CZ101798A3

CZ101798A3 - Thiosubstituované peptidy jako inhibitory metaloproteinas a uvolňování TNF

Info

Publication number: CZ101798A3
Application number: CZ981017A
Authority: CZ
Inventors: Andrew Douglas Baxter; John Gary Montana; David Alan Owen
Original assignee: Darwin Discovery Limited
Priority date: 1995-10-05
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 1998-08-12
Also published as: DE69625506T2; DE69625506D1; CA2229434A1; US5981490A; HUP0003760A2; BR9610922A; CN1198747A; HUP0003760A3; NO981520L; NO981520D0; KR100472752B1; ES2186803T3; AU7139896A; NZ319222A; MX9802680A; CZ289711B6; DK0859784T3; JPH11512733A; IL123430A; ATE229972T1

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká nové třídy peptidových derivátů, způsobů jejich přípravy a jejich použití v medicíně

Dosavadní stav techniky

Metaloproteinasy, kolagenasa (lidského fibroblastu), želatinasa a nádorový nekrotický faktor (TNF) a způsoby jejich působení a také jejich inhibitory a jejich klinické účinky jsou uvěřejněny ve WO-A-9611209, jehož obsah je připojen v odkazu.

V normálních tkáních je syntéza buněčné pojivové tkáně vyrovnávána mimo buněčným rozkladem matrixu, přičemž tyto dva protichůdné efekty jsou v dynamické rovnováze. Rozklad matrixu je způsoben činností proteinas uvolňovaných z vlastních buněk pojivové tkáně a činností napadajících zánětlivých buněk a je částečně připsán činnosti alespoň čtyř skupin metaloproteinas. Jsou to kolagenasy (intersticiální kolagenasa MMP-1, PMN kolagenasa, MMP8, kolagenasa-3, MMP-13), želatinasy (želatinasa A, MMP-2, 72kDa želatinasa, kolagenasa typu IV, želatinasa Β, MMP-9, 92 kDa želatinasa, kolagenasa typu IV), stromelyziny (proteoglykanasa, MMP-3, stromelyzin-1, transin, stromelyzin-2, MMP-10, stromelyzin-3, MMP-11) a metaloproteinasy matrixu membránového typu (MT-1, MMP-14; MT-2, MMP-15; MT-3, MMP-16 a MT-4, MMP-17). Normálně jsou tyto katabolické enzymy pevně regulovány úrovní své syntézy a sekrece a také úrovní své mimobuněčné aktivity, která je regulována činností specifických inhibitorů jako jsou TIMP (tkáňové inhibitory metaloproteinas), které tvoří inaktivní komplexy s metaloproteinasami a obecnějšími inhibitory proteinas jako jsou a₂makroglobuliny.

Zrychlený, nekontrolovaný rozpad pojivové tkáně metaloproteinasou katalyzovaného resorbování mimobuněčného matrixu je rysem mnoha patologických stavů jako je kloubní revmatismus, osteoartritida, septická artritida, zvředovatění rohovky, epidermální a žaludeční zvředovatění; nádorová metastáze nebo invaze; onemocnění ozubice, proteinurie, koronární trombózy spojené s prasknutím aterosklerotického plátu a onemocnění kosti. Inhibitory nárokované na tomto místě mohou být také užitečné pro zabránění patologickým poruchám • · • · · ·

doprovázejícím traumatické poranění, které může vést k trvalé nezpůsobilosti. Tyto sloučeniny také mají použití jako prostředky pro kontrolu porodnosti zamezením ovulace nebo uhnízdění oplodněného vajíčka. Lze očekávat, že patogeneze těchto nemocí se pravděpodobně pozmění užitečným způsobem podáním inhibitorů metaloproteinas. Pro tento účel byly navrženy mnohé sloučeniny [pro obecný přehled viz R. C. Wahl et al Ann. Rep, Med. Chem. 25:175-184, Academie Press lne., San Diego (1990)].

Bylo popsáno množství sloučenin podobných nízkomolekulárním peptidům, které inhibují metaloproteinasy. Asi nej pozoruhodnější z těchto sloučenin jsou ty, které se vztahují k enzymu přeměňujícímu angiotenzin (ACE), kde tato činidla blokují přeměnu dekapeptidu angiotenzinu I na angiotenzin II, silně účinnou tlak ovlivňující látku. Sloučeniny tohoto typu jsou popsány v EP-A-0012401. Také příbuzné merkaptoamidové peptidické deriváty vykázaly ACE inhibiční aktivitu in vitro a in vivo (Η. N. Weller et al (1984), Biochem Biophys. Res. Comm., 125 (1): 82-89).

TNF je cytokinin, který je produkován zpočátku jako s buňkou spojený 28kD prekursor. Uvolňuje se v aktivní 17kD formě (D-M Jue et al, (1990) Biochemistry, 29:8371-8377), která může zprostředkovávat velké množství škodlivých vlivů in vivo. Při podání živočichům či lidem způsobuje zánět, horečku, kardiovaskulární efekty, hemoragii, koagulaci a akutní fázové odezvy podobné těm, které jsou pozorovány během akutních infekcí a šokových stavů. Chronické podávání může také způsobit kachexii a anorexii. Nahromadění nadbytečného TNF může být také smrtelné.

Z modelových studií na zvířatech existují významné důkazy, že blokace účinku TNF specifickými protilátkami může být přínosná při akutních infekcích, šokových stavech, reakcích štěp versus příjemce a autoimunitního onemocnění. TNF je také samozmenšovacím růstovým faktorem pro některé myelomy a lymfomy a může inhibovat normální krvetvorbu u pacientů s těmito nádory.

Předpovídá se proto, že zabránění produkci nebo účinku TNF je účinnou terapeutickou strategií pro mnohé zánětlivé, infekční, imunologické a zhoubné nemoci. Tyto nemoci zahrnují, avšak nejsou omezeny na septický šok, hemodynamický šok a otravu krve (Mathison et al (1988) J. Clin. Invest. 81: 1925-1937; Miethke et al (1992), J. Exp. Med. 175:91-98), postischemické poranění opětným promýváním, malárii (Grau et al (1989), Immunol. Rev. 112: 49-70); mykobakteriální infekci (Barnes et al (1992) Infect. Imm. 60:1441-6), meningitidu, psoriázu, městnavé selhání srdce, onemocnění vaziva, kachexii, odhojení štěpu, • · • · · · · ·

rakovinu, autoimunitní onemocnění, kloubní revmatismus, roztroušenou sklerózu, radiační poškození, otravné stavy následující po podání imunosupresívních monoklonálních protilátek jako OKT3 nebo CAMPATH-1 a alveolární poranění zvýšeným obsahem kyslíku.

Běžné klinické strategie proti TNF zahrnují použití kortikosteroidů jako je dexamethason a použití cyklosporinu-A nebo FK506, které jsou nespecifickými inhibitory benové transkripce cytokininu. Inhibitory fosfodiesterasy jako je pentoxyfilin se ukázaly být specifičtějšími inhibitory genové transkripce TNF (Endres S. (1991) Immunol. 72:56-60, Schandene et al (1992), Immunol. 76:30-34, Alegre M. L. et al (1991), Transplantation 52:674-679, Bianco et al (1991) Blood 78:1205-1221. Bylo ukázáno, že Thalidomid také inhibuje produkci TNF leukocyty (Sampajo et al (1991), J. Exp. Med. 173:699-703). V experimentálních uspořádáních bylo také ukázáno, že anti-TNF monoklonáiní protilátky, rozpustné receptory TNF a rozpustné receptory/imunoadhesiny TNF specificky inhibují účinky působení TNF (Bagby et al (1991) J. Infect. Dis. 163:83-88, Charpentier et al (1991) Pressemed. 20:2009-2011, Silva et al (1990) J. Infect. Dis. 162:421-427; Franks et al (1991) Infect. Immun. 59:2609-2614, Tracey et al (1987) Nátuře 330:662-664; Fischer et al (1992) PNAS USA v tisku, Lesslauer et al (1991) Eur. J. Immunol. 21:2883-2886, Ashkenazi et al (1991) PNAS USA 88:10535-10539).

Nedávno bylo ukázáno, že účinky TNF jsou zprostředkovány dvěma peptidy, TNFa a FNFp. Ačkoliv jsou tyto peptidy navzájem homologické pouze ze 30 %, aktivují ty samé receptory a jsou kódovány bezprostředně sousedními geny. Jak je zde používáno, termín nádorový nekrotický faktor nebo TNF proto znamená nádorový nekrotický faktor a a peptidy, které mají vysoké stupně homologie sekvencí s TNFa nebo značně podobné fyziologické účinky jako TNFa, jako například TNFp.

Jedním z cílů předloženého vynálezu je poskytnout sloučeniny, které podstatně inhibují uvolňování TNF z buněk a proto se používají v léčení stavů zprostředkovaných TNF. Taková použití zahrnují, ale nejsou omezena na léčbu zánětu, horečky, kardiovaskulárních efektů, hemoragie, koagulace a akutní fázové odezvy , kachexie a anorexie, akutních infekcí, šokových stavů, reakce štěpu proti hostiteli a autoimunitního onemocnění.

Bylo ukázáno, že sloučeniny, které mají vlastnost inhibice činnosti metaloproteinas, které jsou zapojeny do rozpadu pojivové tkáně, jako je kolagenasa, stromelyzin a želatinasa, inhibují uvolňování TNF jak in vitro, tak in vivo (A.J.H. Gearing et al (1994), Nátuře, 370:555557; G.M. McGeehan et al (1994), Nátuře, 370:558-561; WO 93/20047). Všechny tyto popsané inhibitory obsahují skupinu s hydroxamovou kyselinou, která váže zinek.

·· ···· ·· · ··· ·· ·· · · · ····· ·· · ········· • · ··· · · · · ···· · ···· ·······

Jak je uznáváno odborníky v oboru, značná míra homologie mezi kolagenasou lidského fibroblastu, stromelyzinem a želatinasou vede k možnosti, že sloučenina, která inhibuje jeden enzym, může do určitého stupně inhibovat všechny. Sloučeniny, které inhibují kolagenasu, zahrnují ty, které jsou obsažené v U.S, Patentu No. 4,511,504 vydaného 16. dubna 1985 a U.S. Patentu No. 4,568,666 vydaného 4. února 1986. Sloučeniny podobné struktury, které jsou nárokovány na inhibici stromelyzinu (proteoglykanasa) jsou obsaženy v U.S. Patentu No. 4,771,037 vydaném 13. září 1988.

