PL185312B1 - Tiopodstawione peptydy, zawierające je środki farmaceutyczne i ich zastosowanie - Google Patents

Abstract

1. T iopodstaw ione peptydy, bedace zw iazkam i o w zorze ogólnym (I): w którym : R 1 oznacza C 1 -7 alkil lub grupe C 1 -6 alkilo-SR 9, gdzie R 9 oznacza H lub C 1 -4 alkil; R 2 oznacza atom w odoru lub C 1 -6 alkil; R 3 oznacza C 1 -6 alkil; X oznacza grupe -C O -N H -C 1 -6 alkil; R7 oznacza w odór lub grupe C 1 -4 -alkil-CO-; R 8 i R 1 6 sa takie sam e lub rózne i kazdy z nich niezaleznie oznacza C 1 -4 alki)-R 1 1 , przy czym R 1 6 m oze takze oznaczac H; R 11 oznacza grupe -N H -C O -C 1 -4 alkil-N (R 2 ) 2 lub grupe o wzorze: w którym q oznacza 0 lub 1, a R 2 m a znaczenie podane powyzej; oraz ich sole. 4. Srodek farm aceutyczny do zastosow ania w terapii, zn am ien n y tym , ze zaw iera zw iazek okreslony w zastrzezeniu 1 jak o substancje czynna, i dopuszczalny farm aceutycznie rozcienczalnik lub nosnik. 5. Z astosow anie zw iazku okreslonego w zastrzezeniu 1 do wytw arzania srodka leczniczego przeznaczonego do leczenia lub zapobiegania stanu chorobow ego zw iazanego z m etaloproteinazam i z substancji m iedzykom órkow ej lub w yw olyw anego przez TN Fa lub enzymy odpow iedzialne za wydalanie L-selektyny. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowa klasa pochodnych peptydowych i ich zastosowanie w medycynie, związki te są inhibitorami metaloproteinaz i uwalniania TNF.

Metaloproteinazy (MMP), kolagenaza (fibroblastów ludzkich), żelatynaza i czynnik martwicy guza (TNF) oraz sposoby ich działania, a także ich inhibitory i ich działanie kliniczne ujawniono w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO-A-9611209.

W tkankach normalnych, komórkowej syntezie tkanki łącznej towarzyszy proces pozakomórkowej degradacji matriksu (substancji międzykomórkowej); oba te przeciwstawne efekty występują w stanie równowagi dynamicznej. Degradacja matriksu jest wynikiem działania proteinaz uwalnianych z istniejących komórek tkanki łącznej i wnikających komórek zapalnych i wiąże się, po części, z aktywnością przynajmniej czterech grup metaloproteinaz. Są nimi kolagenazy (kolagenaza śródmiąższowa, mMP-1; kolagenaza PMN, MMP-8, kolagenaza-3, MMP 13), żelatynazy (żelatynaza A, MMP-2, 72kDa-żelatynaza, kolagenaza typu IV; żelatynaza B, MMP-9, 92kDa-żelatynaza, kolagenaza typu IV) i stromelizyny (proteoglikana4

185 312 za, MMP-3, stromelizyna-1, tranzyna, stromelizyna-2, MMP:10, stromelizyna-3, MMP:11). Normalnie, działanie tych enzymów katabolicznych jest ściśle regulowane na poziomie ich syntezy i wydzielania jak również na poziomie aktywności pozakomórkowej. W tym drugim przypadku aktywność ich regulowana jest poprzez działanie specyficznych inhibitorów, takich jak TIMP (tkankowe inhibitory metaloproteinaz), które wytwarzają z metaloproteinazami nieaktywne kompleksy, a także przez działanie bardziej wszechstronnych inhibitorów proteinaz, jakimi są a2-makroglobuliny.

Przyśpieszony, niekontrolowany rozpad tkanki łącznej poprzez katalizowaną przez metaloproteinazy resorpcję pozakomórkowej matriksu jest cechą charakterystyczną wielu stanów patologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie stawów i kości, septyczne zapalenie stawów, owrzodzenia rogówki, naskórka lub żołądka; inwazja lub przerzuty guzów; choroba okołozębowa, białkomocz, zakrzepica naczyń wieńcowych związana z pękaniem płytek miażdżycowych i choroby kości. Zastrzegane tutaj inhibitory mogą być również przydatne w zapobieganiu stanom patologicznym występującym po urazach i mogącym prowadzić do całkowitego inwalidztwa. Związki te mogą stać się również narzędziem w regulacji urodzin przez zapobieganie owulacji lub zagnieżdżaniu zarodka. Przypuszcza się, że patogenezę powyższych chorób można zapewne modyfikować korzystnie podając inhibitory metaloproteinaz i zasugerowano możliwość zastosowania w tym celu szeregu związków: [ogólna praca przeglądowa, patrz R.C. Wahl i in. Ann. Rep. Med. Chem. 25:175-184, Academic Press Inc., San Diego (1990)].

Opisano szereg małych peptydopodobnych związków hamujących metaloproteinazy. Zapewne najważniejszymi z nich są te, które związane są z enzymem przekształcającym angiotensynę (ACE) gdyż blokują one przekształcenie dekapeptydu angiotensyny I w angiotensynę II - silny czynnik presyjny. Związki tego typu opisane są w EP-A-0012401. Pokrewne pochodne merkaptoamidopeptydowe wykazuj również aktywność hamowania ACE in vitro i in vivo (H.N. Weller i in. (1984), Biochem. Biophys. Res. Comm. 125, (l):82-89).

TNFa jest cytokiną, wytwarzaną początkowo jako związany z komórką prekursor o masie 28kD. Uwalnia się on następnie w aktywnej formie 17kD (D-M. Jue i in., (1990) Biochemistry, 29:8371-8377), która pośredniczy w wystąpieniu wielkiej liczby niszczących efektów in vivo. Po podaniu zwierzętom lub ludziom wywołuje ona stan zapalny, gorączkę, efekty sercowo-naczyniowe, krwotok, koagulację i odpowiedź ostrej fazy podobne do obserwowanych podczas ostrych zakażeń i stanów wstrząsu. Ciągłe podawanie wywołuje również wyniszczenie i jadłowstręt. Nadmierne gromadzenie się TNFa może być śmiertelne.

Badania na modelach zwierzęcych dostarczają poważnych dowodów na to, że blokowanie efektów wywoływanych przez TNFa przez specyficzne przeciwciała jest bardzo cenne przy ostrych zapaleniach, stanach wstrząsu, reakcjach przeszczep-biorca i chorobach autoimmunologicznych. TNFa stanowi również wewnątrzwydzielniczy czynnik wzrostu w przypadku pewnych szpiczaków i chłoniaków i może działać jako inhibitor normalnego procesu krwiotwórczego u pacjentów z tymi nowotworami.

Oczekuje się więc, że zapobieganie wytwarzaniu lub działaniu TNTa może stanowić silne narzędzie terapeutyczne w leczeniu wielu stanów zapalnych, zakażeń, chorób immunologicznych lub złośliwych. Obejmują one, choć nie stanowi to ograniczenia, wstrząs septyczny, wstrząs hemodynamiczny, i zespół zakażenia ogólnego (posocznica) (Mathison i in. (1988) J. Clin. Invest. 81:1925-1937; Miethe i in. (1992), J. Exp. Med. 175:91-98), uszkodzenia reperfuzyjne w następstwie niedotlenienia, malaria (Grau i in. (1989), Immunol. Rev. 112:49-70), zakażenie mykobakteriami (Barnes i in. (1992) Infect. Imm. 60:1441-6), zapalenie opon mózgowych, łuszczyca, prawokomorowa niewydolność krążenia, choroby tkanki włóknistej, wyniszczenie, odrzucanie przeszczepu, rak, choroby autoimmunologiczne, artretyzm reumatoidalny, stwardnienie rozsiane, uszkodzenia popromienne, stany toksyczne po podawaniu immunosupresyjnych przeciwciał monoklonalnych takich jak OKT3 lub CAMPATH-1 i uszkodzenia pęcherzyka płucnego.

Aktualne działania kliniczne skierowane przeciw TNFa polegają na stosowaniu kortykosteroidów takich jak deksametazon oraz cyklosporyny-A lub FK506, które są niespecyficznymi inhibitorami transkrypcji genu cytokiny. Wykazano, że inhibitory fosfodiesterazy, takie

185 312 jak pentoksyfilina, są bardziej specyficznymi inhibitorami transkrypcji genu TNFa (Endres S. (1991) Immunol. 72:56-60, Schandene i in. (1992) Immunol. 76:30-34, Algre M.L. i in. (1991) Transplantation 52:674-679, Bianco i in. (1991) Blood 78:1205-1221). Wykazano, że również talidomid hamuje wytwarzanie TNFa przez leukocyty (Sampajo i in. (1991), J. Exp. Med. 173:669-703). W toku badań eksperymentalnych wykazano, że skutki działania TNFa są specyficznie hamowane przez przeciwciała monoklonalne anty-TNFa, rozpuszczalne receptory TNF i połączenia rozpuszczalne receptory TNF/immunoadhezyny (Bagby i in. (1991) J. Infect. Dis. 163:83-88, Charpentier i in. (1991) Presse-med.20: 2009-2011, Silva i in. (1990) J. Infect. Dis. 162:421-427, Franks i in. (1991) Infect. Immun. 59:2609-2614, Tracey i in. (1987) Nature 330:662-664, Fischer i in. (1992) PNAS USA w druku, Lesslauer i in. (1991) Eur. J. Immunol. 21:2883-2886, Ashkenazi i in. (1991) PNAS USA 88:10535-10539).

Ostatnio wykazano, że w efektach wywoływanych przez TNF pośredniczą dwa peptydy TNFa i TNFp. Aczkolwiek peptydy te wykazują jedynie 30% homologię w swojej budowie, aktywują. one te same receptory i są kodowane przez bezpośrednio sąsiadujące ze sobą geny. Dlatego też stosowany tutaj termin czynnik martwicy guza lub TNF oznacza czynnik martwicy guza a i peptydy, które wykazują bądź wysoki stopień homologii sekwencji z TNFa, lub zasadnicze podobieństwo w wywoływanych efektach fizjologicznych do TNFa, jak na przykład TNFp.

