PL174686B1 - Sposób wykrywania wczesnej serokonwersji w gospodarzach ssaczych i sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) - Google Patents

Abstract

1. Sposób wykrywania wczesnej serokonwersji w gospodarzach ssaczych jako odpowiedzi na wirusa zapalenia watroby typu C (HCV) obejmujacy (a) otrzymywanie z gospodarza, skladnika ciala podejrzanego o posiadanie przeciwcial przeciwko HCV, (b) kontaktowanie tego skladnika ciala z antygenowa sekwencja aminokwasowa HCV albo ze standardowa próba kontrolna w warunkach umozliwiajacych zajscie reakcji immunologicznej, i (c) wykrywanie obecnosci kompleksów immunologicznych przeciwcial i antygenu, przy czym nieobecnosc tego kompleksu immunologicznego zawierajacego te standardowa próbe kontrolna i obe- cnosc tego kompleksu immunologicznego zawierajacego te aminokwasowa sekwencje antygenowa HCV wskazuje serokonwersje w odpowiedzi na HCV, znamienny tym, ze aminokwasowa sekwencja antygenowa HCV wybrana jest z aminokwasowej sekwencji antygenowej kodowanej w regionie E l genomu HCV, amino- kwasowej sekwencji antygenowej kodowanej w regionie E2 genomu HCV Iub ich agregatach i która charakte- ryzuje sie tym, ze oczyszczana jest w warunkach nie denaturujacych. 11. Sposób wykrywania przeciwcial przeciw wirusowi zapalenia watroby typu C (HCV) w sklad- niku ciala ssaka, obejmujacy (a) otrzymanie skladnika ciala ssaka podejrzanego o posiadanie przeciwcial przeciw HCV, (b) kontaktowanie tego skladnika ciala ssaka z co najmniej dwiem a antygenowymi sekwen- cjami am inokwasowymi w warunkach umozliwiajacych zajscie reakcji im m unologicznej, (c) wykrycie kompleksów im m unologicznych tych am inokwasowych sekwencji antygenowych i przeciwcial, znamien- ny tym, ze co najmniej jedna aminokwasowa sekwencja antygenowa wybrana jest z grupy stanowiacej aminokwasowa sekwencje antygenowa kodowana w regionie E l genomu HCV, aminokwasowa sekwencje antygenowa kodowana w regionie E2 genomu HCV albo ich agregatów i która charakteryzuje sie tym, ze oczyszczana jest w warunkach nie denaturujacych. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania wczesnej serokonwersji w gospodarzach ssaczych jako odpowiedzi na wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) obejmujący (a) otrzymywanie z gospodarza, składnika ciała podejrzanego o posiadanie przeciwciał przeciwko HCV, (b) kontaktowanie tego składnika ciała z antygenową sekwencją aminokwasową HCV albo ze standardową próbą kontrolną w warunkach umożliwiających zajście reakcji immunologicznej, i (c) wykrywanie obecności kompleksów immunologicznych przeciwciał i antygenu, przy czym nieobecność tego kompleksu immunologicznego zawierającego standardową próbę kontrolną i obecność tego kompleksu immunologicznego zawierającego tę aminokwasową sekwencję antygenową HCV wskazuje serokonwersję w odpowiedzi na HCV, polegający na tym, że aminokwasową sekwencja antygenowa HCV wybrana jest z aminokwasowej sekwencji antygenowej kodowanej w regionie E1 genomu HCV, aminokwasowej sekwencji antygenowej kodowanej w regionie E2 genomu HCV lub ich agregatach i która ponadto charakteryzuje się tym, że oczyszczana jest w warunkach nie denaturujących. Korzystnie jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję aminokwasową kodowaną w obrębie domeny El genomu HCV, lub również korzystnie sekwencję aminokwasową polipeptydu E1.

W innym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję aminokwasową kodowaną w obrębie domeny E2 genomu hCv, lub również korzystnie sekwencję aminokwasową polipeptydu E2. W innym korzystnym wykonaniu jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję agregatu polipeptydu E1/E2. Można też stosować sekwencję aminokwasową agregatu polipeptydu E1/E1, lub sekwencję agregatu polipeptydu E2/E2.

Korzystnie w sposobie według wynalazku jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję wytwarzaną na drodze ekspresji w rekombinantowym wirusie krowianki, lub również korzystnie stosuje się sekwencję wytwarzaną na drodze ekspresji w komórkach CHO. W drugim wariancie przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka, obejmujący (a) otrzymanie składnika ciała ssaka podejrzanego o posiadanie przeciwciał przeciw HCV, (b) kontaktowanie tego składnika ciała ssaka z co najmniej dwiema antygenowymi sekwencjami aminokwasowymi w warunkach umożliwiających zajście reakcji immunologicznej, (c) wykrycie kompleksów immunologicznych tych aminokwasowych sekwencji antygenowych i przeciwciał, polegający na tym, że co najmniej jedna aminokwasową sekwencja antygenowa wybrana jest z grupy stanowiącej aminokwasową sekwencję antygenową kodowaną w regionie El genomu HCV, aminokwasową sekwencję antygenową kodowaną w regionie E2 genomu HCV albo ich agregatów i która charakteryzuje się tym, że jest oczyszczana w warunkach nie denaturujących.

Sposoby według wynalazku pozwalają na przeprowadzenie metody badania przesiewowego składników krwi lub krwi na obecność wirusa HCV przed użyciem tej krwi lub składników krwi do wytwarzania produktów krwi.

W oparciu o sposoby według wynalazku można utworzyć zestaw do wykrywania przeciwciał HCV, w którego skład wchodzą: antygen HCV zawierający epitop z domeny E1 lub E2 wirusa HCV i standardy kontrolne, zapakowane w odpowiednie fiolki oraz instrukcje stosowania składników zestawu.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym na fig. 1 jest przedstawiony schemat, na którym wskazano przypuszczalne domeny poliproteiny HCV.

Figura 2 przedstawia schemat charakteryzujący pewne cechy wektora pSC59, fig. 3A, 3B i 3C przedstawia udział procentowy pacjentów z grup l, Π i m reagujących w testach ELlSA na poszczególne antygeny HCV.

174 686

Termin antygen HCV odnosi się do polipeptydu lub analogu polipeptydu (np. mimitopów) zawierającego sekwencję aminokwasów (i/lub analogów aminokwasów) definiujące co najmniej jeden epitop HCV.

W zasadzie, sekwencje definiujące ten epitop odpowiadają sekwencji aminokwasowej białka HCV (są albo identyczne albo zawierają podstawione analogi natywnych reszt aminokwasowych nie niszczące epitopu). Na ogół, sekwencja definiująca epitop będzie miała długość 5 Iub więcej aminokwasów, częściej 8 Iub więcej aminokwasów, a najczęściej 10 Iub więcej aminokwasów. W odniesieniu do epitopów konformacyjnych, długość sekwencji definiującej epitop będzie podlegać wielu zmianom, ponieważ uważa się, że epitopy te powstają w wyniku tworzenia się trójwymiarowej struktury (sfałdowania) antygenu. Tak więc aminokwasy definiujące epitop mogą występować w stosunkowo niewielkiej liczbie, ale mogąbyć rozprzestrzenione wzdłuż łańcucha cząsteczki (Iub nawet różnych cząsteczek w przypadku dimerów, i.t.p.) i mogą tworzyć prawidłową konformację epitopu w wyniku sfałdowania. Części antygenu występujące pomiędzy resztami definiującymi antygen mogą nie mieć krytycznego znaczenia dla konformacyjnej struktury epitopu. Przykładowo, delecja Iub podstawienie tych sekwencji wtrąconych może nie mieć wpływu na epitop konformacyjny, pod warunkiem, że zostaną zachowane sekwencje krytyczne dla konformacji epitopu (np. reszty cysteinowe, potrzebne do tworzenia wiązań dwusiarczkowych, miejsca glikozylacji i podobne).

