PL176372B1

PL176372B1 - Sposób zwalczania owadów

Info

Publication number: PL176372B1
Application number: PL94312277A
Authority: PL
Inventors: David R. Corbin; John T. Greenplate; Michael G. Jennings; John P. Purcell; Robert D. Sammons
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1993-06-28
Filing date: 1994-06-24
Publication date: 1999-05-31
Also published as: ES2097656T3; CA2163120C; ATE147231T1; WO1995001098A3; US5554369A; DE69401436D1; NZ268794A; DE69401436T2; HUT73324A; US5518908A; PL312277A1; CA2163120A1; AU686200B2; CN1126423A; BR9406965A; HU9503805D0; EP0706320A1; AU7214094A; GR3023050T3; DK0706320T3

Abstract

1. Sposób zwalczania owadów nalezacych do motyli na rosliny, znamienny tym, ze obejmuje dostarczanie oksydazy 3-hydroksysteroidowej do spozywania przez owady. PL PL PL PL PL

Description

ZAKRES WYNALAZKU

Wynalazek ten dotyczy sposobu zwalczania owadów należących do motyli przez zastosowanie enzymu, który można stosować bezpośrednio wobec roślin lub wytwarzać na nich poprzez wykorzystanie mikroorganizmów bądź przez genetyczne modyfikowanie roślin w taki sposób, że wytwarzają one enzym oraz genów, mikroorganizmów i roślin użytecznych w tym sposobie.

PODSTAWA WYNALAZKU

Stosowanie naturalnych produktów, włącznie z białkami, jest dobrze znaną metodą zwalczania wielu szkodliwych owadów. Na przykład, endotoksyny Bacillus thuringiensis (B.t.) stosuje się do zwalczania zarówno szkodliwych owadów należących do motyli, jak i chrząszczy.

176 372

Geny wytwarzające te endotoksyny wprowadzono i umożliwiono ich ekspresję w różnych roślinach, włącznie z bawełną, tytoniem i pomidorem. Istnieje, jednakże, kilka ważnych z ekonomicznego punktu widzenia szkodliwych owadów, które nie są wrażliwe na endotoksyny B.t. Istnieje także zapotrzebowanie na dodatkowe białka, które zwalczają owady, dla których B.t. stanowi kontrolę, w celu opanowania ewentualnego rozwinięcia się oporności w populacji.

Dlatego też, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie białek zdolnych do zwalczania owadów należących do motyli oraz genów użytecznych w wytwarzaniu takich białek. Ponadto celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie odpowiednich konstrukcji genetycznych i sposobów wprowadzania takiego materiału genetycznego do mikroorganizmów i komórek roślinnych. Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie stransformowanych mikroorganizmów i roślin zawierających taki materiał genetyczny.

PODSUMOWANIE WYNALAZKU

Stwierdzono, że białka, które katalizują utlenianie 3-hydroksysteroidów, na przykład cholesterolu, mogą zwalczać owady należące do motyli. Powodują one śmiertelność i zahamowanie rozwoju larw motyli. Enzymy można stosować bezpośrednio wobec roślin lub wprowadzać innymi sposobami, takimi jak przez zastosowanie mikroorganizmów zasiedlających rośliny lub wytwarzać w samych roślinach, które stransformowano, tak aby produkowały enzymy.

Oksydazy 3-hydroksysteroidowe (E.C.1.1.3.6.) są w sposób naturalny wytwarzane przez mikroorganizny takie jak Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Mycopbacterium sp., Schizophyllum commune, Nocardia sp., i Rhodococcus sp., [Smith i in., 1976 oraz Long i in., 1990]. Preparaty enzymów z kilku różnych źródeł są dostępne w Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. .

Wyizolowano i zsekwencjonowano nowe geny Streptomyces, które kontrolują ekspresję oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Te nowe geny, lub geny pochodzące z innych znanych producentów oksydazy 3-hydroksysteroidowej można wstawiać w kasetkę wektora transformującego, który stosuje się do transformacji mikroorganizmów zasiedlających rośliny. Mikroorganizmy takie jeśli zastosuje się je wobec roślin prowadzą ekspresję genów wytwarzających oksydazę 3-hydroksysteroidową, zapewniając w ten sposób zwalczanie owadów. Alternatywnie, geny, które funkcjonują w roślinach i kodują enzymy będące przedmiotem zainteresowania, można wstawiać do kasetek wektorów transformujących: można je wprowadzać do genomu rośliny, która następnie ochrania sama siebie przed atakiem poprzez ekspresję genu i wytwarzanie oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Dodatkowo, roślinę można także stransformować tak, aby zachodziła w niej koekspresja genów B.t, odpowiedzialnych za ekspresję białek do zwalczania innych owadów. Przykłady roślin stransformowanych w taki sposób, aby zachodziła w nich ekspresja genów B.t, ujawniono w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0 385 962 (Fischhoff i in.).

Do zrealizowania tego, dostarcza się, zgodnie z jednym aspektem niniejszego wynalazku, sposób zwalczania inwazji owadów na roślinach obejmujący dostarczanie oksydazy 3-hydroksysteroidowej do spożywania przez owady.

Zgodnie z innym aspektem wynalazku, dostarcza się sposób wytwarzania genetycznie stransformowanych roślin, w których zachodzi ekspresja skutecznej, w zwalczaniu owadów należących do motyli, ilości oksydazy 3-hydroksysteroidowej, obejmujący etapy:

a) wstawiania do genomu komórki roślinnej cząsteczki zrekombinowanego, dwuniciowego DNA, zawierającej (i) promotor, który działa w komórce roślinnej powodując wytwarzanie sekwencji RNA;

(ii) strukturalną sekwencję kodującą, która koduje oksydazę 3-hydroksysteroidową; i (iii) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w rzeczonych komórkach roślinnych powodując dodanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA, gdzie rzeczony promotor jest heterologiczny pod względem strukturalnej sekwencji kodującej i gdzie rzeczony promotor jest połączony w sposób umożliwiający działanie z rzeczoną strukturalną sekwencją kodującą, którajest z kolei połączona w sposób umożliwiający działanie z rzeczonym regionem nie ulegającym translacji;

b) otrzymywania stransformowanych komórek roślinnych; i

176 372

c) regenerowania ze stransformowanych komórek roślinnych genetycznie stransformowanych roślin, w których zachodzi ekspresja owadobójczo skutecznej ilości oksydazy sterolowej.

Dostarcza się także, zgodnie z innym aspektem niniejszego wynalazku, bakteryjne i stransformowane komórki roślinne, które zawierają DNA składający się ze wspomnianych powyżej elementów (i), (ii), i (iii).

W znaczeniu tu stosowanym, termin zwalczanie inwazji owadów oznacza zmniejszanie liczby owadów powodujących obniżenie wydajności, albo przez zabijanie, opóźnianie rozwoju larwalnego (hamowanie) lub zmniejszenie wydajności rozrodczej.

W znaczeniu tu stosowanym, termin strukturalna sekwencja kodująca oznacza sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który może zostać wytworzony w komórce w wyniku transkrypcji DNA na mRNA, a następnie translacji pożądanego polipeptydu.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Oksydazy 3-hydroksysteroidowe katalizują utlenianie grupy 3-hydroksylowej 3-hydroksysteroidów w wyniku czego powstaje ketesteroidy i nadtlenek wodoru. Są one zdolne do katalizowania utleniania różnych 3-hydroksysteroidów, takich jak na przykład cholesterol. Większość ze znanych uprzednio oksydaz 3-hydroksysteroidowych nazywanych jest oksydazami cholesterolowymi (skatalogowanymi jako E.C. #1.1.3.6), ale cholesterol jest tylko jednym z substratów 3-hydroksysteroidowych. Stosowanie wszystkich oksydaz 3-hydroksysteroidowych i genów kodujących takie białka do celów zwalczania owadów pozostaje w zakresie niniejszego wynalazku.

Oksydazy 3-hydroksysteroidowe są komercjalnie dostępne do stosowaniajako odczynniki w oznaczeniach cholesterolu osocza. Na przykład, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, oferuje trzy takie oksydazy 3-hydroksysteroidowe (nazwane oksydazami cholesterolowymi), jedną z Streptomyces sp., jedną z Pseudomonas fluorescens i jedną z Brevibacterium. Wyizolowano dwa inne źródła oksydazy 3-hydroksysteroidowej, dwa Streptomycetes nazwane A19241 i A19249, z których każdy wytwarza oksydazę 3-hydroksysteroidową. Organizmy wyizolowano na Madagaskarze. Gdy te organizmy hodowano zgodnie ze zwykłymi metodami, stwierdzono, że przesącze hodowlane działają na larwy owadów w sposób opisany poniżej.