Jednym z celów niniejszego wynalazku jest dostarczenie związków, które w istotny sposób hamują uwalnianie TNF z komórek i mogą być w związku z tym stosowane w zwalczaniu stanów wywoływanych przez TNF. Zastosowania takie obejmują, choć nie stanowi to ograniczenia, leczenie stanów zapalnych, gorączki, efektu sercowo-naczyniowego, krwotoku, koagulacji i odpowiedzi ostrej fazy, wyniszczenia i jadłowstrętu, ostrych zakażeń, stanów wstrząsu, reakcji przeszczep-biorca i chorób autoimmunologicznych.

Stwierdzono, że związki wykazujące właściwość hamowania działania metaloproteaz zaangażowanych w rozpad tkanki łącznej, takich jak kolagenaza, stromelizyna i żelatynaza, hamują uwalnianie TNF zarówno in vitro jak i in vivo. (A.J.H. Gearing i in. (1994) Nature, 370:555-557; G.M. McGeehan i in. (1994) Nature, 370:558-561; WO 93/20047). Wszystkie inhibitory o których donoszono zawieraj ą grupę kwasu hydroksamowego wiążącą cynk.

Dla znawców dziedziny jest zrozumiałym, że duże podobieństwo pomiędzy kolagenazą ludzkich fibroblastów, stromelizyną i żelatynazą stwarza taką sytuację, że enzymy hamujące jeden enzym będą również hamować w pewnym stopniu wszystkie pozostałe.

Związki hamujące kolagenazę objęte są opisami patentowymi USA nr 4,511,504 z 16 kwietnia 1985 i USA nr 4,568,666 z 4 lutego 1986.

Związki o pokrewnej budowie zastrzeżone jako inhibitory stromelizyny (proteoglikanazy) objęte są opisem patentowym USA nr 4,771,037 z 13 września 1988.

Uważa się, że inhibitory stromelizyny i kolagenazy posiadają zdolność zapobiegania uszkodzeniu chrząstki stawowej związanemu z septycznym zapaleniem stawów. Zakażenie stawów przez bakterie może wywołać odpowiedź zapalną, która się utrwali poza granicę usuwalności czynnika zakażającego i doprowadzi do trwałego uszkodzenia składników strukturalnych. W badaniach modelowych na zwierzętach stosuje się czynniki bakteryjne aby wywołać odpowiedź artretycznai pojawienie się aktywności proteolitycznej (patrz J. P. Case i in. (1989) J. Clin. .Invest., 84:1731-40; R.J. Williams i in. (1990) Arth. Rheum. 33:533-41).

Uważa się również, że inhibitory stromelizyny, kolagenazy i żelatynazy będą przydatne w zwalczaniu przerzutów nowotworów, ewentualnie w kombinacji z bieżącą chemioterapią i/lub leczeniem naświetlaniami. Patrz L.M. Matrisian i in. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:9413-7; S.M. Wilhelm i in. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:6725-29; Z. Werb i in. (1989), J. Cell. Biol. 109:872-889; L.A. Liotta i in. (1983), Lab. Invest. 49:636-649; R. Reich i in. w „Metatesis”, Ciba Foundation Symposium, Wiley, Chicester, 1988 str. 193-210).

Wydzielane proteinazy takie jak stromelizyna, kolagenaza i żelatynaza odgrywają ważną rolę w procesach związanych z przemieszczaniem się komórek podczas inwazyjnych przerzutów nowotworu. Istotnie, istnieją dowody wskazujące, że w pewnych liniach komórkowych nowotworów przerzutowych zachodzi nadekspresja metaloproteinaz substancji międzykomórkowej. W tym kontekście, enzym działa penetrując pod błonami podstawnymi i po6

185 312 zwalając uciec komórkom nowotworowym z miejsca ich pierwotnego powstania i włączyć się do krążenia. Po przylgnięciu do ścian naczyń krwionośnych komórki nowotworowe wykorzystują te same metaloproteinazy do przebicia błon podstawnych i w ten sposób penetrują inne tkanki, wywołując przerzuty. Hamowanie tych procesów zapobiegałoby przerzutom i poprawiłoby efektywność aktualnie stosowanego leczenia chemioterapią i/lub naświetlaniami.

Inhibitory te powinny znaleźć również zastosowanie w leczeniu chorób okołozębnych, takich jak ropne zapalenie dziąseł. Z fibroplastów zakażonych dziąseł izoluje się aktywności odpowiadające zarówno kolagenazie jak i stromelizynie (V.J. Uitto i in. (1981) J. Periodontal. Res., 16:417-424). Poziomy enzymów daje się skorelować ze stopniem zaawansowania choroby dziąseł; C.M. Overall i in. (1987), J. Periodontal. Res., 22:81-88).

Procesy proteolityczne obserwuje się również przy owrzodzeniach rogówki spowodowanych oparzeniami alkaliami (S.I. Brown i in. (1969), Arch. Opthalmol. 81:370-373). Peptydy zawierające grupę merkaptanową hamują kolagenazę wyizolowaną z poparzonej alkaliami rogówki królika (F.R. Burns i in., Invest. Ophthalmol., 30:1569-1575). Leczenie poparzonych alkaliami oczu, lub oczu z owrzodzeniami rogówki wynikającymi z zakażeń, za pomocą inhibitorów tych metaloendoproteinaz w połączeniu z cytrynianem sodu lub askorbinianem sodu i/lub środkami przeciwbakteryjnymi efektywnie zapobiega rozwojowi degradacji rogówki.

Stromelizyna jest zaangażowana w proces degradacji składników strukturalnych kłębuszkowatej błony podstawnej (GMB) nerki, której główną funkcją jest hamowanie przepływu białek osocza do moczu (W.H. Baricos i in. (1989), Biochem. J., 254:609-612). Białkomocz (proteinuria), jest wynikiem schorzenia kłębuszków i objawia się wystąpieniem nadmiaru białka w moczu spowodowanego zwiększoną przepuszczalnością białek osocza przez GMB. Nieznane są przyczyny powodujące wzrost przepuszczalności GMB lecz proteinazy, w tym stromelizyna, odgrywają ważną rolę w chorobach kłębków nerkowych. Hamowanie tego enzymu może łagodzić skutki białkomoczu związanego ze złym funkcjonowaniem nerki.

Sugeruje się, że hamowanie aktywności stromelizyny może zapobiegać miażdżycowemu pękaniu płytek miażdżycowych, prowadzącemu do zakrzepu naczyń wieńcowych. Rozrywanie lub pękanie płytek miażdżycowych jest najczęstszym zdarzeniem rozpoczynającym wystąpienie zakrzepu naczyń wieńcowych. Zaproponowano mechanizm tłumaczący, że pękanie płytek spowodowane jest przez destabilizację i degradację matriksu tkanki łącznej otaczającej te blaszki przez enzymy proteolityczne i cytokiny uwalniane przez infiltrujące komórki zapalne. Takie rozrywanie płytek może powodować gwałtowne wydarzenia zakrzepowe, gdyż krew szybko wypływa z naczyń krwionośnych. W indywidualnych komórkach w płytkach miażdżycowych wydobytych z serca pacjenta w trakcie operacji transplantacji stwierdzono wysoki poziom odpowiadającego stromelizynie informacyjnego RNA (A. M. Henney i in. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8154-8158). Hamowanie stromelizyny przez te związki może pomóc w zapobieganiu lub opóźnianiu degradacji matriksu tkanki' łącznej, która stabilizuje płytki miażdżycowe, zapobiegając w ten sposób rozwojowi zdarzeń prowadzącemu do ostrej zakrzepicy naczyń wieńcowych.

Ostatnio wykazano w modelu zastoinowej niewydolności serca (CHF) u świń, że podczas CHF zachodzą istotne zmiany w strukturze morfologicznej serca. Rozszerzenie przedsionków i pocienienie ścianek spowodowane przez zmiany w matriksie zewnątrzkomórkowym powoduje zmniejszenie połączeń kolagenowych między kardiomiocytami i zmniejszenie całkowitej ilości kolagenu. W takim przypadku słabsza siła skurczu prowadzi do niefektywnego działania przedsionków. Uważa się, że specyficzne inhibitory metaloproteinaz matriksu będą odgrywać kluczową rolę w stabilizacji matriksu zewnątrzkomórkowego i będą zatem miały znaczenie w leczeniu i/lub zapobieganiu CHF.

Ostatnio wykazano (WO 96/0240), że inhibitory metaloproteinaz matriksu, takie jak kolagenaza i stromelizyna, hamują także tworzenie ludzkiego rozpuszczalnego CD23. CD23 jest integralnym białkiem 45 kDa typu II, którego ekspresja przebiega na powierzchni różnych dojrzałych komórek, w tym limfocytów B i T, makrofagów, komórek NK, komórek Langerhansa, monocytów, eozynofili i płytek (Delespesse i współpr., (1991), Adv. Immunology, 49:149; Grangette i współpr. (1980), J. Immunol, 143:3580). Rozpuszczalnemu ludzkiemu

185 312

CD23 przypisuje się kilka aktywności, wszystkie związane z regulacją IgE. Poszczególne aktywności to:

i) prezentacja antygenu ii) cytotoksyczność eozynofilowa mediowana przez IgE iii) zasiedlanie się komórek B w gruczołach limfatycznych i śledzionie iv) regulacja syntezy IgE.

Zatem cała nadprodukcja rozpuszczalnego CD23 powoduje nadprodukcję IgE, będąca cechą chorób alergicznych, takich jak astma zewnątrzpochodna, katar sienny, alergiczne zapalenie spojówek, wyprysk, atopowe zapalenie skóry i anafilaksja (Sutton i współpr., (1993), Nature, 366:421). Podwyższone poziomy rozpuszczalnego CD23 obserwowano także w osoczu pacjentów cierpiących na przewlekłą białaczkę limfoblastyczna B (Safarti i współpr., (1988), Blood, 71:94) oraz wpłynie maziowym pacjentów cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów (Chomarat i współpr., (1993), Arthritis and Rheumatism, 36:234).

