 | 0 | 146 | 0 | 0 | 93 | 136 | 140 |
| CNRZ86 | 594 | 491 | 0 | 14 | 41 | 405 | 9 | 28 | 62 |
| CNRZ287 | 624 | 570 | 646 | 0 | 0 | 5 | 9 | 20 | 29 |
상기 표는 다음과 같은 관측을 하도록한다:
- 4 ㎍의 NO/㎖를 생산하는 균주는 배양 24시간 후 유용가능한 질산염 (즉 550 μM)을 모두 환원시킬 수 있다. 또한, 이들은 처음 48시간의 배양중에 수득한 아질산염을 모두 환원시킬수 있다;
- 매우 낮은 수준의 NO를 생산하는 균주 LS410 및 CNRZ287은 배지중에 존재하는 질산염을 현저하게 흡수할 수 없다;
- 중간 정도의 NO 축적량을 나타내는 균주의 경우, 질산염과 아질산염 농도에서 매우 상이한 변화를 관측할 수 있는데, 이는 매우 상이한 NO3 -의 흡수 및(또는) NO3 -및 NO2 -의 환원 속도를 반영하는 것이다. 따라서, 균주 CNRZ81은 배양 24시간후 질산염을 모두 환원시킬 수 있다. 48시간후, CNRZ81은 또한 NO3 -를 환원시켜 수득한 NO2 -를 모두 환원시킨다. 대조적으로, CNRZ277은 배양 72시간 후에도 여전히 246 μM NO3 -와 85 μM NO2 -를 함유한다.
상기 요약된 시험은 특정 프로피오니박테리아 균주가 컬쳐 배지중에서 질산염을 환원시킬 수 있으며 따라서 NO의 합성에 요구되는 아질산염을 생산한다.
최대량의 NO를 생산하는 프로피오니박테리아 균주 (TL223, CNRZ80, NCDO1072 및 PR75)는 모두 P. acidipropionici종에 속하며, 또한 모두 질산염 리덕타제 활성을 갖는다는 것을 인지하여야 한다.
대조적으로, 명백하게 적은 양의 NO를 생산하거나 NO를 전혀 생산하지않는 (질량 분광기의 검출 제한치) 균주는 또한 공지된 질산염 리덕타제 활성이 없는 세균이다 (LS410, LS2501 및 CNRZ287).
특정 프로피오니박테리아 균주의 경우, 질산염 리덕타제 활성과 직접 연결되지 않는 NO 생산 카이네틱스는 없는 것으로 나타났다.
이들 결과로부터, 본 발명은 또한 550 μM 질산염을 함유하는 YEL 배지 ㎖ 당 1 ㎍ 이상의 비율로 산화질소를 방출 및(또는) 축적하는 능력의 함수로서 선택된 프로피오니박테리아 균주를 다량, 바람직하게는 109개 세포/g 함유하는 제제로 이루어져 있음을 특징으로하는, 피흡수성 식이 또는 의약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징에 따라서, 상기 조성물은 P. acidipropionici종의 균주 TL223, CNRZ80, CNRZ86 및 NCDO1072 중 1종 이상에 속하는 프로피오니박테리아를 함유한다.
이들 균주중에서 균주 TL223이 특히 유리한 것으로 증명되었다.
균주 CNRZ80은 높은 농도의 NO를 축적할 수 있으며, 매우 신속하게 (상대적으로 낮은 혼탁도 수치에 대해) 수행할 수 있다는 "생산성"의 관점에서 매우 특이적인 가치가 있다.
본 발명의 다른 특징에 따라서, 상기 조성물은 P. freunenreichii종의 균주 ITG23, CNRZ81, CNRZ89, CNRZ277 및 LS2502 중 1종 이상에 속하는 프로피오니박테리아를 함유한다.
본 발명의 다른 특성에 따라서, 본 조성물이 또한 비피도박테리아 및(또는) 유산균과 같은 다른 세균을 함유할 수 있다는 점을 인지하여야 한다.
상기 수득한 결과를 완성하기위하여, 아질산염을 환원시킬 수 있는 능력에 대해 공지된 두가지 타입의 비-프로피온계 세균인, 이. 콜리 및 락토바실러스 파르시미니스 (Lactobacillus farciminis)에 대해 시험을 수행하였다.
