CZ289711B6

CZ289711B6 - Thiosubstituované peptidy, jejich pouľití jako inhibitorů metaloproteináz a uvolňování TNFalfa a farmaceutický prostředek je obsahující

Info

Publication number: CZ289711B6
Application number: CZ19981017A
Authority: CZ
Inventors: Andrew Douglas Baxter; John Gary Montana; David Alan Owen
Original assignee: Darwin Discovery Limited
Priority date: 1995-10-05
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 2002-03-13
Also published as: BR9610922A; IL123430A0; EP0859784B1; EP0859784A1; AU7139896A; DE69625506T2; KR19990063996A; ATE229972T1; NO981520L; DE69625506D1; IL123430A; NO981520D0; JPH11512733A; HUP0003760A2; DK0859784T3; US5981490A; HUP0003760A3; ES2186803T3; CA2229434A1; MX9802680A

Abstract

e en se t²k thiosubstituovan²ch peptid obecn ho vzorce I a farmaceutick²ch prost°edk je obsahuj c ch. Pou it t chto peptid jako inhibitor matrixov²ch metaloprotein z, jako kolagen zy a stromelyzinu, a uvol ov n n dorov ho nekrotick ho faktoru .alfa..\

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká thiosubstituovaných peptidových derivátů, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků je obsahujících a jejich použití v medicíně

Dosavadní stav techniky

Metaloproteinázy, kolagenáza (lidského fibroblastu), želatináza a nádorový nekrotický faktor (TNF) a způsoby jejich působení a také jejich inhibitory a jejich klinické účinky jsou uveřejněny ve WO 96 11209, jehož obsah je připojen v odkazu.

V normálních tkáních je syntéza buněčné pojivové tkáně vyrovnávána mimobuněčným rozkladem matrixu, přičemž tyto dva protichůdné efekty jsou v dynamické rovnováze. Rozklad matrixu je způsoben činností proteináz uvolňovaných z vlastních buněk pojivové tkáně a činností napadajících zánětlivých buněk a je částečně připsán činnosti alespoň čtyř skupin metaloproteináz. Jsou to kolagenázy (intersticiální kolagenáza MMP-1, PMN kolagenáza, MMP-8, kolagenáza-3, MMP-13), želatinázy (želatináza A, MMP-2, 72kDa želatináza, kolagenáza typu IV želatináza Β, MMP-9, 92 kDa želatináza, kolagenáza typu IV), stromelyziny (proteoglykanáza, MMP-3, stromelyzin-1, tranzin, stromelyzin-2, MMP-10, stromelyzin-3, MMP-11) a metaloproteinázy matrixu membránového typu (MT-1, MMP-14; MT-2, MMP-15; MT-3, MMP-16 a MT-4, MMP-17). Normálně jsou tyto katabolické enzymy pevně regulovány úrovní své syntézy a sekrece a také úrovní své mimobuněčné aktivity, která je regulována činností specifických inhibitorů jako jsou TIMP (tkáňové inhibitory metaloproteináz), které tvoří inaktivní komplexy s metaloproteinázami a obecnějšími inhibitory proteináz jako jsou aj-makroglobuliny.

Zrychlený, nekontrolovaný rozpad pojivové tkáně metaloproteinázou katalyzovaného resorbování mimobuněčného matrixu je rysem mnoha patologických stavů jako je kloubní revmatizmus, osteoartritida, septická artritida, zvředovatění rohovky, epidermální a žaludeční zvředovatění; nádorová metastáze nebo invaze; onemocnění ozubice, proteinurie, koronární trombózy spojené s prasknutím aterosklerotického plátu a onemocnění kosti. Inhibitory nárokované na tomto místě mohou být také užitečné pro zabránění patologickým poruchám doprovázejícím traumatické poranění, které může vést k trvalé nezpůsobilosti. Tyto sloučeniny také mají použití jako prostředky pro kontrolu porodnosti zamezením ovulace nebo uhnízdění oplodněného vajíčka. Lze očekávat, že patogeneze těchto nemocí se pravděpodobně pozmění užitečným způsobem podáním inhibitorů metaloproteináz. Pro tento účel byly navrženy mnohé sloučeniny [pro obecný přehled viz R. C. Wahl et al Ann. Rep., Med. Chem. 25:175-184, Academie Press lne., San Diego (1990)].

Bylo popsáno množství sloučenin podobných nízkomolekulámím peptidům, které inhibují metaloproteinázy. Asi nejpozoruhodnější z těchto sloučenin jsou ty, které se vztahují k enzymu přeměňujícímu angiotenzin (ACE), kde tato činidla blokují přeměnu dekapeptidu angiotenzinu I na angiotenzin II, silně účinnou tlak ovlivňující látku. Sloučeniny tohoto typu jsou popsány vEP-A-0 012 401. Také příbuzné merkaptoamidové peptidické deriváty vykázaly ACE inhibiční aktivitu in vitro a in vivo (Η. N. Weller et al (1984), Biochem Biophys. Res. Comm., 125(1): 82-89).

TNF je cytokinin, který je produkován zpočátku jako s buňkou spojený 28kD prekurzor. Uvolňuje se v aktivní 17kD formě (D-M Jue et al., (1990) Biochemistry, 29:8371-8377), která může zprostředkovávat velké množství škodlivých vlivů in vivo. Při podání živočichům či lidem

-1 CZ 289711 B6 způsobuje zánět, horečku, kardiovaskulární efekty, hemoragii, koagulaci a akutní fázové odezvy podobné těm, které jsou pozorovány během akutních infekcí a šokových stavů. Chronické podávání může také způsobit kachexii a anorexii. Nahromadění nadbytečného TNF může být také smrtelné.

Z modelových studií na zvířatech existují významné důkazy, že blokace účinku TNF specifickými protilátkami může být přínosná při akutních infekcích, šokových stavech, reakcích štěp versus příjemce a autoimunitního onemocnění. TNF je také samozmenšovacím růstovým faktorem pro některé myelomy a lymfomy a může inhibovat normální krvetvorbu u pacientů s těmito nádory.

Předpovídá se proto, že zabránění produkci nebo účinku TNF je účinnou terapeutickou strategií pro mnohé zánětlivé, infekční, imunologické a zhoubné nemoci. Tyto nemoci zahrnují, avšak nejsou omezeny na septický šok, hemodynamický šok a otravu krve (Mathison et al (1988) J. Clin. Invest. 81: 1925-1937; Miethke et al (1992), J. Exp. Med. 175:91—98), postischemické poranění opětným promýváním, malárii (Grau et al (1989), Immunol. Rev. 112: 49-70); mykobakteriální infekci (Bames et al (1992) Infect. Imm. 60:1441-6), meningitidu, psoriázu, městnavé selhání srdce, onemocnění vaziva, kachexii, odhojení štěpu, rakovinu, autoimunitní onemocnění, kloubní revmatismus, roztroušenou sklerózu, radiační poškození, otravné stavy následující po podání imunosupresívních monoklonálních protilátek jako OKT3 nebo CAMPATH-1 a alveolámí poranění zvýšeným obsahem kyslíku.

Běžné klinické strategie proti TNF zahrnují použití kortikosteroidů jako je dexamethason a použití cyklosporinu-A nebo FK506, které jsou nespecifickými inhibitory benové transkripce cytokininu. Inhibitory fosfodiesterázy jako je pentoxyfílin se ukázaly být specifičtějšími inhibitory genové transkripce TNF (Endres S. (1991) Immunol. 72:56-60, Schandene et al (1992), Immunol. 76:30-34, Alegre M. L. et al (1991), Transplantation 52:674-679, Bianco et al (1991) Blood 78:1205-1221. Bylo ukázáno, že Thalidomid také inhibuje produkci TNF leukocyty (Sampajo et al (1991), J. Exp. Med. 173:699-703). V experimentálních uspořádáních bylo také ukázáno, že anti-TNF monoklonální protilátky, rozpustné receptory TNF a rozpustné receptory/imunoadheziny TNF specificky inhibují účinky působení TNF (Bagby et al (1991) J. Infect. Dis. 163:83-88, Charpentier et al (1991) Pressemed. 20:2009-2011, Silva et al (1990) J. Infect. Dis. 162:421-427; Franks et al (1991) Infect. Immun. 59:2609-2614, Tracey et al (1987) Nátuře 330:662-664; Fischer et al (1992) PNAS USA v tisku, Lesslauer et al (1991) Eur. J. Immunol. 21:2883-2886, Ashkenazi et al (1991) PNAS USA 88:10535-10539).

Nedávno bylo ukázáno, že účinky TNF jsou zprostředkovány dvěma peptidy, TNFa a TNFp. Ačkoliv jsou tyto peptidy navzájem homologické pouze ze 30 %, aktivují ty samé receptory a jsou kódovány bezprostředně sousedními geny. Jak je zde používáno, termín nádorový nekrotický faktor nebo TNF proto znamená nádorový nekrotický faktor a a peptidy, které mají vysoké stupně homologie sekvencí s TNFa nebo značně podobné fyziologické účinky jako TNFa, jako například TNFp.

Jedním z cílů předloženého vynálezu je poskytnout sloučeniny, které podstatně inhibují uvolňování TNF z buněk a proto se používají v léčení stavů zprostředkovaných TNF. Taková použití zahrnují, ale nejsou omezena na léčbu zánětu, horečky, kardiovaskulárních efektů, hemoragie, koagulace a akutní fázové odezvy, kachexie a anorexie, akutních infekcí, šokových stavů, reakce štěpu proti hostiteli a autoimunitního onemocnění.

Bylo ukázáno, že sloučeniny, které mají vlastnost inhibice činnosti metaloproteináz, které jsou zapojeny do rozpadu pojivové tkáně, jako je kolagenáza, stromelyzin a želatináza, inhibují uvolňování TNF jak in vitro, tak in vivo (A. J. H. Gearing et al (1994), Nátuře, 370:555-557; G. M. McGreehan et al (1994), Nátuře, 370-558-561; WO 93/20047). Všechny tyto popsané inhibitory obsahují skupinu s hydroxamovou kyselinou, která váže zinek.

-2CZ 289711 B6

Jak je uznáváno odborníky v oboru, značná míra homologie mezi kolagenázou lidského fibroblastu, stromelyzinem a želatinázou vede k možnosti, že sloučenina, která inhibuje jeden enzym, může do určitého stupně inhibovat všechny. Sloučeniny, které inhibují kolagenázu, zahrnují ty, které jsou obsažené v US patentu č. 4 511 504 vydaného 16. dubna 1985 a US patentu č. 4 568 666 vydaného 4. února 1986. Sloučeniny podobné struktury, které jsou nárokovány na inhibici stromelyzinu (proteoglykanáza) jsou obsaženy v US patentu č. 4 771 037 vydaném 13. září 1988.