Panuje přesvědčení, že inhibitory stromelyzinu a kolagenasy mohou mít využití v prevenci poškození kloubních chrupavek, spojeného se septickou artritidou. Bakteriální infekce kloubů mohou vyvolat zánětlivou reakci, která může přetrvat i po odstranění infekčního agens a rezultovat v permanentním poškození strukturních komponent. Bakteriální činidla byla použita v modelech se zvířaty k vyvolání artritické reakce s objevením se proteolytických aktivit. Viz J.P. Čase et al (1989), J. Clin. Invest., 84:1731-40; R. J. Williams et al (1990), Arth. Rheum. 33:533-41.

Panuje přesvědčení, že inhibitory stromelyzinu, kolagenasy a želatinasy mohou být užitečné ke kontrole nádorových metastáz, s výhodou v kombinaci se souběžnou chemoterapií a/nebo ozařováním. Viz L. M. Martisian et al (1986), Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 83:9413-7;

S.M. Wilhelm et al (1987), ibid. 84:6725-29; Werb et al (1989), J. Cell Biol., 109:872-889; L. A. Liotta et al (1983), Lab. Invest., 49:636-649; Reich et al v Metastasis, Ciba Foundation Symposium, Wiley, Chichester, 1988, str. 193-210.

Vylučované proteinasy jako stromelyzin, kolagenasa a želatinasa hrají důležitou roli v procesech zahrnujících pohyb buněk během metastázové nádorové invaze. Skutečně je také dokázáno, že matrixové metaloproteinasy jsou vylučovány v nadbytku v určitých metastázových nádorových buněčných řadách. V tomto kontextu enzym zastává funkci umožňující průchod vlastních základních membrán a dovoluje nádorovým buňkám uniknout z místa tvorby primárního nádoru a dostat se do oběhu. Po přilnutí ke stěnám krevních cév používají nádorové buňky ty samé metaloproteinasy k provrtání vlastních základních membrán a proniknutí ostatními tkáněmi a tak vedou k nádorovým metastázám. Inhibice tohoto procesu by zabránila metastázi a zlepšila by účinnost běžných léčeb chemoterapeutiky a/nebo ozařování.

Tyto inhibitory by také měly být užitečné v kontrole periodontálmch onemocnění, jako je zánět sliznice dásně. Z fibroblastů zanícené dásně byly odseparovány jak kolagenasové, tak stromelyzinové účinky (Uitto et al (1981), J. Periodontal Res., 16:417-424). Hladiny enzymů • · · · · · • · · · byly korelovány se závažností průběhu onemocnění dásně; C.M. Overall et al (1987), J.

Periodontal Res., 22:81-88.

Proteolytické procesy byly také pozorovány při zvředovatění rohovky následující po popáleninách alkáliemi (S. I. Brown et al (1969), Arch. Opthalmol., 81:370-373). Peptidy obsahující merkaptoskupinu inhibují kolagenasu izolovanou z králičí rohovky popálené alkálií (F. R. Burns et al (1989), Invest. Opthalmol., 30:1569-1575). Léčení alkáliemi popálených očí nebo očí vykazujících zvředovatění rohovky v důsledku infekce pomocí inhibitorů těchto metaloendoproteinas v kombinaci s citranem sodným nebo askorbanem sodným a/nebo antimikrobiálními prostředky je efektivní v prevenci vývoje rozpadu rohovky.

Účast stromelyzinu byla prokázána v degradaci strukturních komponent glomerulární základní membrány (GBM) ledviny, jejíž hlavní funkcí je omezovat průchod proteinů plazmy do moči (W. H. Baricos et al (1989), Bioehem. J., 254:609-612). Proteinurie, jako výsledek glomerulárního onemocnění, znamená nadbytek bílkoviny v moči, způsobený zvýšenou propustností GBM pro proteiny plazmy. Základní příčiny zvýšené propustnosti GBM jsou neznámé, ale proteinasy, které zahrnují stromelyzin, mohou hrát důležitou roli v glomerulárních onemocněních. Inhibice tohoto enzymu může zmírnit proteinurii spojenou se špatnou funkcí ledviny.

Uvažuje se, že inhibice činnosti matrixové metaloproteinasy brání prasknutí aterosklerotických povlaků vedoucích ke koronární trombóze. Trhání či prasknutí aterosklerotických povlaků je nejběžnějším případem počínajícím koronární trombózu. Tvrdí se, že destabilizace a degradace matrixové pojivové tkáně, která obklopuje tyto povlaky, pomocí proteolytických enzymů nebo cytokininů uvolněných vnikajícími zánětlivými buňkami, je příčinou trhlin povlaku. Takové trhání těchto povlaků může způsobit akutní trombolytické případy, jak krev rychle vytéká z krevních cév. Vysoké hladiny mediátorové RNA stromelyzinu byly nalezeny lokalizovány v individuálních buňkách aterosklerotických povlaků odstraněných v době operace ze srdce transplantovaných pacientů (A. M. Henney et al (1991), Proč. Naťl. Acad. Sci. USA, 88:8154-8158). Inhibice stromelyzinu těmito sloučeninami pomáhá zabránit či zpozdit degradaci matrixu pojivové tkáně, který stabilizuje aterosklerotické povlaky, a tak zabraňuje případům vedoucím k akutní koronární trombóze.

Nedávno bylo ukázáno na modelu městnavého selhání srdce (CHF) u prasete, že během CHF jsou patrné změny v morfologické struktuře srdce. Ventrikulární rozšíření a zeslabení stěn způsobené změnami extracelulárního matrixu má za následek méně kolagenových spojení mezi • · ·· ·· ··

kardiomyocyty a méně celkového kolagenu. V takovém příkladě slabší síla kontrakce vede k neefektivní komorové činnosti. Panuje přesvědčení, že specifické inhibitory matrixových metaloproteinas budou hrát klíčovou roli při stabilizaci extracelulárního matrixu, a proto budou důležité v léčbě a/nebo prevenci CHF.

Nedávno bylo ukázáno (WO 96/0240), že inhibitory matrixových metaloproteinas jako kolagenasy a stromelyzinu také inliibují tvorbu rozpustného lidského CD23. CD23 je úplný protein typu II o hmotnosti 45kDa, který se vylučuje na povrchu různých dospělých buněk, v to zahrnujíc B a T lymfocyty, makrofágy, NK buňky, Langerhansovy buňky, monocyty, eosinofily a krevní destičky (Delespesse et al (1991), Adv. Immunology, 49:149; Grangette et al (1989), J. Immunol, 143:3580). Některé aktivity v člověku byly připsány rozpustnému CD23, přičemž všechny zahrnují regulaci IgE. Jednotlivé aktivity zahrnují:

i) rozpoznání antigenu ii) IgE zprostředkovanou cytotoxicitu eozinofilního leukocytu iii) navedení B buněk do lymfatických uzlin a sleziny iv) omezení syntézy IgE

Paušálně je tak nadbytečná produkce rozpustného CD23 zapojena v nadprodukci IgE, která je známkou alergických nemocí jako astma vyvolané vnějšími faktory, rýma, alergický zánět spojivek, ekzém, atopická dermatitida a anafylaxie (Sutton et al (1993), Nátuře, 366:421). Zvýšené hladiny rozpustného CD23 byly také pozorovány v séru pacientů s chronickou B leukémií lymfocytů (Safarti et al (1988), Blood, 71:94), a v synoviálním moku pacientů s revmatickou artritidou (Chomarat et al (1993), Arthritis and Rheumatism, 36:234).

Nedávné zprávy spekulují, že nové enzymy ze skupiny MMP enzymů zaké zprostředkují ztrátu přilnavosti molekul jako jsou selektiny, jako je L-selektin. Tyto rozpustné přilnavé molekuly se účastní v četných nemocech, v ně zahrnujících rakovinu, autoimunitní a zánětlivé reakce. Bylo navrženo, že selektin po odštěpení se váže na určité ligandy a to vysvětluje jejich biologickou aktivitu. Tak látky, které interferují se selektiny nebo zamezují navázání ligandů k selektinům, budou užitečnými léky pro léčení rozmanitých nemocí popsaných výše. Proto je dalším cílem předloženého vynálezu poskytnout sloučeniny, které inhibují ztrátu určitých přilnavých molekul a tak poskytnout výrobu léku pro léčení nebo profylaxi poruch jako je rakovina, autoimunitní onemocnění nebo zánětlivá onemocnění (jako je zánětlivé onemocnění střev a roztroušená skleróza).

• · · · · · • ·

Má se také za to, že specifické inhibitory stromelyzinu a kolagenasy by mohly být užitečné jako porodnost kontrolující agens. Existují důkazy, že exprese metaloproteinas - v to zahrnujíc stromelyzin a kolagenasu - je pozorováno u neoplodněných vajíček a zygot a při dalším rýhování a je zvýšeno v blastocystové fázi vývoje plodu a při endodermní diferenciací (C. A. Brenner et al (1989), Genes & Develop., 3:848-59). Analogicky s nádorovou invazí může blastocysta exprimovat metaloproteinasy za účelem proniknutí extracelulámího matrixu děložní stěny během uhnízdění oplodněného vajíčka. Inhibice stromelyzinu a kolagenasy během těchto raných vývojových procesů by mohla zabránit normálnímu embyonickému vývoji a/nebo uhnízdění oplodněného vajíčka v děloze. Takový zásah by utvořil novou metodu kontroly porodnosti. Navíc existuje důkaz, že kolagenasa je důležitá při ovulačních procesech. V tomto příkladě musí být proniknuta vrstva kolagenu ve vrcholové oblasti folikulu, aby se vajíčko uvolnilo. Během tohoto procesu byla delegována kolagenasa a bylo prokázáno, že inhibitor je účinný při zabránění ovulace (J. F. Woessner et al (1989), Steroids, 54:491-499). Také stromelyzin může hrát aktivní roli během ovulace. (C. K. L. Too et al (1984), Endocrin., 115:1043-1050).

Kolagenolytické a stromelyzinové aktivity byly také pozorovány při dystrofické epidermolytické bulóze (A. Kronberger et al (1982), J. Invest. Dermatol., 79:208-211; D. Sawamura et al (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 184:1003-8). Inhibice metaloendoproteinas by měla omezovat rychlou destrukci pojivových součástí kůže.

Kromě extracelulámího matrixu obsahujícího strukturní složky může stromelyzin degradovat další in vivo substráty jako inhibitory, jako inhibitor αι-proteinasu a může proto ovlivnit působení jiných proteinas jako elestasy (P. G. Winyard et al (1991), FEBS Letts., 279,1:91-94). Inhibice matrixových metaloendoproteinas může umocnit antiproteinasové působení těchto endogenních inhibitorů.