Antygeny HCV stosowane w sposobie według wynalazku zawierają epitopy konformacyjne z domen E1 i/lub E2 (otoczkowych) wirusa HCV. Domena E1, co do której wysuwa się przypuszczenie, że odpowiada białku otoczki wirusa, jak wykazały niedawne badania, rozciąga się od 192 do 383 aminokwasu poliproteiny HCV (publikacja opisu zgłoszeniowego PCT, WO 91/15771; fig. 1). Białko to wydzielane w układzie CHO (w którym zachodzi glikozylacja) posiada średnią masę cząsteczkową 35 kD oznaczoną metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS-PAGE. Uważa się, że białko E2, początkowo zwane białkiem NS1, rozciąga się od 384 do 800 aminokwasu tej poliproteiny i również jest białkiem otoczki. Dla białka wydzielanego w układzie CHO (w którym zachodzi glikozylacja) przyjmuje się masę cząsteczkową oznaczoną metodą elektroforezy żelowej, wynoszącą około 72 kD. Jest zrozumiałe, że dla miejsc zakończeń tych białek przyjmuje się uśrednienia (np. koniec karboksylowy białka E2 powinien leżeć gdzieś w rejonie między 750 a 820 aminokwasem). Jest również zrozumiałe, że sekwencję HCV 1 z prototypowego izolatu opisanego we wspomnianym zgłoszeniu PCT cytuje się jedynie dla celów ilustracji wynalazku. Dowolny izolat HCV (patrz piśmiennictwo cytowane w stanie techniki) jest odpowiednim źródłem sekwencji E1 i/lub E2 przy praktycznym wykonywaniu sposobu według wynalazku.

Antygeny El i E2 stosowane w niniejszym wynalazku mogą być proteinami wirusowymi o pełnej długości, i<ch wersjami o zasadniczo pełnej długości albo i<ch funkcyjnymi fragmentami (to znaczy, fragmentami, w których nie brakuje sekwencji niezbędnych do utworzenia bądź zachowania konformacji epitopu). Antygeny HCV stosowane w sposobie według wynalazku mogą ponadto zawierać inne sekwencje, które nie blokują ani nie uniemożliwiają utworzenia żądanego epitopu konformacyjnego. Obecność lub nieobecność epitopu konformacyjnego można łatwo oznaczyć drogą skriningu danego epitopu z przeciwciałem (z surowicą poliklonalną lub z przeciwciałem monoklonalnym swoistym w stosunku do epitopu konformacyjnego) i porównania jego reaktywności z reaktywnością denaturowanej wersji tego antygenu, zawierającą tylko epitopy liniowe (o ile w ogóle występują epitopy). Przy prowadzeniu skriningu z użyciem przeciwciał poliklonalnych, może być korzystne uprzednie zaadsorbowanie surowicy poliklonalnej ze zdenaturowanym antygenem i następnie obserwowanie, czy utrzymują się w niej przeciwciała przeciw żądanemu antygenowi.

Antygeny HCV stosowane w sposobie według wynalazku można wytwarzać dowolnym dogodnym sposobem pozwalającym na uzyskanie żądanego epitopu konformacyjnego. Przykładowo, rekombinantowa ekspresja w komórkach ssaków lub owadów jest metodą korzystną dla wytworzenia wydzielanych poza komórkę, glikozylowanych antygenów El i/lub E2 w konformacji naturalnej (natywnej). Możliwe jest również, i jest to metoda znana dla białek, dokonanie ekspresji tych antygenów w innych gospodarzach rekombinantowych i renaturacja tych białek po ich odzyskaniu. Jest oczywiste, że przez syntezę chemiczną można również uzyskać mimitopy

174 686 konformacyjnych antygenów, które wchodzą w reakcję krzyżową z konformacyjnym epitopem antygenu naturalnego. ,

Antygenami stosowanymi w korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku są również kompleksy E1 i E2 (zwane również agregatami) zawierające więcej niż jeden monomer E1 lub E2. W sposobie według wynalazku są również stosowane dimery E1:E1, E2:E2 i heterodimery E1 :E2. Agregaty mogą również obejmować formy większe, a ich masa cząsteczkowa może przekraczać 800 kD.

Termin polipeptyd fuzyjny oznacza polipeptyd, w którym antygen bądź antygeny HCV stanowią część ciągłego łańcucha aminokwasowego, który to łańcuch nie występuje w stanie naturalnym. Takie antygeny HCV mogą być ze sobą połączone bezpośrednio wiązaniami peptydowymi albo mogą być oddzielone sekwencjami aminokwasowymi wtrąconymi. Polipeptydy fuzyjne mogą również zawierać sekwencje aminokwasowe egzogenne w stosunku do HCV.

Termin wspólna stała matryca oznacza ciało stałe, do którego przyłącza się wiązaniami kowalencyjnymi Iub niekowalencyjnymi, na przykład przez adsorpcję hydrofobową, indywidualne antygeny HCV albo polipeptyd fuzyjny zawierający antygeny HCV.

Wyrażenie składnik organizmu oznacza płyn Iub tkankę ssaka (np. człekokształtnego Iub człowieka) na ogół zawierającą przeciwciała wytwarzane przez osobnika, z którego pochodzi. Składniki te są znane i obejmują bez ograniczeń: krew, osocze, surowicę, płyn mózgowordzeniowy, płyn limfatyczny, wydzieliny układu oddechowego, trawiennego, moczopłciowego, łzy, ślinę, mleko, białe ciałka krwi i komórki szpiczaka. Do składników ciała zalicza się płyny biologiczne. Określenie płyn biologiczny odnosi się do cieczy uzyskanej z organizmu. Niektóre płyny biologiczne stosuje się jako źródła innych produktów, takich jak czynniki krzepnięcia (np. czynnik VIIIC), albumina surowicy, czynnik wzrostu i podobne. W takich przypadkach jest ważne, aby źródło płynu biologicznego nie zawierało zanieczyszczeń wirusem, takim jak wirus HcV.

Wyrażenie reaktywny immunologicznie oznacza, że dany antygen będzie swoiście reagował z przeciwciałami anty-HCV obecnymi w składniku organizmu pochodzącym od osobnika zakażonego wirusem HCV.

Termin kompleks immunologiczny oznacza połączenie utworzone w wyniku połączenia przeciwciała z epitopem na antygenie.

E1 oznacza białko Iub polipeptyd wytwarzany w obrębie pierwszych 400 aminokwasów poliproteiny HCV. Niekiedy nazywany jest białkiem E Iub S. W postaci naturalnej jest to glikoproteina o wielkości 35 kD, występująca w ścisłym połączeniu z błoną. U większości naturalnych szczepów wirusa HCV, białko E1 jest kodowane w poliproteinie wirusowej po białku C (rdzeniowym). W poliproteinie o pełnej długości białko El rozciąga się od aminokwasu około 192 do aminokwasu około 383. W niniejszym opisie, termin El oznacza również te analogi i formy skrócone, które reagują krzyżowo immunologicznie z naturalnym białkiem E1.

E2 oznacza białko Iub polipeptyd wytwarzany w obrębie pierwszych 900 aminokwasów poliproteiny HCV, niekiedy nazywany białkiem NS1. W postaci naturalnej jest to glikoproteina o wielkości 72 kD, występująca w ścisłym połączeniu z błoną. U większości naturalnych szczepów wirusa HCV, białko E2 jest kodowane w poliproteinie wirusowej po białku E1. W poliproteinie o pełnej długości białko E2 rozciąga się od aminokwasu około 384 do aminokwasu około 820. W niniejszym opisie, termin E2 oznacza również te analogi i formy skrócone, które reagują krzyżowo immunologicznie z naturalnym białkiem E2.

Stosowany w opisie termin agregat oznacza kompleks białka E1 i/lub E2, zawierający więcej niż jeden monomer E1 Iub E2. W zakres definicji agregatu wchodzą wszystkie dimery E1-.E1, E2:E2 i heterodimery E1:E2. Agregaty mogą również obejmować większe formy, a ich masa cząsteczkowa może przekraczać 800 kD.

Termin oczyszczony w odniesieniu do białek według wynalazku oznacza kompozycję, w której żądane białko stanowi co najmniej 35% całkowitego składnika białkowego w tej kompozycji. Żądane białko może stanowić co najmniej 40%, albo około 50%, co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 80%, co najmniej około 90%, a najlepiej co najmniej około 95% całkowitego składnika białkowego. Kompozycja może zawierać inne

174 686 związki, takie jak węglowodany, sole, lipidy, rozpuszczalniki i podobne związki, nie wpływające na oznaczenie procentowej czystości.

Wyizolowane białko HCV oznacza kompozycję białka HCV o czystości co najmniej 35 procentowej.

Określenie wyizolowany polipeptyd oznacza polipeptyd, który został zasadniczo pozbawiony innych składników wirusa HCV, zwłaszcza genomowego polinukleotydu HCV. Kompozycja polipeptydową jest zasadniczo wolna od innego składnika, jeśli ciężar tego polipeptydu w kompozycji stanowi co najmniej 70% łącznego ciężaru tego polipeptydu i innego składnika, korzystnie, co najmniej około 89%, korzystniej około 90%, a najkorzystniej 95% lub więcej.