Hodowlę zarodowe A19249 rozpoczęto w 55 ml jałowego bulionu z pankreatynowym hydrolizatem kazeiny i ekstraktem drożdżowym. pH 6.8, w 250 ml kolbach do wytrząsania. Hodowle zarodowe wytrząsano przy 250 obrotach na minutę na wytrząsarce obrotowej w ciągu 3 dni w temperaturze 3°C. New Brunswick Bioflo II Bioreactor o objętości roboczej 2 litrów napełniono podłożem 202' ^! (MgSO, · 7H₂O 2g/itlr, KH2PO4 0,5 g//ittr, NaCl 0,5 g/ittr , CaCO^ 1 g/litr, ZnS04 · H2O (1 mg/ml roztworu podstawowego) 5 ml/litr, 100 mM FeEDTA 0,5 ml/litr, skrobia rozpuszczalna 5 g/litr, dekstroza2,5 g/litr, ekstrakt maltozowy 2,5 g/litr, Soytone 5 g/litr). pH doprowadzano do 6,5 2,5 N NaOH lub 1 N HCl i dodawano 1 ml/litr P2000, czynnika przeciwpiennego. Bioreaktor zamknięto i autoklawowano w ciągu 25 minut w temperaturze 250°C. Hodowlę zarodową, w trzecim dniu wzrostu, stosowano do zaszczepiania fermentora w ilości 2% lub 40 ml. Fermentacja zachodziła w temperaturze 30°C, z przepływem powietrza 1 litr/minutę i mieszaniu przy 500 obrotach na minutę. Brzeczkę fermentacyjną zbierano po 40 h.

Jak opisano poniżej, wykazano, że każdy z tych enzymów zwalcza owady. Oksydaza 3-hydroksysteroidowa P. fluorescens jest immunologicznie różna od enzymów Streptomyces, ale również zwalcza owady.

Inne organizmy wytwarzające oksydazy 3-hydroksysteroidowe według niniejszego wynalazku można zidentyfikować przez oznaczanie aktywności oksydazy 3-hydroksysteroidowej w przesączach hodowlanych lub pojedynczych białek z zastosowaniem opisanego poniżej oznaczenia spektrofotometrycznego, w którym się mierzy wytwarzanie nadtlenku wodoru w obecności 3-hydroksysteroidu, na przykład cholesterolu [Galio, 1981].

OZNACZENIA SKUTECZNOŚCI BIOLOGICZNEJ

Oznaczenia biologiczne prowadzone na larwach

Larwy motyli testowano na sztucznym, opartym na agarze pokarmie (Marrone i in., 1985) ze wskazaną ilością oksydazy 3-hydroksysteroidowej (oksydazy cholesterolowej A19249 w ciągu 3 dni. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Procent hamowania rozwoju definiuje się jako

176 372 waga larw (kontrola z Hepes) - waga larw (oksydaza cholesterolowa) _inno, waga larw (kontrola z Hepes) ^X cwaga

Stosując larwy Heliothis virescens przeprowadzono przedłużony test w celu sprawdzenia wpływu hamowania rozwoju zaobserwowanego w teście sześciodniowym. Jaja Heliothis virescens dodano do sztucznego pokarmu (jak opisano powyżej) zawierającego albo bufor, albo 100 ppm oksydazy 3-hydroksysteroidowej (oksydazy cholesterolowej) A19249. Po siedmiu dniach odnotowano pewną śmiertelność w porównaniu z larwami kontrolnymi. Larwy, które przeżyły przenoszono do świeżego pożywienia (kontrolnego lub zawierającego enzym, odpowiednio) co siedem dni. Procent śmiertelności (po uwzględnieniu poprawki na śmiertelność w grupie kontrolnej) przedstawiono dla okresów 7, 10 i 14 dni w tabeli 2. Liczba larwy po uwzględnieniu poprawki wynosiła 23. Do 27 dnia tylko dwie larwy były żywe; obie miały bardzo zahamowany rozwój i nigdy nie przekształciły się w poczwarki. 92% larw kontrolnych przeżyło i wszystkie przekształciły się w poczwarki do 27 dnia. Doświadczenie to wykazuje, że oksydaza 3-hydroksysteroidowa w znacznym stopniu hamuje rozwój larw Heliothis virescens.

Tabela 1

Owad	Stadium	Dawkagg/ml	Hamowanie rozwoju
Heliothis virescens	jaja/larwy	30	0
	larwy	100	86%
Słonecznica orężówka	larwy	50	0
	larwy	100	35%
Spodoptera frugiperda	larwy	30	0
Manduca sexta	larwy	30	0
	larwy	100	30%
Pectinophora gossypiella	larwy	50	0
	larwy	100	30%
omacnica	larwy	50	0
	larwy	100	46%
Spodoptora exigua	larwy	100	76%
rolnica gwoździówka	larwy	100	68%

Tabela 2

Odstęp czasu (dni)	Procent śmiertelności
7	20
10	61
14	80

BADANIA SPOSOBU DZIAŁANIA

Poniższe badania pokazują, że oksydaza 3-hydroksysteroidowa ma bezpośredni wpływ na same owady, oraz że aktywność wykazana w doświadczeniach opisanych powyżej nie może być przypisywana wpływowi enzymów na pokarm owadów, na przykład przez usuwanie steroli. Larwy ryjkowca niszczącego owoc bawełny i motyli są najbardziej wrażliwe na enzym. Sądzi się, że ta specyficzność jest spowodowana wpływem oksydazy 3-hydroksysteroidowej na jelito środkowe owada, co wyjaśniono bardziej szczegółowo poniżej. Inne owady o podobnej fizjologii jelita środkowego mogą również być zwalczane przez oksydazę 3-hydroksysteroidową. Ponadto, inne niż te testowane i opisywane tu oksydazy 3-hydroksysteroidowe mogą zwalczać różne spektra owadów o różnej fizjologii jelita środkowego.

176 372

Oznaczenie z wykorzystaniem pokarmu z nasion bawełny

Pokarm zawierający enzym sporządzono przez zmieszanie 30 g Pharmamedia™ (Traders Protein) mączki z nasion bawełny z 170 ml 1,6% roztworu agaru w temperaturze 50°C, zawierającego 0,13% kwas propionowy, 0,014% kwas fosforowy i po 30 mg siarczanu stereptomycyny i chlorotetracykliny. Przed zmieszaniem zastosowano 10% KOH do doprowadzenia pH do 6,2. Pharmamedia ^1M jest mączką przygotowaną z zarodków nasion bawełny. Pokarm inkubowano w łaźni wodnej w 40°C. Do pokarmu włączono rozcieńczenia oksydazy 3-hydroksysteroidowej (oksydazy cholesterolowej) Streptomyces Sigma. 68% larw Heliothis virescens wykazywało zahamowanie rozwoju przy obecności oksydazy 3-hydroksysteroidowej (100 ppm) w pokarmie z nasion bawełny.

Oznaczenie z wykorzystaniem pokarmu z kalusem

Oznaczenie wykorzystujące kalus bawełny prowadzono stosując kalus bawełny Coker 312 i 96-studzienkową płytkę do testowania pokarmu dla owadów. Każda studzienka zawierała 0,5 ml zżelowanego 2% agaru (zawierającego 0,13% kwasu propionowego i 0,014% kwasu fosforowego) przykrytego krążkami bibuły filtracyjnej. W każdej studzience umieszczano kawałek kalusa (około 150 mg). Dla każdego powtórzenia, pipetowano na każdy kawałek kalusa 25 gl roztworu podstawowego oksydazy 3-hydroksysteroidowej (1,25 mg/ml roztworu podstawowego) lub 25 gl 25 mM buforu Hepes (pH 7,5). Na kalus umieszczony na krążkach bibuły filtracyjnej pipetowano jaja Heliothis virescens (4-8 jaj/studzienkę, 0-12 godzin po wylęgu) w 0,15% agarze. Pojedyncze larwy przenoszono na świeże próbki kalusa z enzymem co trzy dni. Larwy ważono po 10 dniach.