Panuje přesvědčení, že inhibitory stromelyzinu a kolagenázy mohou mít využití v prevenci poškození kloubních chrupavek, spojeného se septickou artritidou. Bakteriální infekce kloubů mohou vyvolat zánětlivou reakci, která může přetrvat i po odstranění infekčního agens a rezultovat v permanentním poškození strukturních komponent. Bakteriální činidla byla použita v modelech se zvířaty k vyvolání artritické reakce s objevením se proteolytických aktivit. Viz J. P. Čase et al (1989), J. Clin. Invest., 84:1731-40; R. J. Williams et al (1990), Arth. Rheum. 33:533-41.

Panuje přesvědčení, že inhibitoiy stromelyzinu, kolagenázy a želatinázy mohou být užitečné ke kontrole nádorových metastáz, s výhodou v kombinaci se souběžnou chemoterapií a/nebo ozařováním. Viz L. M. Martisian et al (1986), Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 83:9413—7; S.M. Wilhelm et al (1987), ibid. 84:6725-29; Werb et al (1989), J. Cell Biol., 109:872-889; L. A. Liotta et al (1983), Lab. Invest., 49:636-649; Reich et al vMetastasis, Ciba Foundation Symposium, Wiley, Chichester, 1988, str. 193-210.

Vylučované proteinázy jako stromelyzin, kolagenáza a želatináza hrají důležitou roli v procesech zahrnujících pohyb buněk během metastázové nádorové invaze. Skutečně je také dokázáno, že matrixové metaloproteinázy jsou vylučovány v nadbytku v určitých metastázových nádorových buněčných řadách. V tomto kontextu enzym zastává funkci umožňující průchod vlastních základních membrán a dovoluje nádorovým buňkám uniknout z místa tvorby primárního nádoru a dostat se do oběhu. Po přilnutí ke stěnám krevních cév používají nádorové buňky ty samé metaloproteinázy k provrtání vlastních základních membrán a proniknutí ostatními tkáněmi a tak vedou k nádorovým metastázám. Inhibice tohoto procesu by zabránila metastázám a zlepšila by účinnost běžných léčeb chemoterapeutiky a/nebo ozařováním.

Tyto inhibitory by také měly být užitečné v kontrole periodontálních onemocnění, jako je zánět sliznice dásně. Z fíbroblastů zanícené dásně byly odseparovány jak kolagenázové, tak stromelyzinové účinky (Uitto et al (1981), J. Periodontal Res., 16:417-424). Hladiny enzymů byly korelovány se závažností průběhu onemocnění dásně; C. M. Overall et al (1987), J. Periodontal Res., 22:81-88.

Proteolytické procesy byly také pozorovány při zvředovatění rohovky následující po popáleninách alkáliemi (S. I. Brown et al (1969), Arch. Opthalmol., 81:370-373). Peptidy obsahující merkaptoskupinu inhibují kolagenázu izolovanou z králičí rohovky popálené alkálií (F. R. Bums et al (1989), Invest. Opthalmol., 30:1569-1575). Léčení alkáliemi popálených očí nebo očí vykazujících zvředovatění rohovky v důsledku infekce pomocí inhibitorů těchto metaloendoproteináz v kombinaci s citranem sodným nebo askorbanem sodným a/nebo antimikrobiálními prostředky je efektivní v prevenci vývoje rozpadu rohovky.

Účast stromelyzinu byla prokázána v degradaci strukturních komponent glomerulámí základní membrány (GBM) ledviny, jejíž hlavní funkcí je omezovat průchod proteinů plazmy do moči (W. H. Baricos et al (1989), Biochem. J., 254:609-612). Proteinurie, jako výsledek glomerulámího onemocnění, znamená nadbytek bílkoviny v moči, způsobený zvýšenou propustností GBM pro proteiny plazmy. Základní příčiny zvýšené propustnosti GBM jsou neznámé, ale proteinázy, které zahrnují stromelyzin, mohou hrát důležitou roli v glomerulámích onemocněních. Inhibice tohoto enzymu může zmírnit proteinurii spojenou se špatnou funkcí ledviny.

-3CZ 289711 B6

Uvažuje se, že inhibice činnosti matrixové metaloproteinázy brání prasknutí aterosklerotických povlaků vedoucích ke koronární trombóze. Trhání či prasknutí aterosklerotických povlaků je nejběžnějším případem počínajícím koronární trombózu. Tvrdí se, že destabilizace a degradace matrixové pojivové tkáně, která obklopuje tyto povlaky, pomocí proteolytických enzymů nebo cytokininů uvolněných vnikajícími zánětlivými buňkami, je příčinou trhlin povlaku. Takové trhání těchto povlaků může způsobit akutní trombolytické případy, jak krev rychle vytéká z krevních cév. Vysoké hladiny mediátorové RNA stromelyzinu byly nalezeny lokalizovány v individuálních buňkách aterosklerotických povlaků odstraněných v době operace ze srdce transplantovaných pacientů (A. M. Henney et al (1991), Proč. Naťl. Acad. Sci. USA, 88:8154-8158). Inhibice stromelyzinu těmito sloučeninami pomáhá zabránit či zpozdit degradaci matrixu pojivové tkáně, který stabilizuje aterosklerotické povlaky, a tak zabraňuje případům vedoucím k akutní koronární trombóze.

Nedávno bylo ukázáno na modelu městnavého selhání srdce (CHF) u prasete, že během CHF jsou patrné změny v morfologické struktuře srdce. Ventrikulámí rozšíření a zeslabení stěn způsobené změnami extracelulámího matrixu má za následek méně kolagenových spojení mezi kardiomyocyty a méně celkového kolagenu. V takovém příkladě slabší síla kontrakce vede k neefektivní komorové činnosti. Panuje přesvědčení, že specifické inhibitory matrixových metaloproteináz budou hrát klíčivou roli při stabilizaci extracelulámího matrixu, a proto budou důležité v léčbě a/nebo prevenci CHF.

Nedávno bylo ukázáno (WO 96/0240), že inhibitory matrixových metaloproteináz jako kolagenázy a stromelyzinu také inhibují tvorbu rozpustného lidského CD23. CD23 je úplný protein typu II o hmotnosti 45kDA, který se vylučuje na povrchu různých dospělých buněk, v to zahrnujíc B a T lymfocyty, makrofágy, NK buňky, Langerhansovy buňky, monocyty, eosinofily a krevní destičky (Delespesse et al (1991), Adv. Immunology, 49:149; Grangette et al (1989), J. Immunol, 143:3580). Některé aktivity v člověku byly připsány rozpustnému CD23, přičemž všechny zahrnují regulaci IgE. Jednotlivé aktivity zahrnují:

i) rozpoznání antigenu, ii) IgE zprostředkovanou cytotoxicitu eozinofilního leukocytu, iii) navedení B buněk do lymfatických uzlin a sleziny, iv) omezení syntézy IgE.

Paušálně je tak nadbytečná produkce rozpustného CD23 zapojena v nadprodukci IgE, která je známkou alergických nemocí jako astma vyvolané vnějšími faktory, lýma, alergický zánět spojivek, ekzém, atopická dermatitida a anafylaxie (Sutton et al (1993), Nátuře, 366:421). Zvýšené hladiny rozpustného CD23 byly také pozorovány v séru pacientů s chronickou B leukémií lymfocytů (Safarti et al (1988), Blood, 71:94), a vsynoviálním moku pacientů s revmatickou artritidou (Chomarat et al (1993), Arthritis and Rheumatism, 36:234).

Nedávné zprávy spekulují, že nové enzymy ze skupiny MMP enzymů také zprostředkují ztrátu přilnavosti molekul jako jsou selektiny, jako je L-selektin. Tyto rozpustné přilnavé molekuly se účastní v četných nemocech, vně zahrnujících rakovinu, autoimunitní a zánětlivé reakce. Bylo navrženo, že selektin po odštěpení se váže na určité ligandy a to vysvětluje jejich biologickou aktivitu. Tak látky, které interferují se selektiny nebo zamezují navázání ligandů k selektinům, budou užitečnými léky pro léčení rozmanitých nemocí popsaných výše. Proto je dalším cílem předloženého vynálezu poskytnout sloučeniny, které inhibují ztrátu určitých přilnavých molekul a tak poskytnout výrobu léku pro léčení nebo profylaxi poruch jako je rakovina, autoimunitní onemocnění nebo zánětlivá onemocnění (jako je zánětlivé onemocnění střev a roztroušená skleróza).

Má se také za to, že specifické inhibitory stromelyzinu a kolagenázy by mohly být užitečné jako porodnost kontrolující agens. Existují důkazy, že exprese metaloproteináz - v to zahrnujíc

-4CZ 289711 B6 stromelyzin a kolagenázu - je pozorována u neoplodněných vajíček a zygot a při dalším rýhování a je zvýšena v blastocystové fázi vývoje plodu a při endodermní diferenciaci (C. A. Brenner et al (1989), Genes & Develop., 3:848-59). Analogicky s nádorovou invazí může blastocysta exprimovat metaloproteinázy za účelem proniknutí extracelulámího matrixu děložní stěny během uhnízdění oplodněného vajíčka. Inhibice stromelyzinu a kolagenázy během těchto raných vývojových procesů by mohla zabránit normálnímu embyonickému vývoji a/nebo uhnízdění oplodněného vajíčka v děloze. Takový zásah by utvořil novou metodu kontroly porodnosti. Navíc existuje důkaz, že kolagenáza je důležitá při ovulačních procesech. V tomto příkladě musí být proniknuta vrstva kolagenu ve vrcholové oblasti folikulu, aby se vajíčko uvolnilo. Během tohoto procesu byla detekována kolagenáza a bylo prokázáno, že inhibitor je účinný při zabránění ovulace (J. F. Woessner et al (1989), Steroids, 54:491-499). Také stromelyzin může hrát aktivní roli během ovulace. (C. K. L. Too et al (1984), Endocrin., 115:1043-1050).

Kolagenolytické a stromelyzinové aktivit byly také pozorovány při dystrofícké epidermolytické bulóze (A. Kronberger et al (1982), J. Invest. Dermatol., 79:208-211; D. Sawamura et al (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 184:1003-8). Inhibice metaloendoproteináz by měla omezovat lychlou destrukci pojivových součástí kůže.

Kromě extracelulámího matrixu obsahujícího strukturní složky může stromelyzin degradovat další in vivo substráty jako inhibitoiy, jako inhibitor aj-proteinázu a může proto ovlivnit působení jiných proteináz jako elastázy (P. G. Winyard et al (1991), FEBS Letts., 279,1:91-94). Inhibice matrixových metaloendoproteináz může umocnit antiproteinázové působení těchto endogenních inhibitorů.