W technikach oznaczeń immunologicznych wykonywanych zgodnie ze sposobem według wynalazku stosuje się antygeny HCV z domen El i E2, które to domeny zachowują epitopy konformacyjne rozpoznawane przez przeciwciała obecne w surowicy osobników zakażonych wirusem HCV. Każdy z tych antygenów zawiera co najmniej jeden epitop konformacyjny, który występuje w naturalnej cząsteczce HCV albo w produkcie zakaźnym, czego dowodem jest reaktywność immunologiczna tego antygenu z przciwciałami w składniku organizmu pochodzącym od osobnika zakażonego wirusem HCV i strata tej reaktywności przez epitop w wyniku denaturacji antygenu.

Długość takiego antygenu jest wystarczająca do zachowania reaktywnego immunologicznie epitopu konformacyjnego związanego z tym antygenem. Zakresem wynalazku są objęte przypadki występowania na antygenie więcej niż jednego epitopu konformacyjnego.

Często naturalne antygeny otoczkowe stosowane w technikach immunologicznych mają prawie pełną długość, można jednak stosować antygeny w formie skróconej (np. z delekcją domen wiążących się z błoną), przykładowo dla zwiększenia rozpuszczalności albo w celu zwiększenia sekrecji.

W sposobie według wynalazku używa się albo pojedyncze antygeny albo ich połączenia lub ich agregaty antygenowe. Tak więc, w technikach immunologicznych można stosować epitopy E1, epitopy E2, agregaty lub połączenianatywnych białek E1 i E2. W sposobie według wynalazku znajdują także zastosowanie antygeny z epitopami liniowymi w połączeniu z konformacyjnymi epitopami otoczki HCV.

W oparciu o przepuszczalne aminokwasy kodowane przez sekwencję nukleotydową wirusa HCV 1 i inne dowody, zaproponowano następujące możliwe domeny proteinowe w kodowanej poliproteinie HCV oraz orientacyjne miejsca graniczne:

Przypuszczalna domena	Orientacyjna granica (numery aminokwasów)
C (białko nukleokapsydu)	1 - 191
E1 (białko otoczki wirionu)	192- 383
E2/NS1 (otoczka?)	384 - 800
NS2	800- 1050
NS3 (proteaza?)	1050-1650
NS4	1651-2100
NS5 (polimeraza)	2100 - 3011 (koniec)

Domeny te są jednak teoretyczne. Przykładowo, granica E1-NS2 znajduje się prawdopodobnie w rejonie 750 - 810, a granica NS3-NS4 leży w rejonie aminokwasów 1649 - 1650. Istnieje również dowód na to, że wersja białka C o długości 191 aminokwasów jest prekursorem, który jest dalej przetwarzany (do długości około 170 aminokwasów) i że każde z białek NS2, NS4 i NS5 jest dalej przetwarzane na dwa białka dojrzałe. Wzajemne zależności domen są przedstawione na fig. 1.

174 686

Sposoby przygotowywania antygenów E1 i E2, łącznie z tymi o konformacjach natywnych, są opisane przez SpaeteR. i wsp. w Virology (1992) 188,819-830 oraz w opisie zgłoszenia patentowego międzynarodowego WO 92/08734, włączonych do niniejszego opisu jako odnośnik. W zasadzie, wybiera się komórki gospodarza, które umożliwią powstanie natywnych epitopów konformacyjnych w wytwarzanych białkach otoczki. Do takich komórek gospodarza należą np. komórki zwierzęce, komórki owadzie, komórki drożdży i podobne.

Jako organizmy gospodarzy eukariotycznych stosuje się komórki drożdży i ssaków w hodowlach komórkowych. Do najczęściej stosowanych komórek drożdży należą Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces carlsbergensis. Są to najbardziej dogodni gospodarze z rodzaju grzybów. Wektory zgodne z komórkami drożdży są wyposażone w markery umożliwiające selekcję pozytywnych transformantów, przez nadanie szczepom dzikim właściwości prototropowych w stosunku do mutantów auksotroficznych lub oporności na metale ciężkie. Do konstrukcji wektorów kompatybilnych z drożdżami można zastosować źródło replikacji 2 mikrony (Broach i wsp., Meth. Enz. 1983,101, 307), połączenie CEN3 i ARS1 lub inne środki pozwalające na replikację, takie jak sekwencje pozwalające na wbudowanie odpowiedniego fragmentu do genomu komórki gospodarza. Sekwencje kontrolne dla wektorów drożdżowych są znane i obejmują promotory do syntezy enzymów glikolitycznych (Hess i wsp., J. Adv. Enzyme Reg. 1968,7, 149; Holland i wsp., Biochemistry, 1978,17,4900), w tym promotor dla kinazy fosfoglicerynianu-3 (Hitzeman, J. Biol. Chem. 1980, 255, 2073). Do. wektorów można również włączać terminatory, zwłaszcza pochodzące z genu enolazy (Holland, J. Biol. Chem. 1981,256,1385). Szczególnie użytecznymi układami kontrolnymi są te, które zawierają promotor dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) albo podlegający regulacji promotor dehydrogenazy alkoholowej (ADH), terminatory również pochodzące z GAPDH, a jeśli wskazana jest sekrecja, włącza się sekwencję liderową z drożdżowego czynnika alfa. Rejon regulujący transkrypcję i rejon inicjujący transkrypcję, które są operacyjnie związane, można wybrać z takich typów, które nie są w sposób naturalny związane z organizmem typu dzikiego. Układy te są szczegółowo opisane w publikacji zgłoszeniowej europejskiej nr 120.551 z 3 października 1984; publikacji zgłoszeniowej europejskiej nr 116.201 z 22 sierpnia 1984 i publikacji zgłoszeniowej europejskiej nr 164.556 z 18 grudnia 1985 r. Wszystkie są zgłoszone przez niniejszego zgłaszającego i włączone do niniejszego opisu jako odnośniki.

Linie komórek ssaków jako gospodarze, w których zachodzi ekspresja są znane. Należy do nich wiele immortalizowanych linii komórkowych dostępnych w American Type Culture Collection (ATCC), łącznie z komórkami Hela, komórkami jajnika chomika chińskiego (CHO), komórkami nerki chomika i wieloma innymi liniami komórkowymi. Znane są również promotory odpowiednie dla komórek ssaków. Należą do nich promotory wirusowe, takie jak promotor z wirusa Simiana 40 (SV40) opisany przez Fiersa (Nature 1978, 273, 113), z wirusa mięsaka Rousa (RSV), adenowirusa (ADV) i bydlęcego wirusa brodawczaka (BPV). Komórki ssaków mogą również wymagać dodatkowych sekwencji terminatora i sekwencji poli-A; można również włączyć sekwencje wzmacniacza, zwiększające ekspresję, a ponad to mogą być pożądane sekwencje wywołujące amplifikację genu. Sekwencje te są znane.

Wektory odpowiednie do replikacji w komórkach ssaka są znane i obejmują replikony wirusowe albo sekwencje zapewniające integrację odpowiednich sekwencji kodujących epitopy NANBV z genomem gospodarza.

Wektorem stosowanym do ekspresji obcego DNA, który może być użyty w preparacie szczepionki jest wirus krowianki (Vaccinia). W tym układzie dokonuje się insercji heterologicznego DNA do genomu Vaccinia. Techniki insercji obcego DNA do genomu wirusa krowianki są znane i obejmują np. rekombinację homologiczną. Insercji heterologicznego DNA dokonuje się na ogół do genu, który nie ma zasadniczego znaczenia w naturze, np. do genu kinazy tymidynowej (tk), który zawiera jednocześnie marker selekcyjny. Wektory plazmidowe, które znacznie ułatwiają konstruowanie rekombinantowych wirusów są opisane w literaturze (np. Mackett i wsp., J. Virol. 1984,49, 857; Chakrabarti i wsp., Mol. Celi Biol. 1985,5, 3403; Moss w książce Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (red. Miller i Calos, wyd.: Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N. Y., 10). Ekspresja polipeptydu HCV zachodzi w komórkach albo w osobnikach immunizowanych żywym, rekombinantowym wirusem krowianki.

Segment cDNA wirusa HCV kodujący żądaną sekwencję wprowadza się do wektora Vaccinia drogą insercji. Sekwencję kodującą polipeptyd można podłączyć do sekwencji liderowej. Jako sekwencję liderową można użyć sekwencję liderową dla tkankowego aktywatora plazminogenu (TPA) albo sekwencję z innego źródła, np. z sekwencji dla beta-globiny. Heterologiczny polinukleotyd wbudowywuje się przez insercję do wektora Vaccinia będącego zmodyfikowaną wersją plazmidu pSCl 1 w wyniku addycji sekwencji poliłącznika, którazawiera miejsce klonowania.