W studzienkach z enzymem obserwowano hamowanie rozwoju larw, chociaż mniejsze w porównaniu ze sztucznym pokarmem lub pokarmem z nasion bawełny. Ten obniżony poziom hamowania rozwoju, przy stosowaniu kalusa bawełny jest prawdopodobnie spowodowany nie całkowitym pokrywaniem tkanki kalusa pipetowanym roztworem enzymu i utratą pewnej ilości enzymu na bibule filtracyjnej.

Wpływ na pokarm przed spożyciem

Brak jest wpływów letalnego lub hamującego rozwój w przypadku larw, które spożywały pokarm, który inkubowano w ciągu jednego tygodnia z oksydazą 3-hydroksysteroidową, a następnie ogrzewano do temperatury 80°C w celu denaturacji enzymu przed zastosowaniem w powyższym oznaczeniu. Wykazuje to ponadto, że sposób działania oksydazy 3-hydroksysteroidowej nie jest zależny od usuwania steroli ze źródła składników odżywczych, ale że enzym jest bezpośrednio aktywny wobec owada.

Badania mikroskopowe

Larwy Heliothis virescens wyhodowano z jaj na sztucznym pokarmie zawierającym 100 gg/ml oksydazy 3-hydroksysteroidowej lub buforu Hepes (kontrola). Po dziesięciu dniach wycinano nabłonki jelita środkowego i poddawano mikroskopii jak opisali Purcell i in., 1993. Jelita środkowe z traktowanych larw wykazywały szereg zmian histologicznych i ultrastrukturalnych w porównaniu z kontrolami (bufor Hepes). Oksydaza 3-hydroksysteroidowa indukowała boczne zwężenie i apikalno-bazalne wydłużenie komórek w nabłonku jelita środkowego, czego wynikiemjest poszerzenie przestrzeni międzykomórkowych oraz tworzenie nieregularnej i zwiniętej powierzchni światła przewodu pokarmowego. Zmiany komórkowe charakteryzowały się także miejscowym tworzeniem pęcherzyków w apikalnej części cytoplazmy i usuwaniem mikrokosmków. To usuwanie czasami powodowało odłączanie fragmentów cytoplazmy do światła przewodu pokarmowego. Obserwowano miejscową cytolizę, ale nabłonek jako całość pozostawał nienaruszony. Obserwacje te sugerują, że kontakt z oksydazą 3-hydroksysterolową naraża na szwank integralność apikalnej błony plazmatycznej, czego wynikiem jest wtórna uogólniona nadwrażliwość komórkowa na pęcznienie osmotyczne i lizę.

Cholesterol jest wymagany do zachowania integralności i normalnego funkcjonowania zasadniczo wszystkich błon komórkowych. Zmniejszenie dostępności cholesterolu do inkorporacji do i utrzymania błon komórkowych na skutek metabolizowania przez oksydazę 3-hydroksysteroidową mogłoby dlatego być jednym możliwym mechanizmem toksyczności tego czynnika. Jednakże, opisane powyżej obserwacje pokazują, że najbardziej dramatyczne zmiany strukturalne przy zetknięciu z oksydazą 3-hydroksysteroidową w świetle jelita zlokalizowane są

176 372 w części wierzchołkowej komórek jelita środkowego. Sugeruje to, że oksydaza 3-hydroksysteroidowa działa bezpośrednio, zmieniając cholesterol już wbudowany w błonę. Ponadto, opisane powyżej badania z traktowaniem pokarmu wykazały, że nie był on zmieniany przed spożyciem w sposób narażający na szwank wzrost Heliothis virescens, ponownie sugerując bezpośredni wpływ enzymu na owada.

Teoria sposobu działania

Chociaż teoria ta nie ogranicza wynalazku, sądzi się, że enzym oksydaza 3-hydroksysteroidowa hamuje wzrost larw motyli przez działanie w jelicie po spożyciu. Dane z oznaczeń biologicznych i dane morfologiczne wykazują, że występował wyraźnie stan patologiczny będący wynikiem spożywania pokarmu zawierającego oksydazę 3-hydroksysteroidową.

IDENTYFIKACJA ENZYMU

Aktywne białka z mikroorganizmów Streptomyces z Madagaskaru wyizolowano, oczyszczono, częściowo zsekwencjonowano i zidentyfikowano jako oksydazy 3-hydroksysteroidowe.

Izolowanie białka

Każdy z przesączy hodowlanych oczyszczano najpierw przez sączenie przez membrany YM10 (Amicon) do frakcji [>10 kDa],a następnie wielokrotne poddawanie chromatografii na kolumnie FPLC Mon Q HR10/10 (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Przy chromatografii na kolumnie Mono Q, próbki nakładano na kolumnę w 25 mM Hepes pH 7,5 i eluowano gradientem do 1,0 M KCl w 25 mM Hepes pH 7,5. Zbierano frakcje i próbki każdej z nich sączono przez nakładane na strzykawki sączki Acrodisc o średnicy porów 0,2 μ. Każdą próbkę frakcji testowano w oznaczeniach na owadach. Próbki frakcji aktywnych owadobójczo poddawano elektroforezie SDS-PAGE [Laemmli, 1970] stosując Daiichi Double Gel Device i 10-20% miniżel. Białka uwidaczniano przez barwienie srebrem stosując zestaw odczynników do barwienia srebrem Daiichi. Stwierdzono, że aktywne enzymy według niniejszego wynalazku, wyizolowane z nowych mikroorganizmów, są białkiem o masie cząsteczkowej 52,5 kDa.

Sekwencje aminokwasowe

Żel SDS-PAGE białka wytworzonego przez Streptomyces A19241, wyizolowanego jak opisano powyżej, poddawano blottingowi na membranę PVDF (Immobilon, Millipore) stosując procedurę Matsudaira [Matsudaira, 1987]. Koniec N zsekwencjonowano stosując metodę automatycznej degradacji Edmana. Do degradacji użyto sekwenatora z fazą gazową- (Applied Biosystems, Inc), stosując standardowy cykl sekwenatora. Odpowiednie pochodne PTHaminokwas identyfikowano poprzez analizę przez HPLC z odwróconymi fazami z wykorzystaniem analizatora PTH (Applied Biosystems, Inc.) połączonego z kolumną Brownlee PTH-C18 o średnicy wewnętrznej 2,1 mm. Dla określenia sekwencji wewnętrznych przeprowadzono trawienia oczyszczonej oksydazy 3-hydroksysteroidowej z A19249 stosując trypsynę (traktowaną TPCK, Worthington Biochemicals Corp., Freehold, NJ). Następnie fragmenty oczyszczono przez HPLC z odwróconymi fazami i zsekwencjonowano w jak w przypadku końca N.

Otrzymane częściowe sekwencje porównano ze znanymi białkami i stwierdzono silną (71%) homologię z opublikowaną cztemastoaminokwasową sekwencją w końcu N oksydazy 3-hydroksysteroidowej wyizolowanej z gatunków Streptomyces [Ishizaki in., 1989]. Opisany enzym ma M_r 54,9 kDa, co pozostaje w dobrej zgodności z Mr 52,5 kDa enzymu wyizolowanego.

Zsekwencjonowano sześć wewnętrznych fragmentów enzymu oczyszczonego z A19249, również posiadających homologię do sześciu regionów opisanego enzymu. Fragmenty wykazywały 95, 76, 64, 58, 89 i 100 procent identyczności sekwencji.

Oznaczanie i porównanie składu aminokwasowego

Oznaczono skład aminokwasowy oksydazy 3-hydroksysteroidowej wytwarzanej przez A19249 i porównano go ze składem opisanego enzymu Streptomyces. Próbki poddano kwaśnej hydrolizie (6 N HCl, hydroliza w fazie pary z zastosowaniem stacji roboczej Picotag firmy Water, 24 godziny, 110°C). Wszystkie analizy przeprowadzono po pokolumnowym przeprowadzeniu hydrolizatów w pochodne z zastosowaniem ninhydryny [Moore i in., 1963]. Do oznaczeń tych wykorzystano analizator Beckman Model 6300. Dla porównania dwóch składów, do przewidy8

176 372 wania ich podobieństwa, stosuje się metodę statystyczną S delta n/N. W tym celu wykorzystuje się następujący wzór:

1/2 Σ (nAi - nBi)²/N gdzie A jest jednym składem, B jest drugim składem, i jest każdym aminokwasem, n jest liczbą każdego aminokwasu, N jest całkowitą liczbą aminokwasów białka. Jeśli S delta n/N jest <0,42, to występuje więcej niż 95% prawdopodobieństwa, że białka są zbliżone. Im niższa wartość, tym bardziej oznaczone składy są zbliżone.