Z nedávných publikací je zřejmé, že bylo identifikováno několik nových enzymů ze skupiny MMP, přičemž některé z nich mohou být důležité v nemoci. Kolagenáza 3, která je specifickým enzymem buněk rakovinového nádoru prsu, může být užitečná při rakovině prsu (J. Μ. P. Freije et al (1994), J. Biol. Chem., 269(24):16766-16773), zatímco enzymy MT-MMP, které jsou dalšími členy enzymů skupiny MMP, byly prokázány jako klíčové enzymy v aktivaci želatinázy A (H. Sáto et al (1994), Nátuře, 370:61—65). Želatináza A je důležitým enzymem pro růst a metastázu nádorů (jak bylo výše definováno).

Bylo prokázáno, že degradace bílkovinného prekurzoru b-amyloidu (APP) generuje amyloidní povlaky, které jsou hlavní složkou stařeckých povlaků nalezených u pacientů s Alzheimerovou chorobou (AD). Dvě nedávné publikace zjistily, že metaloproteinázové enzymy štěpí APP na amyloidní povlaky (C. R. Abraham et al (1994), Biochemistry, 33:192-199; G. Huber et al (1994), Biochem. Biophys. Res. Comm., 201 (1):45-53).

Jak je uznáváno odborníky v oboru, značná poměrná část homologie mezi těmito novými enzymy a jinými enzymy ze skupiny MMP vede k možnosti, že sloučenina, která inhibuje jeden enzym, může do určitého stupně inhibovat tyto nové enzymy. Proto inhibitory zahrnuté v tomto vynálezu jsou užitečné u nemocí, ve kterých jsou tyto nové enzymy zapojeny.

Proto je dalším cílem tohoto vynálezu poskytnout sloučeniny, které navíc k inhibici uvolňování TNF také inhibují činnost enzymů MMP, a proto se používají při léčení pacientů, kteří strádají stavy zprostředkovanými TNF a/nebo enzymy MMP.

Je proto dalším cílem předloženého vynálezu poskytnout sloučeniny, které inhibují tvorbu lidského rozpustného CD23, aby se vyrobil lék pro léčení nebo profylaxi poruch jako je alergie a autoimunitní onemocnění, při kterých hraje roli nadprodukce rozpustného CD23, jako u těch, popsaných výše.

-5CZ 289711 B6

Podstata vynálezu

Vynález se týká nových thiosubstituovaných derivátů obecného vzorce I, které jsou znamenitými inhibitory nemocí přenášených metaloproteinázami matrixu a/nebo TNFa, v to zahrnujíc degenerativní nemoci (takové, které jsou definovány výše a ve WO 96 11209) a některých karcinomů. Dále pak jejich použití a farmaceutických prostředků tyto deriváty obsahujících.

V prvém aspektu vynález poskytuje thiosubstituované peptidy obecného vzorce I

R7S

O R¹ R²

R⁸ R¹⁶ O R³

0), kde R¹ je Ci-C7 alkylový zbytek, C2-C6 alkenylový zbytek, C]-C6 alkylsubstituovaný arylový zbytek, arylový zbytek, Ci-Ce alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, heterocyklický zbytek aromatického charakteru nebo Ci-C6 alkyl-AR⁹ skupina, kde A je O, NR⁹ nebo S(O)m, kde m = 0 až 2, a R⁹ je H, C]-C₄ alkylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, C1-C4 alkylsubstituovaný arylový zbytek nebo C1-C4 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru; jestliže A = NR⁹, skupiny R⁹ jsou stejné nebo různé;

přičemž aiylový zbytek je případně substituovaný fenyl nebo naftyl se substituenty vybranými ze skupiny obsahující halogen, trifluormethyl, C]_6 alkylový zbytek, alkoxyl a fenyl, a heterocyklický zbytek aromatického charakteru je aromatický kruhový systém pěti až deseti atomů, z nichž alespoňň jeden je vybrán ze skupiny obsahující kyslík, dusík a síru,

R² je vodík nebo C1-C6 alkylový zbytek;

R³ je skupina [Alk]_nR⁶, kde Alk je Ci-Ce alkylový zbytek nebo Cr-Ce alkenylový zbytek a n je nula nebo 1;

X je heterocyklický zbytek aromatického charakteru nebo skupina CONR⁴R⁵, kde R⁴ je vodík nebo Ci-C₆ alkylový zbytek, aiylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, Ci-C₆ alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, cyklo(C₃-C₆)alkylový zbytek, Ci-C₆ alkylsubstituovaný cyklo(C₃-C₆)alkylový zbytek, nasycený heterocyklickýC₄-C₆) zbytek nebo Ci-C₆ alkylsubstituovaná nasycená heterocyklická(C₄-C6) skupina a R⁵ je vodík nebo Ci-Cé alkylový zbytek; NR⁴R⁵ je pyrrolidinový, piperidinový nebo morfolinový kruh, přičemž heterocyklický zbytek aromatického charakteru a arylový zbytek je jak uvedeno výše;

R⁷ je vodík nebo skupina R¹⁰CO, kde R¹⁰ je Ci-C₄ alkylový zbytek, Ci-C₄alkylsubstituovaný arylový zbytek, Ci-C₆ alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, cyklo(C₃-C₆)alkylový zbytek, cyklo(C₃-C₆)alkylsubstituovaný Ci-C₄alkylový zbytek, C2-C6 alkenylový zbytek, C₂-Ce alkenylsubstituovaný arylový zbytek nebo arylový zbytek, nebo heterocyklický zbytek aromatického charakteru, jak je definováno výše;

přičemž nasycený heterocyklický (C₄-C₆) zbytek je nasycený heterocyklický zbytek se čtyřmi až šesti atomy uhlíku a mající alespoň jeden heteroatom vybraný ze skupiny obsahující dusík, kyslík nebo síru,

R⁸ a R¹⁶ jsou stejné nebo různé ajsou každý Ci-C₄alkylsubstituovaný zbytek Rⁿ, R¹⁶je také H;

-6CZ 289711 B6

R⁶ je AR⁹ nebo cyklo(C3-C6)alkylový zbytek, cyklo(C3-C6)alkenylový zbytek, Ci-C6 alkylový zbytek, Cj-Có alkoxyarylový zbytek, benzyloxyarylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, Ci-C3 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, Ci-C3alkylsubstituovaný arylový zbytek, C]-C6 alkyl-COOR⁹, Ci~C6 alkyl-NHR¹⁰, CONHR¹⁰, NHCO2R¹⁰, NHSO2R¹⁰, NHCOR¹ , amidino nebo guanidino, skupina přičemž arylový zbytek a heterocyklický zbytek aromatického charakteru jsou jak uvedeno výše,

R¹¹ je COR¹³ nebo NHCOR¹³ nebo kterákoliv ze skupin

kde p a q jsou oba 0 nebo 1 a jsou stejné nebo různé, ale když p=q=l, pak Y nemůže být H;

R a S jsou CH nebo N a jsou stejné nebo různé;

W je O, S(O)_m, kde m=0,1 nebo 2 nebo NR¹²;

Y a Z jsou oba H nebo Co-C₄ alkylsubstituovaný zbytek R¹⁴, kde R¹⁴ je NHR², N(R²)2, kde oba zbytky R² jsou stejné nebo různé, COOR², CONHR², NHCO2R², kde R² není H, NHSO₂R², kde R² není H nebo NHCOR²; Z se váže do kterékoliv polohy kruhu;

R¹² je vodík, C]-C4alkylový zbytek, COR⁹, CO2R⁹, kde R⁹ není H, CONHR⁹ nebo SO₂R⁹, kde R⁹ není H;

R¹³ je C]-C₄alkylsubstituovaný zbytek R¹⁵;

R¹⁵ je N(R⁹)2, kde každý zbytek R⁹ je stejný nebo různý), CO2R⁹, CONHR⁹, CON(R⁹)2, kde každá R⁹ je stejná nebo různá, nebo SO2R⁹, kde R⁹ není H, ftalimidová skupina nebo skupiny a, b, c, d, e

Popsání vynálezu

Sloučeniny podle vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více asymetricky substituovaných uhlíkových atomů, například těch, které jsou označeny hvězdičkou ve vzorci I. Přítomnost jednoho nebo více těchto asymetrických center ve sloučenině vzorce I dává vznik stereoizomerům, přičemž vynález se v každém případě vztahuje na všechny takové stereoizomery, v to zahrnujíc enantiomery a diastereomery a směsi zahrnující jejich racemické směsi.

Ve vzorcích zde je ~ vlnovka použita u potenciálního asymetrického centra ke znázornění možnosti konfigurace R a S, znaménko < a tečkovaná přímka .... ke znázornění jedinečné konfigurace na asymetrickém centru.

Jak je používáno ve výčtu, ať samotný či v kombinaci, termín „C1-C7 alkylový zbytek“ se vztahuje k nerozvětveným nebo rozvětveným řetězcům alkylové skupiny, které má od jednoho do šesti uhlíkových atomů, v to zahrnujíc například methyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, terc.butyl, pentyl, hexyl, heptyl a podobně,“Ci-C₆ alkylový zbytek“ znamená to samé, až do 6 uhlíkových atomů, například hexyl, „C1-C4 alkylový zbytek“ znamená to samé až do 4 uhlíkových atomů, například butyl nebo terc.butyl.

Termín „C₂-C₆ alkenylový zbytek“ se vztahuje k nerozvětvenému nebo rozvětvenému řetězci alkylové skupiny, který má dva až šest uhlíkových atomů a má navíc jednu dvojnou vazbu, jak v E, tak v Z prostorovém uspořádání, kde toto přichází v úvahu. Tento termín zahrnuje například vinyl, 1-propenyl, 1- a 2-butenyl, 2-methyl-2-propenyl etc.

Termín „cyklo(C₃-C6)alkylový zbytek“ se vztahuje k nasycené alicyklické skupině, která má tři až šest uhlíkových atomů a zahrnuje například cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl a podobně.

Termín „cyklo(C₃-C₆)alkenylový zbytek“ se vztahuje k alicyklické skupině, která má od tří do šesti uhlíkových atomů a navíc má jednu dvojnou vazbu. Tento termín zahrnuje například cyklopentenyl nebo cyklohexenyl.

-8CZ 289711 B6

Termín „nasycený heterocyklický(C4-C6)zbytek“ se vztahuje k nasycenému heterocyklickému zbytku, který má čtyři až šest uhlíkových atomů a jednu nebo více heteroatomů vybraných ze skupiny N, O, S a zhmuje například azetidinyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuryl, piperídinyl a podobně.

Termín „aryl“ nebo „arylový zbytek“ znamená s výhodou substituovaný fenyl nebo naftyl se substituentem (substituenty) vybranými(i) například z halogenu, trifluormethylu, Ci-Ce alkylového zbytku, alkoxy skupiny, fenylu a podobně.

Termín „halogen“ znamená fluor, chlor, brom nebo jod.