W celu wykrycia, czy ten wektor Vaccinia ma zdolność ekspresji polipeptydu HCV, zakaża się komórki BSC1 tym rekombinantowym wektorem i prowadzi się ich wzrost na szkiełkach mikroskopowych w warunkach pozwalających na ekspresję. Następnie komórki utrwala się acetonem i prowadzi się próbę immunofluorescencyjną, stosując surowicę, o której wiadomo, że zawiera przeciwciała anty-HCV swoiste wobec polipeptydu (polipeptydów) kodowanych przez rejon genomu HCV, z którego pochodzi segment HCV w rekombinantowym wektorze ekspresyjnym.

Do innych układów nadających się do ekspresji genomów eukariotycznych lub wirusowych należą komórki owadzie i wektory nadające się do użycia w tych komórkach. Układy takie są znane i obejmują na przykład owadzie ekspresyjne wektory transferowe pochodzące z baculowirusa, wirusa polihedrozy jądrowej Autographa califomica (AcNPV) będącego wirusowym wektorem ekspresyjnym niezależnym od czynności pomocniczej wirusa. W wektorach ekspresyjnych pochodzących z tego układu na ogół stosuje się silny wirusowy promotor genu polihedryny dla wywołania ekspresji genów heterologicznych. Najpowszechniej ostatnio stosowanym wektorem transferowym używanym do wprowadzania obcych genów do AcNPV jest plazmid pAc373.

Wiele innych znanych wektorów zostało tak zaprojektowanych, aby zwiększyć ekspresję. Należą do nich na przykład, plazmid pVL985 (który zmienia kodon startu polihedryny z aTg na ATT i który wprowadza miejsce klonowania BamHI w miejscu 32 par zasad w dół od ATT (patrz: Lucków i Summers; Virology 1989, 17, 31). Zazwyczaj, warunkiem uzyskania dobrej ekspresji niefuzyjnych obcych białek jest, aby obce geny miały krótką sekwencję liderową zawierającą odpowiednie sygnały początku translacji poprzedzające sygnał startu ATG. Taki plazmid zawiera również sygnał poliadenylacji z genu polihedryny i gen oporności na ampicylinę (amp), a także źródło replikacji, potrzebne do selekcji i namnożenia w E. coli.

Techniki wprowadzania heterologicznego DNA do żądanego miejsca w baculowirusie są znane (patrz: Summer i Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin, 1555; Ju i wsp. (1987); Smith i wsp., Mol. & Cell Biol. 1983,3,2156-2165; Lucków i Summers, Virology 1989, 17, 31). Przykładowo, insercji można dokonać do genu takiego jak gen polihedryny przez rekombinację homologiczną albo do miejsca dla enzymu restrykcyjnego wprowadzonego techniką inżynierii genetycznej do żądanego genu baculowirusa. Wprowadzanymi sekwencjami mogą być takie, które kodują całą poliproteinę albo różne jej segmenty albo inne sekwencje z innych wirusów ospy owczej, które kodują wirusowe polipeptydy.

Okazuje się, że sygnały dla modyfikacji posttranslacyjnych, takie jak sygnał rozszczepienia peptydu, rozkładu proteolitycznego i fosforylacji są rozpoznawane przez komórki owadzie. Sygnały wymagane do sekrecji i akumulacji jądrowej mogą być również przenoszone z komórek bezkręgowców na komórki kręgowców. Znane są przykłady sekwencji sygnalnych z komórek kręgowców, które zachowują efektywność w komórkach bezkręgowców. Należy do nich sygnał ludzkiej interleukiny-2 (lL-2_s), który jest sygnałem dla transportu poza komórkę. Jest on rozpoznawany i prawidłowo funkcjonuje w komórkach owadzich, co ujawnia się prawidłowym transportem peptydu poza komórkę.

Rodzaje (formaty) prób immunologicznych

Antygeny El i e2 wirusa HCV stosowane w sposobie według wynalazku mogą być wykorzystane w dosłownie każdej technice polegającej na zastosowaniu znanego antygenu do wykrywania przeciwciał. Jest oczywiste, że nie mogą tu być stosowane, bądź muszą być zmodyfikowane techniki, w których zachodzi denaturacja epitopu konformacyjnego wirusa HCV. Wspólną cechą wszystkich tych technik jest kontaktowanie antygenu ze składnikiem organizmu podejrzanym o występowanie w nim przeciwciał anty-HCV, w warunkach umożli10

174 686 wiających związanie antygenu z tym przeciwciałem obecnym w tym składniku. Warunki te polegają w zasadzie na utrzymaniu fizjologicznej temperatury, wartości pH, siły jonowej i użyciu nadmiaru antygenu. Po inkubacji antygenu z próbką prowadzi się detekcję kompleksów immunologicznych zawierających ten antygen.

Przy projektowaniu prób immunologicznych można uwzględnić wiele wariantów. Znanych jest wiele technik. Przykładowo, w próbach tych można stosować stałe nośniki albo immunoprecypitację. W większości technik stosuje się znaczone przeciwciało lub polipeptyd. Można użyć znaczniki enzymatyczne, fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, radioaktywne albo cząsteczki barwnika. Znane są również techniki, w których stosuje się zwielokrotnienie (wzmocnienie) sygnałów pochodzących z kompleksu immunologicznego; przykładami są tu techniki, w których wykorzystuje się biotynę i awidynę oraz techniki, w których stosuje się enzymy jako znaczniki i mediatory, takie jak ELlSA.

Próby immunologiczne można bez ograniczeń prowadzić w układzie heterogenicznym albo homogenicznym. Mogą to być próby standardowe lub oparte na kompetycji. W technikach heterogenicznych polipeptyd jest na ogół związany ze stałą matrycą albo nośnikiem dla ułatwienia rozdzielenia próbki od tego polipeptydu po inkubacji. Przykładami stałych nośników, które stosuje się w tych próbach są: nitroceluloza (np. w formie błon lub wgłębień w płytkach do mikromianowania), polichlorek winylu (np. w postaci arkuszy lub wgłębień w płytkach do mikromianowania), lateks polistyrenowy (np. w postaci perełek lub wgłębień w płytkach do mikromianowania), polifluorek winylidenu (znany jako lmmunlon™), bibuła dwuazowana, błony nylonowe, aktywowane perełki i perełki Proteiny A. Przykładowo, w układzie heterogenicznym można użyć płytki do mikromianowania Dynatech lmmunlon™ 1 albo lmmunlon™ 2 lub perełki polistyrenowe (Precision Plastic Ball). Stały nośnik zawierający antygenowe polipeptydy na ogół wymywa się po oddzieleniu go od badanej próbki przed detekcją związanych przeciwciał. Zarówno techniki standardowe jak i kompetycyjne są znane.

W układzie homogenicznym, badaną próbkę inkubuje się łącznie z antygenami w roztworze. Próbę można przykładowo wykonywać w warunkach, w których zachodzi precypitacja utworzonych kompleksów antygen-przeciwciało. W technice znane są zarówno standardowe jak i kompetycyjne formaty prowadzenia tych prób. ,

W formacie standardowym bezpośrednio monitoruje się ilość przeciwciał HCV w kompleksach przeciwciało-antygen. Można to prowadzić przez oznaczanie, czy znaczone anty-ksenogeniczne (np. anty-ludzkie) przeciwciała rozpoznające epitop na przeciwciałach anty-HCV wiążą się w wyniku tworzenia się kompleksu. W formacie kompetycyjnym, ilość przeciwciał HCV w próbce oznacza się przez monitorowanie wpływu kompetycji na wiązanie znanej ilości znakowanego przeciwciała (lub innego kompetycyjnego ligandu) w kompleksie.

Powstałe kompleksy zawierające przeciwciało anty-HCV (albo w przypadku technik kompetycyjnych, pewną ilość współzawodniczącego przeciwciała) wykrywa się jedną z wielu znanych metod, w zależności od użytej techniki. Przykładowo, nieznakowane przeciwciała anty-HCV w kompleksie wykrywa się wykorzystując koniugat antyksenogenicznej immunoglobuliny (lg) skompleksowanej ze znacznikiem (np. znacznikiem enzymatycznym).