Z nedávných publikací je zřejmé, že bylo identifikováno několik nových enzymů ze skupiny MMP, přičemž některé z nich mohou být důležité v nemoci. Kolagenasa 3, která je specifickým enzymem buněk rakovinového nádoru prsu, může být užitečná při rakovině prsu (J. Μ. P. Freije et al (1994), J. Biol. Chem., 269(24):16766-16773), zatímco enzymy MT-MMP, které jsou dalšími členy enzymů skupiny MMP, byly prokázány jako klíčové enzymy v aktivaci želatinasy A (H. Sáto et al (1994), Nátuře, 370:61-65). Želatinasa A je důležitým enzymem pro růst a metastázu nádorů (jak bylo výše definováno).

• · · · • · • · ··

Bylo prokázáno, že degradace bílkovinného prekursoru b-amyloidu (APP) generuje amyloidní povlaky, které jsou hlavní složkou stařeckých povlaků nalezených u pacientů s Alzheimerovou chorobou (AD). Dvě nedávné publikace zjistily, že metaloproteinasové enzymy štěpí APP na amyloidní povlaky (C. R. Abraham et al (1994), Biochemistry, 33:192-199; G. Huber et al (1994), Biochem. Biophys. Res. Comm., 201 (1):45-53).

Jak je uznáváno odborníky v oboru, značná poměrná část homologie mezi těmito novými enzymy a jinými enzymy ze skupiny MMP vede k možnosti, že sloučenina, která inhibuje jeden enzym, může do určitého stupně inhibovat tyto nové enzymy. Proto inhibitory zahrnuté v tomto vynálezu jsou užitečné u nemocí, ve kterých jsou tyto nové enzymy zapojeny.

Proto je dalším cílem tohoto vynálezu poskytnout sloučeniny, které navíc k inhibici uvolňování TNF také inhibují činnost enzymů MMP, a proto se používají při léčení pacientů, kteří strádají stavy zprostředkovanými TNF a/nebo enzymy MMP.

Je proto dalším cílem předloženého vynálezu poskytnout sloučeniny, které inhibují tvorbu lidského rozpustného CD23, aby se vyrobil lék pro léčení nebo profylaxi poruch jako je alergie a autoimunitní onemocnění, při kterých hraje roli nadprodukce rozpustného CD23, jako u těch, popsaných výše.

Podstata vynálezu

Vynález obsahuje nové alkylsulfidové peptidické sloučeniny vzorce I, které jsou znamenitými inhibitory nemocí přenášených metaloproteinasami matrixu a/nebo TNFa, v to zahrnujíc degenerativní nemoci (takové, které jsou definovány výše a ve WO-A-9611209) a některých karcinomů.

V prvém aspektu vynález poskytuje sloučeninu obecného vzorce I, kde (l)

R¹ je C]-C₇ alkylový zbytek, C2-C6 alkenylový zbytek, C1-C6 alkylsubstituovaný arylový zbytek, arylový zbytek, C]-C₆ alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, heterocyklický zbytek aromatického charakteru nebo Ci-C^ alkyl-AR⁹ skupina, kde A je O, NR⁹ • · · · • 999 • ·9 •9 9

9 9 99

99

............

nebo S(O)_m, kde m = 0 až 2, a R⁹ je H, C]-C₄ alkylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, C1-C4 alkylsubstituovaný arylový zbytek nebo Cj-C₄alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru; jestliže A = NR⁹ , skupiny R⁹ jsou stejné nebo různé;

R² je vodík nebo Ci-Cý, alkylový zbytek;

R³ je skupina [Alk]nR⁶ , kde Alk je C]-C6 alkylový zbytek nebo C2-C6 alkenylový zbytek a n je nula nebo 1;

X je heterocyklický zbytek aromatického charakteru nebo skupina CONR⁴R⁵, kde R⁴ je vodík nebo Ci-Cé alkylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, CjCé alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, cyklo(C3-C6)alkylový zbytek, Ci-C₆ alkylsubstituovaný cyklo(C3-C6)alkylový zbytek, nasycený heterocyklický(C₄-C6) zbytek nebo Ci-Cř alkyl substituovaná nasycená heterocyklická(C₄-C6) skupina a R⁵ je vodík nebo C|-C6 alkylový zbytek; NR⁴R⁵je také kruh jako pyrrolidinový, piperidinový nebo morfolinový;

R⁷ je vodík nebo skupina R¹⁰CO, kde R^l0je C]-C₄ alkylový zbytek, C]-C₄alkylsubstituovaný arylový zbytek, Ci-C₄alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, cyklo(C3-C6)alkylový zbytek, cyklo(C3-C6)alkylsubstituovaný C]-C₄alkylový zbytek, C2-C6 alkenylový zbytek, C₂-Cé alkenylsubstituovaný arylový zbytek, arylový zbytek nebo heterocyklický zbytek aromatického charakteru, jak je definováno výše;

R⁸ a R¹⁶ jsou stejné nebo různé a jsou každý C]-C4alkylsubstituovaný zbytek R¹¹, R¹⁶ je také H; R⁶ je AR⁹ nebo cyklo(C3-C6)alkylový zbytek, cyklo(C3-C6)alkenylový zbytek, C|-Cg alkylový zbytek, Ci-Cýalkoxyarylový zbytek, benzyloxyarylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, C1-C3 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, Cj-C3alkylsubstituovaný arylový zbytek, Ci-Cóalkyl-COOR⁹ skupina, Ci-CýalkylNHR¹⁰ skupina, CONHR¹⁰ skupina, NHCO2R¹⁰ skupina, NHSO₂R¹⁰ skupina, NHCOR¹⁰skupina, amidin nebo guanidin;

R¹¹ je COR¹³ nebo NHCOR¹³ nebo skupiny •φ φφφφ

kde ρ a q jsou oba 0 nebo 1 a jsou stejné nebo různé, ale když p=q=l, pak Y nemůže být H;

R a S jsou CH nebo N a jsou stejné nebo různé;

W je O, S(O)_m, kde nr=0, 1 nebo 2 nebo NR¹²;

Y a Z jsou oba H nebo Co-C₄ alkylsubstituovaný zbytek R¹⁴, kde R¹⁴ je NHR², N(R²)2 (kde oba zbytky R² jsou stejné nebo různé), COOR², CONHR², NHCO2R² (kde R² není H), NHSO₂R²(kde R² není H) nebo NHCOR²; Z se váže do kterékoliv polohy kruhu;

R¹² je vodík, C,-C4alkylový zbytek, COR⁹, CO2R⁹ (kde R⁹ není H), CONHR⁹ nebo SO₂R⁹ (kde R⁹ není H);

R¹³ je C]-C₄alkylsubstituovaný zbytek R¹⁵;

R¹³ je N(R²)2 (kde každý zbytek R⁹ je stejný nebo různý), CO2R⁹, CONHR⁹, CON(R⁹)2 (kde každá R⁹ je stejná nebo různá) nebo SO2R⁹ (kde R⁹ není H), ftalinůdová skupina nebo skupiny • · • ·

a jejich soli, solváty a hydráty.

Popsání vynálezu

Bude oceněno, že sloučeniny podle vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více asymetricky substituovaných uhlíkových atomů, například těch, které jsou označeny hvězdičkou ve vzorci I. Přítomnost jednoho nebo více těchto asymetrických center ve sloučenině vzorce I dává vznik stereoizomerům, přičemž vynález se v každém případě vztahuje na všechny takové stereoizomery, v to zahrnujíc enantiomery a diastereomery a směsi zahrnující jejich racemické směsi.

Ve vzorcích zde je ~ vlnovka použita u potenciálního asymetrického centra ke znázornění možnosti konfigurace R a S, znaménko < a tečkovaná přímka.....ke znázornění jedinečné konfigurace na asymetrickém centru.

Jak je používáno ve výčtu, ať samotný či v kombinaci, termín C]-C₇ alkylový zbytek se vztahuje k nerozvětveným nebo rozvětveným řetězcům alkylové skupiny, která má od jednoho do šesti uhlíkových atomů, v to zahrnujíc například methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, terc.butyl, pentyl, hexyl, heptyl a podobně. Cj-Cé alkylový zbytek znamená to samé, až do 6 uhlíkových atomů, například hexyl. C1-C4 alkylový zbytek znamená to samé, až do 4 uhlíkových atomů, například butyl nebo terc.butyl.

Termín Cj-Q alkenylový zbytek se vztahuje k nerozvětvenému nebo rozvětvenému řetězci alkylové skupiny, který má dva až šest uhlíkových atomů a má navíc jednu dvojnou ·· ·· • · • · · • · · · · · • ·· • · · • · ·· • · · ·· · ·

·· ·· ·· ·· vazbu, jak v E, tak v Z prostorovém uspořádání, kde toto přichází v úvahu. Tento termín zahrnuje například vinyl, 1-propenyl, 1- a 2-butenyl, 2-methyl-2-propenyl etc.

Termín cyklo(C3-C6)alkylový zbytek se vztahuje k nasycené alicyklické skupině, která má tři až šest uhlíkových atomů a zahrnuje například cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl a podobně.

Termín cyklo(C3-C6)alkenylový zbytek se vztahuje k alicyklické skupině, která má od tří do šesti uhlíkových atomů a navíc má jednu dvojnou vazbu. Tento termín zahrnuje například cyklopentenyl nebo cyklohexenyl.

Termín nasycený heterocyklický(C4-C6) zbytek se vztahuje k nasycenému heterocyklickému zbytku, který má čtyři až šest uhlíkových atomů a jednu nebo více heteroatomů vybraných ze skupiny N, O, S a zahrnuje například azetidinyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, piperidinyl a podobně.

Termín aryl nebo arylový zbytek znamená s výhodou substituovaný fenyl nebo naftyl se substituentem (substituenty) vybraným(i) například z halogenu, trifluormethylu, Ci-C₆alkylového zbytku, alkoxy skupiny, fenylu a podobně.

Termín halogen znamená fluor, chlor, brom nebo jod.

Termíny chráněná aminoskupina a chráněná karboxyskupina znamenají aminoskupinu nebo karboxyskupinu, které jsou chráněny způsobem známým odborníkům v oboru. Například aminoskupina může být chráněna benzyloxykarbonylem, terc.butoxykarbonylem, acetylem nebo podobnými skupinami nebo ve formě ftalimidové skupiny nebo podobné skupiny. Karboxylová skupina může být chráněna ve formě snadno rozštěpitelného esteru jako je methylester, ethylester, benzylester nebo terc.butylester.