Ostatnie doniesienia sugerują, że nowe enzymy z rodziny MMP również uczestniczą w wydalaniu cząsteczek adhezyjnych, takich jak selektyny, na przykład L-selektyna. Te rozpuszczalne cząsteczki adhezyjne odgrywają rolę w wielu chorobach, w tym raku, chorobach autoimmunologicznych i odpowiedzi zapalnej. Zaproponowano, że po rozszczepieniu selektyna wiąże się z poszczególnymi Ugandami, co przyczynia się do ich czynności biologicznej. Zatem leki oddziaływujące na wiązanie ligandów lub zapobiegające wiązaniu ligandów do selektyn będą stanowić użyteczne leki do leczenia wielu chorób opisanych powyżej. Zatem dalszym celem wynalazku jest dostarczenie związków hamujących wydalanie niektórych cząsteczek adhezyjnych i przez to zapewnienie leku do leczenia lub profilaktyki zaburzeń takich jak rak, choroby autoimmunologiczne lub choroby zapalne (takie jak zapalna choroba jelit i stwardnienie rozsiane).

Uważa się również, że specyficzne inhibitory stromelizyny i kolagenazy powinny stać się przydatne jako czynniki regulacji urodzin. Istnieją dowody na to, że obserwuje się nadekspresję metaloproteinaz, w tym stromelizyny i kolagenazy, w niezapłodnionych jajach i zygotach i w dalszych stadiach rozszczepiania i ich wzrost w stadium blastocysty rozwoju zarodka i przy różnicowaniu endodermalnym (C.A. Brenner i in. (1989), Genes & Develop., 3:848-59). Przez analogię do inwazji nowotworowej, w zarodku może zachodzić ekspresja metaloproteinaz, penetrujących zewnątrzkomórkowy matriks ściany macicy podczas zagnieżdżania. Hamowanie stromelizyny i kolagenazy na tych wczesnych etapach rozwoju powinno zapewne zapobiec normalnemu rozwojowi embrionalnemu i/lub zagnieżdżeniu zarodka w macicy. Taka interwencja stanowiłaby nową metodę regulacji urodzin. Ponadto istnieją dowody na to, że kolagenaza jest ważna w procesach owulacji. W tym przypadku, kolagenowa otoczka wierzchołkowego regionu pęcherzyka musi zostać spenetrowana aby jajeczko mogło uciec. W procesach tych wykryto obecność kolagenazy i stwierdzono, że inhibitor efektywnie hamował jajeczkowanie (J.F. Woessner i in. (1989), Steroids, 54:491-499). Aktywność stromelizyny może również odgrywać rolę podczas jajeczkowania (C.K.L. Too i in. (1984), Endocrin. 115:1043-1050).

Aktywność kolagenazy i stromelizyny zaobserwowano również w zaburzeniach pęcherzykowego oddzielania naskórka (A. Kronberger i in. (1982), J. Invest. Dermatol., 79:208-211; D. Sawamura i in. (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 184:1003-8). Hamowanie metaloendoproteinaz powinno również hamować szybką destrukcję tkanki łącznej skóry.

Oprócz degradowania komponentów strukturalnych tworzących matriks pozakomórkowy stromelizyna może degradować in vivo inne substraty, w tym inhibitory cai-proeeinaz i wpływać w ten sposób na aktywności innych proteinaz jak np. elastyny (P.G. Winyard i in. (1991) FFES Leet., 227:1:91-94). Hamowanie meetaoendoproteenaa nmariksu moóe wzmaaaa aktywność przeciwproteinazową tych endogennych inhibitorów.

Z ostatnich publikacji wynika, że zidentyfikowano szereg nowych enzymów z grupy

MMP; niektóre z nich mogą odgrywać ważną rolę w chorobach. Kolagenaza 3, enzym specyficzny dla komórek nowotworowych raka piersi może znaleźć zastosowanie w leczeniu raka piersi (J.M.P. Freije i in. (1994), J. Biol. Chem. 269(24): 16766-16773), podczas gdy MTMMP, inny członek rodziny MMP okazał się kluczowym enzymem w aktywowaniu żelatyna8

185 312 zy A (H. Sato i in. (1994) Naturę, 370:61-65). Żelatynaza A jest ważnym enzymem z punktu widzenia wzrostu i przerzutów nowotworów (jak to omówiono powyżej).

Stwierdzono, że degradacja prekursorowego białka β-nmyloiaowegh (APP) prowadzi do wytwarzania płytek amyloiahwych, będących głównym składnikiem płytek amyloidowych, znalezionych u pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera (AD). Dwie ostatnie publikacje donoszą o zidentyfikowaniu enzymów metnloproteinnz, rozszczepiających APP do płytek nmyloiaowyyy (C.R. Abraham i in. (1994), Biochemistry, 33:192-199; G. Huber i in. (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun. 201 (Ο):45-53).

Dla znawców dziedziny jest zrozumiałym, że znaczna homologia pomiędzy tymi nowymi enzymami, a innymi enzymami typu metnloproteinaz (MMP) stwarza możliwość, że związek hamujący jeden enzym może w pewnym stopniu hamować te nowe enzymy. Dlatego inhibitory objęte niniejszym wynalazkiem mogą być przydatne w leczeniu chorób, których przebieg związany jest z tymi nowymi enzymami.

Tak więc, dalszym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie związków, które oprócz hamowania uwalniania TNF, hamują również działanie metaloproteinaz (MMP), i mogą być zatem stosowane w leczeniu pacjentów dotkniętych chorobami wywoływanymi przez TnF i/lub MMP.

Następnym celem wynalazku jest zatem dostarczenie związków, które hamują tworzenie ludzkiego rozpuszczalnego CD23, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zaburzeń takich jak alergia i choroby authimmuyologiczye, w których przebiega nadprodukcja rozpuszczalnego CD23, takich jak związki opisane poniżej.

Wynalazek obejmuje nowe związki merkaptoalkilopeptydowe o wzorze (I), które są użytecznymi inhibitorami chorób phwodownoycy przez metaloproteinazy matriksu i/lub TNFa, w tym chorób destrukcyjnych (tak jak je zdefiniowano powyżej i w WO-A-96/11209) i pewnych yhwhtwhrów.

Przedmiotem wynalazku są tihphdstawione peptydy, będące związkami o wzorze ogólnym (I):

w którym:

R1 oznacza C1_7alkil lub grupę C’--sialYilt^^SR'’, gdzie R9 oznacza H lub .Malkil; r2 oznacza atom whahru lub C’.alkil;

R3 oznacza CR .alkil;

X oznacza grupę -CO-NH-CLalkil;

R7 oznacza wodór lub grupę Clc-alkil-CO[;

R⁸ i R’6 są takie same lub różne i każdy z nich niezależnie oznacza C’.alkil-R’¹, przy czym R¹⁶ może także oznaczać H;

R¹1 oznacza grupę -NH[CO-Clcalkii-N(R-)- lub grupę o wzorze:

(O)q

185 312 w którym q oznacza 0 lub 1, a R ma znaczenie podane powyżej;

oraz ich sole.

Jest zrozumiałe, że związki według wynalazku zawierają jeden lub większą ilość podstawionych asymetrycznie atomów węgla, na przykład atomy węgla zaznaczone gwiazdką we wzorze (I). Obecność jednego lub większej liczby centrów asymetrycznych w związku o wzorze (I) prowadzi do wystąpienia stereoizomerii; należy rozumieć, że w każdym przypadku wynalazek obejmuje wszystkie takie stereoizomery w tym enancjomery i diastereoizomery, mieszaniny, wśród nich także mieszaniny racemiczne.

Zastosowany w przedstawianym opisie, pojedynczo lub w kombinacji, termin „Ci-7alkil” oznacza prosty lub rozgałęziony łańcuch alkilowy zawierający od jednego do siedmiu atomów węgla i obejmuje na przykład metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, t-butyl, pentyl, heksyl i tym podobne. Termin „Ci_6alkil” oznacza taki sam łańcuch, mający do sześciu atomów węgla, na przykład heksyl, „Ci-talkil” oznacza taki sam łańcuch, mający do czterech atomów węgla, na przykład butyl lub t-butyl.

Terminy „chroniona grupa aminowa” i „chroniona grupa karboksylowa” oznaczają, że grupy aminowe i karboksylowe są chronione (zabezpieczane) sposobami znanymi znawcom dziedziny. Na przykład, grupę aminową można zabezpieczać grupami benzyloksykarbonylową, tert-butoksykarbonylową, aeetylowąi podobnymi lub w formie ftalimidowej i podobnymi. Grupę karboksylową można zabezpieczać w postaci łatwo rozszczepialnego estru jak ester metylowy, etylowy, benzylowy lub tert-butylowy.

Sole związków o wzorze (I) obejmują sole dopuszczalne farmaceutycznie, na przykład sole addycyjne z kwasami nieorganicznymi i organicznymi takie jak chlorowodorki, bromowodorki, p-toluenosulfoniany, fosforany, siarczany, nadchlorany, octany, trifluorooctany, propioniany, cytryniany, maloniany, bursztyniany, mleczany, szczawiany, winiany i benzoesany.

Można również utworzyć sole z zasadami. Wśród takich soli znajdują się sole wywodzące się z zasad nieorganicznych lub organicznych, na przykład sole metali alkalicznych jak sole magnezowe lub wapniowe, sole z aminami organicznymi takimi jak morfolina, piperydyna, dimetyloamina lub dietyloamina.

Jeśli „chronioną grupą karboksylową” w związku według wynalazku jest zestryfikowaną grupa karboksylowa, to może to być labilny metabolicznie ester o wzorze CO2RI⁷, gdzie R ¹'oznacza grupę etylową, benzylową, fenetylową, fenylopropylową, a- lub β-naftylową, 2,4-dimetylofenylową, 4-tert-butylofenylową, 2,2,2-trifluoroetylową, i -(benzyloksy)benzylową, 1-(benzyloksy)etylową, 2-metylo-I-propionyloksypropylową, 2,4,6-trimetylobenzyloksymetylową lub piwaloiloksymetylową.