Termíny „chráněná aminoskupina“ a „chráněná karboxyskupina“ znamenají aminoskupinu nebo karboxyskupinu, které jsou chráněny způsobem známým odborníkům v oboru. Například aminoskupina může být chráněna benzyloxykarbonylem, terc.butoxykarbonylem, acetylem nebo podobnými skupinami nebo ve formě ftalimidové skupiny nebo podobné skupiny. Karboxylová skupina může být chráněna ve formě snadno rozštěpitelného esteru jako je methylester, ethylester, benzylester nebo terc.butylester.

Termín „alkoxy“ se vztahuje k nerozvětvenému nebo rozvětvenému řetězci alkoxyskupiny, která obsahuje maximálně šest uhlíkových atomů, jako je methoxyskupina, ethoxyskupina, propoxyskupina, izopropoxyskupina, butoxyskupina, terc.butoxyskupina a podobně.

Termín „heterocyklický zbytek aromatického charakteru“ se vztahuje k aromatickému kruhovému systému pěti až deseti atomů, z nichž alespoň jeden atom je vybrán ze skupiny O, N a S a zahrnuje například furyl, thienyl, pyridyl, indolyl, chinolyl a podobně.

Soli sloučenin vzorce I zahrnují farmaceuticky přijatelné soli, například adicí odvozené kyselé soli kyselin, odvozené od anorganických nebo organických kyselin, jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, p-toluensulfonany, fosforečnany, sírany, chloristany, octany, trifluoroctany, propionany, citrany, malonany, jantarany, mléčnany, šťavelany, vínany a benzoany.

Soli se také tvoří se zásadami. Takové soli zahrnují soli odvozené od anorganických nebo organických zásad, jako například soli alkalických kovů jako jsou hořečnaté nebo vápenaté soli a soli organických aminů jako jsou soli morfolinu, piperidinu, dimethylaminu nebo diethylaminu.

Když je „chráněná karboxyskupina“ ve sloučeninách podle vynálezu ve formě esterifíkované karboxyskupiny, může se jednat o metabolicky nestálý ester vzorce CO2R¹⁷, kde R¹⁷ je ethyl, benzyl, fenethyl, fenylpropyl, a- nebo β-naftyl, 2,4-dimethylfenyl, 4-terc.butylfenyl, 2,2,2-trifluorethyl, l-(benzyloxy)benzyl, l-benzyloxy)ethyl, 2-methyl-l-propionyloxypropyl, 2,4,6—trimethylbenzyloxymethyl nebo pivaloyloxymethyl.

Sloučeniny obecného vzorce I se připravují jakoukoliv vhodnou metodou známou v oboru a/nebo následujícími způsoby, které samy tvoří součást vynálezu.

Druhým aspektem vynálezu je poskytnout způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I, jak je definováno výše. Je třeba uvést, že je-li požadován jednotlivý stereoizomer vzorce I, mohou být užity zde popsané syntetické způsoby s vhodnou výchozí surovinou o stejné chiralitě a/nebo izomery ze směsí mohou být rozděleny s použitím běžných separačních technik (například HPLC).

Sloučeniny podle vynálezu se připravují následujícím způsobem. V popisu a vzorcích níže skupiny R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, R , R¹⁷, A, B, C, R, S, W, X, Y a Z jsou jak byly definovány výše, kromě toho, kde jsou definovány jinak. Je třeba uvést, že funkční skupiny jako aminoskupiny, hydroxyskupiny nebo karboxyskupiny, které jsou v různých sloučeninách popsaných níže a které je žádoucí udržet, je možné mít v chráněné formě před tím,

-9CZ 289711 B6 než jakákoliv reakce bude započata. V těchto případech je odstranění chránící skupiny posledním krokem u jednotlivé reakce. Vhodné chránící skupiny pro tyto funkční skupiny budou zřejmé odborníkům v oboru. Pro specifické detaily viz T. W. Greene, P. G. M. Wutts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley Interscience.

Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I zahrnuje odstranění chránění (například hydrolýzou) sloučeniny o vzorci Π,

R⁷S-CHR⁸-CO-NR¹⁶-CHR‘-CO-NR²-CHR-X (II), kde R⁷ představuje vhodnou chránící skupinu (například terc.butyl, trityl, benzoyl nebo octan.

Bude oceněno, že kde je vyžadován jednotlivý stereoizomer vzorce I, tento se získá běžnými rozdělovačům technikami, jako vysokoůčinnou kapalinovou chromatografií. Avšak kde je žádoucí, užije se vhodná výchozí surovina o stejné chiralitě ve spřažených reakcích pro zisk jednotlivého stereoizomeru vzorce I. Toto je níže doloženo příkladem.

Meziprodukty obecného vzorce Π se připravují reakcí kyseliny vzorce ΠΙ r⁷s-chr⁸-cooh (m), nebo jejího aktivního derivátu, kde R⁷ a R⁸ jsou definovány výše, s aminem vzorce IV.

R^,6NH-CHR’-CO-NR²-CHR³-X (IV).

Aktivní deriváty kyselin vzorce III zahrnují například anhydridy kyselin nebo halogenidy kyselin, jako chloridy kyselin.

Spřažená reakce se provádí za použití standardních podmínek pro aminační reakce tohoto typu. Reakce tak probíhá v rozpouštědle, jako například v inertním organickém rozpouštědle jako je ether, jako například v cyklickém etheru tetrahydrofuranu, dále jako je amid, jako například v substituovaném amidu, jako je dimethylformamid, nebo jako je halogenovaný uhlovodík, jako dichlormethan při nízké teplotě například od -30 °C do teploty okolí, jako od -20 °C do 0 °C, s výhodou v přítomnosti zásady, jako například organické zásady jako je amin, například triethylamin nebo cyklický amin jako je N-methylmorfolin. Kde se používá kyseliny vzorce III, reakce může být navíc provedena v přítomnosti kondenzačního činidla, například diimidu jako je Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid, výhodně v přítomnosti triazolu jako je 1-hydroxybenzotriazol. Alternativně kyselina může před reakcí s aminem vzorce IV reagovat s chloromravenčanem, jako například chloromravenčanem ethylnatým.

Amin obecného vzorce IV se připravuje reakcí kyseliny vzorce V

R¹⁶NH-CHR‘-COOH ( V ) nebo jejího aktivního derivátu s aminem vzorce VI

R²NH-CHX-R³ (VI) s následným odstraněním kterékoliv z chránících skupin.

Aktivní deriváty kyselin vzorce V zahrnují například anhydridy kyselin nebo halogenidy kyselin, jako jsou chloridy kyselin, jak bylo v hlavních rysech popsáno dříve.

Aminokyseliny a jejich deriváty, jak jsou znázorněny obecnými vzorci V a VI, se získají v chirální nebo racemické formě. V chirální formě poskytují asymetrické stavební bloky pro

-10CZ 289711 B6 chirální syntézu sloučenin obecného vzorce I. Mnohé tyto deriváty lze snadno získat z komerčně dostupných výchozích surovin použitím způsobů známých odborníkům v oboru. (VizM. Bodanszk et al, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York, 1984; WO92/21360).

Sloučeniny obecného vzorce II se připravují nukleofilní substitucí sloučenin vzorce VII, r⁸r^,8c-co-nr¹⁶-chr’-co-nr²-chr³-x (vn), kde R¹⁸ představuje vhodnou odstupující skupinu, například halogen jako je bromid nebo ester alkansulfonové kyseliny, jako je methansulfonan, s thiolem vzorce VIII

R⁷SH (VIR) za užití standardních podmínek známých odborníkům v oboru, jak je doloženo příkladem ve W090/05719.

Thioly obecného vzorce VIII lze získat z komerčně dostupných výchozích surovin při použití způsobů známých odborníkům v oboru. Mnohé thioly obecného vzorce VIII jsou také k dispozici komerčně.

Sloučeniny vzorce VII se připravují reakcí kyseliny vzorce IX

R¹⁸R³CH-COOH (IX ) s aminem vzorce IV, kde R¹⁸ a R⁸ jsou jak byly výše definovány, nebo jejich vhodně chráněné verze, nebo jejich aktivní deriváty za použití podobných reakčních podmínek popsaných pro přípravu sloučenin vzorce Π.

Karboxylové kyseliny o strukturách popsaných vzorci ΠΙ a IX se získají v chirální nebo racemické formě. Mnohé tyto deriváty lze snadno získat z komerčně dostupných výchozích surovin při použití způsobů známých odborníkům v oboru (viz WO 90/05719).

Meziprodukty vzorce II se připraví reakcí kyseliny vzorce X,

R⁷S-CHR⁸-CO-NR¹⁶-CHR¹-COOH ( X), kde R¹, R⁷ a R⁸ jsou definovány výše nebo aktivního derivátu kyseliny s aminem vzorce VI způsobem popsaným dříve.

Kyseliny obecného vzorce X se jedna po druhé připraví reakcí kyseliny vzorce ΙΠ nebo jejího aktivního derivátu s aminem vzorce V nebo jeho vhodně chráněným derivátem s následným odstraněním každé chránící skupiny.

Aktivní deriváty kyselin vzorce X zahrnují například anhydridy kyselin nebo halogenidy kyselin jako jsou chloridy kyselin, jak bylo v hlavních rysech popsáno dříve.

Sloučeniny vzorce I se také připraví vzájemnou konverzí jiných sloučenin vzorce I. Tak například sloučenina vzorce I, kde R¹ je Ci-Cé alkylová skupina se připraví hydrogenací použitím palladia na uhlíku ve vhodném rozpouštědle jako je alkohol, například ethanol sloučeniny vzorce I, kde R¹ je C₂-C6 alkenylová skupina. Další příklad zahrnuje sloučeninu vzorce I, kde R⁷ je skupina R^l0CO připravená acylací použitím vhodného chloridu kyseliny R¹⁰COC1 v přítomnosti zásady jako je triethylamin ve vhodném rozpouštědle, jako je chlorované rozpouštědlo - například dichlormethan, sloučeniny vzorce I, kde R⁷ je H.

-11CZ 289711 B6

Sloučeniny, kde X je heterocyklický zbytek aromatického charakteru, se připraví podle způsobů popsaných ve WO 96/35687.

Všechny směsi získaných finálních výrobků nebo intermediátů lze dělit známým způsobem na 5 základě fyzikálně-chemických rozdílů složek na čisté finální výrobky nebo intermediáty, například chromatografií, destilací, frakční krystalizací nebo tvorbou soli, jsou-li okolnosti vhodné nebo možné.

Sloučeniny podle vynálezu vykazují in vitro inhibiční aktivity ve vztahu ke stromelyzinu, 10 kolagenáze a želatináze. Sloučeniny podle vynálezu také vykazují in vitro inhibici uvolňování TNFa. Aktivita a selektivita sloučenin se určuje použitím vhodného testu inhibice enzymu, například jak je popsáno v příkladu A níže a ve WO 96 11209. Stejná publikace podává další testy (příklady B až G) vhodné pro testování sloučenin podle tohoto vynálezu.