Termín alkoxy se vztahuje k nerozvětvenému nebo rozvětvenému řetězci alkoxyskupiny, která obsahuje maximálně šest uhlíkových atomů, jako je methoxyskupina, ethoxyskupina, propoxyskupina, isopropoxyskupina, butoxyskupina, terc.butoxyskupina a podobně.

Termín heterocyklický zbytek aromatického charakteru se vztahuje k aromatickému kruhovému systému pěti až deseti atomů, z nichž alespoň jeden atom je vybrán ze skupiny O, N a S a zahrnuje například furyl, thienyl, pyridyl, indolyl, chinolyl a podobně.

Soli sloučenin vzorce I zahrnují farmaceuticky přijatelné soli, například adicí odvozené kyselé soli kyselin, odvozené od anorganických nebo organických kyselin, jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, p-toluensulfonany, fosforečnany, sírany, chloristany, octany, • · 9 99 9 trifluoroctany, propionany, citrany, malonany, jantarany, mléčnany, šťavelany, vínany a benzoany.

Soli se také tvoří se zásadami. Takové soli zahrnují sole odvozené od anorganických nebo organických zásad, jako například soli alkalických kovů jako jsou hořečnaté nebo vápenaté soli a soli organických aminů jako jsou soli morfolinu, piperidinu, dimethylaminu nebo diethylaminu.

Když je chráněná karboxyskupina ve sloučeninách podle vynálezu ve formě esterifikované karboxyskupiny, může se jednat o metabolicky nestálý ester vzorce CO₂R , kde R¹⁷ je ethyl, benzyl, fenethyl, fenylpropyl, a- nebo β-naftyl, 2,4-dimethylfenyl, 4-terc.butyIfenyI,

2,2,2-trifluorethyl, l-(benzyloxy)benzyl, l-benzyloxy)ethyl, 2-methyl-l-propionyloxypropyl, 2,4,6-trimethylbenzyloxymethyl nebo pivaloyloxymethyl.

Sloučeniny obecného vzorce I se připravují jakoukoliv vhodnou metodou známou v oboru a/nebo následujícími způsoby, které samy tvoří součást vynálezu.

Druhým aspektem vynálezu je poskytnout způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I, jak je definováno výše. Bude oceněno, že je-li požadován jednotlivý stereoizomer vzorce I, mohou být užity zde popsané syntetické způsoby s vhodnou výchozí surovinou o stejné chiralitě a/nebo izomery ze směsí mohou být rozděleny s použitím běžných separačních technik (například HPLC).

Sloučeniny podle vynálezu se připravují následujícím způsobem. V popisu a vzorcích

níže skupiny R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹R

S, W, X, Y a Z jsou jak byly definovány výše, kromě toho, kde jsou definovány jinak. Bude oceněno, že funkční skupiny jako aminoskupiny, hydroxyskupiny nebo karboxyskupiny, které jsou v různých sloučeninách popsaných níže a které je žádoucí udržet, je možné mít v chráněné formě před tím, než jakákoliv reakce bude započata. V těchto případech je odstranění chránící skupiny posledním krokem u jednotlivé reakce. Vhodné chránící skupiny pro tyto funkční skupiny budou zřejmé odborníkům v oboru. Pro specifické detaily viz T.W. Greene, P.G.M. Wutts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley Interscience.

Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I zahrnuje odstranění chránění (například hydrolýzou) sloučeniny o vzorci II,

R⁷S-CHR⁸-CO-NR¹⁶-CHR'-CO-NR²-CHR³-X (II) kde R⁷ představuje vhodnou chránící skupinu (například terc.butyl, trityl, benzoyl nebo octan.

··	9···	• 9
9 ·	•	• ·
• ·	9	•	•
9 ·	• ·	•	•
• ·	• ·	• ·
• 9	99	99

«499 ·· • 9 · 99 ··· · ··· • 9 9 *·· ·· • · · ·· ···· ··

Bude oceněno, že kde je vyžadován jednotlivý stereoizomer vzorce I, tento se získá běžnými rozdělovacími technikami, jako vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Avšak kde je žádoucí, užije se vhodná výchozí surovina o stejné chiralitě ve spřažených reakcích pro zisk jednotlivého stereoizomeru vzorce I. Toto je níže doloženo příkladem.

Meziprodukty obecného vzorce II se připravují reakcí kyseliny vzorce III, R⁷S-CHR⁸-COOH (III) nebo jejího aktivního derivátu, kde R⁷ a R⁸ jsou definovány výše, s aminem vzorce IV. R¹⁶NH-CHR'-CO-NR²-CHR³-X (IV)

Aktivní deriváty kyselin vzorce III zahrnují například anhydridy kyselin nebo halogenidy kyselin, jako chloridy kyselin.

Spřažená reakce se provádí za použití standardních podmínek pro aminační reakce tohoto typu. Reakce tak probíhá v rozpouštědle, jako například v inertním organickém rozpouštědle jako je ether, jako například v cyklickém etheru tetrahydrofuranu, dále jako je amid, jako například v substituovaném amidu, jako je dimethylformamid, nebo jako je halogenovaný uhlovodík, jako dichlormethan při nízké teplotě například od -30 °C do teploty okolí, jako od -20 °C do 0 °C, s výhodou v přítomnosti zásady, jako například organické zásady jako je amin, například triethylamin nebo cyklický amin jako je N-methylmorfolin. Kde se používá kyseliny vzorce III, reakce může být navíc provedena v přítomnosti kondenzačního činidla, například diimidu jako je Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid, výhodně v přítomnosti triazolu jako je 1-hydroxybenzotriazol. Alternativně kyselina může před reakcí s aminem vzorce IV reagovat s chloromravenčanem, jako například chloromravenčanem ethylnatým.

Amin obecného vzorce IV se připravuje reakcí kyseliny vzorce V R¹⁶NH-CHR*-COOH (V) nebo jejího aktivního derivátu s aminem vzorce VI R²NH-CHX-R³ (VI) s následným odstraněním kterékoliv z chránících skupin.

Aktivní deriváty kyselin vzorce V zahrnují například anhydridy kyselin nebo halogenidy kyselin, jako jsou chloridy kyselin, jak bylo v hlavních rysech popsáno dříve.

Aminokyseliny a jejich deriváty, jak jsou znázorněny obecnými vzorci V a VI, se získají v chirální nebo racemické formě. V chirální formě poskytují asymetrické stavební bloky pro chirální syntézu sloučenin obecného vzorce I. Mnohé tyto deriváty lze snadno získat z komerčně dostupných výchozích surovin použitím způsobů známých odborníkům v oboru. (Viz M.

• φ φφφφ

Bodanszk et al, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York, 1984; WO92/21360).

Sloučeniny obecného vzorce II se připravují nukleofilní substitucí sloučenin vzorce VII, R⁸Rⁱ⁸C-CO-NR^,6-CHR'-CO-NR²-CHR³-X (VII) kde R¹⁸ představuje vhodnou odstupující skupinu (například halogen jako je bromid nebo ester alkansulfonové kyseliny, jako je methansulfonan) s thiolem vzorce VIII

R⁷SH (VIII) za užití standardních podmínek známých odborníkům v oboru, jak je doloženo příkladem ve W090/05719.

Thioly obecného vzorce VIII lze získat z komerčně dostupných výchozích surovin při použití způsobů známých odborníkům v oboru. Mnohé thioly obecného vzorce VIII jsou také k dispozici komerčně.

Sloučeniny vzorce VII se připravují reakcí kyseliny vzorce IX R¹⁸R³CH-COOH (IX) s aminem vzorce IV, kde R¹⁸ a R⁸ jsou jak byly výše definovány (nebo jejich vhodně chráněné verze) nebo jejich aktivní deriváty za použití podobných reakčních podmínek popsaných pro přípravu sloučenin vzorce II.

Karboxylové kyseliny o strukturách popsaných vzorci III a IX se získají v chirální nebo racemické formě. Mnohé tyto deriváty lze snadno získat z komerčně dostupných výchozích surovin při použití způsobů známých odborníkům v oboru (viz WO 90/05719).

Meziprodukty vzorce II se připraví reakcí kyseliny vzorce X, R⁷S-CHR⁸-CO-NR¹⁶-CHR‘-COOH (X) kde R¹, R⁷ a R⁸ jsou definovány výše nebo aktivního derivátu kyseliny s aminem vzorce VI způsobem popsaným dříve.

Kyseliny obecného vzorce X se jedna po druhé připraví reakcí kyseliny vzorce III nebo jejího aktivního derivátu s aminem vzorce V nebo jeho vhodně chráněným derivátem s následným odstraněním každé chránící skupiny.

Aktivní deriváty kyselin vzorce X zahrnují například anhydridy kyselin nebo halogenidy kyselin jako jsou chloridy kyselin, jak bylo v hlavních rysech popsáno dříve.

Sloučeniny vzorce I se také připraví vzájemnou konverzí jiných sloučenin vzorce I. Tak například sloučenina vzorce I, kde R¹ je Q-Cé alkylová skupina se připraví hydrogenací (použitím paladia na uhlíku ve vhodném rozpouštědle jako je alkohol, například ethanol) • · sloučeniny vzorce I, kde R¹ je C2-C6 alkenylová skupina. Další příklad zahrnuje sloučeninu vzorce I, kde R⁷ je skupina R¹⁰CO připravená acylací (použitím vhodného chloridu kyseliny R¹⁰COC1 v přítomnosti zásady jako je triethylamin ve vhodném rozpouštědle, jako je chlorované rozpouštědlo - například dichlormethan) sloučeniny vzorce I, kde R je H.

Sloučeniny, kde X je heterocyklický zbytek aromatického charakteru, se připraví podle způsobů popsaných v PCT/GB96/01137.

Všechny směsi získaných finálních výrobků nebo intermediátů lze dělit známým způsobem na základě fyzikáině-chemických rozdílů složek na čisté finální výrobky nebo intermediáty, například chromatografií, destilací, frakční krystalizací nebo tvorbou soli, jsou-li okolnosti vhodné nebo možné.

Sloučeniny podle vynálezu vykazují in vitro inhibiční aktivity ve vztahu ke stromelyzinu, kolagenase a želatinase. Sloučeniny podle vynálezu také vykazují in vitro inhibici uvolňování TNFa. Aktivita a selektivita sloučenin se určuje použitím vhodného testu inhibice enzymu, například jak je popsáno v příkladu A níže a ve WO-A-9611209. Stejná publikace podává další testy (příklady B až G) vhodné pro testování sloučenin podle tohoto vynálezu.