Związki o wzorze ogólnym (I) można wytworzyć dowolną odpowiednią znaną w dziedzinie metodą i/lub według następujących procesów. Należy rozumieć, że tam gdzie pożądane jest wytworzenie określonego stereoizomeru o wzorze (I), należy w opisanych tutaj procesach syntetycznych stosować homochiralny materiał wyjściowy i/lub powstające izomery wydzielać z mieszanin za pomocą konwencjonalnych technik rozdzielczych (np. HPLC).

Związki według wynalazku wytwarza się w następujących procesach. W poniższym opisie i wzorach oznaczenia grup Ri, R², R³, R⁴, R⁷, R⁸, R ^ιζ R¹⁶ są, jeśli nie zaznaczono inaczej, takie jak zdefiniowano powyżej dla wzoru (I). Należy rozumieć, że jeśli jest pożądane aby grupy funkcyjne, takie jak aminowe, hydroksylowe i karboksylowe obecne w różnych opisanych poniżej związkach pozostały zachowane, to występuje konieczność ich zabezpieczania przed każdą rozpoczynaną reakcją. W takich przypadkach usunięcie grupy ochronnej może być końcowym etapem reakcji. Odpowiednie grupy zabezpieczające dla tych funkcji są jasne dla znawców dziedziny. Odnośnie szczegółowych danych patrz „Protective Groups in Organie Synthesis”, Wiley Interscience, T.W. Greene, PGM Wuts.

Tak więc sposób wytwarzania związków o wzorze ogólnym (I) polega na usunięciu zabezpieczenia (na przykład poprzez hydrolizę) w związku o wzorze ogólnym

R⁷S-CHR8-CO-NR^|6-CHR¹-CO-NR2-CHR3-X (II),

185 312 gdzie R⁷ oznacza odpowiednią grupę ochronną (na przykład t-butyl, trityl, benzoli lub acetyl), a R¹, R², R⁸, R¹¹, r1 są takie jak zdefiniowano powyżej dla wzoru (I).

Należy rozumieć, że w przypadku konieczności uzyskania konkretnego określonego stereoizomeru o wzorze (I) można zastosować konwencjonalne techniki rozdzielcze takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Można jednak w celu otrzymania określonego stereoizomeru o wzorze (I), jeśli jest to korzystniejsze, wziąć do reakcji sprzęgania odpowiednie homochiralne materiały wyjściowe. Zostanie to zilustrowane poniżej przykładami.

Związki pośrednie o wzorze ogólnym (ID otrzymuje się w reakcji sprzęgania kwasu o wzorze R7S-CHR⁸-COOH (III), gdzie R7 i R^są jak zdefiniowano powyżej, lub aktywnej pochodnej tego kwasu, z aminą o wzorze

R¹⁶NH-CHR’-CO-NR2-CHR³-X (IV).

Aktywnymi pochodnymi kwasów o wzorze (III) są na przykład bezwodniki kwasowe lub halogenki kwasowe takie jak chlorki kwasowe.

Reakcję sprzęgania przeprowadza się w warunkach standardowych dla tego typu reakcji aminowania. I tak, reakcję można prowadzić w rozpuszczalniku, np. w obojętnym rozpuszczalniku organicznym takim jak eter np. eter cykliczny jak tetrahydrofuran, amid, np. podstawiony amid jak dimetyloformamid lub w takim jak halogenowany węglowodór jak dichlorometan, w niskiej temperaturze np. w przedziale od -30°C do temperatury otoczenia, np. od -20°C do 0°C, ewentualnie w obecności zasady np. zasady organicznej takiej jak amina np. trietyloamina lub cykliczna amina jak N-metylomorfolina. Gdy do reakcji bierze się kwas (HI), reakcję można prowadzić ponadto w obecności czynnika kondensującego, na przykład diimidu takiego jak jak N,N'-dicykloheksylokarbododiimid, korzystnie w obecności triazolu takiego jak 1-hydroksybenzotriazol. Alternatywnie przed reakcją z aminą (IV) kwas poddaje się reakcji z chloromrówczanem np. chloromrówczanem etylu.

Aminę o wzorze ogólnym (IV) otrzymuje się poprzez sprzęganie kwasu o wzorze R^1óNH-CHR’-COOH (V) lub jego aktywnej pochodnej z aminą o wzorze r2-NH-CHX-R3 (VI) a następnie usunięcie grup ochronnych.

Aktywnymi pochodnymi kwasów o wzorze (V) są, jak to przedstawiono wcześniej, przykładowo bezwodniki kwasowe lub halogenki kwasowe takie jak chlorki kwasowe.

Aminokwasy i ich pochodne przedstawione wzorami ogólnymi (V) i (VI) otrzymuje się w postaci chiralnej lub racemicznej. W formie chiralnej stanowią one asymetryczne bloki syntetyczne do chiralnej syntezy związków o wzorze ogólnym (I). Wiele z tych pochodnych otrzymuje się łatwo z dostępnych handlowo materiałów stosując znane znawcom w dziedzinie metody. (Patrz „The Practise of Peptide Synthesis”, M. Bodanszky i wsp., Springer Verlag, New York, 1984; W092/21360).

Związki o wzorze ogólnym (II) można otrzymać w reakcji podstawienia nukleofilowego związków o wzorze ogólnym R⁸r'1⁸C-CO-NR¹⁶-Chr1-CO-NR2-CHR3-X (VII), w którym R™ oznacza odpowiednią grupę opuszczającą (np. halogen taki jak brom, lub ester alkilosulfonowy taki jak metanosulfonian) z tiolem o wzorze ogólnym R'SH (VIII), w którym R7 oznacza odpowiednią grupę ochronną (np. tert-butyl lub acetyl), w warunkach standardowych znanych specjalistom w dziedzinie i zobrazowanych przykładowo w WO 90/05719.

Tiole o wzorze ogólnym (VIII) otrzymuje się z dostępnych handlowo materiałów wyjściowych metodami znanymi specjalistom w dziedzinie. Wiele tioli o wzorze ogólnym (VIII) jest również dostępnych handlowo.

Związki o wzorze ogólnym (VII) wytwarza się w reakcji sprzęgania kwasu o wzorze ogólnym Iv R^CH-COOH (IX), gdzie R8 i R¹⁸ mają znaczenia zdefiniowane powyżej (lub jego wersji odpowiednio zabezpieczonej) lub jego aktywnej pochodnej, z aminą o wzorze (IV) w warunkach podobnych do zastosowanych w sprzęganiu opisanym przy wytwarzaniu związków o wzorze (II).

Kwasy karboksylowe o strukturze przedstawionej wzorami ogólnymi (III) i (IX) otrzymuje się w postaci chiralnej lub racemicznej. Wiele z tych pochodnych otrzymuje się łatwo

185 312 z dostępnych handlowo materiałów stosując znane specjalistom w dziedzinie metody (patrz WO 90/05719).

Związki pośrednie o wzorze ogólnym (II) można otrzymać w reakcji sprzęgania kwasu o wzorze

R.7 S-CHR8-CO-NR ¹⁶-CHR'-COOH (X), w którym R¹, R⁷ i R⁸ są jak zdefiniowano powyżej, lub jego aktywnej pochodnej z aminą o wzorze (VI), prowadzonej według poprzednio opisanej procedury.

Kwasy o wzorze ogólnym (X) wytwarza się z kolei przez sprzęganie kwasu o wzorze (III), lub jego aktywnej pochodnej, z aminą o wzorze (VI) gdzie X oznacza OH lub odpowiednio chronioną pochodną, a następnie usunięcie każdej z grup ochronnych.

Aktywnymi pochodnymi kwasów o wzorze (X) są na przykład, jak już wyszczególniono poprzednio, bezwodniki kwasowe lub halogenki kwasowe, takie jak chlorki kwasowe.

Związki o wzorze (I), w którym R¹ oznacza grupę C ^alkilową, można również otrzymać przez uwodornienie (prowadzone w odpowiednim rozpuszczalniku takim jak alkohol np. etanol, stosując pallad na węglu jako katalizator) związku o wzorze (I), w którym R ¹ oznacza grupę C2-6alkenylową. Związki o wzorze (I), w którym R7 jest grupą Ci^alkil-CO poprzez acylowanie (z użyciem odpowiedniego chlorku acylowego Cm-alkil-COCl w obecności zasady takiej jak trietyloamina w odpowiednim rozpuszczalniku takim jak rozpuszczalnik chlorowany np. dichlorometan) związku o wzorze (I), w którym R7 oznacza H.

Każdą z mieszanin produktów końcowych lub związków pośrednich można rozdzielić w znany sposób na czyste produkty końcowe lub związki pośrednie w oparciu o różnice fizykochemiczne składników mieszaniny, np. chromatograficznie, przez destylację, krystalizację frakcjonowaną lub wytwarzanie soli jeśli jest to możliwe lub wskazane.

Związki według wynalazki wykazują in vitro właściwości hamujące w stosunku do enzymów stromelizyny, kolagenazy i żelatynazy. Związki według wynalazku hamują również in vitro uwalnianie TNFa. Aktywność i selektywność działania związków można określać przeprowadzając odpowiednie testy hamowania enzymów, jak to przykładowo opisano w zamieszczonym poniżej przykładzie A i w publikacji WO-A-9611209. W tych samych publikacjach podano inne testy (przykłady B do G), odpowiednie do testowania związków według niniejszego wynalazku.

Wynalazek niniejszy znajduje zastosowanie w leczeniu pacjentów (ludzi i/lub ssaków zwierząt hodowlanych dla celów przemysłu mlecznego, mięsnego i futrzarskiego oraz zwierząt domowych) dotkniętych schorzeniami i chorobami związanymi jak to poprzednio opisano z metaloproteinazami matriksu i/lub TNFa, w szczególności przez podawanie, jako składników aktywnych, inhibitorów metaloproteinaz matriksu o wzorze (I).

Zgodnie z tym, związki o wzorze (I) można stosować, między innymi w leczeniu zapalenia stawów i kości, artretyzmu reumatoidalnego oraz chorób i objawów pochodzących z nadekspresji metaloproteinaz matriksu, takiej jak stwierdzana w liniach komórkowych nowotworów przerzutowych..