Tento vynález se také vztahuje ke způsobu léčení pacientů (v to zahrnujíc člověka a/nebo savce chované pro mlékárenský, masný a kožešinový průmysl nebo jako domácí zvířata), trpících poruchami nebo nemocemi, které se přičítají metaloproteinázám matrixu a/nebo TNFa, jak bylo dříve popsáno, a specifičtěji způsobu léčení, který zahrnuje podání inhibitorů metaloproteináz matrixu vzorce I, jako aktivních složek.

Podle toho se sloučeniny vzorce I používají mezi jiným v léčení osteoartritidy, kloubního revmatismu a při nemocech nebo indikacích vyplývajících ze zvýšené exprese těchto matrixových metaloproteináz, jak je nalézáno při určitých metastázových nádorových buněčných liniích.

Jak bylo zmíněno výše, sloučeniny vzorce I jsou užitečné v humánní nebo veterinární medicíně, neboť jsou aktivní jako inhibitory TNFa nebo MMP enzymů. Podle toho se v dalším aspektu vynález týká:

způsobu zvládání (čímž je myšleno léčení nebo profylaxe) nemocí nebo stavů zprostředkovaných TNFa a/nebo MMP enzymy u savců, zvláště pak u člověka, kterýžto způsob zahrnuje podání efektivního množství výše uvedené sloučeniny vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelné soli savci; a sloučeniny vzorce I pro použití v humánní nebo veterinární medicíně, zvláště ve způsobu zvládání (čímž je myšleno léčení nebo profylaxe) nemocí nebo stavů zprostředkovaných TNFa a/nebo MMP enzymy; a použití sloučeniny vzorce I pro přípravu činidla pro zvládnutí (čímž je myšleno léčení nebo 40 profylaxe) nemocí nebo stavů zprostředkovaných TNFa a/nebo MMP enzymy.

Onemocnění nebo stavy odkazované výše zahrnují zánětlivá onemocnění, autoimunitní onemocnění, rakovinu, kardiovaskulární nemoci, nemoci zahrnují rozpad tkáně, jako je kloubní revmatizmus, osteoartritida, osteoporóza, neurodegenerace, Alzheimerova choroba, atero45 skleróza, městnavé selhání srdce, mrtvice, vaskulitida, Crohnova nemoc, vředovitý zánět tlustého střeva, roztroušená skleróza, periodontitida, zánět dásní a ty, které zahrnují rozpad tkáně, jako je resorpce kosti, hydroxyhemoragie, koagulace, akutní fázová odpověď, kachexie a anorexie, akutní infekce, HTV infekce, horečka, šokové stavy, reakce štěp versus příjemce, dermatologické stavy, hojení operačních ran, psoriáza, atopická dermatitida, puchýřové odloučení epidermis, růst 50 nádoru, vznik angiomu a invaze sekundárními metastázemi, oftalmologické onemocnění, onemocnění sítnice, vředovatění rohovky, reperfuzní poranění, migréna, meningitida, astma, rýma, alergický zánět spojivky, ekzém a anafylaxie.

-12CZ 289711 B6

Při léčení revmatického zánětu kloubů, osteoartritidy a při nemocech a indikacích vyplývajících ze zvýšené exprese matrixových metaloendoproteináz tak, jak je nalézáno při určitých metastázových nádorových buněčných liniích nebo jiných nemocech, zprostředkovaných matrixovými metaloendoproteinázami nebo zvýšenou produkcí TNFa, se sloučeniny vzorce I podávají orálně, místně, parenterálně, inhalačními spreji nebo rektálně v dávkovačích jednotkách přípravků obsahujících netoxické, farmaceuticky přijatelné nosiče, pomocné látky a přenašeče. Termín parenterální, jak je zde užit, zahrnuje podkožní injekce, nitrožilní, intramuskulámí, intrastemální injekce nebo infuzní techniky. Sloučeniny podle vynálezu jsou navíc k léčení teplokrevných živočichů jako jsou myši, krysy, koně, dobytek, ovce, psi, kočky atd. účinné i v léčbě lidí.

Farmaceutické prostředky obsahující aktivní složku jsou ve formě vhodné pro orální použití, například jako tablety, pastilky, bonbony, vodné nebo olejové suspenze, rozprašovatelné prášky nebo granule, emulze, tvrdé nebo měkké kapsle nebo sirupy nebo léčebné nápoje. Prostředky zamýšlené pro orální použití se připraví podle kteréhokoliv v oboru známého způsobu pro výrobu farmaceutických prostředků a takové prostředky obsahují jedno nebo více činidel vybraných ze skupiny sladidel, ochucovadel, barvicích a konzervačních prostředků pro zisk farmaceuticky prvotřídních a stravitelných přípravků. Tablety obsahují aktivní složku ve směsi s netoxickými, farmaceuticky přijatelnými základy, které jsou vhodné pro výrobu tablet. Tyto základy jsou například inertní ředicí roztoky jako je uhličitan vápenatý, uhličitan sodný, laktóza, fosforečnan vápenatý nebo fosforečnan sodný; granulační a rozmělňovací činidla jako například obilný škrob nebo alginová kyselina; vázací činidla jako například škrob, želatina nebo klovatina a lubrikační činidla jako například stearan hořečnatý, kyselina stearová nebo mastek. Tablety jsou nepotažené nebo potažené známými způsoby ke zpomalení rozpadu a absorpce v gastrointestinálním traktu, čímž poskytují udržení účinku po delší dobu. Jako zpožďovací suroviny se používají například monostearan glycerinu nebo distearan glycerinu. Tablety se pokrývají také způsoby popsanými v US patentech 4 256 108; 4 166 452; a 4 265 874 pro tvorbu osmotických terapeutických tablet pro kontrolu uvolňování účinných složek.

Výrobky léčivých prostředků pro orální použití jsou také tvrdé želatinové kapsle, kde je aktivní složka smíchána s inertním pevným ředicím prostředkem, například uhličitanem vápenatým, fosforečnanem vápenatým nebo kaolinem, nebo jsou také měkké želatinové kapsle, kde aktivní složka je smíchána s vodou nebo olejovitým prostředím, například arašídovým olejem, kapalným parafínem nebo olivovým olejem.

Vodné suspenze obsahují aktivní látky ve směsi se základy vhodnými pro výrobu vodných suspenzí. Takové základy jsou suspendující činidla jako například sodná sůl karboxymethylcelulózy, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, alginát sodný, polyvinylpyrrolidon, tragantová klovatina, arabská guma; dispergační nebo zvlhčovači činidla jsou přirozeně se vyskytující fosfatidy, jako například lecithin nebo kondenzační produkty alkylenoxidu s mastnými kyselinami, například polyethylenstearan, nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s alifatickými alkoholy s dlouhým řetězcem, jako například heptadekaethylenoxyethanol nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s hexitolem částečně esterifikovanými mastnými kyselinami, jako polyoxyethylenu s částečnými estery mastných kyselin a anhydridů hexitolu, jako například monoolejan polyoxyethylensorbitolu. Vodné suspenze také obsahují jeden nebo více konzervačních prostředků, například ethyl nebo propyl, p-hydroxybenzoan, jedno nebo více barvicích činidel, jedno nebo více ochucovadel a jedno nebo více sladidel jako je sacharóza nebo sacharin.

Olejovité suspenze se sestavují suspendováním aktivní složky v rostlinném oleji, například arašídovém oleji, olivovém oleji, sezamovém oleji nebo kokosovém oleji nebo v minerálním oleji jako je kapalný parafín. Olejové suspenze obsahují zahušťovací látku, například včelí vosk, tvrdý parafín nebo cetylalkohol. Sladidla jako ta, která jsou uvedená výše a ochucovadla se přidají pro zisk chutného ústního přípravku. Tato složení se konzervují přídavkem antioxidantu jako je kyselina askorbová.

-13CZ 289711 B6

Dispergovatelné prášky a granule vhodné pro přípravu vodné suspenze po přidání vody poskytují aktivní složku ve směsi s dispergujícím nebo zvlhčovacím činidlem, suspenzním činidlem ajednou nebo více konzervačními látkami. Vhodná dispergující nebo zvlhčovači činidla a suspenzační činidla jsou doložena příklady, přičemž v příkladu jsou také přítomna sladidla, ochucovadla a barvicí činidla.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou také ve formě emulzní oleje ve vodě. Olejová fáze je rostlinný olej, například olivový olej nebo arašídový olej nebo minerální olej, například kapalný parafín nebo jejich směsi. Vhodná emulgující činidla jsou přirozeně se vyskytující klovatiny, například arabská guma nebo tragantová guma, přirozeně se vyskytující fosfatidy, například ze sojových bobů, lecithin a estery nebo anhydridy hexitolu částečně esterifikované mastné kyseliny, například monoolejan sorbitolu a kondenzační produkty uvedených částečných esterů s ethylenoxidem, například monoolejan polyoxyethylensorbitolu. Emulze také obsahují sladidla a ochucovadla.

Sirupy a léčebné nápoje se sestavují ze sladidel, například glycerolu, propylenglykolu, sorbitolu nebo sacharózy. Taková složení léčivých přípravků také obsahují tišící látku, konzervační prostředek a ochucovadla a barvicí látky. Farmaceutické přípravky jsou ve formě sterilních injektovatelných vodných nebo olejovitých suspenzí. Tato suspenze se skládá podle znalostí v oboru s použitím těch vhodných dispergujících nebo zvlhčujících činidel a suspenzních činidel, která byla zmíněna výše. Sterilní injektovatelné přípravky jsou sterilní injikovatelné roztoky nebo suspenze v netoxických, mimostřevně akceptovatelných ředicích roztocích nebo rozpouštědlech, například jako roztok v 1,3-butandiolu. Mezi přijatelnými přenašeči a rozpouštědly, která lze použít, jsou voda, Ringierův roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Navíc se jako rozpouštědla nebo suspenzní média běžně používají sterilní, husté oleje. Pro tento účel se používá jakýkoliv nedráždivý, hutný olej, v to zahrnujíc syntetické mono- a diglyceridy. Navíc mastné kyseliny jako je kyseliny olejová nalézají použití v přípravě injikovatelných přípravků.

Sloučeniny vzorce I se také podávají ve formě čípků pro rektální podání léku. Tyto přípravky se připravují smícháním léku s vhodným, nedráždivým základem, který je pevný při běžných teplotách, ale kapalný při rektální teplotě, a proto v rektu taje a uvolňuje lék. Takovými materiály jsou kakaové máslo a polyethylenglykoly.