W technikach wykorzystujących immunoprecypitację lub aglutynację, w wyniku reakcji zachodzącej między antygenami HCV a przeciwciałem powstaje sieć, która strąca się z roztworu lub zawiesiny i powstaje widoczna warstwa lub błona strącona. Jeśli w badanej próbce nie występują przeciwciała anty-HCV, wówczas nie tworzy się widzialna warstwa strącona.

Obecnie znane są trzy specyficzne próby oparte na aglutynacji cząstek. Próby te stosuje się do wykrywania przeciwciał przeciw różnym antygenom związanym w formie powłoki z nośnikiem. Jednym z typów tych prób jest próba aglutynacji z zastosowaniem czerwonych krwinek (RBC) uprzednio uczulonych przez pasywną adsorpcję antygenu (lub przeciwciała) na tych krwinkach. Dodanie przeciwciał swoistych w stosunku do antygenu, obecnych w składniku organizmu (o ile te przeciwciała w nim występują) powoduje aglutynację krwinek powleczonych oczyszczonym antygenem.

W próbie hemoaglutynacji, w celu wyeliminowania reakcji nieswoistych, zamiast krwinek czerwonych, do aglutynacji cząstek można użyć dwa sztuczne nośniki. Najpowszechniej stosuje się cząstki lateksu. Można jednak również użyć cząstki żelatynowe. Próby wykorzystujące jeden

174 686 z tych nośników są oparte na aglutynacji biernej cząstek powleczonych oczyszczonymi antygenami.

Antygeny El i E2 wirusa HCV zawierające epitopy konformacyjne będą zazwyczaj dostarczane w formie zestawu gotowego do użycia w tych próbach immunologicznych. Taki zestaw będzie na ogół zawierał w oddzielnych pojemnikach natywny antygen HCV, formę recepturową kontrolnego przeciwciała (pozytywną i/lub negatywną), znakowane przeciwciało, jeśli technika próby tego wymaga oraz pewne reagenty generujące sygnały (np. substrat enzymu), jeśli znacznik nie generuje sygnału bezpośrednio. Natywny antygen HCV może w takim zestawie występować w formie już związanej ze stałą matrycą albo występować oddzielnie, wraz z reagentami do związania go z matrycą. W zestawie są również na ogół zawarte instrukcje prowadzenia próby (np. w formie pisanej, taśm, dysków optycznych i podobnych nośników informacyjnych).

Próby immunologiczne, w których stosuje się natywny antygen HCV są użyteczne do badań przesiewowych (skriningu) krwi przeznaczonej do banków krwi nie zagrażających potencjalnym przeniesieniem infekcji. Sposób przygotowywania banków krwi polega na prowadzeniu następujących etapów postępowania: Składnik organizmu, korzystnie krew albo składnik krwi pochodzący od indywidualnego dawcy krwi poddaje się reakcji z natywnym antygenem E1 lub E2 wirusa HCV dla wywołania reakcji immunologicznej między przeciwciałami anty-HCV (jeśli takie występują w próbce) a antygenem HCV. Wykrywa się, czy w wyniku tej reakcji powstały kompleksy: przeciwciało anty-HCV - antygen HCV. Do banku krwi przeznacza się krew pochodzącą od dawców, u których nie wykryto przeciwciał przeciw natywnym antygenom El i E2 wirusa HCV.

W przypadkach dodatniej reakcji z antygenem HCV zaleca się powtórzenie próby immunologicznej dla zmniejszenia możliwości fałszywych odpowiedzi dodatnich. Przykładowo, przy skriningu krwi na dużą skalę, przy produkcji produktów krwi (np. krwi przeznaczonej do transfuzji, osocza, czynnika VIH, immunoglobuliny i podobnych), testy skriningowe projektuje się tak, aby zwiększyć czułość kosztem spoistości (dla upewnienia się, że nie zostanie do banku włączona krew zanieczyszczona), to znaczy, zwiększa się ilość dodatnich odpowiedzi fałszywych. Tak więc, przy typowym postępowaniu przeznacza się do dalszych badań tylko tych dawców, którzy reagują wielokrotnie dodatnio, to jest, próbki pobrane od tych dawców dają odczyny dodatnie w dwu Iub w większej ilości testów immunologicznych.

Wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami, w żaden sposób nie ograniczającymi wynalazku.

Przykład 1. Konstruowanie plazmidu Poli pSC59.

Stosowaną do konstruowania sekwencję HCV izoluje się z plazmidu pC5P-l w postaci fragmentu Stul i częściowego Bg1ll. Fragment ten rozciąga się od kodonu dla pierwszej metioniny poliproteiny HCV-1 do kwasu asparaginowego w pozycji 966 i obejmuje odpowiednio domeny nukleokapsydu C, obydwu przypuszczalnych glikoprotein otoczkowych, E1 i E2 oraz skróconej formy NS2. Fragment ten zawiera również około 60 par zasad odpowiadających odpowiedniej części 5’- nie podlegającego translacji rejonu z genomu wirusa HCV.

Na fragment ten działa się polimerazą Klenowa w celu wytworzenia tępych końców, po czym klonuje się go do miejsca Stul w wektorze wirusa krowianki, PSC59 (uzyskanego od dr B. Moss’a z National Institute of Health, Bethesda, Md). Wektor ten jest przedstawiony na fig. 2. Po ligacji z sekwencją poliłącznika tego wektora, koniec C’ rejonu NS2 zawiera dodatkową sekwencję Pro-Tyr.

Przykład 2. Przygotowanie zapasów wirusa krowianki kodujących fragment poliproteiny HCV obejmujący glikoproteiny E1 i E2.

Skrining na obecność rekombinantowego wirusa krowianki prowadzi się w sposób opisany przez Mackett’a i wsp. w podręczniku DNA Cloning, tom II (wyd. D. M. Glover, IRL Press, Oxford, Anglia, 1985, str. 191-211). Zlaną monowarstwę (płytka o średnicy 6 cm) komórek nerki zielonej małpy afrykańskiej, BSC40, zakaża się dzikim typem wirusa krowianki (szczep WR) z krotnością infekcji (MOI) wynoszącą 0.05. Po dwugodzinnej inkubacji w temperaturze 37°C komórki poddaje się transfekcji ilością 25 fig PSC59 poli dNa metodą z fosforanem wapnia. Po czterogodzinnej inkubacji zmienia się podłoże na podłoże normalne i-komórki inkubuje się

174 686 przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 37°C. Komórki odzyskuje się przez zdrapanie ich z płytki i uwalnia się wirusy w 3 cyklach zamrażania/rozmrażania, po czym przechowuje się uwolnione wirusy w lizacie komórkowym w temperaturze -80°C.

W celu wykonania skriningu na obecność rekombinantowego wirusa zakaża się zlaną monowarstwę ludzkich komórek 143 TK' tym lizatem komórkowym w czasie 2 godzin w 1O-krotnych rozcieńczeni ach seryjnych. Po usunięciu inokulum, dodaje się 1% agarozy w surowicy zawierającej 25 pg/ml 5-bromodezoksyurydyny i inkubuje się komórki w czasie 72 godzin w temperaturze 37°C. Łysinki wizualizuje się przez naniesienie na warstwę komórek 1 % roztworu agarozy z dodatkiem 0.01% czerwieni obojętnej i inkubowanie tych komórek przez dobę w temperaturze 37°C. Następnie ostrożnie usuwa się warstwę agarozy i na warstwę komórek nakłada się podstawowy filtr nitrocelulozowy (Schleir i Schuell, BA85, 0.45 (im). Wykonuje się replikę filtru podstawowego na płytce i do sekwencji HCV wbudowywuje się znakowaną za pomocą ³²p sondę hybrydyzacyjną. Z filtra podstawowego izoluje się łysinki pozytywne, umieszcza się je w ilości 0.5 ml pożywki bez surowicy i poddaje się sonifikacji, dwukrotnie przez 30 sekund. W celu oczyszczenia wirusa, proces skriningu metodą łysinek powtarza się dwukrotnie.

W celu namnożenia rekombinantowego wirusa krowianki, zakaża się 10 płytek (150 cm²) z komórkami BSC40 roztworem podstawowym wirusa przy krotności infekcji (MOI) równej 0.5. Proces infekcji prowadzi się przez 2 godziny w temperaturze 37°C, po czym w roztworze podstawowym wirusa wymienia się pożywkę na świeżą. Po 72 godzinach zbiera się komórki, zawiesza je w 10 mM Tris HCl (pH=9.0) i homogenizuje w młynku do tkanek Wheatona. Usuwa się komórkowe debris przez wirowanie, supematanty poddaje się działaniu trypsyny i sonifikuje się. Porcje zawiesin wirusowych przechowuje się w temperaturze -80°C.