Jak wspomniano powyżej, związki o wzorze (I) są przydatne w medycynie ludzkiej lub w weterynarii, ponieważ są one aktywnymi inhibitorami TNFa i metaloproteinaz MMP. W innym aspekcie wynalazek znajduje zatem zastosowanie w postępowaniu (rozumianym jako leczenie lub profilaktyka) w chorobach lub stanach wywoływanych przez TNFa i/lub MMP u ssaków, zwłaszcza u ludzi, polegającym na podawaniu ssakom efektywnej ilości związku o powyżej podanym wzorze (I), lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

Przedmiotem wynalazku jest zatem również zastosowanie związku o wzorze (I) określonego powyżej do wytwarzania środka leczniczego przeznaczonego do leczenia lub zapobiegania stanu chorobowego związanego z metaloproteinazami z substancji międzykomórkowej lub wywoływanego przez TNFa lub enzymy odpowiedzialne za wydalanie L-selektyny.

Do chorób lub stanów chorobowych wymienionych powyżej należą: zapalenie, choroby autoimmunologiczne, rak, choroby sercowo-naczyniowe, choroby związane z rozkładem tkanki takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kostnostawowe, osteoporoza, neu12 rodegeneracja, choroba Alzheimera, miażdżyca tętnic, zastoinowa niewydolność serca, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, stwardnienie rozsiane, udar, zapalenie żył, choroba Crohn'a, zapalenie tkanki okołozębowej, zapalenie dziąseł, oraz choroby związane z rozpadem tkanek, takie jak resorpcja kości, krwotoki, koagulacja, odpowiedź fazy ostrej, wyniszczenie i anoreksja, ostre infekcje, infekcje HIV, gorączka, stany wstrząsu, reakcje przeszczep-biorca, choroby dermatologiczne, gojenie ran pooperacyjnych, łuszczyca, atopowe zapalenie skóry, pęcherzowe oddzielanie się naskórka, wzrost nowotworu, angiogeneza i inwazja przerzutów wtórnych, choroby oczu, retinopatia, owrzodzenie rogówki, uszkodzenia reperfuzyjne, migrena, zapalenie opon mózgowych, astma, katar, alergiczne zapalenie spojówki, wyprysk skórny i anafilaksja.

W leczeniu artretyzmu reumatoidalnego, zapalenia stawów i kości, oraz chorób i objawów wywołanych nadekspresją metaloproteinaz matriksu, stwierdzonej w pewnych liniach komórkowych nowotworów przerzutowych lub innych chorób związanych ze zwiększonym wytwarzaniem metaloendoproteinaz matriksu lub TNFa związki o wzorze (I) można podawać doustnie, powierzchniowo, pozajelitowo, poprzez inhalację wspray'u lub doodbytniczo w formach farmaceutycznych o określonej dawce (jednostkowych) zawierających nietoksycznie, dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, środki pomocnicze i rozczynniki. Zastosowany tutaj termin „pozajelitowo” obejmuje iniekcje podskórne, dożylne, domięśniowe, domostkowe oraz techniki wlewu. Oprócz leczenia zwierząt ciepłokrwistych takich jak myszy, szczury, konie, bydła rogatego, owiec, psów, kotów itd. związki są efektywne w leczeniu ludzi.

Przedmiotem wynalazku jest zatem również środek farmaceutyczny do zastosowania w terapii, zawierający związek o wzorze (I) określony powyżej jako substancję czynną, i dopuszczalny farmaceutycznie rozcieńczalnik lub nośnik.

Środek farmaceutyczny zawierający składnik aktywny może być przygotowany w formie odpowiedniej do podawania doustnego, na przykład, tabletek, pastylek, pigułek, zawiesin wodnych lub olejowych, dyspergowalnych proszków lub granulatów, emulsji, twardych i miękkich kapsułek, syropów i eliksirów. Środki farmaceutyczne przeznaczone do podawania doustnego można przygotować dowolną, znaną w dziedzinie metodą, stosowaną w produkcji środków farmaceutycznych i środki te mogą zawierać jeden lub więcej składników wybranych z środków słodzących, zapachowych, barwiących i stabilizujących tak aby uzyskać elegancki i smaczny preparat. Tabletki zawierają składnik aktywny w mieszaninie z nietoksycznymi dopuszczalnymi farmaceutycznie rozczynnikami odpowiednio dobranymi do produkcji tabletek. Rozczynnikami tymi są, na przykład, obojętne rozcieńczalniki takie jak węglan wapnia, węglan sodu, laktoza, fosforan wapnia i fosforan sodu; środki granulujące i rozsadzające takie jak np. skrobia kukurydziana, kwas alginowy; środki wiążące jak np. skrobia, żelatyna, akacja i środki zwilżające jak np. stearynian magnezu, kwas stearynowy lub talk. Można przygotowywać tabletki niepowlekane lub powlekać je znanymi technikami co przedłuża rozpad i absorpcję w układzie żołądkowo-jelitowym prowadząc do przedłużonego w czasie działania leku. Na przykład można zastosować taki materiał opóźniający działanie jak monostearynian gliceryny lub distearynian gliceryny. Można również zastosować powlekanie technikami opisanymi wpatentach USA nr 4,256,108; 4,166,452 i 4,265,874 co prowadzi do osmotycznych tabletek leczniczych z kontrolowanym uwalnianiem leku.

Środki farmaceutyczne przeznaczone do podawania doustnego mogą również występować w formie kapsułek z twardej żelatyny, w których składnik aktywny zmieszany jest z obojętnym stałym rozcieńczalnikiem takim jak np. węglan wapnia, fosforan wapnia lub kaolin, lub w postaci kapsułek z miękkiej żelatyny, w których składnik aktywny zmieszany jest z wodą lub olejem, np. olejem z orzeszków ziemnych, ciekłą parafiną lub oliwą z oliwek.

Wodne zawiesiny zawierają składniki aktywne zmieszane z odpowiednimi do produkcji wodnych zawiesin rozczynnikami. Stanowią je środki zawieszające takie jak na przykład sól sodowa karboksymetylocelulozy, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, alginian sodowy, poliwinylopirolidon, guma tragantowa i guma akacjowa; środki dyspergujące lub zwilżające, którymi mogą być naturalnie występujące fosfatydy jak na przykład lecytyna, lub produkty kondensacji tlenku alkilenu z kwasami tłuszczowymi jak na przykład stearynian polioksyetylenu, lub produkty kondensacji tlenku etylenu z długołańcuchowymi alkoholami alifatycznymi jak na przykład heptadekaetylenooksycetanol, lub produkty kondensacji tlenku

185 312 etylenu z częściowymi estrami kwasów tłuszczowych i heksytolu, takimi jak polioksetylen z częściowymi estrami kwasów tłuszczowych i bezwodników heksytolu, na przykład monooleinian polioksyetylenosorbitanu. Zawiesiny wodne mogą również zawierać jeden lub więcej środków konserwujących, jak na przykład p-hydroksybenzoesan etylu lub n-propylu, jeden lub więcej czynników barwiących, jeden lub więcej czynników zapachowo-smakowych, jeden lub więcej czynników słodzących jak sacharoza lub sacharyna.

Zawiesiny w oleju przygotowuje się przez zawieszenie składnika aktywnego w oleju roślinnym, jak na przykład w oleju arachidowym, oliwy z oliwek, oleju sezamowym lub oleju kokosowym, lub w olejach mineralnych, takich jak olej parafinowy. Zawiesiny olejowe mogą zawierać środki zagęszczające, jak na przykład wosk pszczeli, twarda parafina lub alkohol cetylowy. Dla uzyskania preparatu doustnego o dobrym smaku można dodać wymienione wyżej składniki słodzące oraz składniki smakowo-zapachowe. Środki farmaceutyczne można konserwować dodając przeciwutleniacz taki jak np. kwas askorbinowy.

Dyspergowalne proszki i granulaty odpowiednie do przygotowywania zawiesin wodnych po zmieszaniu z wodą dostarczają składnik aktywny w mieszaninie ze środkiem dyspergującym lub zwilżającym, środkiem zawieszającym i jednym lub większą ilością środków konserwujących. Właściwe środki dyspergujące i zwilżające są zilustrowane przykładami, mogą być również obecne składniki słodzące, składniki smakowo-zapachowe i barwiące.

Środki farmaceutyczne według wynalazku można przygotować również w postaci emulsji typu olej w wodzie. Fazą olejową jest wówczas olej roślinny, na przykład oliwa z oliwek lub olej arachidowy, lub olej mineralny, jak na przykład, ciekła parafina lub ich mieszaniny. Odpowiednimi środkami emulgującymi są gumy naturalne, jak na przykład guma akacjowa lub guma tragantowa, naturalnie występujące fosfatydy jak na przykład lecytyna sojowa, i estry lub częściowe estry pochodzące z kwasów tłuszczowych i bezwodników heksytolu, jak na przykład monooleinian sorbitanu, i produkty kondensacji wymienionych częściowych estrów z tlenkiem etylenu, jak na przykład monooleinian polioksyetylenosorbitanu. Emulsje mogą zawierać również środki słodzące i zapachowo-smakowe.

Syropy i eliksiry przygotowuje się dodając środki słodzące, jak na przykład glicerynę, glikol propylenowy, sorbitol lub sacharozę. Środki takie mogą również zawierać składnik łagodzący, składniki konserwujące, zapachowo-smakowe i barwiące. Środki farmaceutyczne mogą mieć postać jałowych wodnych lub olejowych zawiesin do iniekcji. Zawiesiny takie przygotowuje się zgodnie ze znanymi w dziedzinie metodami, wykorzystując wymienione powyżej odpowiednie czynniki dyspergujące lub zwilżające i czynniki zawieszające. Jałowe preparaty do iniekcji mogą mieć również postać sterylnych roztworów lub zawiesin w nietoksycznym dopuszczalnym przy podawaniu pozajelitowym rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, na przykład roztworu w 1,3-butanodiolu. Do dopuszczalnych rozczynników i rozpuszczalników należą woda, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Ponadto konwencjonalnie stosowanymi rozpuszczalnikami lub środowiskiem zawieszającym są jałowe utwardzone oleje. Do tego celu można stosować dowolną mieszankę gotowych olejów, w tym syntetycznych mono- i diglicerydów. Co więcej, w przygotowaniu form do iniekcji znajdują zastosowanie kwasy tłuszczowe jak np. kwas olejowy.