Metoda statystyczna S delta n/N dla białka A19249 porównanego z opisanym enzymem wynosi 0,36, co wskazuje, że oba białka są w znacznym stopniu zbliżone.

Oznaczanie oksydazy 3-hydroksysteroidowej

Identyczność enzymu potwierdzono przez testowanie jego zdolności utleniania 3-hydroksysteroidów, szczególnie cholesterolu.Enzym dodaje się do mieszaniny odczynników zawierającej peroksydazę z chrzanu (20 U/ml), fenol (14 mM), 4-aminoantypirenę (0,82 mM), Triton^RΧ-100 (0,05%) i bufor fosforanowy (100 mM, pH 7). Następnie dodaje się sterol w izopropanolu i monitoruje absorbancję przy długości fali 500 nm. Jedną jednostkę aktywności definiuje się jako ilość enzymu wymaganą do utlenienia 1 gmola sterolu na minutę w temperaturze 20°C.

W tabeli 12 podano poziomy aktywności enzymów dla 3-hydroksysteroidów należących do różnych klas 3-hydroksysteroidów. Źródła enzymów były następujące:

= A19249

2= A19241 = Streptomyces Sigma = Pseudomonas Sigma

Tabela 3

Względne szybkości reakcji dla enzymów

Sterol	1	2	3	4
cholesterol	100	100	100	100
dihydrocholesterol	56	56	59	69
dehydrocholesterol	13	12	7	47
latosterol	28	34	27	71
stigmasterol	22	28	11	21
sitosterol	88	65	49	50
kampesterol	65	64	45	49
fukosterol	22	20	12	68
lanosterol	<1	<1	<1	1
ekdyzon	<1	<1	<1	<1
2-OH ekdyzon	<1	<1	<1	<1

* mieszanina kampesterolu i dihydrobrasikasterolu w stosunku 65/35

Immunologiczne porównanie enzymów

Jak wykazano przez blotting typu Western [Bumette i in., 1981] z zastosowaniem poliklonalnych antysurowic wytworzonych przeciw enzymowi Streptomyces Sigma, enzym ten jest immunologicznie zbliżony do oksydaz 3-hydroksysteroidowych wytwarzanych przez izolaty według niniejszego wynalazku o numerach A19241 i 19249. Antysurowice rozpoznawały oba enzymy wytwarzane przez izolaty. Oksydaza 3-hydroksysteroidowa z P. fluorescens nie była rozpoznawana przez antysurowice. Wykazuje to, że immunologicznie odrębne oksydazy 3hydroksysteroidowe są toksyczne dla owadów.

IDENTYFIKACJA GENETYCZNA

Gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej wyizolowano z jednego z mikroorganizmów Streptomyces wyizolowanego na Madagaskarze i określono jego sekwencję.

176 372

Klonowanie genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej z A19249

Jak dyskutowano powyżej, otrzymano sekwencje peptydów oczyszczonej oksydazy 3hydroksysteroidowej z A19249 dla czterech regionów białka. Te sekwencje peptydowe porównano z bazą danych znanych sekwencji białek, i porównanie to ujawniło, że białka A19249 wykazywało wysoki stopień homologii do znanej oksydazy 3-hydroksysteroidowej ze Streptomyces [Ishizaki]. Porównując sekwencje peptydów A19249 z tą znaną sekwencją białka, peptydy te przyporządkowano ich prawdopodobnym pozycjom w sekwencji białka A19249. Sekwencja pochodząca z nienaruszonej oksydazy 3-hydroksysteroidowej z A19249 odpowiadała regionowi w pobliżu końca N wydzielanej postaci enzymu o opublikowanej sekwencji. Na tej podstawie wyciągnięto wniosek, że sekwencja peptydu N-końcowego również prawdopodobnie odpowiada dojrzałej wydzielanej postaci białka pozbawionej przypuszczalnej sekrecyjnej sekwencji sygnałowej. Potwierdzono to później przez analizę sekwencji DNA genu A19249 (patrz poniżej). Trzy peptydy zastosowano do skonstruowania sond hybrydyzacyjnych do izolowania genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej A19249. PeptydN2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1) odpowiadał N-końcowym aminokwasom 29-43 znanej sekwencji dojrzałego białka (sekwencji bez przypuszczalnego peptydu sygnałowego), peptyd Cl (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2) aminokwasom 434-449 sekwencji dojrzałego białka, a peptyd C2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3) aminokwasom 464-475 sekwencji dojrzałego białka.

N2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1):

ValSerThrLeuMetLeuGluMetGiyGlnLeuTrpAsnGinPro

Cl (sekwencja o numerze ident^^i^fł^:ac^^/lr^i^r^m2^):

AlaPheAlaAspAspPheCysT yrHisProLeuGlyGlyCysV alLeu

C2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3):

AsnLeuTyrValThrAspGlySerLeuHeProGly

W oparciu o te sekwencje peptydów zaprojektowano trzy długie niezdegenerowane oligonukleotydy odpowiadające sekwencjom peptydów oksydazy 3-hydroksysteroidowej z A19249 wykorzystując preferowane kodony Streptomyces. Oligonukleotydy N2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4), C1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5) i C2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6) odpowiadały opisanym powyżej peptydom N2, C1 i C2.

Sonda N2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4): gtgtccaccctgatgctggagatgggccagctgtggaaccagccc Sonda Cl (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5): gccttcgccgacgacttctgctaccacccgctcggcggctgcgtcctg Sonda C2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6): aacctctacgtgaccgacggttcgctgatcccgggt

Wszystkie z sond N2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4), Cl (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5) i C2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6) zastosowano jako sondy hybrydyzacyjne na biotach Southema DNA genomowego A19249. Wszystkie trzy sondy hybrydyzowały z tym samym prążkiem, o długości 2,2 kb, DNA strawionego BamHI, ale N2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4) hybrydyzowała z innym fragmentem niż Cl (sekwencja o numerze identyfikacyinym:5) i C2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6) w produktach trawienia Sali i BglII. Wskazywało to, że SalI i BglI trawią w obrębie sekwencji kodującej genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej z A19249, co potwierdzono przez analizę sekwencji DNA.

Stosując trzy syntetyczne oligonukleotydy jako sondy hybrydyzacyjne, z biblioteki fragmentów DNA Al 9249 w wektorze faga lambda wyizolowano gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej z A19249. Bibliotekę sporządzono w lambda EMBL3 używając częściowo strawionych Mbol fragmentów DNA A19249. Sondy te zastosowano do przeszukania około łusinek faga lambda z pierwotnej biblioteki. Przeszukiwanie łysinek pierwotnej biblioteki przeprowadzono stosując sondy N2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4) plus C2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6). W sumie 12 zrekombinowanych łysinek, które hybrydyzowały z sondami N- i C-końcową, pobrano i oczyszczono przez drugą turę przeszukiwania hybrydyzacyjnego sondami N2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4) i C2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6). Analiza przez blotting Southema ujawniła, że w pięciu z sześciu analizowanych

176 372 klonów z zarówno N-, jak i C-końcową sondą hybrydyzował fragment BamHI o długości 2,2 kb. Wynik ten potwierdził wcześniejszą analizę przez hybrydyzację Southema, która wskazywała, że fragment BamHI o długości 2,2 kb zawierał gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Ten fragment DNA o długości 2,2 kb sklonowano do dalszej analizy w wektorze plazmidowym pUC18 (Yanish-Perron i in., 1985) w obu orientacjach. Mapowanie restrykcyjne wykazało obecność wewnętrznych miejsc restrykcyjnych Sali i Bglll, jak przewidziano na podstawie analizy przez hybrydyzację Southerna. Miejsca te są również konserwatywne w porównaniu z opublikowaną sekwencją genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Fragment BamHI zsubklonowano dalej w postaci czterech fragmentów do bezpośredniego sekwencjonowania DNA.