Pro místní nanášení se používají krémy, masti, želé, roztoky nebo suspenze atd. obsahující sloučeniny vzorce I. Účely této aplikace zahrnují místní podávání ústními vodami a kloktadly.

Hladiny dávkování pro léčbu výše popsaných stavů jsou užitečné v řádu 0,05 mg až 140 mg na kilogram tělesné váhy na den (2,5 mg až 7 g na pacienta na den). Například zánět se úspěšně léčí podáním 0,01 až 50 mg sloučeniny na kilogram tělesné váhy na den (0,5 až 3,5 g na pacienta na den).

Množství aktivní složky, která se kombinuje s nosičovými materiály k získání jedné dávkové formy kolísá v závislosti na léčeném příjemci a jednotlivém způsobu podávání. Například léčivý přípravek zamýšlený pro orální podání člověku kolísá mezi 5 až 95 procenty celkového složení přípravku. Dávkovači jednotkové formy obecně obsahují 1 mg až 500 mg aktivní složky.

Je však srozumitelné, že specifické hladiny dávek pro každého jednotlivého pacienta budou záviset na různosti faktorů, v to zahrnujíc aktivitu použité specifické sloučeniny, věk, tělesnou váhu, celkový zdravotní stav, pohlaví, dobu podání v rozvrhu stravování, způsob podání léku, rychlost vyměšování, kombinace léků a vážnost jednotlivé léčené nemoci.

- 14CZ 289711 B6

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady nejsou vyčerpávající a jsou zamýšleny pro popsání přípravy sloučenin vzorce I a jako takové nelimitují vynález, jak je dále uvedeno v nárocích.

V příkladech se používají následující zkratky:

TNFa nádorový nekrotický faktor a,

LPS lipopolysacharid,

ELISA enzymově spřažená imunochemická analýza,

RT teplota místnosti,

EDC hydrochlorid l-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)karbodiimidu.

Meziprodukt 1 N-methylamid [2R-brom-5-ftalimido]pentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu

EDC (1,47 g, 7,71 mmol) byl přidán k roztoku kyseliny [(2R)-brom-5-ftalimido]pentenové (viz WO 96 11209, meziprodukt 117, 2,40 g, 7,35 mmol) a N-hydroxybenzotriazolu (1,04 g, 7,71 mmol) v tetrahydrofiiranu (40 ml) při 3 °C. Dále byl přidán N-methylamid L-leucyl-Lterc.leucinu (viz WO 96 11209, meziprodukt 116, 1,89 g, 7,35 mmol), směs byla ponechána pomalu zahřát na teplotu místnosti a míchána přes noc. Směs byla rozdělena mezi ethylacetát a vodu a vodná fáze byla extrahována ethylacetátem. Spojené organické fáze byly promyty IN HC1, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysušeny (MgSO₄) a odpařeny za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,93 g, 95 %) jako bílé pěny, která byla použita v dalším kroku bez dalšího čištění.

TLC R_f = 0,25 (5 % MeOH-CH₂Cl₂).

Meziprodukt 2 N-methylamid [(2S)-trifenylmethylsulfanyl-5-ftalimido]pentanoyl-L-leucylL-terc.leucinu

Terc.butoxid draselný (677 mg, 6,03 mmol) byl přidán k míchanému roztoku trifenylmethylmerkaptanu (1,66 g, 6,03 mmol) v dimethylformamidu (70 ml) při 3 °C. Po 20 min. míchání byl přidán meziprodukt 1 (3,25 g, 5,75 mmol) a směs byla ponechána pomalu zahřát na teplotu místnosti a míchána přes noc. Směs byla poté vlita do vody (200 ml) a výsledná sraženina byla shromážděna filtrací a vysušena za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,12 g, 71 %) jako světle žluté pevné látky.

TLC R_f = 0,47 (5 % MeOH-CH₂Cl₂).

Meziprodukt 3 N-methylamid [(2S)-trifenylmethylsulfanyl-5-amino]pentanoyl-L-leucyl-Lterc.leucinu

40% vodný roztok methylaminu (10 ml, 116 mmol) byl přidán k roztoku meziproduktu 2 (1,13 g, 1,48 mmol) v methanolu (20 ml) při teplotě místnosti. Výsledná suspenze byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku, odparek byl rozpuštěn v ethylacetátu a promyt vodou a solankou, vysušen (MgSO₄) a odpařen za zisku sloučeniny z nadpisu (850 mg, 91 %) jako oranžové pěny.

TLC Rf = 0,27 (5 % MeOH-CH₂Cl₂).

-15CZ 289711 B6

Meziprodukt 4 N-methylamid [(2S)-trifenylmethylsulfanyl-5-[N,N-dimethylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu

EDC (65 mg, 0,34 mmol) byl přidán k míchanému roztoku meziproduktu 3 (200 mg,0,32 mmol), N,N-dimethylglycinu (33 mg, 0,32 mmol) a N-hydroxybenzotriazolu (46 mg, 0,34 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) při 3 °C. Směs byla ponechána pomalu zahřát na teplotu místnosti a míchána přes noc. Směs byla poté rozdělena mezi ethylacetát a vodu a vodná fáze byla extrahována ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly promyty nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysušeny (MgSO₄) a odpařeny za sníženého tlaku za zisku surového produktu jako bezbarvého oleje. Čištění rychlou kolonovou chromatografií s elucí směsí 2 až 3 % methanol-dichlormethan poskytlo sloučeninu z nadpisu (163 mg, 0,23 mmol, 71 %) jako bílé pevné látky.

TLC Rf = 0,36 (5 % MeOH-CH₂Cl₂).

Podobně byl připraven:

Meziprodukt 5 N-methylamid [(2S)-trifenylmethylsulfanyl-5-[[N-niethyl-N-(l,l-dimethylethoxykarbonyl]aminoacetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu

Meziprodukt 5 byl připraven z meziproduktu 3 (250 mg, 0,40 mmol), N-(l,l-dimethylethoxykarbonyl)sarkosinu (76 mg, 0,40 mmol), EDC (77 mg, 0,40 mmol) a N-hydroxybenzotriazolu (54 mg, 0,40 mmol). Surový produkt byl získán jako bezbarvý olej. Čištění rychlou kolonovou chromatografií s elucí směsí 2 až 3 % methanol-dichlormethan poskytlo sloučeninu z nadpisu (260 mg, 0,32 mmol, 81 %) jako bílou pevnou látku.

TLC R_f = 0,47 (5 % MeOH-CH₂Cl₂).

Meziprodukt 6 Terc.butylester kyseliny 4-brommáselné

Etherát fluoridu boritého (2 ml) byl přidán ke směsi kyseliny 4-brommáselné (8,3 g, 50 mmol) aterc.butyl 2,2,2-trichloracetimidanu (10,5 g, 50 mmol) v dichlormethanu (15 ml) a hexanu (50 ml) při teplotě místnosti. Směs byla míchána při teplotě místnosti po dalších 18 hodin, poté byla reakce ukončena přidáním hydrogenuhličitanu sodného (5 g). Směs byla poté zfíltrována přes Celíte a filtrát byl odpařen za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (7,2 g, 64 %) jako bezbarvého oleje.

TLC Rf = 0,72 (25 % ether-hexan).

Meziprodukt 7 1,5,5-trimethyl-3-(3-terc.butoxykarbonylpropyl)hydantoin

Hydrid sodný (60%, 1,3 g, 32 mmol) byl přidán k roztoku 1,5,5-trimethylhydantoinu (4,0 g, 28,2 mmol) v dimethylformamidu (10 ml) při 0 °C a směs byla míchána 30 minut v atmosféře dusíku. Poté byl přidán roztok meziproduktu 6 (7,1 g) a vzniklá směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti, poté vlita do vody (100 ml) a extrahována terc.butylmethyletherem (100 ml). Organická fáze byla promyta vodou a solankou, vysušena (MgSO₄) a odpařena za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,7 g, 46 %) jako bezbarvého oleje.

TLC Rf = 0,25 (2:1 ether-hexan).

-16CZ 289711 B6

Meziprodukt 8 l,5,5-trimethyl-3-(3-karboxypropyl)hydantoin

Kyselina trifluoroctová (10 ml) byla přidána k roztoku meziproduktu 7 (3,6 g) v dichlormethanu (10 ml) při teplotě místnosti a roztok byl míchán po dobu 18 hodin. Výsledný roztok odpařen za sníženého tlaku a zbylá kyselina trifluoroctová byla s toluenem (3 x 50 ml) azeotropně oddělena za zisku sloučeniny z nadpisu jako bezbarvého, viskózního oleje, který byl přímo použit v dalším kroku.

TLC R_f= 0,45 (ether).

Meziprodukt 9 l,5,5-trimethyl-3-(3-brom-3-karboxypropyl)hydantoin

Roztok surového intermediátu 8 byl míchán 3 hodiny v dichlormethanu (10 ml) obsahujícím thionylchlorid (1,1 ml), poté zahříván 30 minut při 80 °C. Byl přidán chlorid fosforitý (0,11 ml), dále byl přidán brom (2,5 g) a směs byla zahřívána 3 hodiny při 80 °C po. Roztok byl poté ochlazen, opatrně byla přidána voda (10 ml) a dvoufázová směs byla míchána 72 hodin při 50 °C. Poté byla přidána další voda (100 ml) a směs zalkalizována hydrogenuhličitanem sodným, poté promyta etherem. Vodná fáze byla okyselena 2M kyselinou chlorovodíkovou na pH 2 a směs byla extrahována dichlormethanem. Spojené extrakty byly vysušeny (MgSO₄) a odpařeny za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,5 g, 87 %) jako bezbarvého viskózního oleje.

TLC R_f = 0,45 (ether).

Meziprodukt 10 1,5,5-trimethyl-3-(3-acetylthio-3-karboxypropyl)hydantoin

Na roztok meziproduktu 10 (3,5 g) v methanolu (20 ml) bylo působeno thiooctanem draselným (1,56 g) při teplotě místnosti. Směs byla poté míchána 18 hodin, odpařena za sníženého tlaku a odparek byl rozdělen mezi 0,5M kyselinu chlorovodíkovou a dichlormethan. Organická fáze byla promyta vodou a solankou, vysušena (MgSO₄) a odpařena za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (3,0 g, 88 %) jako oranžové pevné látky.

TLC Rf = 0,52 (ether).

Následující meziprodukty byly připraveny podle způsobu popsaného pro N-methylamid L-leucyl-L-terc.leucinu (meziprodukt 116 ve WO-96 11209).

Meziprodukt 11 N-methylamid L-(S-methyl)cysteinyl-L-leucyl-L-terc.leucinu.

Meziprodukt 12 N-methylamid L-norvalinyl-L-terc.leucinu.