이들 시험의 결과를 하기에 요약하였다:
7 - 이. 콜리 및 에. 파프시미니스 균주에 의한 NO의 생산 연구
이들 상보적인 시험은 주로 특정 유산균 (L. farciminis)이 아질산염으로부터 산화질소를 생산할 수 있다고 언급하고 있는 하기 문헌에 대해 수행된다: "Heme-dependent and Heme-independent nitrite reduction by lactic acid bacteria results in different N-containing products" Gudrun Wolf, Elke K. Arendt, Ute Pfahler and Walter P. Hammes - International Journal of Food Microbiology, 10 (1990).
예비 실험은 균주 L. 파르치미니스를 5시간 30분 동안 1 mM 질산염이 보충된 MRS중에서 성장시킨후, 질산염 및 아질산염이 더이상 검출되지 않음을 나타낸다.
1 mM 질산염이 보충된 BHI 배지상에서 7시간 30분 동안 성장시킨후의 이. 콜리 균주에 대해서도 동일하게 관찰되었다.
성장중, 균주 L. 파르치미니스는 MRS 배지를 산성화시킨다 (5 내지 6시간 동안 배양후 약 pH 5)는 것은 공지되어 있다.
산성 배지중에서 아질산염이 NO로 전환됨을, YEL 배지상에서 수행된 시험으로부터 관찰할 수 있었다.
이들 시험을 다음과 같은 실험 조건하에서 수행되었다:
- YEL 배지를 HCl로 산성화시킴,
- 400 μM의 농도로 아질산염을 공급함,
- 배지를 오토클레이빙시킴,
- 3회 반복.
수득한 결과를 도면 13에 제시하였는데 이는 37 ℃에서 24시간 동안 배양후 아질산염이 보충된 YEL 배지중에서 NO의 생산에 있어서, pH의 함수로서, 변화를 나타낸다.
도면 13은 또한 상기 배지가 산성일 경우 배지중 아질산염으로부터 NO의 생산이 상당하게 생산되며, 상기 생산은 pH가 감소함에 따라 증가함을 증명할 수 있다.
결과적으로, NO를 생산하기위함이 아니라 재투입된 L. 파르치미니스 및 이. 콜리에 의한 NO 생산의 비교 시험을 수행하였다: Brittain T, Blackmore R, Greenwood C & Thomson AJ (1992) - Bacterial nitrite - reducing enzyme - Eur. J. Bio. Chem., 209 , 793-820.
이들 시험을 다음 조건하에서 수행한다:
- 37 ℃에 BHI 배지 (이. 콜리) 또는 MRS 배지 (L. 파르치미니스)상에서 배양,
- 배지에 질산염이 1 mM의 농도로 제공됨,
- 각 관의 대기를 헬륨으로 100초간 플러슁함,
- 3회 반복,
- 배양 말기에 혼탁도를 측정함.
이들 시험 결과를 도면 14에 보고한다.
더욱 상술하면:
- 도면 14A는 배양 시간의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타내며,
- 도면 14B는 배지의 혼탁도의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타낸다.
NO 생산에 대해 수득한 수치는 모두 1 ㎍/㎖의 역치보다 현저히 낮은데, 이를 유의적인 것으로 판단하는데: 이 결과 배양관중에 NO의 축적량이 전혀 없음을 인지하여야 한다.
따라서 이들 결과는 각각 5시간 30분 (L. farminis) 및 7시간 30분 (E.coli)후 예비 실험에서 관찰된 질산염 및 아질산염의 부재가 화학 기원 (배지의 산성화와 관련) 또는 세균 기원의 것일 수 있는 NO의 축적에 의해 보상되지 않음을 나타내는 것이다.
엘. 파르치미니스 균주의 경우, 이들 결과가 락테이트를 함유하는 인산염 완충액으로 pH를 6.5로 조정한 휴지기 세포 형태의 세균에 대해 하기 작업 조건하에서 수행된 시험으로 확인되었다:
- 37 ℃에서 배양,
- 400 μM의 농도로 질산염을 공급,
- 각 관을 헬륨으로 100초간 플러슁시킴,
- 3회 반복,
- 배양 말기에 혼탁도를 측정함.