Analiza sekwencji genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej

W sumie 1865 nukleotydów sekwencji DNA fragmentu BamHI o długości 2,2 kb określono przez bezpośrednią analizę sekwencji DNA subklonów tego fragmentu z zastosowaniem metody terminacji łańcucha dideoksynukleotydami. Sekwencji tej nadano numer identyfikacyjny: 7. Ta sekwencja DNA zawiera nie kodujące regiony flankujące w zarówno końcu 3', jak i 5'. Analiza tej sekwencjiDNAujawniła pojedynczą otwartą ramkę odczytu, którakoduje sekrecyjny peptyd sygnałowy i dojrzałe białko oksydazy 3-hydroksysteroidowej o długości odpowiednio 43 i 504 aminokwasów. Jest ona w 84,37% identyczna z opublikowaną sekwencją nukleotydową oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Przewidywana sekwencja aminokwasowa jest w 81,685% identyczna z opublikowaną sekwencją oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Nadano jej numer identyfikacyjny sekwencji: 8. Sprawdzenie sekwencji DNA A19249 i porównanie z N-końcową sekwencją aminokwasową nienaruszonej oksydazy 3-hydroksysteroidowej z A19249 ujawniły, że gen A19249 kodował białko obejmujące sekwencję peptydu sygnałowego, który jest rzeczywiście odtrawiany podczas sekrecji białka z komórek. A zatem, koniec N dojrzałego białka z A19249 zaczyna się Ser-Gly-Gly-Thr-Phe; nadano mu numer identyfikacyjny sekwencji: 12.

TRANSFORMACJA GENETYCZNA

Gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej można wyizolować z nowych organizmów, lub można go otrzymać ze znanych źródeł, takich jak Rhodococcus sp. opisany przez Longa i in. w światowym opisie patentowym numer WO 90 05,788. Gen ten można następnie zastosować do stransformowania komórek bakteryjnych lub komórek roślinnych dla umożliwienia wytwarzania oksydazy 3-hydroksysteroidowej i zastosowania metod tego wynalazku. Przykłady, jak można tego dokonać z genem A19249 podano poniżej.

Mutageneza genu A19249

Do wbudowania genu A19249 do wektorów odpowiednich do ekspresji oksydazy 3-hydroksysteroidowej w heterologicznych gospodarzach bakteryjnych lub roślinnych, konieczne było wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych blisko końców genu. Celem tej mutagenezy było utworzenie kasetek, które zawierały sekwencję kodującą białko z niewielkimi nie kodującymi sekwencjami flankującymi i wprowadzenie użytecznych miejsc restrykcyjnych do uwalniania tych kasetek. Zaprojektowano kasetki, które powinny umożliwić uwolnienie nienaruszonej sekwencji kodującej, włącznie z peptydem sygnałowym lub bezpośrednio przed dojrzałą sekwencją kodującą. Dla wprowadzania tych kasetek do odpowiednich bakteryjnych lub roślinnych wektorów ekspresyjnych, przy N-końcu nienaruszonej sekwencji białka utworzono miejsca restrykcyjne Ncol. Miejsce BamHI utworzono bezpośrednio po kodonie terminacji nienaruszonej sekwencji kodującej. Dla utworzenia tych kasetek zaprojektowano trzy mutagenizujące startery, jak pokazano poniżej. Mutageneza starterem Chossn (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9) spowodowała podstawienie trzema aminokwasów (MAT) waliny i asparaginy w końcu N peptydu sygnałowego nienaruszonego białka, starterem Chomnr (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10) dodała dwa aminokwasy (MA) w końcu N dojrzałego białka. Było to konieczne dla umożliwienia wbudowania miejsca restrykcyjnego Ncol. Mutageneza starterem Cho3br (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11) wprowadziła miejsce BamHI przy końcu 3' sekwencji kodującej. Startery Chomnr i Cho3br użyto bezpośrednio utworzenia antysensownej nici DNA.Chossn (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9):

CTCAGGAGCACCATGGCGACCGCACAC (miejsca Ncol podkreślone)

Chomnr (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10):

176 372

GTGCCGCCGGAGGCCATGGGGGCGGTGGC (miejsce Ncol podkreślone)

Cho3br (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11):

GCCCCGCCCGTCGGATCCGTCAGGAACCCG (miejsce BamHI podkreślone)

Otrzymane zmodyfikowane sekwencje określono jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 13, kodującą nienaruszone białko i sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 14 dla dojrzałego białka.

Ekspresja oksydazy 3-hydroksysteroidowej w E. coli

Fragmenty Ncol-BamHI, zawierające albo sekwencję kodującą nienaruszone białko, albo sekwencję kodującą dojrzałe białko, wstawiono do wektora przeznaczonego do ekspresji białka w E. coli, pKK233-2 (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Wektor zawierający sekwencję kodującą zmodyfikowane białko nienaruszone (pełnej długości) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13) oznaczono pMON20907. Wektor zawierający sekwencję kodującą zmodyfikowane dojrzałe białko (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14) oznaczono pMON20907. W komórkach E. coli XL1 Blue (Stratagene, San Diego, CA) zmodyfikowanych wektorem pMON20909 zachodziła ekspresja oksydazy 3-hydroksysteroidowej o wyższych poziomach aktywności enzymatycznej niż w komórkach zmodyfikowanych wektorem pMON20907. Białko wyekstrahowano i oczyszczono z 4 litrów indukowanej IPTG. E. coli zawierającej pMON20909. Rozpuszczalną frakcję z zsonikowanego lizatu bakteryjnego zatężono i dializowano, a następnie częściowo oczyszczono na przez chromatografię na mono Q otrzymując 11 jednostek aktywności oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Analiza przez blotting typu Western wskazuje, że sekwencja sygnałowa nienaruszonego białka jest odtrawiana w E. coli, ale dokładnego miejsca odtrawienia nie określono. Analiza odzyskanego białka wykazała pięciokrotne zmniejszenie aktywności enzymatycznej w stosunku do białka A19249, ale utraty tej nie wyjaśniono przez sekwencjonowąnie DNA, które nie wykazało żadnych zmian mogących wyjaśnić utratę aktywności enzymatycznej w protoplastach roślinnych lub E. coli.

Odzyskane białko testowano wobec Heliothis virescens i uzyskano 88% zahamowania rozwoju przy dawce 100 pg/ml.

Expresja oksydazy 3-hydroksysteroidowej w bakteriach zasiedlających rośliny.

Dla zwalczania owadów może być pożądana ekspresja oksydazy 3-hydroksysteroidowej w bakteriach zasiedlających rośliny, a następnie stosowanie tych bakterii wobec roślin. Gdy owad żeruje na roślinie, to spożywa toksyczną dawkę oksydazy 3-hydroksysteroidowej wytwarzanej przez bakterie zasiedlające roślinę. Bakteriami zasiedlającymi rośliny mogą być albo te, które zamieszkują powierzchnię rośliny, takiejak gatunki Pseudomonas lub Agrobacterium, albo endofity, które zamieszkują tkankę naczyniową rośliny, takie jak gatunki Clavibacter. W przypadku bakterii zasiedlających powierzchnię, gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej można wprowadzać do wektora o szerokim spektrum gospodarzy, zdolnego do replikacji w tych gospodarzach Gram-ujemnych. Przykładami takich wektorów są pKT231 z grupy zgodności IncQ [Bagdasarian i in., 1981] lub pVK100 z grupy IncP z grupy IncP [Knauf, 1982]. W przypadku endofitów gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej można wstawić do chromosomu przez rekombinację homologiczną lub przez wprowadzenie genu do odpowiedniego transpozonu, zdolnego do włączania się do chromosomów w tych bakteriach endofitycznych.

Konstruowanie genu roślinnego

Ekspresja genu roślinnego, który istnieje w postaci dwuniciowego DNA, obejmuje transkrypcję matrycowego RNA (mRNA) z jednej nici DNA przez enzym polimerazę RNA i następnie procesowanie pierwotnego transkryptu mRNA wewnątrz jądra. To procesowanie obejmuje 3'-końcowy region nie ulegający translacji, i polega na dołączaniu nukleotydów poliadenylowych do końca 3' RNA. Transkrypcja DNA na RNA jest regulowana przez region DNA zazwyczaj określany jako 'promotor. Region promotora zawiera sekwencję zasad, która przekazuje sygnał polimerazie RNA do związania się z DNA i rozpoczyna transkrypcję mRNA wykorzystując jedną z nici DNA jako matrycę do utworzenia odpowiadającej nici DNA.