Przykład 3. Wytwarzanie antygenów E1/E2.

Jeden litr komórek HeLa S3 (spinner) hoduje się w kolbie do gęstości 10⁶ komórek/ml. Następnie komórki infekuje się rekombinantowym wirusem krowianki, kodującym fragment poliproteiny HCV z krotnością infekcji wynoszącą 1.0, prowadzi się inkubację przez dobę, komórki zbiera się i przechowuje w postaci peletki komórek w temperaturze -80°C.

Produkt ekspresji E1/E2 oczyszcza się poddając komórki lizie w buforze hipotonicznym i prowadząc ekstrakcję w buforze zawierającym niejonowy środek powierzchniowo czynny. Ekstrakt komórkowy poddaje się chromatografii na kolumnie agarozowej z lektyną (GNA). Żądane białka eluuje się z kolumny metylo-a-D-mannopiranozydem (Sigma Corp.). W eluowanych frakcjach oznacza się El i E2 techniką punktową Westema stosując swoistą antysurowicę przeciw E1 albo E2. Zbiera się frakcje zawierające antygeny i zatęża się je na kolumnie z S-Sepharozą (Pharmacia). Czystość końcowego produktu wynosi około 70%.

Przykład 4. Użycie E1/E2 do oznaczeń immunologicznych.

Pacjenci. Próbki surowicy uzyskano od losowo wybranych, płatnych dawców osocza pobranego w stanach wschodnich, zachodnich, środkowo-zachodnich i południowych Stanów Zjednoczonych Ameryki. Próbki dostarczyła Uniglobe Research Corporation (Reseda, ICA). Próbki surowicy otrzymane od H. Tonga (Huntington Memoriał Hospital w Pasadena, California) pochodziły od grupy 38 pacjentów z chroniczną postacią związanej z transfuzją NANBH i od innej grupy 39 pacjentów, biorców leków dożylnych z chroniczną postacią NANBH. U tych 77 pacjentów nie występowały inne choroby wątroby. Pacjenci nie reagowali z przeciwciałami anty-HAV i anty-Hbsag i mieli normalny poziom przeciwciał przeciwjądrowych (ANA). Trzy panele do oznaczania związanej z transfuzją serokonwersji HCV otrzymano od H. Altera (the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) i z Serologicals Incorporation w Clarkston, Georgia. Próbki HCV z fazy ostrej choroby uzyskano z Max von Petlenkofer-Institute z Uniwersytetu w Monachium, Niemcy. Dziewiętnaście przypadków ostrej postaci NANBH zdiagnozowano na podstawie biopsji wątroby i normalnych poziomów aminotransferazy alaninowej (ALT) podczas długoletnich (2 do 11 lat) następnych obserwacji.

Ekspresja i oczyszczanie rekombinantowych antygenów HCV

Ekspresję antygenów C22 (119 aminokwas), El (130 aminokwas), E2 (251 aminokwas), NS5 (942 aminokwas) oraz chimerowego C25 (zwanego również antygenem c200/c22; 858 aminokwas) jako antygenów wewnętrznych prowadzi się w drożdżach S. cerevisiae w postaci

174 686

C-terminalnych fuzji z ludzką dysmutazą supertlenkową (SOD) sposobami opisanymi przez Kuo G. i wsp. (Science, 1989,244, 362-364) i Cousens’a L. i wsp. (Gene, 1987, 61, 265-272). Antygen C33C (266 aminokwas) był wytwarzany jako wewnętrzny polipeptyd fuzyjny z SOD w E. coli sposobami opisanymi wcześniej dla syntezy antygenu 5-1-1 (publikacja zgłoszenia patentowego PCT, WO 89/046699, publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego, 318.216 i Houghton i wsp, Science 1989, 244, 359; wszystkie te publikacje są włączone do opisu jako odnośniki. Po rozbiciu komórek i odwirowaniu, odzyskuje się nierozpuszczalne polipeptydy fuzyjne z SOD przez ekstrakcję z peletek komórkowych stosując albo 5 M mocznik albo 1% SDS i oczyszcza się je stosując albo technikę filtracji żelowej albo połączenie chromatografii jono-wymiennej (Q-Sepharoza i S-Sepharoza) i chromatografii z filtracja żelową (Sephacryl S-300 HR).

Naturalne antygeny El i E2 wirusa HCV (zwane również antygenami rVV (e1 i e2) oczyszcza się z retikulum endoplazmatycznego komórek zakażonych rekombinantowym wirusem krowianki (rvv), posiadających geny dla pełnej długości El i E2 z wirusa HCV. Oczyszczanie prowadzi się techniką chromatografii powinowactwa, a następnie techniką chromatografii jono-wymiennej w warunkach niedenaturujących. Techniki te zostały opisane w publikacji zgłoszeniowej PCT, WO 92/08734, włączonej do niniejszego opisu jako odnośnik.

Naturalny antygen E2 z wirusa HCV, oznaczony symbolami CHO-e2, otrzymuje się zasadniczo w sposób opisany przez Spaete i wsp. (Virology, 1^I9⁽)^, 188, 819-830). W sposobie tym konstruuje się ssaczą linię komórkową CHO wytwarzającą antygen CHO-e2 wychodząc z plazmidu zawierającego sekwencję HCV-1 kodującą odcinek od Ala383 do Glu661. Plazmid ten wprowadza się do komórek CHO metodą transfekcji, generując trwałą linię wytwarzającą antygen e2 o pełnej długości (zwany również antygenem e2/ns 1). Wybiera się klony wykazujące wysoką ekspresję i namnaża się je w kolbach obrotowych, prowadząc wzrost w pożywce DME/H21 z dodatkiem 10% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej i zwykle stosowanych dodatków oraz 1.6 μΜ metotreksatu. Następnie zbiera się supernatant hodowli i stosuje go do oczyszczania antygenu CHO-e2. Proces oczyszczania obejmuje chromatografię powinowactwa i jono-wymienną w warunkach niedenaturujących.

W celu zaburzenia naturalnej konformacji przypuszczalnych epitopów e2, przygotowuje się denaturowany CHO-e2 przez dodanie DL-ditiotreitolu (DTT) do końcowego stężenia wynoszącego 10 mM, 0.2% dodecylosiarczanu sodowego (SDS) i utrzymywanie w temperaturze 100°C przez 5 minut. Metodą analizy w żelu poliakryloamidowym SDS i metodą barwienia błękitem Coomassie oznaczono, że wszystkie oczyszczone rekombinantowe antygeny HCV mają czystość co najmniej 90%.

Próby ELISA. Antygeny RVV(e1 i e2), CHO-e2 i denaturowany antygen CHO-e2 rozcieńcza się do optymalnego stężenia w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) opH = 7.4 i nanosi się na płytki Immulon™ 1 firmyDyrnatech, Charntilly, FA . JF^róńb^y ELISA prowadzi się następująco: Badane próbki na płytce rozcieńcza się 40-krotnie w rozcieńczalniku do próbek i inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37°C, po czym przemywa się buforem do przemywania. Do każdego wgłębienia dodaje się kozie przeciwciała poliklonalne przeciw ludzkiej IgG (H + L) skoniugowane z peroksydazą chrzanu (HRPO). Płytki inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37°C i następnie przemywa. Do wywołania barwy peroksydazy dodaje się orto-fenylenodiaminę 2 HCl (OPD) i nadtlenek wodoru. Wyniki odczytuje się w czytniku do płytek przy długości fali 492 nm/620 nm. Wartości granicznej gęstości optycznej po wykonaniu próby ELISA dla antygenów: RVV(e1 i e2), SOD, C25, C22, C33C i ns-5 wynosiły 0.4 plus wartość O.D. ze średniej z wyników prób kontrolnych negatywnych. Wartości granicznej gęstości optycznej dla CHO-e2 i denaturowanego CHO-e2 wynosiły 0.3 plus wartość O.D. z wyników prób kontrolnych negatywnych odpowiedniego antygenu. Wartość granicznej gęstości optycznej dla C100-3 wynosiła 0.45 plus wartość O.D. ze średniej z wyników prób kontrolnych negatywnych.