Tento vynález se také vztahuje ke způsobu léčení pacientů (v to zahrnujíc člověka a/nebo savce chované pro mlékárenský, masný a kožešinový průmysl nebo jako domácí zvířata) trpících poruchami nebo nemocemi, které se přičítají metaloproteinasam matrixu a/nebo TNFa, jak bylo dříve popsáno, a specifičtěji způsobu léčení, který zahrnuje podání inhibitorů metaloproteinas matrixu vzorce I, jako aktivních složek.

Podle toho se sloučeniny vzorce I používají mezi jiným v léčení osteoartritidy, kloubního revmatismu a při nemocech nebo indikacích vyplývajících ze zvýšené exprese těchto matrixových metaloproteinas, jak je nalézáno při určitých metastázových nádorových buněčných liniích.

Jak bylo zmíněno výše, sloučeniny vzorce I jsou užitečné v humánní nebo veterinární medicíně, neboť jsou aktivní jako inhibitory TNFa nebo MMP enzymů. Podle toho se v dalším aspektu vynález týká:

způsobu zvládání (čímž je myšleno léčení nebo profylaxe) nemoci nebo stavů zprostředkovaných TNFa a/nebo MMP enzymy u savců, zvláště pak u člověka, kterýžto způsob zahrnuje podání efektivního množství výše uvedené sloučeniny vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelné soli savci; a • · · ·

sloučeniny vzorce I pro použití v humánní nebo veterinární medicíně, zvláště ve způsobu zvládání (čímž je myšleno léčení nebo profylaxe) nemocí nebo stavů zprostředkovaných TNFa a/nebo MMP enzymy; a použití sloučeniny vzorce I pro přípravu činidla pro zvládnutí (čímž je myšleno léčení nebo profylaxe) nemocí nebo stavů zprostředkovaných TNFa a/nebo MMP enzymy.

Onemocnění nebo stavy odkazované výše zahrnují zánětlivá onemocnění, autoimunitní onemocnění, rakovinu, kardiovaskulární nemoci, nemoci zahrnující rozpad tkáně, jako je kloubní revmatizmus, osteoartritida, osteoporóza, neurodegenerace, Alzheimerova choroba, ateroskleróza, městnavé selhání srdce, mrtvice, vaskulitida, Crohnova nemoc, vředovitý zánět tlustého střeva, roztroušená skleróza, periodontitida, zánět dásní a ty, které zahrnují rozpad tkáně, jako je resorpce kosti, hydroxyhemoragie, koagulace, akutní fázová odpověď, kachexie a anorexie, akutní infekce, HIV infekce, horečka, šokové stavy, reakce štěp versus příjemce, dermatologické stavy, hojení operačních ran, psoriáza, atopická dermatitida, puchýřové odloučení epidermis, růst nádoru, vznik angiomu a invaze sekundárními metastázemi, oftalmologické onemocnění, onemocnění sítnice, vředovatění rohovky, reperfuzní poranění, migréna, meningitida, astma, rýma, alergický zánět spojivky, ekzém a anafylaxie.

Při léčení revmatického zánětu kloubů, osteoartritidy a při nemocech a indikacích vyplývajících ze zvýšené exprese matrixových metaloendoproteinas tak, jak je nalézáno při určitých metastázových nádorových buněčných liniích nebo jiných nemocech, zprostředkovaných matrixovými metaloendoproteinasami nebo zvýšenou produkcí TNFa, se sloučeniny vzorce I podávají orálně, místně, parenterálně, inhalačními spreji nebo rektálně v dávkovačích jednotkách přípravků obsahujících netoxické, farmaceuticky přijatelné nosiče, pomocné látky a přenašeče. Termín parenterální, jak je zde užit, zahrnuje podkožní injekce, nitrožilní, intramuskulární, intrasternální injekce nebo infuzní techniky. Sloučeniny podle vynálezu jsou navíc k léčení teplokrevných živočichů jako jsou myši, krysy, koně, dobytek, ovce, psi, kočky atd. účinné i v léčbě lidí.

Farmaceutické prostředky obsahující aktivní složku jsou ve formě vhodné pro orální použití, například jako tablety, pastilky, bonbony, vodné nebo olejové suspenze, rozprašovatelné prášky nebo granule, emulze, tvrdé nebo měkké kapsle nebo sirupy nebo léčebné nápoje. Prostředky zamýšlené pro orální použití se připraví podle kteréhokoliv v oboru známého způsobu pro výrobu farmaceutických prostředků a takové prostředky obsahují jedno nebo více činidel vybraných ze skupiny sladidel, ochucovadel, barvících a konzervačních prostředků pro ·· ···· · ♦ · · · ·· · • · · ······· • · · · · ···· ··· • · ··· · · ·· ···· · • · · · ······· • · · · · · ·· · · · · zisk farmaceuticky prvotřídních a stravitelných přípravků. Tablety obsahují aktivní složku ve směsi s netoxickými, farmaceuticky přijatelnými základy, které jsou vhodné pro výrobu tablet. Tyto základy jsou například inertní ředící roztoky jako je uhličitan vápenatý, uhličitan sodný, laktóza, fosforečnan vápenatý nebo fosforečnan sodný; granulační a rozmělňovací činidla jako například obilný škrob nebo alginová kyselina; vázací činidla jako například škrob, želatina nebo klovatina a lubrikační činidla jako například stearan hořečnatý, kyselina stearová nebo mastek. Tablety jsou nepotažené nebo potažené známými způsoby ke zpomalení rozpadu a absorpce v gaslrointestinálním traktu, Čímž poskytující udržení účinku po delší dobu. Jako zpožďovací suroviny se používají například monostearan glycerinu nebo distearan glycerinu. Tablety se pokrývají také způsoby popsanými v US Patentech 4,256,108; 4,166,452; a 4,265,874 pro tvorbu osmotických terapeutických tablet pro kontrolu uvolňování účinných složek.

Výrobky léčivých prostředků pro orální použití jsou také tvrdé želatinové kapsle, kde je aktivní složka smíchána s inertním pevným ředícím prostředkem, například uhličitanem vápenatým, fosforečnanem vápenatým nebo kaolinem, nebo jsou také měkké želatinové kapsle, kde aktivní složka je smíchána s vodou nebo olejovitým prostředím, například arašídovým olejem, kapalným parafinem nebo olivovým olejem.

Vodné suspenze obsahují aktivní látky ve směsi se základy vhodnými pro výrobu vodných suspenzí. Takové základy jsou suspendující činidla jako například sodná sůl karboxymethylcelulosy, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, alginát sodný, polyvinylpyrrolidon, tragantová klovatina, arabská guma; dispergační nebo zvlhčovači činidla jsou přirozeně se vyskytující fosfatidy, jako například lecithin nebo kondenzační produkty alkylenoxidu s mastnými kyselinami, například polyethylenstearan, nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s alifatickými alkoholy s dlouhým řetězcem, jako například heptadekaethylenoxyetanol nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s hexitolem částečně esterifikovanými mastnými kyselinami, jako polyoxyethylenu s částečými estery mastných kyselin a anhydridů hexitolu, jako například monoolejan polyoxyethylensorbitolu. Vodné suspenze také obsahují jeden nebo více konzervačních prostředků, například ethyl nebo propyl, p-hydroxybenzoan, jeden nebo více barvících činidel, jedno nebo více ochucovadel a jedno nebo více sladidel jako je sacharóza nebo sacharin.

Olejovité suspenze se sestavují suspendováním aktivní složky v rostlinném oleji, například arašídovém oleji, olivovém oleji, sezamovém oleji nebo kokosovém oleji nebo v minerálním oleji jako je kapalný parafín. Olejové suspenze obsahují zahušťovací látku, • · • ·· · · ·· ·· ·· • · · · · · · · • · · · · · · ··· ··· ·· ·· · · · · « • · · · · ··· • · · · ·· ·· · · · · například včelí vosk, tvrdý parafín nebo cetylalkohol. Sladidla jako ta, která jsou uvedená výše a ochucovadla se přidají pro zisk chutného ústního přípravku. Tato složení se konzervují přídavkem antioxidantu jako je kyselina askorbová.

Dispergovatelné prášky a granule vhodné pro přípravu vodné suspenze po přidání vody poskytují aktivní složku ve směsi s dispergujícím nebo zvlhčovacím činidlem, suspenzním činidlem a jednou nebo více konzervačními látkami. Vhodná dispergující nebo zvlhčovači činidla a suspenzační činidla jsou doložena příklady, přičemž v příkladu jsou také přítomna sladidla, ochucovadla a barvící činidla.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou také ve formě emulzí oleje ve vodě. Olejová fáze je rostlinný olej, například olivový olej nebo arašídový olej nebo minerální olej, například kapalný parafín nebo jejich směsi. Vhodná emulgující činidla jsou přirozeně se vyskytující klovatiny, například arabská guma nebo tragantová guma, přirozeně se vyskytující fosfatidy, například ze sojových bobů, lecithin a estery nebo anhydridy hexitolu částečně esterifíkované mastné kyseliny, například monoolejan sorbitolu a kondenzační produkty uvedených částečných esterů s ethylenoxidem, například monoolejan polyoxyethylensorbitolu. Emulze také obsahují sladidla a ochucovadla.

Sirupy a léčebné nápoje se sestavují ze sladidel, například glycerolu, propylenglykolu, sorbitolu nebo sacharózy. Taková složení léčivých přípravků také obsahují tišící látku, konzervační prostředek a ochucovadla a barvící látky. Farmaceutické přípravky jsou ve formě sterilních injektovatelných vodných nebo olejovitých suspenzí. Tato suspenze se skládá podle znalostí v oboru s použitím těch vhodných dispergujících nebo zvlhčujících činidel a suspenzních činidel, která byla zmíněna výše. Sterilní injektovatelné přípravky jsou sterilní injikovatelné roztoky nebo suspenze v netoxických, mimostřevně akceptovatelných ředících roztocích nebo rozpouštědlech, například jako roztok v 1,3-butandiolu. Mezi přijatelnými přenašeči a rozpouštědly, která lze použít, jsou voda, Ringierův roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Navíc se jako rozpouštědla nebo suspenzní média běžně používají sterilní, husté oleje. Pro tento účel se používá jakýkoliv nedráždivý, hutný olej, v to zahrnujíc syntetické mono- a diglyceridy. Navíc mastné kyseliny jako je kyselina olejová nalézají použití v přípravě injikovatelných přípravků.