Příklad 1

N-methylamid [(2S)-sulfanyl-5-[(N,N-dimethylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-Lterc.leucinu

Meziprodukt 4 (150 mg, 0,21 mmol) byl rozpuštěn ve směsi (10 ml) trifluoroctové kyseliny (90 %), thioanisolu (5 %), triizopropylsilanu (2,5 %) a vody (2,5 %) a roztok byl míchán přes noc při teplotě místnosti. Těkavé složky byly odpařeny za sníženého tlaku za zisku surového produktu jako žluté pevné látky. Vyčištění iychlou kolonovou chromatografií na silikagelu selucí směsí 2 až 3 % methanol-dichlormethan poskytlo sloučeninu z nadpisu (59 mg, 0,12 mmol, 59 %) jako bílou pevnou látku.

-17CZ 289711 B6

TLC R_f = 0,30 (5 % MeOH-CH₂Cl₂).

Podobně byl připraven:

Příklad 2

N-methylamid [(2S)-sulfanyl-5-[(N-methylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu

Sloučenina z nadpisu byla získána z meziproduktu 5 (220 mg, 0,27 mmol). Surový produkt byl získán jako žlutá pevná látka. Vyčištění rychlou kolonovou chromatografií s elucí směsí 2 až 3 % methanol-dichlormethan poskytlo sloučeninu z nadpisu (92 mg, 0,16 mmol, 59 %) jako bílou pevnou látku.

TLC R_f = 0,21 (5 % MeOH-CH₂Cl₂).

Příklad 3

N-methylamid N-[2-(acetylthio)-4-( 1,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-leucyl-L-terc.leucinu

Roztok N-methylamidu L-leucyl-L-terc.leucinu (0,4 g) a meziproduktu 10 (0,4 g) v dichlormethanu (20 ml) byl podroben působení EDC (0,3 g) a směs byla míchána 18 hodin při teplotě místnosti. Roztok byl poté promyt 0,5M kyselinou chlorovodíkovou a hydrogenuhličitanem sodným, vysušen (MgSO₄) a odpařen za sníženého tlaku za zisku sloučeniny z nadpisu (65 %) jako béžové pěny.

TLC R_f= 0,42 (10 % MeOH-CH₂Cl₂).

Příklad 4

N-methylamid N-[2-(acetylthio)-4-( 1,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-(S-methyl)cysteinyl-L-terc.leucinu

Sloučenina z nadpisu byla získána z meziproduktu 10 a meziproduktu 11 jako béžová pěna (73 %).

TLC R_f = 0,37 (10 % MeOH-CH₂Cl₂).

Příklad 5

N-methylamid N-[2-(acetylthio}-4-( 1,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-norvalinyl-Lterc.leucinu

Sloučenina z nadpisu byla získána z meziproduktu 10 a meziproduktu 12 jako béžová pěna (68 %).

TLC R_f = 0,35 (10 % MeOH-CH₂Cl₂).

-18CZ 289711 B6

Příklad 6

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-( 1,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-leucyl-L-terc.leucinu

Roztok z příkladu 3 (0,4 g) v methanolu (10 ml) byl podroben působení hydroxidu amonného (SG 0,88, 1 ml) 3 hodiny při teplotě místnosti. Směs byla odpařena za sníženého tlaku, rozdělena mezi dichlormethan a vodu, vysušena (MgSQí) a odpařena za sníženého tlaku za zisku surového produktu jako béžové pevné látky. Odparek byl vyčištěn rychlou kolonovou chromatografií na silikagelu s elucí směsí 5 % methanolu v dichlormethanu za zisku sloučeniny z nadpisu (0,35 g, 83 %) jako bezbarvé pevné látky.

TLC R_f = 0,35 (10 % MeOH-CH₂Cl₂).

Příklad 7

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-( 1,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L·-(S-methyl)cysteinyl-L-terc.leucinu

Z příkladu 5, jako bezbarvá pevná látka (85 %).

Příklad 8

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-(l, 5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-norvalinyl-L-terc.leucinu

Z příkladu 6, jako bezbarvá pevná látka (88 %).

Příklad A

Inhibice kolagenázy

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů kolagenázy byla určena způsobem Cawstona a Barretta (Anal. Biochem., 99:340-345, 1979), kde lmM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byl inkubován 16 hodin při 37 °C s kolagenem a kolagenázou (za pufrování 50 mM tris pufrem, pH 7,6, obsahujícím 5 mM CaCl₂, 0,05 % Brij 35, 60 mM NaCl a 0,02 % NaN₃). Kolagen byl acetylován s ³H nebo byl připraven ¹⁴C-kolagen způsobem Cawstona a Murphyho (Methods in Enzymology, 80:711, 1981). Výběr radioaktivního značkování nezměnil schopnost kolagenázy rozložit substrát kolagenu. Vzorky byly zcentrifugovány, aby se usadil nerozložený kolagen a alikvotní část radioaktivního supematantu byla odebrána pro stanovení na scintilátoru k určení měřítka hydrolýzy. Aktivita kolagenázy v přítomnosti 1 mM inhibitoru nebo jeho zředěného roztoku byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici kolagenázy (IC50).

Příklad B

Inhibice stromelyzinu

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů stromelyzinu byla určena způsobem Nagase et al (Methods in Enzymology, Vol. 254, 1994), kde 0,1 mM roztok testovaného

-19CZ 289711 B6 inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byl inkubován 16 hodin při 37 °C se stromelyzinem a ³H transferrinem (za pufrování 50 mM tris pufrem, pH 7,6, obsahujícím lOmM CaCl₂, 150 mM NaCl, 0,05 M Brij 35 a 0,02 % NaNj). Transferrin byl derivatizován karboxymethylem s kyselinou jodoctovou značenou ³H. Aktivita stromelyzinu v přítomnosti lmM inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici stromelyzinu (IC50).

Příklad C

Inhibice želatinázy

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů želatinázy byla určena postupem Harrise & Kraneho (Biochem. Biophys. Acta, 258:566-576,1972), kde 1 mM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byl inkubován 16 hodin při 37 °C se želatinázou a tepelně denaturovaným ³H značeným nebo ¹⁴C acetylovaným kolagenem (za pufrování 50 mM tris pufrem, pH 7,6, obsahujícím 5 mM CaCl₂, 0,05 % Brij 35 a 0,02 % NaN₃). ³H nebo ^I4C značená želatina byla připravena denaturací ³H nebo ¹⁴C značeného kolagenu vyrobeného podle způsobu Cawstona a Murphyho (Methods in Enzymology, 80:711, 1981) 30 minutovou inkubací při 60 °C. Nezreagovaná želatina byla vysrážena přídavkem kyseliny trichloroctové a centrifugací. Aktivita želatinázy v přítomnosti 1 mM inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici želatinázy (IC50).

Příklad D

Inhibice MMP enzymů-fluorimetrické stanovení

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů kolagenázy-1 (MMP-1), kolagenázy2 (MMP-8), želatinázy-A (MMP-2), želatinázy-B (MMP-9) a stromelyzinu-1 (MMP-3) byla určena s použitím následujícího způsobu:

Inhibitory se rozpustily v dimethylsulfoxidu obsahujícím 0,02 % β-merkaptoethanolu a byla připravena sériová naředění. Aktivovaný enzym se inkuboval v pufru užitém při stanovení a obsahujícím 50 mM tris pufr, pH 7,4, 5 mM CaCl₂ 0,002 % NaN₃ a Brij 35 v přítomnosti a nepřítomnosti inhibitoru. Vzorky byly preinkubovány 15 minut při 37 °C před přídavkem fluorimetrického substrátu (Mca-Pro-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂) na konečnou koncentraci 10 mM. Stanovovaný vzorek byl inkubován 90 minut při 37 °C a poté změřen Fluoroscanem II při excitační vlnové délce 355 nm a emisní vlnové délce 460 nm.

Aktivita enzymu byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici stromelyzinu (IC₅o).

Příklad E

Inhibice tvorby TNFa

Účinnost sloučenin obecného vzorce I jako inhibitorů tvorby TNFa byla určena pomocí následujícího způsobu. lmM roztok testovaného inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byl inkubován při 37 °C v atmosféře 5 % CO₂ s buňkami THP-1 (humánními monocyty) suspendovanými v prostředí RPM1 1640 a 20μΜ β-merkaptoethanolu při hustotě buněk 1 x 10⁶ ml'¹ a za

-20CZ 289711 B6 stimulace 5pg/ml konečné koncentrace LPS. Po 18 hodinách byly v supematantu stanoveny hladiny TNFa užitím komerčně dostupné soupravy ELISA (R & D Systems).

Aktivita tvorby TNFa v přítomnosti 0,1 mM inhibitoru nebo jeho zředěných roztoků byla porovnána s aktivitou kontrolního vzorku bez inhibitoru a výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace inhibitoru způsobující 50% inhibici tvorby TNFa (IC50).

Příklad F

Pomocný model artritidy krysy

Sloučeniny obecného vzorce I byly zhodnoceny v pomocném modelu artritidy krysy založeném na způsobech použitých Β. B. Newbouldem (1963), Br. J. Pharmacol., 21,127-136 a C. M. Pearsonem a F. D. Woodem (1959), Arthritis Rheum, 2,440-459. Stručně samci krys Wistar (180 až 200 g) byli injektováni u kořenu ocasu Freundovým adjuvans. Za dvanáct dnů byla reagující zvířata namátkově rozdělena do experimentálních skupin. Sloučeniny obecného vzorce I byly dávkovány buď orálně jako suspenze v 1% methylcelulóze nebo intraperitoneálně v 0,2% karboxymethylcelulóze od dvanáctého dne do konce experimentu, dne dvacátého druhého. Každé dva dny od dvanáctého dne dále byly měřeny objemy zadní tlapky a při ukončení experimentu byly vzaty rentgenové snímky zadní nohy. Výsledky byly vyjádřeny jako procenta vzrůstu objemu nohy nad hodnoty z dvanáctého dne.

Příklad G

Xenoimplantátový model rakoviny vaječníku myši

Sloučeniny obecného vzorce I byly zhodnoceny pomocí rakovinového xenoimplantátového modelu rakoviny vaječníku, založeném na popisu B. Daviese et al (1993), Cancer Research, 53, 2087-2091. Tento model v krátkosti sestává z inokulace samic myši se dvěma regresními alelami 1 x 10⁹OVCAR3-icr buňkami do peritoneální dutiny. Sloučeniny obecného vzorce I se podají orální cestou jako suspenze v 1% methylcelulóze nebo intraperitoneálně jako suspenze ve fyziologickém roztoku tlumeném fosfátem v 0,01 % Tween-20. Při ukončení experimentu (4 až 5 týdnů) se spočetlo množství peritoneálních buněk a zvážila se každá pevná nádorová usazenina. V některých experimentech se sleduje vývoj nádoru měřením specifických nádorových antigenů.