Wyniki prób immunologicznych

Wyniki oznaczeń techniką ELISA z użyciem podanych powyżej antygenów dla wykrycia przeciwciał anty-HCV w składnikach krwi grup pacjentów ze Stanów Zjednoczonych Ameryki są przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Częstość występowania przeciwciał anty-HCV w poszczególnych grupach pacjentów w Stanach Zjednoczonych

Grupa	Ilość pacjen- tów	Pacjenci anty-HCV - dodatni
C22	Y-el	Y-e2	CHO-e2	rW (el i e2)	C33C	C100-3	Ns5	C25	ANY
A. Płatni dawcy	158	29 18%	19 12%	15 9%	30 19%	30 19%	30 19%	26 17%	27 17%	32 20%	32 20%
B. Pacjenci z potransfu-	38	35	22	21	36	36	36	27	28	36	36
zyjną przewlekłą fazą NANBH		92%	58%	55%	95%	95%	95%	71%	74%	95%	95%
C. Biorcy leków dożył-	39	39	17	13	39	39	39	27	32	39	39
nych chorzy na NANBH		100%	44%	33%	100%	100%	100%	69%	82%	100%	100%

A. Dobierani losowo płatni dawcy krwi ze Wschodnich, Zachodnich, Środkowo-zachodnich i Południowych Stanów Zjednoczonych

B. i C. Próbki surowicy pochodziły od 77 pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby nie-A, nie-B (NANBH) ze szpitala Hunington Memoriał Hospital w Pasadena, CA, z historią transfuzji krwi lub dożylnego brania leków

Wyniki przedstawione w tabeli 1 wskazują, że wytworzone w drożdżach antygeny otoczkowe wirusa HCV, el i e2 są znacznie mniej reaktywne immunologicznie niż rekombinantowe antygeny wytworzone w wirusie Vaccinia, RVV(el i e2) i w komórkach CHO, CHO-e2. W każdej badanej grupie reaktywność antygenów e 1 i e2 wytworzonych w drożdżach stanowiła jedynie 2/3 lub mniej aktywności antygenów wytworzonych w komórkach zwierzęcych. Godny uwagi jest fakt, że antygeny drożdżowe el i e2 zostały wytworzone w komórkach drożdży i oczyszczone w warunkach denaturujących. Oznacza to, że w tych antygenach występują jedynie epitopy liniowe. Na odwrót, natywne antygeny HCV, RVV(el i e2) oraz CHO-e2 izoluje się z komórek gospodarza zwierzęcego w warunkach niedenaturujących, umożliwiających istnienie natywnych epitopów konformacyjny eh.

Rekombinantowe natywne antygeny HCV wytwarzane w wyniku ekspresji genów El i E2 w komórkach okazały się równie immunoreaktywne jak C33C i prawdopodobnie C25, a bardziej immunoreaktywne niż wszystkie inne badane antygeny HCV. C25 jest poliproteiną chimerową składającą się z części polipeptydów NS3, NSą i C połączonych ze sobą przez fuzję, jak to przedstawiono na fig. 1.

Rolę epitopów konformacyjnych w stymulowaniu wczesnej odpowiedzi układu immunologicznego gospodarza oceniano metodami immunologicznymi, przy użyciu paneli odczynników do oznaczeń serokonwersji wirusa HCV.

Wyniki przedstawione w tabeli 2 podają reaktywność immunologiczną natywnych antygenów otoczkowych, RVV(el i e2) i CHO-e2 wobec próbek w trzech zestawach do serokonwersji. Poszczególne próbki w każdym panelu reprezentują kolejne pobieranie krwi od pacjentów z potransfuzyjnym zakażeniem NANBH. Jak widać z tabeli 2, natywne antygeny otoczkowe HCV, to znaczy takie, w których występują naturalne epitopy konformacyjne, wykrywają przeciwciała, które powstają stosunkowo wcześnie w okresie rozwoju infekcji w porównaniu do tych, jakie są wykrywane przez inne badane antygeny HCV. Tak więc, antygeny te mogą znaleźć szczególne zastosowanie w próbach immunologicznych do diagnozy zakażenia HCV.

174 686

Tabela 2

Porównanie wyników prób ELISA z udziałem antygenów CHO-e2, rW(el i e2) i prób multiantygenowych wykonywanych na panelach metodą serokonwersji

Próbka	Data pobrania krwi	Ilość dni od transfu- zji*	CHO-e2 ELISA S/CO	rW (el i e2) ELISA S/CO	C22 ELISA S/CO	C33C ELISA S/CO	C100-3 ELISA S/CO	NS5 ELISA S/CO	C25 ELISA S/CO	Poziom ALT Jedn. m/litr
(1) Serokonwersja, panel A
Al	18.07.88	0	0.61	0.6	0.01	0.01	0.09	0.03	0.02	23
A6	15.08.88	28	0.19	0.2	0.02	0.02	0.01	0.03	0.21	39
A7	25.08.88	38	1.23	1.75	0.38	1.21	0.12	0.28	1.63	274
A8	29.08.88	42	1.97	2.28	0.42	3.52	0.07	0.32	2.83	346
A9	14.09.88	58	2.88	2.8	2.66	4.48	2.45	0.61	6.03	1175
(2) Serokonwersja, panel C
Cl	28.07.88	0	0.07	0.12	0.08	0.08	0.21	0.23	0.01	22
C6	25.08.88	28	0.54	0.31	0.13	0.11	0.21	0.15	0.02	53
C7	29.08.88	32	1.29	0.43	0.08	0.08	0.10	0.09	0.02	63
C8	01.09.88	35	2.25	1.29	0.26	0.28	0.18	0.13	0.32	81
C9	08.09.88	42	6.14	2.62	1.38	0.86	0.15	0.13	2.11	183
C10	28.09.88	62	7.66	3.42	5.32	4.79	1.68	0.12	6.65	563
(3) Serokonwersja, panel J
J1	04.07.76	0	0.13	0.09	0.07	0.03	0.02	0.02	0.08	13
J2	16.07.76	12	0.05	0.06	0.03	0.04	0.01	0.01	0.10	56
J3	20.07.76	16	0.06	0.09	0.02	0.03	0.06	0.03	0.07	34
J4	02.07.76	29	0.07	0.14	0.06	0.10	0.08	0.07	0.06	19
J5	09.08.76	36	0.12	0.16	0.08	0.08	0.07	0.08	0.09	19
J6	17.08.76	44	0.05	0.14	0.07	0.11	0.08	0.07	0.11	23
J7	09.09.76	67	0.10	0.10	0.11	0.09	0.10	0.09	0.12	163
J8	13.09.76	71	1.03	0.64	0.62	0.21	0.07	0.07	0.68	168
J9	20.09.76	78	1.78	1.10	1.14	0.42	0.08	0.08	1.88	320
J10	27.09.76	85	2.22	2.35	2.10	0.87	0.04	0.07	3.25	660
(4) Serokonwersja, panel B
BI	19.07.88	0	0.08	0.09	0.08	0.09	0.08	0.21	0.09	11
B10	26.08.88	39	0.11	0.35	0.12	0.17	0.10	0.28	0.18	78
B11	30.08.88	43	0.06	0.48	0.63	0.15	0.08	0.27	0.48	180
B12	28.09.88	72	0.26	1.63	6.38	5.19	0.18	0.54	5.88	401
B13	09.11.88	114	0.16	2.18	4.95	5.99'	4.15	8.16	6.78	72

* wartości w dacie pobrania próbek

S/CO: iloraz gęstości optycznej sygnału badanego przez graniczną gęstość optyczną

Wyniki podane w tabeli 3 przedstawiają porównanie natywnych antygenów HCV, będących produktami ekspresji genów E1 i E2 z odpowiednimi antygenami denaturowanymi. W tabeli tej, reaktywność immunologiczną surowicy od pacjentów z ostrą, objawową fazą NANBH śledzono w czasie i porównano z reaktywnością próbek surowicy pochodzącej od pacjentów z przewlekłą fazą NANBH. Jak to jest widoczne w tabeli 3, natywne antygeny otoczkowe wirusa HCV, zawierające zarówno epitopy konformacyjne jak i liniowe, RVV(el i e2) i CHO-e2, są bardziej reaktywne immunologicznie niż antygeny zawierające jedynie epitopy liniowe, e1 i e2 (wytwarzane w drożdżach) i denaturowane, CHO-e2. Z ogólnej obserwacji wynika, że reaktywność immunologiczna natywnych antygenów otoczkowych HCV zwiększa się od 8 do 9-krotnie

174 686 u pacjentów z ostrą fazą choroby i około 2-krotnie u pacjentów z przewlekłym przebiegiem NANBH. Tak więc, okazuje się, że większość odpowiedzi immunologicznych u pacjentów z ostrąobjawowąfaząNANBH to odpowiedzi wynikające z reakcji z epitopami konformacyjnymi, podczas gdy w fazie ostrej odpowiedź dzieli się mniej więcej równo na epitopy konformacyjne i epitopy liniowe.