Sloučeniny vzorce I se také podávají ve formě čípků pro rektální podání léku. Tyto přípravky se připravují smícháním léku s vhodným, nedráždivým základem, který je pevný při • · ···· ·· ·· ·· · · • · · ··· ···· • · · · · · · · · ··· běžných teplotách, ale kapalný při rektální teplotě, a proto v rektu taje a uvolňuje lék. Takovými materiály jsou kakaové máslo a polyethylenglykoly.

Pro místní nanášení se používají krémy, masti, želé, roztoky nebo suspenze atd. obsahující sloučeniny vzorce I. (Účely této aplikace zahrnují místní podávání ústními vodami a kloktadly.)

Hladiny dávkování pro léčbu výše popsaných stavů jsou užitečné v řádu 0,05 mg až 140 mg na kilogram tělesné váhy na den (2,5 mg až 7 g na pacienta na den). Například zánět se úspěšně léčí podáním 0,01 až 50 mg sloučeniny na kilogram tělesné váhy na den (0,5 až 3,5 g na na pacienta na den).

Množství aktivní složky, která se kombinuje s nosičovými materiály k získám jedné dávkové formy kolísá v závislosti na léčeném příjemci a jednotlivém způsobu podávání. Například léčivý přípravek zamýšlený pro orální podání člověku kolísá mezi 5 až 95 procenty celkového složení přípravku. Dávkovači jednotkové formy obecně obsahují 1 mg až 500 mg aktivní složky.

Je však srozumitelné, že specifické hladiny dávek pro každého jednotlivého pacienta budou záviset na různosti faktorů, v to zahrnujíc aktivitu použité specifické sloučeniny, věk, tělesnou váhu, celkový zdravotní stav, pohlaví, dobu podání v rozvrhu stravování, způsob podání léku, rychlost vyměšování, kombinace léků a vážnosti jednotlivé léčené nemoci.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady nejsou vyčerpávající a jsou zamýšleny pro popsání přípravy sloučenin vzorce I a jako takové nelimitují vynález, jak je dále uvedeno v nárocích.

V příkladech se používají následující zkratky:

TNFa nádorový nekrotický faktor a

LPS lipopolysacharid

ELISA enzymově spřažená imunochemická analýza

RT teplota místnosti

EDC hydrochlorid l-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)karbodiimidu

Meziprodukt 1 N-methylamid [2R-brom-5-ftaIimido]pentanoyl-L-leucyl-Lterc.leucinu • · · ·

EDC (1,47 g, 7,71 mmol) byl přidán k roztoku kyseliny [(2R)-brom-5ftalimidojpentenové (viz WO-A-9611209, meziprodukt 117, 2,40 g, 7,35 mmol) aNhydroxybenzotriazolu (1,04 g, 7,71 mmol) v tetrahydrofuranu (40 ml) při 3 °C. Dále byl přidán N-methylamid L-leucyl-L-terc.leucinu (viz WO-A-9611209, meziprodukt 116,1,89 g, 7,35 mmol), směs byla ponechána pomalu zahřát na teplotu místnosti a míchána přes noc. Směs byla rozdělena mezi ethylacetát a vodu a vodná fáze byla extrahována ethylacetátem. Spojené organické fáze byly promyty IN HC1, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysušeny (MgSO₄) a odpařeny za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,93 g, 95 %) jako bílé pěny, která byla použita v dalším kroku bez dalšího čištění.

TLC R_f = 0,25 (5 % MeOH-CH₂Cl₂)

Meziprodukt 2 N-methylamid [(2S)-trifenylmethylsulfanyl-5ftalimido]pentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu

Terc.butoxid draselný (677 mg, 6,03 mmol) byl přidán k míchanému roztoku trifenylmethylmerkaptanu (1,66 g, 6,03 mmol) v dimethylformamidu (70 ml) při 3 °C. Po 20 min. míchání byl přidán meziprodukt 1 (3,25 g, 5,75 mmol) a směs byla ponechána pomalu zahřát na teplotu místnosti a míchána přes noc. Směs byla poté vlita do vody (200 ml) a výsledná sraženina byla shromážděna filtrací a vysušena za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,12 g, 71 %) jako světle žluté pevné látky.

TLC R_f = 0,47 (5 % MeOH-CH₂Cl₂)

Meziprodukt 3 N-methylamid [(2S)-trifenylmethylsulfanyl-5amino]pentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu % vodný roztok methylaminu (10 ml, 116 mmol) byl přidán k roztoku meziproduktu 2 (1,13 g, 1,48 mmol) v methanolu (20 ml) při teplotě místnosti. Výsledná suspenze byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku, odparek byl rozpuštěn v ethylacetátu a promyt vodou a solankou, vysušen (MgSO₄) a odpařen za zisku sloučeniny z nadpisu (850 mg, 91 %) jako oranžové pěny.

TLC Rf = 0,27 (5 % MeOH-CH₂Cl₂)

N-methylamid [(2S)-trifenylmethylsulfanyl-5-[N,Ndimethylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu

Meziprodukt 4 • · · · · · 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 · ··· · · ·· • · · · ···· ···« • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 99

...... ·· ··

EDC (65 mg, 0,34 mmol) byl přidán k míchanému roztoku meziproduktu 3 (200 mg, 0,32 mmol), N,N-dimethylglycinu (33 mg, 0,32 mmol) a N-hydroxybenzotriazolu (46 mg, 0,34 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) při 3 °C. Směs byla ponechána pomalu zahřát na teplotu místnosti a míchána přes noc. Směs byla poté rozdělena mezi ethylacetát a vodu a vodná fáze byla extrahována ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly promyty nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysušeny (MgSO₄) a odpařeny za sníženého tlaku za zisku surového produktu jako bezbarvého oleje. Čištění rychlou kolonovou chromatografií s elucí směsí 2 až 3 % methanol-dichlormethan poskytlo sloučeninu z nadpisu (163 mg, 0,23 mmol, 71 %) jako bílé pevné látky.

TLC Rf = 0,36 (5 % MeOH-CH₂Cl₂)

Podobně byl připraven:

Meziprodukt 5 N-methylamid [(2S)-trifenylmethyIsulfanyl-5-[[N-methyl-N-(l,ldimethylethoxykarbonyl]aminoacetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu Meziprodukt 5 byl připraven z meziproduktu 3 (250 mg, 0,40 mmol), N-(l,ldimethylethoxykarbonyl)sarkosinu (76 mg, 0,40 mmol), EDC (77 mg, 0,40 mmol) a Nhydroxybenzotriazolu (54 mg, 0,40 mmol). Surový produkt byl získán jako bezbarvý olej. Čištění rychlou kolonovou chromatografií s elucí směsí 2 až 3 % methanol-dichlormethan poskytlo sloučeninu z nadpisu (260 mg, 0,32 mmol, 81 %) jako bílou pevnou látku. TLC R_f = 0,47 (5 % MeOH-CH₂Cl₂)

Meziprodukt 6 terc.butylester kyseliny 5-brommáselné

Etherát fluoridu boritého (2 ml) byl přidán ke směsi kyseliny 5-brommáselné (8,3 g, 50 mmol) a terc.butyl2,2,2-trichloracetimidanu (10,5 g, 50 mmol) v dichlormethanu (15 ml) a hexanu (50 ml) při teplotě místnosti. Směs byla míchána při teplotě místnosti po dalších 18 hodin, poté byla reakce ukončena přidáním hydrogenuhličitanu sodného (5 g). Směs byla poté zfíltrována přes Celíte a filtrát byl odpařen za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (7,2 g, 64 %) jako bezbarvého oleje.

TLC Rf = 0,72 (25 % ether-hexan)

Meziprodukt 7 l,5,5-trimethyl-3-(3-terc.butoxykarbonylpropyl)hydantoin • ·9 ·

• ··· · ·· · • · ···· · ·· · • · · ·· · · · · ·· · • · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ··

Hydrid sodný (60 %, 1,3 g, 32 mmol) byl přidán k roztoku 1,5,5-trimethylhydantoinu (4,0 g, 28,2 mmol) v dimethylformamidu (10 ml) při 0 °C a směs byla míchána 30 minut v atmosféře dusíku. Poté byl přidán roztok meziproduktu 7 (7,1 g) a vzniklá směs byla míchána přes noc přo teplotě místnosti, poté vlita do vody (100 ml) a extrahována terc.butylmethyletherem (100 ml). Organická fáze byla promyta vodou a solankou, vysušena (MgSO4) a odpařena za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,7 g, 46 %) jako bezbarvého oleje.

TLC Rf = 0,25 (2:1 ether-hexan)

Meziprodukt 8 l,5,5-trimethyl-3-(3-karboxypropyl)hydantoin

Kyselina trifluorroctová (10 ml) byla přidána k roztoku meziproduktu 7 (3,6 g) v dichlormethanu (10 ml) při teplotě místnosti a roztok byl míchán po dobu 18 hodin. Výsledný roztok odpařen za sníženého tlaku a zbylá kyselina trifluoroctová byla s toluenem (3 x 50 ml) azeotropně oddělena za zisku sloučeniny z nadpisu jako bezbarvého, viskózního oleje, který byl přímo použit v dalším kroku.

TLC R_f= 0,45 (ether)

Meziprodukt 9 1,5,5-trimethyl-3-(3-brom-3-karboxypropyl)hydantoin

Roztok surového intermediátu 8 byl míchán 3 hodiny v dichlormethanu (10 ml) obsahujícím thionylchlorid (1,1 ml), poté zahříván 30 minut při 80 °C. Byl přidán chlorid fosforitý (0,11 ml), dále byl přidán brom (2,5 g) a směs byla zahřívána 3 hodiny při 80 °C po. Roztok byl poté ochlazen, opatrně byla přidána voda (10 ml) a dvoufázová směs byla míchána 72 hodin při 50 °C. Poté byla přidána další voda (100 ml) a směs zalkalizována hydrogenuhličitanem sodným, poté promyta etherem. Vodná fáze byla okyselena 2M kyselinou chlorovodíkovou na pH 2 a směs byla extrahována dichlormethanem. Spojené extrakty byly vysušeny (MgSOn) a odpařeny za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,5 g, 87 %) jako bezbarvého viskózního oleje.

TLC Rf = 0,45 (ether)

Meziprodukt 10 1,5,5-trimethyl-3-(3-acetylthio-3-karboxypropyl)hydantoin

Na roztok meziproduktu 10 (3,5 g) v methanolu (20 ml) bylo působeno thiooctanem draselným (1,56 g) při teplotě místnosti. Směs byla poté míchána 18 hodin, odpařena za • · · · sníženého tlaku a odparek byl rozdělen mezi 0,5M kyselinu chlorovodíkovou a dichlormethan. Organická fáze byla promyta vodou a solankou, vysušena (MgSOJ a odpařena za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,0 g, 88 %) jako oranžové pevné látky.