Związki o wzorze (I) można również podawać doodbytniczo w formie czopków. Takie środki farmaceutyczne przygotowuje się mieszając lek z odpowiednim niedrażniącym rozczynnikiem, który jest stały w zwykłej temperaturze, a cieczą w temperaturze odbytu i dlatego ulega w odbytnicy stopieniu uwalniając lek. Rozczynnikami takimi są masło kakaowe i glikole polietylenowe.

Do zastosowania miejscowego stosuje się kremy, maście, żele, roztwory lub zawiesiny itp., zawierające związek o wzorze (I). (Ten sposób podawania leku obejmuje również płukanki do jamy ustnej i gardła).

Zakres stosowanych dawek w leczeniu wyżej wymienionych stanów chorobowych jest rzędu od około 0,05 mg do około 140 mg na kilogram wagi ciała na dzień (od około 2,5 mg do około 7 gramów na pacjenta na jeden dzień). Na przykład, zapalenie może być skutecznie leczone podawaniem od około 0,01 do 50 mg związku na kilogram masy ciała na dzień (od około 0,5 mg do około 3,5 grama na pacjenta na dzień).

185 312

Ilość składnika aktywnego, która może być łączona z materiałami nośnikowymi w pojedynczej dawce zależy od leczonego pacjenta jak i konkretnego sposobu podawania leku. Na przykład, forma farmaceutyczna przeznaczona do podawania doustnego ludziom stanowi od około 5 do około 95% całości kompozycji. Formy o określonej dawce (jednostkowe) zawierają generalnie od około 1 mg do 500 mg składnika aktywnego.

Należy rozumieć, że poziom specyficznych stosowanych dawek w przypadku konkretnego pacjenta zależy od wielu czynników w tym od aktywności zastosowanego związku, wieku, wagi ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety w okresie podawania leku, drogi podawania, szybkości wydzielania, kombinacji z iddymi lekami i stopnia zaawansowania leczonej choroby.

Następujące nieogradiczające przykłady ilustrują związki o wzorze (I) według wynalazku i sposób ich wytwarzania.

W opisie przykładów zastosowano następujące skróty:

EDC Chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu

TNFa czynnik martwicy nowotworu α

LPS iipopoiisachaydł

ELISA immunosorbentowe badanie witzaimia enzymu

RT temperatura pokojowa

Związek pośredni 1

N-metyloamid [(2R)-brono-5-ftalimido]pedtanoilo-L-leucylo-L-tert-leucydy

Do roztworu kwasu [(2R)-brono-5-ftalimido]pentenowego, (patrz WO-A-96/11209, związek pośredni 117, 2,40 g, 7,35 nnoli) i N-hydroksybenzotriazolu (1,04 g, 7,71 mmoli) w tetrahydrofuranie (40 ml) dodano w temperaturze 3°C EDC (1,47 g, 7,71 mmoli). Dodano N-metyloamid L-leucyle-L-tert-leucydy (patrz WO-A-96/11209, związek pośredni 116, 1,89 g, 7,35 mmoli), pozostawiono mieszaninę do powolnego ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano przez noc. Mieszaninę podzielono między octan etylu i wodę, a fazę wodną ekstrahowano octanem etylu. Połączone fazy organiczne przemyto IN HC1, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką, wysuszono (MgSC4) i odparowano pod próżnią, otrzymując związek tytułowy (3,93 g, 95%) w postaci białej piany, którą użyto do następnego etapu bez dodatkowego oczyszczania.

TLC Rf 0,25 (5% MeOH-CH₂Cl2).

Związek pośredni 2

N-metyloamid [(2S)-trifedylometylosulfadylo-5-fiailmidot-penianoilo-L-leucylo-L9tert-leucyny

Do mieszanego roztworu trifedylometylomerkaptnnu (1,66 g, 6,03 mmoli) w dimetyloformamidzie (70 ml) w temperaturze 3°C dodano tert-butadolan potasu (677 mg, 6,03 mmoli). Mieszano przez 20 minut, po czym dodano związek pośredni 1 (3,25 g, 5,75 mmoli) ipozwalono na powolne ogrzanie się mieszaniny do temperatury pokojowej, po czym mieszano przez noc. Następnie mieszaninę wylano do wody (200 ml), a uzyskany osad odsączono i wysuszono pod próżnią, otrzymując związek tytułowy (3,12 g, 71%) w postaci jasnożółtego osadu.

TLC Rf 0,47 (5% MeOH-CH₂Cl2).

Związek pośredni 3

N-metyloamid [(2S)-trifenylometyłoiulfnaylo95-amino]pedtnaoilo-L-leucylo-L-tert-leucyny

Do roztworu związku pośredniego 2 (1,13 g, 1,48 mmoli) w metanolu (20 ml) dodano w temperaturze pokojowej 40% wodny roztwór metyloaminy (10 ml, 116 mmoli). Uzyskaną zawiesinę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Odparowano rozpuszczalnik pod próżniią pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto wodą oraz solanką, wysuszono (MgSO4) i odparowano pod próżnią, otrzymując związek tytułowy (850 mg, 91%) w postaci pomarańczowej piany

TLC Rf 0,27 (5% MeOH-CH2Cl2).

Związek pośredni 4

N-metyloamid [(2S)-tritedyloo^etyktsulfadyle-5^[(\.'N-0iroetyloao^iap)acetylo]anidopedtadoikt-k-leucykt-L·tert-leucy·ay

185 312

Do mieszanego roztworu związku pośredniego 3 (200 mg, 0,32 mmoli). N,N-aimetylhglicyny (33 mg, 0,32 mmoli) i N-hydroksyUenzotriazoiu (46 mg, 0,34 mmoli) w tetrayyarhfurayie (15 ml) w temperaturze 3°C dodano EDC (65 mg, 0,34 mmoli). Po powolnym samorzutnym ogrzaniu się mieszaniny do RT mieszano ją przez dobę. Następnie rozdzielono mieszaninę między octan etylu i wodę i ekstrahowano fazę wodną octanem etylu. Połączone ekstrakty organiczne przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką, wysuszono (MgSO^ i haparownoh pod próżnią, otrzymując surowy związek w postaci bezbarwnego oleju. Oczyszczono za pomocą szybkiej chromatografii kolumnowej „nasU”, eluując układem 2-3% metanhl-aichiorometay, otrzymując związek tytułowy (163 mg, 0,23 mmoli, 71%) w postaci białego osadu.

TLC Rf 0,36 (5% MeO^^Ch).

PhahUnie htrzymayh:

Związek pośredni 5

N-metylhamia [(2S)-trifenylometylhsulfnyylo-5-[[N-metylo-(1,1 -dimetyloethksykarUonylo]ammhacetylh]amiyhpentanhilosL-leucylo-L-tert-leuyyny

Ze związku pośredniego 3 (250 mg, 0,40 mmoli), N-(1,1-aimetyloetoksyknrbonylh)snrkozyoy (76 mg, 0,40 mg), EDC (77 mg, 0,40 mmoli) i N-hydroksybenzotriazolu (54 mg, 0,40 mmoli). Surowy produkt otrzymano w postaci bezbarwnego oleju. Oczyszczono za pomocą szybkiej chromatografii kolumnowej „fiasy”, eluując układem 2-3% metanoldichlorometan, otrzymując związek tytułowy (260 mg, 0,32 mmoli, 81%) w postaci białego osadu.

TLC Rf 0,47 (5% MeOH-CH-Cl-).

Związek pośredni 6

3sBromhmaślay tert-butylu

Do mieszaniny kwasu 3-bromomnsłowego (8,3 g, 50 mmoli) i 2,2,2-triyhloroacutimidanu tert-butylu (10,5 g, 50 mmoli) w dichlorometanie (15 ml) i heksanie (50 ml) w RT dodano eterat trifluorku boru (2 ml). Mieszaninę mieszano w RT przez następne 18 h, następnie zatrzymano reakcję przez ahdayie wodorowęglanu sodu (5 g). Następnie mieszaninę przesączono przez Celit i odparowano przesącz do sucha pod próżnią, otrzymując związek tytułowy (7,2 g, 64%) w postaci bezbarwnego oleju.

TLC Rf 0,72 (25% eter-heksan)

Związek pośredni 7

1.5, --Trimutylh[3-13-tert-butoksykarUonylhpropylo)hydantoina

Do roztworu 1 ,-,,5-tIrmetylohy<aaotoiyy (4,0 g, 28,2 mmoli) w dimetyloformnmiaz;ie (10 ml) w temperaturze 0°C dodano wodorek sodu (60%, 1,3 g, 32 mmoli) i mieszano mieszaninę pod azotem przez 30 minut. Następnie dodano roztwór związku pośredniego 6 (7,1 g) i mieszano mieszaninę przez noc w RT, po czym wylano ją do wody (100 ml) i ekstrahowano eterem tertbutylowo metylowym (100 ml). Fazę organiczną przemyto wodą i solanką, wysuszono (MgSO₄) i odparowano pod próżnią, otrzymując związek tytułowy (3,7 g, 46%) w postaci bezbarwnego oleju.

TLC Rf 0,25 (2:1 eter-heksan)

Związek pośredni 8

1,5,5 -T rimutylh[3 -(3 -karbokuypropylo)yyanntoina

Do roztworu związku pośredniego 7 (3,6 g) w dichlorometanie (10 ml) w RT dodano kwas trifiuorooytowy (10 ml) i mieszano mieszaninę przez 18 h. Uzyskany roztwór odparowano pod próżnią a resztki kwasu trifiuorooctowego azeotropowano z toluenem (3x50 ml), otrzymując związek tytułowy w postaci bezbarwnego, lepkiego oleju, który użyto bezpośrednio w następnym etapie.