상기 분석 결과를 도면 15에 보고하였다:
- 도면 15A는 배양 시간의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타내고,
- 도면 15B는 혼탁도의 함수로서 NO 생산에서의 변화를 나타낸다.
이들 결과는 상기한 사항, 즉, 생산된 NO의 양이 유의적인 것으로하기에 너무 적고 따라서 엘. 파르치미니스 균주는 산화질소를 축적할 수 없다는 것을 확인시켜준다. 그러나, 상기 균주는 성장 개시 때 산화질소를 생산할 수 있지만, 생산된 NO가 세균에 의해 재사용되지 않는다.
상보적인 시험을 30 및 또한 37 ℃에서 배양시킨후 휴지 세포 형태의 균주 TL223 및 CNRZ80에 대해 수행하였다.
8 - 휴지기 세포 형태의 프로피오니박테리아에 의한 NO 생산에서의 변화
이 실험을 하기 조건하에서 수행한다:
- 6.5에서, 락테이트를 함유하는 인산염 완충액에 현탁시킨 휴지기 세포,
- 30 ℃ 또는 37 ℃에서 배양,
- 400 μM의 농도로 공급되는 아질산염,
- 각 관의 대기를 헬륨으로 100초간 플러슁시킴,
- 3회 반복,
- 배양 말기에 혼탁도를 측정.
30 ℃에서의 배양과 관련한 시험중, 균주 TL223 및 CNRZ80 외에, 균주 CNRZ81을 2배 세균 농도로 조사하였음을 인지하여야 한다.
이 실험으로 수득한 결과를 도면 16 및 17에 보고한다. 더욱 상세하게는,
- 도면 16A는 배양 시간의 함수로서 30 ℃에서 휴지기 세포에 의한 NO 생산에서의 변화를 나타내고,
- 도면 16B는 배지의 혼탁도의 함수로서 30 ℃에서의 휴지기 세포에 의한 NO 생산에서의 변화를 나타내며,
- 도면 17A는 배양 시간의 함수로서 37 ℃에서 휴지기 세포에 의한 NO 생산에서의 변화를 나타내고,
- 도면 17B는 배지의 혼탁도의 함수로서 37 ℃에서의 휴지기 세포에 의한 NO 생산에서의 변화를 나타낸다.
이들 결과는 P. acidipropionici종의 2개의 균주 (TL223 및 CNRZ80)의 경우 뿐만 아니라 P. freudenreichii종의 균주 (CNRZ81)의 경우에서도 휴지기 세포에 의한 NO가 생산됨을 증명할 수 있다. 균주 TL223이 가장 생산적이다.
전체적으로, 동일한 세균 농도의 경우, 휴지기 세포에 의한 NO 생산은 YEL 배지상에서 배양된 세균의 경우에 관찰된 크기와 동일하다.
휴지기 세포에 의한 NO 생산은 배양 초기 5시간 동안 거의 일어나며; 이외의 기간에는 생산량이 적다.
따라서, 37 ℃에서, NO의 생산량은 30 ℃에서 수득한 것과 동일하거나 (TL223) 약간 더 높다 (CNRZ80)는 것을 관찰할 수 있었다.
프로피오니박테리아의 섭취와 관련한 잇점이 또한, 건강한 사람에 대해 수행된 생체내 조사에 의해 확인되었다.
9 - 건강한 사람에서의 장 통과에 대한 프로피오니박테리아의 섭취 효과에 대한 연구
본 연구는 일련의 건강한 남성 지원자 19명에 대해 Caen의 대학 병원에서 병원 환경으로 수행되었다.
이 시험 초기에, 각 지원자에게 10 방사능-불투명 마커를 공급하여 연속 8일간 하기 문헌에 기술된 절차에 따라서 흡수시킨다: Arhan P, Devroeds G, Jehannin B et al. Dis Colon Rectum 1981; 24: 625-9 및 Bouchoucha M, Devroede G. Arhan P et al. Dis Colon Rectum 1992; 35; 773-82.
상기 절차에 따라서, 복측 화상에 분산되어 있는, 복부강의 상이한 영역에 섭취된 방사능-불투명 마커를 계수하여 통과 연구를 수행한다. 이들 영역 (우측 결장, 좌측 결장 및 S상 결장)은 5번째 요추를 골반강의 윤곽에 연결하는 화상 라인으로 구획한다. 통과 시간은 다음식에 따라서 계산한다.