TLC R_f = 0,52 (ether)

Následující meziprodukty byly připraveny podle způsobu popsaného pro N-niethylamid Lleucyl-L-terc.leucinu (meziprodukt 116 ve WO-A-9611209).

Meziprodukt 11 N-methylamid L-(S-methyl)cysteinyl-L-leucyl-L-terc.leucinu

Meziprodukt 12 N-methylamid L-norvalinyl-L-terc.leucinu

Příklad 1

N-methylamid [(2S)-sulfanyl-5-[(N,N-dimethylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-Lterc.leucinu

Meziprodukt 4 (150 mg, 0,21 mmol) byl rozpuštěn ve směsi (10 ml) trifluoroctové kyseliny (90 %), thioanisolu (5 %), triisopropylsilanu (2,5 %) a vody (2,5 %) a roztok byl míchán přes noc při teplotě místnosti. Těkavé složky byly odpařeny za sníženého tlaku za zisku surového produktu jako žluté pevné látky. Vyčištění rychlou kolonovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí 2 až 3 % methanol-dichlormethan poskytlo sloučeninu z nadpisu (59 mg, 0,12 mmol, 59 %) jako bílou pevnou látku.

TLC R_f = 0,30 (5 % MeOH-CH₂Cl₂)

Podobně byl připraven:

Příklad 2

N-methylamid [(2S)-sulfanyl-5-[(N-methylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-Lterc.leucinu

Sloučenina z nadpisu byla získána z meziproduktu 5 (220 mg, 0,27 mmol). Surový produkt byl získán jako žlutá pevná látka. Vyčištění rychlou kolonovou chromatografií s elucí směsí 2 až 3 % methanol-dichlormethan poskytlo sloučeninu z nadpisu (92 mg, 0,16 mmol, 59 %) jako bílou pevnou látku.

TLC Rf = 0,21 (5 % MeOH-CH₂Cl₂) • · · · · · ·« · ··· ···· • · · · · ··· · · ·· • · · · · ·· ·· ···· · *··*···· ·..··..·

Příklad 3

N-methylamid N-[2-(acetylthio)-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-leucyl-L-terc.leucinu

Roztok N-methylamidu L-leucyl-L-terc.leucinu (0,4 g) a meziproduktu 10 (0,4 g) v dichlormethanu (20 ml) byl podroben působení EDC (0,3 g) a směs byla míchána 18 hodin při teplotě místnosti. Roztok byl poté promyt 0,5M kyselinou chlorovodíkovou a hydrogenuhličitanem sodným, vysušen (MgSO₄) a odpařen za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (65 %) jako béžové pěny.

TLC R_f = 0,42 (10 % MeOH-CH₂Cl₂)

Příklad 4

N-methylamid N-[2-(acetylthio)-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-(S-methyl)cysteinylL-terc.leucinu

Sloučenina z nadpisu byla získána z meziproduktu 10 a meziproduktu 11, jako béžová pěna (73 %).

TLC Rf = 0,37 (10 % MeOH-CH₂Cl₂)

Příklad 5

N-methylamid N-[2-(acetylthio)-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-norvalinyl-Lterc.leucinu

Sloučenina z nadpisu byla získána z meziproduktu 10 a meziproduktu 12, jako béžová pěna (68 %).

TLC Rf - 0,35 (10 % MeOH-CH₂Cl₂)

Příklad 6

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-leucyl-L-terc.leucinu

Roztok z příkladu 3 (0,4 g) v methanolu (10 ml) byl podroben působení hydroxidu amonného (SG 0,88, 1 ml) 3 hodiny při teplotě místnosti. Směs byla odpařena za sníženého φ · φ φ φφ φφ φφ φφ φ φ φ φφφ φ φ · · • φ · φ φφφφ φ φφφ φ φ · · φ φφ φ* φφφφ φ _ ' · φ · φ φ φφφ φφφ

............

tlaku, rozdělena mezi dichlormethan a vodu, vysušena (MgSO₄) a odpařena za sníženého tlaku za zisku surového produktu jako béžové pevné látky. Odparek byl vyčištěn rychlou kolonovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí 5 % methanol v dichlormethanu za zisku sloučeniny z nadpisu (0,35 g, 83 %) jako bezbarvé pevné látky.

TLC R_f = 0,35 (10 % MeOH-CH₂Cl₂)

Příklad 7

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-(S-methyl)cysteinyl-Lterc.leucinu

Z příkladu 5, jako bezbarvá pevná látka (85 %).

Příklad 8

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-norvalinyl-Lterc.leucinu

Z příkladu 6, jako bezbarvá pevná látka (88 %).

Příklad A

Inhibice kolagenasy

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů kolagenasy byla určena způsobem Cawstona a Barretta (Anal. Biochem., 99:340-345,1979), kde lmM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byl inkubován 16 hodin při 37 °C s kolagenem a kolagenasou (za pufrování 50 mM tris pufrem, pH 7,6, obsahujícím 5 mM CaCl₂, 0,05 % Brij 35, 60 mM NaCl a 0,02 % NaNj). Kolagen byl acetylován s ³H nebo byl připraven ^l4C-kolagen způsobem Cawstona a Murphyho (Methods in Enzymology, 80:711,1981). Výběr radioaktivního značkování nezměnil schopnost kolagenasy rozložit substrát kolagenu. Vzorky byly zcentrifugovány, aby se usadil nerozložený kolagen a alikvotní část radioaktivního supernatantu byla odebrána pro stanovení na scintilátoru k určení měřítka hydrolýzy. Aktivita kolagenasy v přítomnosti 1 mM inhibitoru nebo jeho zředěného roztoku byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici kolagenasy (IC50).

• ·

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů stromelyzinu byla určena způsobem Nagase et al (Methods in Enzymology, Vol. 254, 1994), kde 0,1 mM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byl inkubován 16 hodin při 37 °C se •· •· •· •· • ·

Příklad Β

Inhibice stromelyzinu strome lyzinem a ³H transferrinem (za pufrování 50 mM tris pufrem, pH 7,6, obsahujícím 10 mM CaCl₂,150 mM NaCl, 0,05 M Brij 35 a 0,02 % NaN₃). Transferrin byl derivatizován o karboxymethylem s kyselinou jodoctovou značenou H. Aktivita stromelyzinu v přítomnosti lmM inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici stromelyzinu (IC50).

Příklad C

Inhibice želatinasy

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů želatinasy byla určena postupem Harrise & Kraneho (Biochem. Biophys. Acta, 258:566-576, 1972), kde 1 mM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byl inkubován 16 hodin při 37 °C se želatinasou a tepelně denaturovaným ³H značeným nebo ¹⁴C acetylovaným kolagenem (za pufrování 50 mM tris pufrem, pH 7,6, obsahujícím 5 mM CaCl₂, 0,05 % Brij 35 a 0,02 % NaN₃). ³H nebo ^l4C značená želatina byla připravena denaturací ³H nebo ^l4C značeného kolagenu vyrobeného podle způsobu Cawstona a Murphyho (Methods in Enzymology, 80:711, 1981) 30 minutovou inkubací při 60 °C. Nezreagovaná želatina byla vysrážena přídavkem kyseliny trichloroctové a centrifugách Aktivita želatinasy v přítomnosti 1 mM inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici želatinasy (IC50).

Příklad D

Inhibice MMP enzymů-fluorimetrické stanovení

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů kolagenasy-1 (MMP-1), kolagenasy-2 (MMP-8), želatinasy-A (MMP-2), želatinasy-B (MMP-9) a stromelyzinu-1 (MMP3) byla určena s použitím následujícího způsobu:

toto ··

• ·· ··· · · • · · ·· ··

Inhibitory se rozpustily v dimethylsulfoxidu obsahujícím 0,02 % β-merkaptoethanolu a byla připravena sériová naředění. Aktivovaný enzym se inkuboval v pufru užitém při stanovení a obsahujícím 50 mM tris pufr, pH 7,4, 5 mM CaCl₂, 0,002 % NaN₃ a Brij 35 v přítomnosti a nepřítomnosti inhibitoru. Vzorky byly preinkubovány 15 minut při 37 °C před přídavkem fluorimetrického substrátu (Mca-Pro-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂) na konečnou koncentraci 10 mM. Stanovovaný vzorek byl inkubován 90 minut při 37 °C a poté změřen Fluoroscanem II při excitační vlnové délce 355 nm a emisní vlnové délce 460 nm.

Aktivita enzymu byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici stromelyzinu (IC₅₀).

Příklad E

Inhibice tvorby TNFa

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů tvorby TNFa byla určena pomocí následujícího způsobu. lmM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byl inkubován při při 37 °C v atmosféře 5 % CO₂ s buňkami THP-1 (humánními monocyty) suspendovanými v prostředí RPM1 1640 a 20μΜ β-merkaptoethanolu při hustotě buněk 1 x 10⁶mF¹ a za stimulace 5pg/ml konečné koncentrace LPS. Po 18 hodinách byly v supernatantu stanoveny hladiny TNFa užitím komerčně dostupné soupravy ELISA (R & D Systems).

Aktivita tvorby TNFa v přítomnosti 0,1 mM inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici tvorby TNFa (IC50).

Příklad F

Pomocný model artritidy krysy

Sloučeniny obecného vzorce I byly zhodnoceny v pomocném modelu artritidy krysy založeném na způsobech použitých B.B. Newbouldem (1963), Br. J. Pharmacol., 21,127-136 a C.M. Pearsonem a F.D. Woodem (1959), Arthritis Rheum, 2,440-459. Stručně samci krys Wistar (180 až 200 g) byly injektovány u kořenu ocasu Freundovým adjuvans. Za dvanáct dnů byla reagující zvířata námátkově rozdělena do experimentálních skupin. Sloučeniny obecného vzorce I byly dávkovány buď orálně jako suspenze v 1% methylcelulóze nebo intraperitoneálně v 0,2% karboxymethylcelulóze od dvanáctého dne do konce experimentu, dne dvacátého • · ····

·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · ··· · · ·· ·· ·· ·· ···· · • · · · · · · byla reagující zvířata námátkově rozdělena do experimentálních skupin. Sloučeniny obecného vzorce I byly dávkovány buď orálně jako suspenze v 1% methylcelulóze nebo intraperitoneálně v 0,2% karboxymethylcelulóze od dvanáctého dne do konce experimentu, dne dvacátého druhého. Každé dva dny od dvanáctého dne dále byly měřeny objemy zadní tlapky a při ukončení experimentu byly vzaty rentgenové snímky zadní nohy. Výsledky byly vyjádřeny jako procenta vzrůstu objemu nohy nad hodnoty z dvanáctého dne.