W literaturze opisano liczne promotory, które są aktywne w komórkach roślinnych. Takie promotory można otrzymać z roślin lub wirusów roślinnych i obejmują one, ale nie ograniczają się do promotorów syntazy nopalinowej (NOS) i syntazy oktopionowej (OCS) (które przenoszone są na indukujących nowotwory plazmidach Agrobacterium tumefaciens), promotory 19S

176 372 i 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), indukowanego światłem promotora małej podjednostki karboksylazy rybulozo-ŁS-bisioslOranowej (ssRUBISCO, bardzo szeroko rozpowszechniony polipeptyd roślinny) i promotora 35S wirusa mozaiki trędownika (FMV). Wszystkie z tych promotorów stosowano do tworzenia różnych typów konstrukcji DNA, które ulegały ekspresji w roślinach (patrz np. publikacja PCT światowego opisu patentowego numer WO 84/02913.

Konkretny wybrany promotor powinien być zdolny do powodowania wystarczającej ekspresji sekwencji kodującej enzym, której wynikiem jest wytwarzanie skutecznej ilości oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Preferowanym promotoremjest promotor konstytutywny, taki jak FMV35S. Obserwowano, że zapewnia on bardziej jednolitą ekspresję genów heterologicznych w kwitnących częściach roślin. Zastosowanie takiego promotora z genem oksydazy 3-hydroksysteroidowej może zapewnić większą ochronę torebek nasiennych i pól bawełny przed zniszczeniami przez owady, niż w przypadku innych promotorów.

Promotory użyte w konstrukcjach DNA (tj. chimerycznych genach roślinnych) według niniejszego wynalazku można, jeśli jest to pożądane, modyfikować w celu wpływania na ich właściwości kontrolujące. Na przykład, promotor CaMV35S można zligować z częścią genu ssRUBISCO, która hamuje ekspresję ssRUBISCO w nieobecności światła, dla utworzenia promotora aktywnego w liściach, ale nie w korzeniach. Otrzymany chimeryczny promotor można zastosować jak tu opisano. Do celów tego opisu, zwrot promotor CaMV35S obejmuje zatem odmiany promotora CaMV, np. promotory otrzymane przez ligację z regionami operatorowymi, mutagenezę losową lub kontrolowaną, itp. Ponadto, promotory można tak zmieniać, aby zawierały wielokrotne sekwencje wzmacniające dla wspomagania podwyższania ekspresji genów. Przykłady takich sekwencji wzmacniających podali Kay i in. (1987).

RNA wytworzony przez konstrukcję dNa według niniejszego wynalazku zawiera również 5'-końcową nie ulegającą translacji sekwencję liderową. Sekwencja ta może pochodzić z promotora wybranego do ekspresji genu, i można ją specyficznie zmodyfikować, tak aby zwiększała translację mRNA. 5'-końcowy region nie ulegający translacji można także otrzymywać z RNA wirusowych, z odpowiednich genów eukariotycznych lub z syntetycznych sekwencji genów. Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do konstrukcji, w których region nie ulegający translacji pochodzi z 5'-końcowej sekwencji nie ulegającej translacji, która towarzyszy sekwencji promotora. Jak pokazano poniżej, sekwencją liderową genu roślinnego, która jest użyteczna w niniejszym wynalazku, jest lider białka szoku cieplnego 70 (Hsp70) petunii [Winter i in.].

Jak podano powyżej, 3'-końcowy region nie ulegający translacji chimerycznych genów roślinnych według niniejszego wynalazku zawiera sygnał poliadenylacji, który działa w roślinach powodując dodanie nukleotydów adenylowych do końca 3' RNA. Przykładami korzystnych regionów 3'-końcowych są (1) 3'-końcowe regiony ulegające transkrypcji, nie ulegające translacji, zawierające sygnał poliadenylacji genów plazmidu indukującego nowotwór (Ti) Agrobacterium, takie jak genu syntezy nopalinowej (NOS) i (2) genów roślinnych, takich jak geny białka zapasowego 7s soi i gen ssRUBISCO E9 grochu. [Fischhoff i in.].

Transformacja i ekspresja w roślinach

Chimeryczny gen roślinny obejmujący strukturalną sekwencję kodującą według niniej szego wynalazku można wstawić do genomu rośliny jakąkolwiek odpowiednią metodą. Odpowiednie transformujące wektory roślinne obejmują wektory pochodzące od plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens, jak również te ujawnione przez np. Herrera-Estrella (1983), Bevana (1983), Klee (1985) i publikację europejskiego opisu patentowego numer 0 120 516 (Schilperoot i in.). Poza roślinnymi wektorami transformującymi pochodzącymi od plazmidu Ti i plazmidu wywołującego chorobę włosowatości korzeni (Ri) Agrobacterium, do wprowadzania konstrukcji DNA według niniejszego wynalazku do komórek roślinnych można użyć alternatywnych metod. Metody takie mogą obejmować, na przykład, zastosowanie liposomów, elektroporacji, środków chemicznych zwiększających pobieranie wolnego DNA, wprowadzanie wolnego DNA przez bombardowanie mikropociskami i transformację z zastosowaniem wirusów lub pyłku.

Szczególnie użytecznym, opartym na plazmidzie Ti wektorem kasetki do transformacji roślin dwuliściennych jest pMON11782. Kaseta ekspresyjna pMONl 1782 składa się z promotora FMV35S, 5'-końcowego nie ulegającego translacji lidera Hsp70 petunii i końca 3', włącznie z sygnałami poliadenylacji, z genu ssRUBISCO E9 grochu. Pomiędzy liderem i 3'-końcowymi

176 372 sygnałami połiadenylacji znajduje się poliłącznik zawierający wiele miejsc restrykcyjnych, włącznie z miejscem BamHI do wstawiania genu. pMON 11782 zawiera także miejsce HindIII przed sekwencją promotora. .

Pozostała część pMON11782 zawiera odcinek pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA), który zapewnia miejsce początku replikacji w E. coli, region oriV z plazmidu RK1 o szerokim zakresie gospodarzy, który umożliwia replikację w szczepie ABI Agrobacterium, gen oporności na streptomycynę-streptinomycynę z Tn7 i chimeryczny gen NPTII, zawierający promotor CaMV35S i koniec 3' genu syntezy nopalinowej (NOS), który zapewnia oporność na kanamycynę stransformowanych komórek roślinnych.

Innym szczególnie użytecznym wektorem kasetki opartym na plazmidzie Ti jest pMON17227. Wektor ten opisali Barry i in. w światowym opisie patentowym numer WO 92/04449; zawiera on gen kodujący enzym nadający oporność na glifosat, który jest doskonałym genem markera selekcyjnego dla wielu roślin.

Krótkotrwała ekspresja oksydazy 3-hydroksysteroidowej w roślinach tytoniu

Obie kasetki genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej, tj. gen kodujący nienaruszone białko z sekwencją sygnałową i gen kodujący tylko dojrzałe białko, z których każdy zmodyfikowano w końcu N jak opisano powyżej, uwolniono jako fragmenty NcoI-BamHI i wstawiono do wektora do krótkotrwałej ekspresji, który przecięto Ncol i BamHI. Wektor do krótkotrwałej ekspresji jest prostym plazmidem, zawierającym promotor roślinny z 5'-końcowym liderem nie ulegającym translacji, 3'-końcową nie ulegającą translacji sekwencją połiadenylacji i pomiędzy nimi poliłącznik posiadający wiele miejsc restrykcyjnych do wstawiania sekwencji kodującej białko. Skonstruowane wektory umieszczają gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej pod kontrolą promotora FMV35S z omówioną powyżej sekwencją lidera HSP70 petunii. W 3'-końcowym regionie terminacji znajduje się nie ulegający translacji sygnał poliadenylacji genu syntazy nopalinowej. Zidentyfikowano plazmid zawierający sekwencję kodującą nienaruszone białko (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13) i nazwano pMON20910. Zidentyfikowano plazmid zawierający sekwencję kodującą zmodyfikowane dojrzałe białko i nazwano go pMON20908.

pMON20910 i pMON20908 są wektorami do ekspresji genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej w komórkach roślinnych, ale pozbawione są sekwencji odpowiednich do stosowania w transformacji roślin za pośrednictwem Agrobacterium. Jednakże, wektory te można stosować albo do krótkotrwałej ekspresji oksydazy 3-hydroksysteroidowej w komórkach roślinnych, albo do utworzenia stabilnie stransformowanych roślin bawełny przez wprowadzenie wolnego DNA, takie jak bombardowanie mikropociskami merystemów bawełny.