TLC Rf 0,45 (eter)

Związek pośredni 9

1.5, -[Trimetylo-3 -(3 -bromo-3 [karboksypropylo)yyanntoiya

Roztwór surowego związku pośredniego 8 mieszano w dichloroetanie (10 ml) zawierającym chlorek tionylu (1,1 ml) przez 3 h, następnie ogrzewano do 80°C przez 30 min. Dodano trichlorek fosforu (0,11 ml), następnie brom (2,5 g) i ogrzewano mieszaninę w80°C przez 3 h.

185 312

Następnie roztwór ochłodzono, dodano ostrożnie wodę (10 ml) i mieszano dwufazową mieszaninę w50°C przez 72 h. Następnie dodano wodę (100 ml) i zalkalizowano mieszaninę wodorowęglanem sodu, po czym przemyto eterem. Fazę wodną zakwaszono 2M kwasem chlorowodorowym do pH 2 i ekstrahowano mieszaninę dichlorometanem. Połączone ekstrakty wysuszono (MgSO4) i odparowano pod próżnią, otrzymując związek tytułowy (3,5 g, 87%) w postaci bezbarwnego, lepkiego oleju.

TLC Rf 0,45 (eter)

Związek pośredni 10

1,5,5-Trimetylo-3-(3-acetylotio-3-karboksypropylo)hydantoina

Roztwór związku pośredniego 9 (3,5 g) w metanolu (20 ml) zadano tiooctanem potasu (1,56 g) wRT. Mieszaninę mieszano następnie przez 18 h, odparowano pod próżnią pozostałość podzielono między 0,5M kwas chlorowodorowy i dichlorometan. Fazę organiczną przemyto wodą i solanką, wysuszono (MgSO4) i odparowano pod próżnią, otrzymując związek tytułowy (3,0 g, 88%) w postaci pomarańczowego osadu.

TLC Rf 0,52 (eter)

Poniższe związki otrzymano zgodnie w procedurą podaną dla N-metyloamidu L-leucylo-L-tert-leucyny (związek pośredni 116 w WO-A-96/11209).

Związek pośredni 11: N-metyloamid L-(S-metylo)cysteinylo-L-leucylo-L-tert-leucyny

Związek pośredni 12: N-metyloamid L-norwalinylo-L-tert-leucyny

Przykład 1

N-metyloamid [(2S)-sulfanylo-5-[(N,N-dimetyloamino)acetylo]aminopentanoilo-L-leucylo-L-tert- leucyny

Związek pośredni 4 (150 mg, 0,21 mmoli) rozpuszczono w mieszaninie (10 ml) kwasu trifluorooctowego (90%), tioanizolu (5%), triizopropylosilanu (2,5%) i wody (2,5%) i mieszano roztwór przez noc wRT. Substancje lotne odparowano pod próżnią, otrzymując surowy produkt w postaci żółtego osadu. Oczyszczono za pomocą szybkiej chromatografii kolumnowej „flash”, eluując układem 2-3% metanol-dichlorometan, otrzymując związek tytułowy (59 mg, 0,12 mmoli, 59%) w postaci białego osadu.

TLC Rf 0,30 (5% MeOH-CH2Cl2).

Podobnie otrzymano:

Przykład 2

N-metyloamid [(2S)-sulfanylo-5-[(N-metyloamino)acetylo]aminopentanoilo-L-leucylo-L-tert-leucyny

Ze związku pośredniego 5 (220 mg, 0,27 mmoli). Surowy produkt otrzymano w postaci żółtego osadu. Oczyszczono za pomocą szybkiej chromatografii kolumnowej „flash”, eluując układem 2-3% metanol-dichlorometan, otrzymując związek tytułowy (92 mg, 0,16 mmoli, 59%) w postaci białego osadu.

TLC Rf 0,21 (5% MeOH-CH2Cl2).

Przykład 3

N-metyloamid N-[2-(acetylotio)-4-( 1,5,5-trimetylohydantoinylo)butanoilo-L-leucylo-Ltert-leucyny

Roztwór N-metyloamidu L-leucylo-L-tert-leucyny (0,4 g) i związku pośredniego 10 (0,4 g) w dichlorometanie (20 ml) zadano EDC (0,3 g) i mieszano mieszaninę przez 18 h w RT. Roztwór przemyto 0,5M kwasem chlorowodorowym i wodorowęglanem sodu, wysuszono (MgSO4) i odparowano pod próżnią, otrzymując związek tytułowy (65%) w postaci beżowej piany.

TLC Rf 0,42 (10% MeOH-CH₂Cl2).

Przykład 4

N-metyloamid N-[2-(acetylotio)-4-(1,5,5-trimetylohydantoinylo)butanoilo-L-(S-metylo)cysteinylo-L-tert-leucyny

Ze związku pośredniego 10 i związku pośredniego 11, w postaci beżowej piany (73%).

TLC Rf 0,37 (10% MeOH-CH₂Cl2).

185 312

Przykład 5

N-metyloamid N-[2-(acetylotio)-4-(1,5,5-trimetylohydantoinylo)butanoilo-L-norwalinylo-L-tert-leucyny

Ze związku pośredniego 10 i związku pośredniego 12, w postaci beżowej piany (68%).

TLC Rf 0,35 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

Przykład 6

N-metyloamid N-[2-sulfanylo-4-(1,5,5-trimetylohydantoinylo)butanoilo-L-leucylo-L-tert-leucyny

Roztwór związku z przykładu 3 (0,4 g) w metanolu zadano wodorotlenkiem amonu (SG 0,88, 1 ml) w RT przez 3 h. Mieszaninę odparowano pod próżnią, pozostałość podzielono między dichlorometan i wodę, wysuszono (MgSO4) i odparowano pod próżnią, otrzymując surowy produkt w postaci beżowego osadu. Pozostałość oczyszczono za pomocą szybkiej chromatografii kolumnowej „flash” na krzemionce, eluując 5% metanolem w dichlorometanie, otrzymując związek tytułowy (0,35 g, 83%) w postaci bezbarwnego osadu.

TLC Rf 0,35 (10% MeOH-CH₂Cl₂).

Przykład 7

N-metyloamid N-[2-sulfanylo-4-(1,5,5-trimetylohydantoinylo)butanoilo-L-(S-metylo)cy steinylo-L-tert-leucyny

Ze związku z przykładu 5, w postaci bezbarwnego osadu (85%).

Przykład 8

N-metyloamid N-[2-sulfanylo-4-(1,5,5-trimetylohydantoinylo)butanoilo-L-norwalinylo-L-tert-leucyny

Ze związku z przykładu 6, w postaci bezbarwnego osadu (88%).

Przykład A

Hamowanie aktywności kolagenazy

Aktywność związków o wzorze ogólnym (I) jako inhibitorów kolagenazy oznaczano według procedury podanej przez Cawstona i Barretta (Anal. Biochem., 99:340-345 (1979), w której 1 mM roztwór testowanego inhibitora, lub jego rozcieńczone roztwory, inkubowano w temperaturze 37°C przez 16 godzin z kolagenem i kolagenazą (w układzie zbuforowanym 50 mM Tris, o pH 7,6 zawierającym 5 mM CaCR 0,05% Brij 35, 60 mM NaCl i 0,02% NaN3). Kolagen acetylowano do ³H lub ¹⁴C-kolagenu metodą Cawstona i Murphy'ego (Methods in Enzymology, 80:711,1981). Sposób znakowania nie wpływa na zdolność kolagenazy do degradowania substratu kolagenowego. Próbki poddawano wirowaniu aby oddzielić przez sedymentację niestrawiony kolagen i pobierano określone ilości radioaktywnego supernatantu do licznika scyntylacyjnego do pomiaru określającego stopień hydrolizy. Aktywność kolagenazy w obecności 1 mM inhibitora, lub jego rozcieńczonych ilości, porównywano z aktywnością próbki kontrolnej pozbawionej inhibitora i wyniki wyrażano jako stężenie inhibitora powodujące 50% zahamowanie aktywności kolagenazy (IC50).

Przykład B

Hamowanie aktywności stromelizyny

Aktywność związków o wzorze ogólnym (I) jako inhibitorów stromelizyny oznaczano według procedury podanej przez Nagase i in. (Methods in Enzymology, Vol. 254, 1994), w której 0,1 mM roztwór testowanego inhibitora, lub jego rozcieńczone roztwory, inkubuje się w temperaturze 37°C przez 16 godzin ze stromelizyną i ³H transieryna (w układzie zbuforowanym 50 mM Tris, opH 7,6 zawierającym 10 mM CaCR 150 M NaCl, 0,05% Brij 35, i 0,02% NaN3). Transferynę karboksymetylowano za pomocą kwasu ³H-jodooctowego. Aktywność stromelizyny w obecności 1 mM inhibitora, lub jego rozcieńczonych ilości, porównywano z aktywnością próbki kontrolnej pozbawionej inhibitora i wyniki wyrażano jako stężenie inhibitora powodujące 50% zahamowanie aktywności stromelizyny (IC50).

Przykład C

Hamowanie aktywności żelatynazy

Aktywność związków o wzorze ogólnym (I) jako inhibitorów żelatynazy oznaczano według procedury podanej przez Harrisa i Krane'go (Biochem. Biophys. Acta, 258:566-576 (1972), w której 1 mM roztwór testowanego związku, lub jego rozcieńczone roztwory, inku18

185 312 buje się w temperaturze 37°C przez 16 godzin z żelatynazą i ze zdenaturowanym przez ogrzewanie ³H lub ^I4C-kolagenem (w układzie zbuforowanym 50 mM Tris, o pH 7,6 zawierającym 5 mM CaCb, 0,05% Brij 35 i 0,02% NaNs). ³H lub ¹⁴C-żelatynę otrzymano przez denaturację ³H lub ^l4C-kolagenu przygotowanego według metody Cawstona i Murphy'ego (Methods in Enzymology, 80:711, 1981) w rezultacie inkubacji w temperaturze 60°C przez 30 minut. Niestrawioną żelatynę wytrącano dodając kwas trichlorooctowy i odwirowywano. Aktywność żelatynazy w obecności 1 mM inhibitora, lub jego rozcieńczonych ilości, porównywano z aktywnością próbki kontrolnej pozbawionej inhibitora i wyniki wyrażano jako stężenie inhibitora powodujące 50% zahamowanie aktywności żelatynazy (IC50).