Příklad G

Xenoimplantátový model rakoviny vaječníku myši

Sloučeniny obecného vzorce I byly zhodnoceny pomocí rakovinového xenoimplantátového modelu rakoviny vaječníku, založeném na popisu B. Daviese et al (1993), Cancer Research, 53, 2087-2091. Tento model v krátkosti sestává z inokulace samic myši se dvěma regresními alelami 1 x 10⁹ OVCAR3-icr buňkami do peritoneální dutiny. Sloučeniny obecného vzorce I se podají orální cestou jako suspenze v 1% inethylcelulóze nebo intraperitoneálně jako suspenze ve fyziologickém roztoku tlumeném fosfátem v 0,01% Tween20. Při ukončení experimentu (4 až 5 týdnů) se spočetlo množství peritoneálních buňek a zvážila se každá pevná nádorová usazenina. V některých experimentech se sleduje vývoj nádoru měřením specifických nádorových antigenů.

Příklad H

Model rakoviny prsu u krysy

Sloučeniny obecného vzorce I byly zhodnoceny pomocí HOST.l rakovinového modelu rakoviny prsu u krysy (S. Eccles et al (1995), Cancer Research, v tisku). Tento model se skládá z intravenózního naočkování samic krys CBH/cbi 2 x 10⁴ nádorovými buňkami do hrdelní žíly. Sloučeniny obecného vzorce I se podají orální cestou jako suspenze v 1% methylcelulóze nebo intraperitoneálně jako suspenze ve fyziologickém roztoku tlumeném fosfátem v 0,01% Tween20. Při ukončení experimentu (4 až 5 týdnů) byla zvířata zabita, plíce byly odebrány a po 20 hodinové fixaci v Methacarnu byly spočteny jednotlivé nádory.

lutotr-V

Claims

1. Deriváty obecného vzorce I, vyznačující se t í m, že R? je C1-C7 alkylový zbytek, C₂-C₆ alkenylový zbytek, Ci-C₆alkylsubstituovaný arylový zbytek, arylový zbytek, C1-C6 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, heterocyklický zbytek aromatického charakteru nebo C1 -C_ř)alkyl-AR⁹ skupina, kde A je O, NR⁹ nebo S(O)m, kde m = 0 až 2, a R⁹ je H, C1-C4 alkylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, C1-C4 alkylsubstituovaný arylový zbytek nebo C|-C4 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru; jestliže A = NR⁹ , skupiny R⁹ jsou stejné nebo různé;

R² je vodík nebo Cj-Có alkylový zbytek;

R³ je skupina [Alk]nR⁶ , kde Alk je Ci-C6 alkylový zbytek nebo C₂-C₆ alkenylový zbytek a n je nula nebo 1;

X je heterocyklický zbytek aromatického charakteru nebo skupina CONR⁴R⁵, kde R⁴ je vodík nebo Ci-Có alkylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, CjCé alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, cyklofCa-Cójalkylový zbytek, Ci-Có alkylsubstituovaný cyklo(C3-C6)alkylový zbytek, nasycený heterocyklickýfCVCé) zbytek nebo Cj-Có alkylsubstituovaná nasycená heterocyklická(C4-C6) skupina a R⁵ je vodík nebo Cj-Có alkylový zbytek; NR⁴R⁵je také kruh jako pyrrolidinový, piperidinový nebo morfolinový; R⁷ je vodík nebo skupina R¹⁰CO, kde R¹⁰je C1-C4 alkylový zbytek, C]C4alkylsubstituovaný arylový zbytek, Ci-Cý, alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, cyklo(C3-C6)alkylový zbytek, cyklo(C3-C6)alkylsubstituovaný C|C4alkyiový zbytek, C2-Cé alkenylový zbytek, C₂-C6 alkenylsubstituovaný arylový zbytek nebo arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, jak je definováno výše;

R⁸ a R¹⁶jsou stejné nebo různé a jsou každý Ci-C₄alkylsubstituovaný zbytek R¹¹, R^,6je také H;

R⁶ je AR⁹ nebo cyklo(C₃-C6)alkylový zbytek, cyklo(C3-C6)alkenylový zbytek, C|-C₆ alkylový zbytek, C|-C₆alkoxyarylový zbytek, benzyloxyarylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, C1-C3 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického

9 9 9 • · · charakteru, Ci-C₃alky Substituovaný arylový zbytek, Ci-C₆alkyl-COOR⁹, Ci-Cóalkyl-NHR¹⁰,

CONHR¹⁰, NHCO2R¹⁰, NHSO2R¹⁰, NHCOR¹⁰, amidin nebo guanidin;

R¹¹ je COR¹³ nebo NHCOR¹³ nebo kterákoliv ze skupin

9 9

9 999 kde p a q jsou oba 0 nebo 1 a jsou stejné nebo různé, ale když p=q=^:l, pak Y nemůže být H;

R a S jsou každý CH nebo N a jsou stejné nebo různé;

W je O, S(O)_m, kde m=0, 1 nebo 2 nebo NR¹²;

Y a Z jsou každý H nebo C0-C4 alkylsubstituovaný zbytek R¹⁴, kde R¹⁴ je NHR², N(R²)2 (kde každá R² je stejná nebo různá), COOR², CONHR², NHCO2R² (kde R² není H), NHSO₂R² (kde R² není H) nebo NHCOR²; Z se váže do kterékoliv polohy kruhu;

R¹² je vodík, C|-C4alkylový zbytek, COR⁹, CO2R⁹ (kde R⁹ není H), CONHR⁹ nebo SO₂R⁹ (kde R⁹ není H);

R¹³ je C]-C4alkylsubstituovaný zbytek R¹⁵;

R¹⁵ je N(R²)2 (kde každá R⁹ je stejná nebo různá), CO2R⁹, CONHR⁹, CON(R⁹)2 (kde každá R⁹je stejná nebo různá) nebo SO2R⁹ (kde R⁹ není H), ftalimidová skupina nebo skupiny φφ φφφφ «φ φφ φ φ φ · φ φφφ a jejich soli, solváty a hydráty.

2. Derivát podle nároku 1, v y z n a č u j í c i se t í m, že X je CONR⁴R⁵; R⁴ je H, alkylový zbytek nebo arylový zbytek; R^{6 * * * *} není amidin nebo guanidin; R^{11 *} není NHCOR¹³ nebo poslední z daných skupin; R¹⁵ není N(R²)2 nebo poslední z daných skupin; a R¹⁶ je H.

3. Derivát podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že se vybere z N-methylamidu [(2S)sulfanyl-5-[(N,N-dimethylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu, N-methylamidu [(2S)-sulfanyl-5-[(N-methylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-Lterc.Ieucinu.

4. Derivát podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že se vybere z N-methylamidu [(2S)acetylthio-4-(l,5,5-trimethyIhydantoinyl)butanoyl]-L-leucyl-L-terc.leucinu,

N-methylamidu [(2S)-acetylthio-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-(S-methyl)cysteinylL-terc.leucinu,

N-methylamidu [(2S)-acetylthio-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-norvalinyl-Lterc.leucinu,

N-methylamidu N-[2-sulfanyl-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-leucyl-L-terc.leucinu,

N-methylamidu N-[2-sulfanyl-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-(S-methyI)cysteinyl-Lterc.leucinu,

Φ

Φ ··· • φ Φ φφ ··· · φ Φ Φ » · φ φ φ Φ ·· φφ ·· • · · · • φ ·« φφφφ φ • · φ • Φ »φ

N-methylamidN-[2-sulfanyl-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-norvalinyl-Lterc.leucinu.

5. Derivát podle kteréhokoliv předchozího nároku laž4, vyznačující setím, že je jednotlivým enantiomerem nebo diastereomerem nebo směsí takových izomerů.

6. Farmaceutický přípravek pro použití v léčbě, vyznačující se l i m, že obsahuje sloučeninu podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 až 5 a farmaceuticky přijatelný ředící roztok nebo nosič.

7. Způsob použití derivátu podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že se použije pro výrobu humánního nebo veterinárního léku pro léčení nebo prevenci stavu spojeného s matrixovými metaloproteinasami nebo který je zprostředkován TNFa nebo enzymem s anglickým názvem L-selectin sheddase.

8. Způsob použití podle nároku 7, v y z n a č u j í c í s e t í m, že stav je vybrán z rakoviny, zánětu a zánětlivých onemocnění, degenerace tkáně, periodontálního onemocnění, oftalmologického onemocnění, dermatologických poruch, horečky, kardiovaskulárních jevů, hemoragie, koagulace a akutní fázové odezvy, kachexie a anorexie, akutních infekce, HIV infekce, šokových stavů, reakce štěp versus příjemce, autoimunitní onemocnění, reperfuzního poranění, meningitidy a migrény.

9. Způsob použití podle nároku 7, vyznačující se tím, že stav je vybrán z růstu nádoru, vznik benigního nádoru z cév, nádorová invaze a její šíření, metastázy, maligní vodnatelnost a maligní pleurální efúze.

10. Způsob použití podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m, že stav je vybrán z kloubní artritidy,, osteoartritidy, astma, roztroušené sklerózy, neurodegenerace, Alzheimerova aterosklerózy, mrtvice, Crohnovy nemoci a vředovitého zánětu tlustého střeva.

11. Způsob použití podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m, že stav je vybrán z vředovatění rohovky, onemocnění sítnice nebo hojení operačního poranění.

··*· ·· ·· 9999

9 9 » ··· · · ·· • · · · · ··· · ··· • · 9 9 9 9 9 9 9 999 9· • 9 · · 9 · · 9 9 ·to

99 99 99 99 9999

12. Způsob použití podle nároku 7, v y z n a č u j í c í s e t í m, že stav je vybrán z psoriázy, atopické dermatitidy, chronického vředovitého puchýřovitého odloučení epidermis.

13. Způsob použití podle nároku 7, vyznačující se tím, že stav je vybrán z periodontitidy a zánětu dásní.

*

14. Způsob použití podle nároku 7, vyznačující setím, že stav je vybrán z rýmy, alergického zánětu oční spojivky, ekzému a anafylaxie.

«

15. Způsob použití podle nároku 7, vyznačující setím, že stav je vybrán z ristonosis, městnavého selhání srdce, endometriózy, aterosklerózy a endosklerózy.