T = 1/N. n - △t; N은 마커 10개와 대등하고, n은 영역에서 계수된 마커의 수를 나타내며 △t는 24시간과 대등하다.
섭취후, 즉 9일째 되는 날, 지원자들에게 준비없이 복측 배의 방사선 사진을 찍는다.
다음날 부터, 즉, 10일째 되는 날부터, 각 지원자에게 2주간 매일 젤라틴 캡슐을 섭취시키는데, 상기 캡슐은 치즈제조 공업에서 사용되어, 사람에게 전혀 해가 없는 균주 은행으로부터 수득한 5x1010마리의 프로피오니박테리아를 함유한다.
1차 연구와 유사한 통과 시간의 2차 연구는 프로피오니박테리아를 섭취한 두번째 주중에, 즉 17일째 부터 26일째 까지 수행한다.
본 연구로 좌측 결장의 통과 시간이 확실이 감속되며 (p < 0.05; Wilcoxon Matched-Paired Signed-Ranks statistical test에 따름); 우측 결장 및 S상 결장의 통과 시간은 프로피오니박테리아의 섭취에 의해 크게 변화되지 않는 것이 밝혀졌다.
따라서 본 연구는 프로피오니박테리아의 섭취가 장의 운동성에 영향을 준다는 것이 입증되었으며; 이들 결과는 프로피오니박테리아에 의한 산화질소의 합성과 관련된 것임을 추정할 수 있다.
사람 또는 동물의 소화관에서 산화질소를 방출시킬 수 있는 프로피오니박테리아를 함유하는 본 발명의 피흡수성 조성물을 통하여 산화질소의 유익한 역할에 대해, 상기 생산량을 특히 천연 경로의 식품 대사작용을 사용하여 증가시킬 수 있다.
Claims (12)
- 사람 또는 동물의 소화관중으로 생리학적으로 현저한 양의 산화질소를 방출시킬 수 있는 피흡수성 식품 조성물 또는 피흡수성 식이 또는 의약 조성물을 생산하기위한 프로피오니박테리아의 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물이 탈수 제제로 이루어져 있음을 특징으로하는 것의 용도.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물이 조절식으로 흡수할 필요가 있는 세균의 투여량을 함유하는 각 분획의 형태임을 특징으로하는 것의 용도.
- 제3항에 있어서, 각각의 분획이 109마리 이상의 세균을 함유함을 특징으로하는 것의 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물이 발효되거나 발효되지 않은 액체 제제로 이루어져 있음을 특징으로하는 것의 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물이 정교한 제제로, 프로피오니박테리아가 치즈 또는 식이 섬유와 같은 식품중에 첨가되거나 혼입되어 있음을 특징으로하는 것의 용도.
- 550 μM 질산염을 함유하는 YEL 배지 ㎖ 당 1 ㎍ 이상의 산화질소를 방출하고(하거나) 축적시킬 수 있는 능력의 기능으로 선택된 프로피오니박테리아를 다량, 바람직하게는 109개 세포/g 함유하는 제제로 이루어져 있음을 특징으로하는 피흡수성 식이 또는 의약 조성물.
- 제7항에 있어서, 피. 아시디프로피오니치 (P. acidipropionici)종의 균주 TL223, CNRZ80, CNRZ86 및 NCDO1072 중 1종 이상에 속하는 프로피오니박테리아를 함유함을 특징으로하는 조성물.
- 제8항에 있어서, 피. 아시티프로피오니치 종의 균주 TL223에 속하는 프로피오니박테리아를 함유함을 특징으로하는 조성물.
- 제8항에 있어서, 균주 CNRZ80에 속하는 프로피오니박테리아를 함유함을 특징으로하는 조성물.
- 제7항에 있어서, 피. 프로이덴라이치 (P. freudenreichii) 종의 균주 ITG23, CNRZ81, CNRZ89, CNRZ277 및 LS2502중 1종 이상에 속하는 프로피오니박테리아를 함유함을 특징으로하는 조성물.
- 제7항 내지 11항 중 어느 한항에 있어서, 비피도박테리아 및(또는) 유산균과 같은 다른 세균을 또한 함유함을 특징으로하는 조성물.
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