Przykład D

Test fluorometryczny na czynność hamowania MMP

Siłę działania związków o wzorze ogólnym (I) jako inhibitorów kolagenazy-1 (MMP-1), kolagenazy-2 (MMP-8), żelatynazy-A (MMP-2), żelatynazy-B (MMP-9) i stromelizyny-1 (MMP-3) oznaczono stosując następującą procedurę:

Inhibitory rozpuszczono w dimetylosulfotlenku zawierającym 0,02% β-merkaptoetanolu i sporządzono kolejne rozcieńczenia. Aktywowany enzym inkubowano w buforze testowym zawierającym 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM CaCh, 0,002% NaN3 i Brij 35 w obecności i w nieobecności inhibitora. Próbki preinkubowano w 37°C przez 15 minut, po czym dodawano substrat fluorometryczny (Mca-Pro-beu-Dpa-Ala-Arg-Nlb) do stężenia końcowego 10 mM. Test inkubowano następnie przez 90 minut w 37°C a następnie odczytano na urządzeniu Fluroscan II przy L_ex (355 nm) i Xe_m (460 nm).

Aktywność enzymatyczną porównano z aktywnością w próbce kontrolnej pozbawionej inhibitora, a wyniki podano jako stężenie inhibitora, powodujące 50% hamowanie stromelizyny (IC50).

Przykład E

Hamowanie wytwarzania TNFa

Aktywność związków o wzorze ogólnym (I) jako inhibitorów wytwarzania TNFa oznaczano według następującej procedury. 1 mM roztwór testowanego związku, lub jego rozcieńczone roztwory, inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 z komórkami ludzkich monocytów THP-1 zawieszonych w pożywce RPMI 1640 i z 20 pM β-merkaptoetanolu przy gęstości komórek 1 x 10⁶/ml i stymulowanych obecnością lipopolisacharydu LPS o stężeniu końcowym 5 pg/ml. Po 18 godzinach badano supematant na poziom TNFa przy użyciu dostępnego handlowo zestawu ELISA (R&D Systems).

Aktywność w obecności 0,1M inhibitora lub jego rozcieńczonych ilości, porównywano z aktywnością próbki kontrolnej pozbawionej inhibitora i wyniki wyrażano jako stężenie inhibitora powodujące 50% zahamowanie wytwarzania TNFa.

Przykład F

Adjuwantowy szczurzy model artretyzmu

Związki o wzorze ogólnym (I) badano przy użyciu adjuwantowego szczurzego modelu artretyzmu opartego na metodach zastosowanych przez B.B. Newbould'a (1963), Br. J. Pharmacol, 21, 127-136 i C.M. Pearson i F.D. Wood (1959), Arthritis Rheum, 2,440-459. W skrócie: samcom szczurzym rasy Wisar (180-200 g) wstrzyknięto w podstawę ogona adjuwant Freunda. Po dwunastu dniach badane zwierzęta podzielono w sposób przypadkowy na grupy eksperymentalne. Następnie zwierzętom podawano określone dawki związków o wzorze ogólnym (I) albo doustnie jako zawiesina w 1% metylocelulozie albo dootrzewnowo w 0,2% karboksymetylocelulozie począwszy od dnia 12 do końca eksperymentu w dniu 22. W tym okresie co dwa dni mierzono objętości tylnych łap szczura i po zakończeniu eksperymentu prześwietlano tylnią stopę promieniami X (rentgenograficznie). Wyniki wyrażono jako procentowy wzrost objętości stopy w stosunku do objętości z 12 dnia.

Przykład G

Ksenograficzny mysi model raka jajnika

Związki o wzorze ogólnym (I) badano stosując ksenograficzny mysi model raka jajnika oparty na opisie w pracy B. Davies'a i in. (1993), Cancer Research, 53, 2087-2091. Skrótowo: w modelu tym wykorzystuje się samice myszy nu/nu inokulowane komórkami 1 x 10

185 312

OVCAR3-icr w jamie otrzewnowej. Związki o wzorze ogólnym (I) podawano albo doustnie jako 1% zawiesinę w metylocelulozie lub dootrzewnowo jako zawiesinę w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej w 0,01% Tween-20. Na koniec eksperymentu (po 4-5 tygodniach) zliczano komórki otrzewnowe i określano wagę każdego stałego guza (zbrylenia). W niektórych eksperymentach rozwój guza śledzono stosując specyficzne antygeny nowotworowe.

Przykład H

Szczurzy model raka piersi

Związki o wzorze ogólnym (I) badano z użyciem szczurzego modelu raka piersi HOSP.1 (S. Eccles i in. (1995), Cancer Research, w druku). W modelu tym samicom szczurzym CBH/cbi zaszczepiano dożylnie 2 x 10⁴ komórek nowotworowych do żyły szyjnej. Związki o wzorze ogólnym (I) podawano albo doustnie jako 1% zawiesinę w metylocelulozie lub dootrzewnowo jako zawiesinę w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej w 0,01% Tween-20. Na koniec eksperymentu (po 4-5 tygodniach) zwierzęta zabijano, usuwano płuca i zliczano indywidualne guzy po 20 godzinnym utrwaleniu w Methacam.

185 312

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Tiopodstawione peptydy, będące związkami o wzorze ogólnym (1):

   w którym:

   R¹ oznacza Cj^alkil lub grupę C1-6alkilo-SR⁹, gdzie R⁹ oznacza H lub Cj^aikil;

   R² oznacza atom wodoru lub Cj-^alkil;

   R³ oznacza Ci^alkil;

   X oznacza grupę -CO-NH-Ci-śdkii;

   R⁷ oznacza wodór lub grupę Ci-t-alkil-CO-;

   R⁸ i R¹⁶ są takie same lub różne i każdy z nich niezależnie oznacza C-4alkil-R-, przy czym R’6 może także oznaczać H;

   R¹ - oznacza grupę -NH-CO-Ci-talkil-N(R2)2 lub grupę o wzorze:

   (O)_q w którym q oznacza 0 lub 1, a R2 ma znaczenie podane powyżej; oraz ich sole.
2. 2. Związek według zastrz. 1, wybrany ze związków następujących:

   N-metyloamid [(2S)sSulfmnylo-5-[(N,N-dimetyloamino)acetylo]aminhpentanoiio-L-leucylo-L-tert-leucyny, .

   N-metyloamid [(2S)-sulfanylo-5-[(N-metyloamino)acetylo]aminopentanoilo-L-leucylo-L-tert-leucyny.
3. 3. Związek według zastrz. 1, wybrany ze związków następujących:

   N-metyloamid N-[2-(acetylotio)-4-(1,5,5-trimetylohydantoinylo)butanoilo-L-leucylo-L-tert-leucyny,

   N-metyloamid N-[2-(acetylotio)-4-(1,5,5-trimetylohydantoinylo)butanoilo-L-(S-metylo) cysteinylo-L-tert-leucyny,

   N-metyloamid N-[2-(acetylotio)-4-(1,5,5-trimetylohydantomylo)butanoiio-L-norwalmylo-L-tert-leucyny,

   N-metyloamid N-[2-sulffnylo-4--1 .5,5-trrnee4ohyilantooiylo)butanoikl-L-leucylcolL

   -tert-leucyny,

   185 312

   N-metyloamid N-[2-sulfanylo-4-(1,5,5-trimetylohydaitoinylo)butanoilo-L-(S-metylo)cysteinylo-L-tert-leucyny,

   N-metyloamid N-[2-sulfanylo-4-(1,5,5-trimetylohyd<untoinylo)butanoilo-L-norwalinylo-L-tert-leucyny.
4. 4. Środek farmaceutyczny do zastosowania w terapii, znamienny tym, że zawiera związek określony w zastrzeżeniu 1 jako substancję czynną, i dopuszczalny farmaceutycznie rozcieńczalnik lub nośnik.
5. 5. Zastosowanie związku określonego w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania środka leczniczego przeznaczonego do leczenia lub zapobiegania stanu chorobowego związanego z metaloproteinazami z substancji międzykomórkowej lub wywoływanego przez TNFa lub enzymy odpowiedzialne za wydalanie L-selektyny.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stan chorobowy wybrany jest spośród następujących: nowotwór, zapalenie i choroby zapalne, degeneracja tkanki, choroba przyzębia, choroba oczu, choroby dermatologiczne, gorączka, efekty sercowo-naczyniowe, krwotok, koagulacja i odpowiedź ostrej fazy, wyniszczenie i jadłowstręt, ostre zakażenie, zakażenie HIV, stany wstrząsu, reakcje przeszczep-biorca, choroba autoimmunologiczna, uszkodzenia reperfuzyjne będące następstwem niedotlenienia, zapalenie opon mózgowych i migrena.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stan chorobowy wybrany jest spośród następujących: wzrost nowotworu, angiogeneza, inwazja i rozprzestrzenianie nowotworu, przerzuty, puchlina brzuszna złośliwa i złośliwy wysięk opłucnowy.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stan chorobowy wybrany jest spośród następujących: reumatoidalne zapalenie stawów i kości, zapalenie stawów i kości, osteoporoza, astma, stwardnienie rozsiane, neurodegeneracja, choroba Alzheimera, miażdżyca, udar mózgowy, zapalenie naczyń, choroba Crohna i wrzodowe zapalenie okrężnicy.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stan chorobowy wybrany jest spośród: owrzodzenia rogówki, retynopatii, i pooperacyjnego gojenia ran.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stan chorobowy wybrany jest spośród: łuszczycy, atopowego zapalenia skóry, chronicznych wrzodów i pęcherzykowego oddzielania naskórka.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stanem chorobowym jest zapalenie tkanki okołozębowej lub ropne zapalenie dziąseł.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stan chorobowy wybrany jest spośród: kataru, alergicznego zapalenia spojówek, wyprysku skórnego i anafilaksji.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że stan chorobowy wybrany jest spośród: restenozy, zastoinowej niewydolności serca, endometriozy, miażdżycy tętnic i endosklerozy.