Do analizy ekspresji krótkotrwałej, oczyszczono próbki plazmidowego DNA z pMON20908 i pMON20910 i wprowadzono je do tytoniu przez elektroporację. Ekstrakcja przez zamrażanie-rozmrażanie, a następnie dziewięciokrotne zatężenie rozpuszczalnych frakcji w koncentratorach sączkowych Centricon-10 umożliwiły jednoznaczne wykrycie aktywności oksydazy 3-hydroksysteroidowej we wszystkich lizatach komórkowych, immunologicznie przez blotting typu Western i enzymatycznie. Aktywność lizatu z komórek zawierających pMON20908, to jest sekwencję kodującą dojrzałe zmodyfikowane białko, było około dzięsięciokrotnie niższa niż ta uzyskana z komórek zawierających pMON20910. Analiza przez blotting Western wskazywała, że sekwencja sygnałowa jest odtrawiana w protoplastach, chociaż niekonicznie z dokładnością niezbędną do utworzenia dojrzałego białka o postaci i aktywności identycznej jak tego naturalnie wydzielanego przez Streptomyces A19249.

Stabilna transformacja roślin dwuliściennych genem oksydazy 3-hydroksysteroidowej pMON20908 i pMON20910 zastosowano do skonstruowania wektorów do stabilnej transformacji roślin dwuliściennych Agrobacterium. Oba częściowo strawiono enzymem restrykcyjnym Notl w celu utworzenia fragmentów DNA zawierających promotor FMV35S, lider HSP70 petunii, sekwencję kodującą albo nienaruszoną [pełnej długości], albo dojrzałą oksydazę 3-hydroksysteroidową oraz 3'-końcowe miejsce poliadenylacji nos. Częściowe strawienie było konieczne, ponieważ poza miejscami NotI flankującymi kasetkę ekspresyjną, występują dwa miejsca Notl w genie oksydazy cholesterolowej - jedno w regionie kodującympeptyd sygnałowy peptydowego i jedno w regionie kodującym dojrzałe białko. Fragmenty po częściowym stra14

176 372 wieniu Notl zawierające całą kasetkę ekspresyjną izoluje się stosując elektroforezę w żelu agarozowym i oczyszcza przez ekstrakcję z agarozy. Te fragmenty Notl wstawia się do strawionego Notl plazmidu pMON17227, który opisali Barry i in. w światowym opisie patentowym numer WO 92/04449. pMON20913 zidentyfikowano jako zawierający nienaruszoną sekwencję kodującą. pMON20923 zidentyfikowano jako zawierający dojrzałą sekwencję kodującą.

Wektory te wprowadzono do rozbrojonego gospodarza Agrobacterium ABI i zastosowano do transformacji tytoniu w hodowli tkankowej. Selekcja pod kątem oporności na glifosat doprowadziła do uzyskania kilku stransformowanych linii dla każdego wektora. Dla pMON20913, przez blotting typu Western potwierdzono, że cztery z 18 linii były zdolne do ekspresji oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Dla pMON20923, przez blotting typu Western potwierdzono, że cztery z 29 linii były zdolne do ekspresji oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Analiza linii stransformowanych pMON20913 potwierdziła obecność aktywności oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Roślina o najwyższej ekspresji wykazywała ekspresję na poziomie 0,2% białka całkowitego, co jest równoważne 54 ng enzymu na mg mokrej tkanki.

Wektory zawierające kasetkę nienaruszonej lub dojrzałej oksydazy 3-hydroksysteroidowej prowadziły ekspresję aktywnego enzymu w cytoplazmie komórki roślinnej. Nie było żadnych dowodów na wydzielanie poza stransformowane komórki. Wykazano, że niektóre bakteryjne sekwencje sygnałowe sekrecji działają w komórkach roślinnych. Może być pożądane skierowanie większości lub całości białka oksydazy 3-hydroksysteroidowej na drogę sekrecji w roślinach. Dla uzyskania tego korzystne być może zastosowanie sekwencji sygnałowej pochodzącej raczej z genu roślinnego niż sygnału bakteryjnego. Przykładem takiej sekwencji sygnałowej jest sekwencja z genu PRlb tytoniu, opisana przez Comelissena in. pMON10824, ujawniony w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 0 385 962, jest roślinnym wektorem transformującym przeznaczonym do ekspresji aktywnego wobec motyli białka B.t. kurstaki. Sekwencję kodującą B.t.k. poddano w pMON10824 fuzji z sekwencją sygnałową PR1b i 10 aminokwasami sekwencji kodującej dojrzałe PRlb. Ten gen fuzyjny B.t.k,. pozostaje pod kontrolą promotora CaMV35S zawierającego podwójną sekwencję wzmacniającą. Inne wektory zawierające sekwencję sygnałowąPRIB i promotor CaMV35S również mogą służyć jako źródło tych elementów. Dla utworzenia wektora, w którym sekwencja sygnałowa PR1b jest połączona z genem oksydazy 3-hydroksysteroidowej, fragment DNA zawierający sekwencję promotora CaMV35S i sekwencję sygnałową PR1B stosuje się do zastąpienia fragmentu zawierającego sekwencje promotora fMv i lidera HSP70 w pMON20913 i pMON20923. W wyniku tego otrzymano plazmidy, w których sekwencja kodująca oksydazę 3-hydroksysteroidową (albo kasetka dojrzałego białka, albo nienaruszonego białka) jest połączona z aminokońcowym sygnałem sekrecyjnym z genu PRlb i pozostaje pod kontrolą promotora CaMV35S. Miejsca rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Ncol w końcu 3' fragmentu zawierającego PR 1b i końcu 5' sekwencji kodującej zmodyfikowane białko oksydazy 3-hydroksysteroidowej umożliwiają połączenia w jednej ramce odczytu pomiędzy dwoma elementami. pMON20930 i pMON20932 są roślinnymi wektorami transformującymi, które zawierają takie fuzje pomiędzy sekwencją sygnałową PR1B i odpowiednio albo nienaruszoną oksydazą cholesterolową, albo dojrzałą oksydazą cholesterolową. Można skonstruować podobny plazmid, w którym gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej znajduje się pod kontrolą promotora FMV35S. Takie plazmidy wprowadza się do rozbrojonego gospodarza Agrobacterium i stosuje do transformowania roślin dwuliściennych. A zatem, rośliny te wytwarzają oksydazę 3-hydroksysteroidową, która jest wydzielana do przestrzeni pozakomórkowej.

W niektórych przypadkach, białka które wkraczają na szlak sekrecyjny rośliny, są kierowane do różnych przedziałów komórkowych, takich jak wakuole. Kierowanie oksydazy 3hydroksysteroidowej do wakuoli komórek roślinnych może być pożądane. W tym przypadku stosuje się opisane powyżej wektory, w których sekwencja sygnałowa PR1b jest ponadto zmodyfikowana, tak aby obejmowała sekwencje kierujące do wakuoli pochodzące ze znanych genów enzymów wakuoli roślinnych.

Pożądane może być również pozostanie oksydazy 3-hydroksysteroidowej w świetle retikulum endoplazmatycznego (ER). W tym przypadku wektory, w których sekwencję sygnałową

PR 1b stosuje się do kierowania białka na szlak sekrecyjny modyfikuje się ponadto w taki sposób, aby obejmowały sekwencje, o których wiadomo, że kodują sygnały zatrzymania w ER. Te sekwencje dodaje się tak, że odpowiadające za pozostanie w ER peptydy o długości czterech aminokwasów, takie jak HDEL (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15) i KDEL (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16) są połączone z końcem karboksylowym oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Do wprowadzenia tych dodatkowych sekwencji do karboksylowego końca sekwencji kodującej oksydazy 3-hydroksysteroidowej stosuje się ukierunkowaną mutagenezę. pMON20937 i pMoN20938 są wektorami, w których do pMON20932 wprowadzono odpowiednio peptydy HDEL (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15) i RGSEKDEL (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17).