Příklad H

Model rakoviny prsu u krysy

Sloučeniny obecného vzorce I byly zhodnoceny pomocí HOST.l rakovinového modelu rakoviny prsu u krysy (S. Eccles et al (1995), Cancer Research, v tisku). Tento model se skládá z intravenózního naočkování samic krys CBH/cbi 2 x 10⁴ nádorovými buňkami do hrdelní žíly. Sloučeniny obecného vzorce I se podají orální cestou jako suspenze v 1% methylcelulóze nebo intraperitoneálně jako suspenze ve fyziologickém roztoku tlumeném fosfátem v 0,01% Tween20. Při ukončení experimentu (4 až 5 týdnů) byla zvířata zabita, plíce byly odebrány a po 20 hodinové fixaci v Methacamu byly spočteny jednotlivé nádory.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Thiosubstituované peptidy obecného vzorce I

R7S

O R¹ R²

R⁸ R¹⁶ O R³ (0, kde R¹ je Ci-C7 alkylový zbytek, Cr-C6 alkenylový zbytek, Ci-C6 alkylsubstituovaný arylový zbytek, arylový zbytek, Ci-C6 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, heterocyklický zbytek aromatického charakteru nebo C]-C6 alkyl-AR⁹ skupina, kde A je O, NR⁹ nebo S(O)m, kde m = 0 až 2, a R⁹ je H, C1-C4 alkylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, C1-C4 alkylsubstituovaný arylový zbytek nebo C1-C4 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru; jestliže A= NR⁹, skupiny R⁵ jsou stejné nebo různé;

přičemž arylový zbytek je případně substituovaný fenyl nebo naftyl se substituenty vybranými ze skupiny obsahující halogen, trifluormethyl, Ci^ alkylový zbytek, přímý nebo rozvětvený řetězec alkoxyskupiny mající 1 až 6 atomů uhlíku vybraný ze skupiny obsahující methoxyskupinu, ethoxyskupinu, propoxyskupinu, izopropoxyskupinu, butoxyskupinu a terc.butoxyskupinu, a fenyl, a heterocyklický zbytek aromatického charakteru je aromatický kruhový systém pěti až deseti atomů, z nichž alespoň jeden je vybrán ze skupiny obsahující kyslík, dusík a síru,

R² je vodík nebo Ci~C₆ alkylový zbytek;

R³ je skupina [Alk]nR⁶, kde Alk je C]-C6 alkylový zbytek nebo Cr-Ce alkenylový zbytek a n je nula nebo 1;

X je heterocyklický zbytek aromatického charakteru nebo skupina CONR⁴R⁵, kde R⁴ je vodík nebo C]—alkylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, Ci-C₆ alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, cyklo(C₃-Ce)alkylový zbytek, C]-C₆ alkylsubstituovaný cyklo(C₃-C₆)alkylový zbytek, nasycený heterocyklický(C4-C₆) zbytek nebo Ci-Ce alkylsubstituovaná nasycená heterocyklická(C₄-C6) skupina a R⁵ je vodík nebo

Ci-C₆ alkylový zbytek; NR⁴R⁵ je pyrrolidinový, piperidinový nebo morfolinový kruh, přičemž heterocyklický zbytek aromatického charakteru a arylový zbytek je jak uvedeno výše;

R⁷ je vodík nebo skupina R^l0CO, kde R¹⁰ je C1-C4 alkylový zbytek, Ci-C₄alkylsubstituovaný arylový zbytek, Ci-Ce alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, cyklo(C₃-C6)alkylový zbytek, cyklo(C₃-C6)alkylsubstituovaný Ci-C₄alkylový zbytek, Cz-Cealkenylový zbytek, Cr-C₆ alkenylsubstituovaný arylový zbytek nebo arylový zbytek, nebo heterocyklický zbytek aromatického charakteru, jak je definováno výše;

přičemž nasycený heterocyklický (C4-C6) zbytek je nasycený heterocyklický zbytek se čtyřmi až šesti atomy uhlíku a mající alespoň jeden heteroatom vybraný ze skupiny obsahující dusík, kyslík nebo síru,

-22CZ 289711 B6

R⁸ a R¹⁶ jsou stejné nebo různé a jsou každý Ci-C₄alkylsubstituovaný zbytek R¹¹, R¹⁶ je také H;

R⁶ je AR⁹ nebo cyklo(C3-C6)alkylový zbytek, cyklo(C3-C6)alkenylový zbytek, Ci-C6 alkylový zbytek, C]-C6 alkoxyarylový zbytek, benzyloxyarylový zbytek, arylový zbytek, heterocyklický zbytek aromatického charakteru, C1-C3 alkylsubstituovaný heterocyklický zbytek aromatického charakteru, Ci-C3alkylsubstituovaný arylový zbytek, Cj-Ce alkyl-COOR⁹, Ci-Cé alkyl-NHR¹⁰, CONHR¹⁰, NHCO2R¹⁰, NHSO₂R¹⁰, NHCOR¹⁰, amidino nebo guanidino skupina, přičemž arylový zbytek a heterocyklický zbytek aromatického charakteru jsou jak uvedeno výše,

R¹¹ je COR¹³ nebo NHCOR¹³ nebo kterákoliv ze skupin vzorců a, b, c, d, e

(O)p >Cy ^(a)’ (0% ⁽°Kz V ^(b)i (0% (O)p -^N _w ^{w (c)}· (0% (O)p 0 K_R ~N “ ί.Γ. k^s KkX -N 7 ₂ (e), (O)_q (OL R²

kde p a q jsou oba 0 nebo 1 a jsou stejné nebo různé, ale když p=q=l, pak Y nemůže být H;

R a S jsou každý CH nebo N a jsou stejné nebo různé;

W je O, S(O)_m, kde m=0,1 nebo 2, nebo NR¹²;

Y a Z jsou každý H nebo R¹⁴ nebo R¹⁴ substituovaný Ci_4 alkylovou skupinou, kde R¹⁴ je NHR², N(R²)2, kde každá R² je stejná nebo různá, COOR², CONHR², NHCO2R² kde R² není H, NHSO₂R² kde R² není H, nebo NHCOR²; Z se váže do kterékoliv polohy kruhu;

R¹² je vodík, C[-C4alkylový zbytek, COR⁹, CO2R⁹, kde R⁹ není H, CONHR⁹ nebo SO₂R⁹, kde R⁹ není H;

R¹³ je C]-C₄alkylsubstituovaný zbytek R¹⁵;

R¹⁵ je N(R⁹)2, kde každá R⁹ je stejná nebo různá, CO2R⁹, CONHR⁹, CON(R⁹)2, kde každá R⁹ je stejná nebo různá, nebo SO2R⁹, kde R⁹ není H, ftalimidová skupina nebo skupiny vzorců a, b, c, d,

-23CZ 289711 B6
2. Thiosubstituované peptidy podle nároku 1 obecného vzorce I, kde X je CONR⁴R⁵; R⁴ je H, alkylový zbytek nebo arylový zbytek; R⁶ má význam uveden v nároku 1 s výjimkou skupin amidino a guanidino, R¹¹ má význam uvedený v nároku 1 s výjimkou NHCOR ³ nebo skupiny vzorce e), R¹⁵ má význam uveden v nároku 1 s výjimkou N(R⁹)₂ nebo skupiny vzorce e), aR^I6jeH.
3. Thiosubstituované peptidy podle nároku 1, kterými jsou

N-methylamid [(2S)-sulfanyl-5-[(N,N-dimethylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-Lterc.leucinu,

N-methylamid [(2S)-sulfanyl-5-[(N-methylamino)acetyl]aminopentanoyl-L-leucyl-L-terc.leucinu.
4. Thiosubstituované peptidy podle nároku 1, kterými jsou

N-methylamid [(2S)-acetylthio-4-( 1,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-leucyl-L-terc.leucinu,

N-methylamid [(2S)-acetylthio-4-( 1,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-(S-methyl)cysteinyl-L-terc.leucinu,

N-methylamid [(2S)-acetylthio-4-( 1,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-norvalinyl-L-terc.leucinu,

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-(l, 5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-leucyl-L·-terc.leucinu,

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-(l, 5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-L-(S-methyl)cysteinyl-L-terc.leucinu,

N-methylamid N-[2-sulfanyl-4-(l,5,5-trimethylhydantoinyl)butanoyl]-Lr-norvalinyl-L-terc.leucinu.
5. Thiosusbtituované peptidy podle kteréhokoliv předchozího nároku 1 až 4, ve formě jednotlivého enantiomeru nebo diastereomeru nebo směsi těchto izomerů.

-24CZ 289711 B6
6. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje thiosubstituované peptidy podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 až 5 a farmaceuticky přijatelný ředicí roztok nebo nosič.
7. Použití thiosubstituovaných peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro výrobu humánního nebo veterinárního léku pro léčení nebo prevenci stavu spojeného smatrixovými metaloproteinázami nebo který je zprostředkován TNFa nebo enzymem s L-selectin sheddase.
8. Použití podle nároku 7, kde stav je vybrán ze skupiny obsahující rakovinu, záněty a zánětlivá onemocnění, degeneraci tkáně, periodontální onemocnění, oftalmologické onemocnění, dermatologické poruchy, horečky, kardiovaskulární jevy, hemoragii, koagulaci a akutní fázové odezvy, kachexii a anorexii, akutní infekci, HIV infekci, šokové stavy, reakci proti štěpu hostitele, autoimunitní onemocnění, reperfuzní poranění, meningitidu a migrénu.
9. Použití podle nároku 7, kde stav je vybrán ze skupiny obsahující růst nádoru, vznik benigního nádoru z cév, nádorovou invazi a její šíření, metastázy, maligní vodnatelnost a maligní pleurální efuzi.
10. Použití podle nároku 7, kde stav je vybrán ze skupiny obsahující kloubní artritidu, osteoartritidu, astma, roztroušenou sklerózu, neurodegeneraci, Alzheimerovu aterosklerózu, mrtvice, Crohnovu nemoc a vředovitý zánět tlustého střeva.
11. Použití podle nároku 7, kde stav je vybrán ze skupiny obsahující vředovatění rohovky, onemocnění sítnice nebo hojení operačního poranění.
12. Použití podle nároku 7, kde stav je vybrán ze skupiny obsahující psoriázu, atopické dermatitidy, chronické vředovité puchýřovité odloučení epidermis.
13. Použití podle nároku 7, kde stav je vybrán ze skupiny obsahující periodontitidu a zánět dásní.
14. Použití podle nároku 7, kde stav je vybrán ze skupiny obsahující rýmu, alergický zánět oční spojivky, ekzém a anafylaxi.
15. Použití podle nároku 7, kde stav je vybrán ze skupiny obsahující restenózu, městnavé selhání srdce, endometriózu, aterosklerózu a endosklerózu.