Korzystne może być kierowanie białka oksydazy 3-hydroksysteroidowej do innego przedziału komórkowego, chloroplastrów. Białka można kierować do chloroplastów przez dołączanie do ich końców N peptydu przenoszącego do chloroplastów (CTP). Jednym z CTP, który wykazywał aktywność lokalizowania białek heterologicznych w chloroplastach jest ten pochodzący z genu małej podjednostki RUBISCO Arabidopsis, oznaczony atslA. Dla zakończonej sukcesem lokalizacji w chloroplastach białka B.t.k. skonstruowano wariant tego peptydu przenoszącego, który koduje peptyd przenoszący, 24 aminokwasy dojrzałej sekwencji RUBISCO plus wielokrotnie powtórzone miejsca odszczepiania peptydu przenoszącego (Wong, 1992). Wektory zawierające peptyd przenoszący ats1A Arabidopsis połączony z genem B.t.k.. można zastosować jako podstawę do konstruowania wektorów do chloroplastowej lokalizacji białka oksydazy 3-hydroksysteroidowej. Na przykład pMON1O817, skonstruowany z promotora małej podjednostki RUBISCO z genu ats1A Arabidopsis, natywnego 5'-końcowego nie ulegającego translacji lidera atsla, opisanego powyżej wariantu peptydu przenoszącego do chloroplastów atslA oraz skróconego genu enzymu B.t.k:. trawi się enzymami restrykcyjnymi NotI i Ncol. Fragment DNA Notl-Ncol zawierający promotor, lider i peptyd przenoszący stosuje się do zastąpienia fragmentu Notl-Ncol zawierającego sekwencje promotora FMV i lidera HSP70 w pMON20913 i pMON20923. W tych reakcjach powstają plazmidy pMON20929 i pMON20931, w których sekwencja kodująca oksydazę 3-hydroksysteroidową (odpowiednio kasetka nienaruszonego białka albo dojrzałego białka) jest połączona w końcu aminowym z peptydem przenoszącym do chloroplastów i ulega transkrypcji pod kontrolą promotora ats1A. Alternatywnie, można skonstruować podobny plazmid, zastępując promotor ats1A promotorami CaMV35S lub FMV35S. Plazmidy takie wprowadza się do rozbrojonych gospodarzy Agrobacterium i stosuje się do transformacji roślin dwuliściennych. A zatem, rośliny te wytwarzają oksydazę 3-hydroksysteroidową, która jest zlokolizowana w chloroplastach.

Korzystne może być również kierowanie oksydazy 3-hydroksysteroidowej do innego przedziału subkomórkowego, mitochondriów. Przykłady białek, które normalnie zlokalizowane są w mitochondriach, i dla których znane są sekwencje kierujące, obejmują cytochrom C1, który zlokalizowany jest w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej (Braun, 1992) i podjednostkę (3 syntezy ATP, która zlokolizowana jest w matriks mitochondrialnej (Boutry, 1987). Kierujące do mitochondrów sekwencje DNA kodujące aminokońcowe peptydy kierujące do mitochondriów izoluje się stosując reakcję łańcuchowąpolimerazy (PCR). Startery oligonukleotydowe odpowiadające amino- i karboksylokońcowym częściom tych sekwencji kierujących stosuje się do amplifikacji przez PCR pierwszej nici cDNA, który utworzono z mRNA stosując odwrotną transkryptazę. Statery oligonukleotydowe posiadają tak przyłączone miejsce restrykcyjne NcoI, że zamplifikowany produkt po strawieniu NcoI można wstawić do miejsc Ncol przy końcu aminowym kasetek sklonowanego genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej. A zatem, stosując promotory takie jak CaMV35S lub FMV35S, w roślinach można uzyskać ekspresję różnych postaci oksydazy 3-hydroksysteroidowej i można je lokalizować w mitochondriach.

Stabilna transformacja roślin jednoliściennych

Gen oksydazy 3-hydroksysteroidowej można w sposób stabilny wbudować do genomu roślin jednoliściennych stosując wektory i metody opisane w światowym opisie patentowym numer WO 93/19189 (Br5own i in.). Gen można wstawić w odpowiedni wektor, na przykład pMON19653 i pMON19643, opisane przez Browna i in. Otrzymane konstrukcje zawierają kasetkę składającą się z promotora CaMv, intronu Hsp70, markera selekcyjnego oporności na

176 372 glifosat CP4 i terminatora NOS; kasetkę składającą się z promotora CaMV E35S, intronu Hsp70, markera selekcyjnego oporności na glifosat GOX i terminatora NOS oraz pojedynczego miejsca NotI do wstawiania kasetki ekspresyjnej genu zawierającej gen oksydazy · 3-hydroksysteroidowej, taki jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13 lub numerze identyfikacyjnym: 14.

Wektor ten wprowadza się przez bombardowanie komórek zarodkowej hodowli tkankowej stosując urządzenie do bombardowania mikropociskami, jak opisali Brown i in. Stransformowane komórki selekcjonuje się pod kątem oporności na glifosat i regeneruje całe rośliny. Poprzez analizę techniką blottingu typu Western, oznaczanie aktywności esterazy lub oznaczanie odporności na owady można potwierdzić, że w roślinach odpornych na owady zachodzi ekspresja genu.

Kierowanie białka do poszczególnych przedziałów jest również możliwe w przypadku roślin jednoliściennych z zastosowaniem opisanych powyżej sekwencji sygnałowych.

Na podstawie powyższego opisu widoczne jest, że wynalazek ten jest dobrze dostosowany do osiągnięcia wszystkich wymienionych powyżej zamierzonych celów, łącznie z korzyściami, które są oczywiste i stanowią istotę wynalazku. Będzie zrozumiałe, że pewne cechy i subkombinacje wynalazku są użyteczne i mogą być stosowane bez odniesienia do innych cech i subkombinacji. Są one przewidywane przez zastrzeżenia i pozostają w ich zakresie. Ponieważ jest wiele możliwych rozwiązań wynalazku bez · wychodzenia poza jego zakres, powinno być zrozumiałe, że wszystko, co zostało przedstawione w tym opisie lub pokazane na dołączonych rysunkach należy traktować jako zilustrowanie wynalazku, a nie jego ograniczanie.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób zwalczania owadów należących do motyli na rośliny, znamienny tym, że obejmuje dostarczanie oksydazy 3-hydroksysteroidowej do spożywania przez owady.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że owad jest w stadium larwalnym.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczoną oksydazę 3-hydroksysteroidową dostarcza się przez mikroorganizmy zasiedlające rośliny, które wytwarzają oksydazę 3-hydroksysteroidową po zastosowaniu wobec roślin.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczoną oksydazę 3-hydroksysteroidową dostarcza się przez ekspresję genu oksydazy 3-hydroksysteroidowej wstawionego do rośliny przez uprzednią genetyczną transformację komórki macierzystej rośliny.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że rzeczoną rośliną jest bawełna lub kukurydza.
6. Sposób wytwarzania genetycznie stransformowanej rośliny, w której zachodzi ekspresja oksydazy 3-hydroksysteroidowej w ilości skutecznej do zwalczania inwazji owadów należących do motyli, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) wstawiania do genomu komórki roślinnej zrekombinowanej, dwuniciowej cząsteczki DNA obejmującej:

(i) promotor, który działa w komórkach roślinnych powodując wytwarzanie sekwencji

RNA;

(ii) strukturalną sekwencję kodującą oksydazę 3-hydroksysteroidową;

(iii) 3'-końcowy region nie ulegający translacji, który działa w rzeczonych komórkach roślinnych powodując dołączanie nukleotydów poliadenylowych do końca 3' sekwencji RNA;

gdzie rzeczony promotor jest heterologiczny wobec rzeczonej strukturalnej sekwencji kodującej i gdzie rzeczony promotorjest połączony w sposób umożliwiający działanie z rzeczoną strukturalną sekwencją kodującą, która jest z kolei połączona w sposób umożliwiający działanie z rzeczonym regionem nie ulegającym translacji;

b) otrzymywania stransformowanych komórek roślinnych; i

c) regenerowania ze stransformowanych komórek roślinnych genetycznie stransformowanych roślin, w których zachodzi ekspresja skutecznej w zwalczaniu inwazji owadami należącymi do motyli ilości oksydazy 3-hydroksysteroidowej.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że rzeczona strukturalna sekwencja DNA obejmuje sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 13 lub sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 14.
8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że rzeczona komórka roślinna jest komórką roślinną bawełny lub kukurydzy.
9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że genom rzeczonej komórki roślinnej zawiera także jeden lub więcej genów powodujących ekspresję endotoksyn B. t.