Badania te dostarczają pierwszego dowodu na to, że epitopy konformacyjne mogą być zaangażowane w odpowiedzi immunologicznej gospodarza na wirusa HCV.

Tabela 3

Częstość występowania antygenów HCV zawierających epitopy konformacyjne w stosunku do antygenów zawierających jedynie epitopy liniowe w fazie ostrej objawowej i w fazie przewlekłej NANBH

	Ilość (%) pacjentów anty-HCV dodatnich po transfuzji
Diagnoza Czas po transfuzji	** faza ostra, objawowa NANBH	Faza przewlekła
0-6 miesięcy	6-12 miesięcy	>12 miesięcy
Antygeny HCV C25	19/19* (100%)	19/19* (100%)	18/19* (95%)	9/9* (100%)
rVV(e1 i e2)	16/19* (84%)	17/19* (89%)	16/19* (84%)	9/9* (100%)
CHO-e2	11/19* (58%)	12^19* (63%)	13/19* (68%)	9/9* (100%)
CHO-e2 (denaturowany)	1/19* (5%)	3/19* (16%)	4/19* (21%)	5/9* (56%)
e1	1/19* (5%)	1/19* (5%)	4/19* (21%)	4/9* 44%)
e2	2/19* (11%)	4/19* (21%)	4/19* (21%)	4/9* (44%)

*

Jlość odpowiedzi dodatnich/ilość badanych

Diagnoza objawowej ostrej fazy NANBH w oparciu o biopsję (przytłaczającą ilość pacjentów poddano biopsji) i utrzymywania się wysokiego poziomu transaminaz

Przykład 5. Próba immunologiczna z użyciem E1/E2: Porównanie pacjentów kompetentnych immunologicznie z pacjentami z upośledzeniem reaktywności immunologicznej.

Pacjenci. Badano trzy grupy pacjentów. U wszystkich pacjentów próby na obecność przeciwciał przeciw wirusowi nabytego braku odporności (HlV) były ujemne. Grupa l obejmowała 20 pacjentów immunokompetentnych z przewlekłym potransfuzyjnym zakażeniem HCV, poza tym zdrowych. U wszystkich pacjentów, próby na obecność przeciwciał anty-HCV i na RNA HCV były dodatnie. W grupie ll znalazło się 15 pacjentów poddawanych dializie podtrzymującej. U 11 pacjentów próby na obecność przeciwciał anty-HCV były dodatnie przy pierwszym badaniu, jeden przebył podczas badań transplantację nerki. U czterech pacjentów pojawiły się przeciwciała anty-HCV w trakcie trwania badań. W grupie Ul zgromadzono 17 pacjentów - biorców po operacjach transplantacji nerek. U 7 pacjentów, próby na obecność przeciwciał anty-HCV i na RNA HCV były dodatnie przy pierwszym badaniu. U siedmiu pacjentów pojawiły się przeciwciała anty-HCV w trakcie trwania badań, z czego u dwóch na początku badań tylko próby na obecność RNA HCV były dodatnie. Dwóch pacjentów było wyłącznie RNA HCV-dodatnich przy prezentacji, i u obydwu próby na RNA HCV pozostały dodatnie, a próby na obecność przeciwciał anty-HCV pozostały ujemne w dalszych badaniach kontrolnych. U jednego pacjenta próby na obecność RNA HCV stały się dodatnie dopiero w trakcie dalszych badań.

Surowice: Surowice gromadzono prospektywnie w okresie od lipca 1989 do kwietnia 1992 roku i przed pobraniem do prób przechowywano w określonych ilościach w temperaturze -70°C. U pacjentów z grupy l badano 2 do 4 próbek zebranych w odstępach czasu od 6 do 12 miesięcy.

174 686

Dwie próbki zebrane w odstępach czasu od 1.5 do 2 lat badano u wszystkich pacjentów w grupach II i III. Dodatkowe próbki pobierane w międzyczasie i w badaniach kontrolnych testowano u tych pacjentów, u których obserwowano zmiany w statucie anty-HCV i/lub RNA HCV w drugiej próbce.

Próba ELISA. Antygeny HCV przygotowywano w sposób opisany w przykładzie 4 i stosowano w technice ELISA w sposób opisany w przykładzie 4. W próbie oznaczonej symbolem N e1 i e2, ilość fałszywych wyników dodatnich spowodowanych wiązaniem z białkiem wirusa krowianki zmniejszono przez (i) dodanie do rozcieńczalnika próbki lizatu komórkowego krowianki, służącego jako antygen kompetycyjny i (ii) użycie próbek Vaccinia-reaktywnych jako kontroli negatywnych.

Wyniki są przedstawione na fig. 3A-3C. Jedynie 55% immunokompetentnych pacjentów z grupy I reagowało na antygeny e1 Iub e2 wytwarzane w drożdżach, natomiast wszyscy pacjenci reagowali na natywne, glikozylowane antygeny e1 i e2 wytwarzane w wirusie krowianki. Tak jak u pacjentów immunokompetentnych, większość pacjentów poddawanych hemodializie z grupy II reagowało z antygenami C25, C22 i N el i e2. Znacząco mniejsza część pacjentów reagowała z antygenami C100-3, C33C, NS-5, e 1i e2. W porównaniu z pacjentami immunokompetentnymi, znacznie mniej pacjentów z grupy ΙΠ - biorców nerek po operacjach transplantacji reagowała na wszystkie badane antygeny wirusa HCV.

Wszyscy immunokompetentni pacjenci reagowali na C25, C22 i C33C. Na NS-5 reagowało 90% pacjentów, a na C100-3 - 80% pacjentów. Jedynie 55% pacjentów reagowało na antygeny e1 i e2 pochodzące z drożdży, lecz wszyscy reagowali na antygeny N e1 i e2 wytwarzane w Vaccinia, co wskazuje, że epitopy otoczkowe są epitopami konformacyjnymi i glikozylowanymi. Od 65% do 90% pacjentów poddawanych dializie i transplantacji nerek reagowało na C25, C22 i N e1 i e2, ale jedynie 12% do 60% pacjentów reagowało na C100-3 i NS-5. Obniżenie Iub stratę reaktywności w stosunku do antygenów wirusa zapalenia wątroby typu C obserwowano po transplantacji nerek i szpiku kostnego, przy czym obniżenie to było słabsze w odniesieniu do C25 i N e1 i e2.

Powyższe dane świadczą o tym, że epitopy e1 i e2 są epitopami konformacyjnymi i że w porównaniu do innych epitopów HCV, reaktywność wobec tego typu epitopów ulega jedynie nieznacznemu osłabieniu w wyniku obniżenia odporności immunologicznej.

(%) 100 η

174 686

C25 C22 CIOO C33C NS5 el e2 NelAe2

FIG. 3A (%) 100-1

C25 C22 CIOO C33C NS5 el e2 Nelie2

FIG. 3B

C25 C22 CIOO C33C NS5 el e2 Nelle2

F I G. 3C

174 686

translacja

5' vacT stop Spel Stul EcoRI Xhol Hlndlłl Sali Bamlll 3' TK—AGAAAAACTAGTTACTTAACTAGTAGGCCTGAATTCCTCGAG-P-AAGCTTGTCGACGGArCC-TK

VacT: Sygnał końca transkrypcji dla wczesnego mRNA wirusa krowianki P: Syntetyczny promotor o długości 60 par zasad

174 686

Przypu-----szczalny rejon strukturalny

Przypuszczalny______r rejon niestrukturalny wiążące RNA ?

białko nukleo- Glukiprokapsydu teiny otoczki

Proteaza/ · helikaza

Polimeraza RNA zależna od RNA

Przypuszczalna funkcja genom wirusa HCV

| C | El 1 E2 1HS2 | HŚ3 Ί NS4

NS5 1 wytwarzane polipeptydy rekombinantowe

Wi

I ns5 | polipeptyd chimerowy C25

C33C fr

F IG. I

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania wczesnej serokonwersji w gospodarzach ssaczych jako odpowiedzi na wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) obejmujący (a) otrzymywanie z gospodarza, składnika ciała podejrzanego o posiadanie przeciwciał przeciwko HCV, (b) kontaktowanie tego składnika ciała z antygenową sekwencją aminokwasową HCV albo ze standardową próbą kontrolną w warunkach umożliwiających zajście reakcji immunologicznej, i (c) wykrywanie obecności kompleksów immunologicznych przeciwciał i antygenu, przy czym nieobecność tego kompleksu immunologicznego zawierającego tę standardową próbę kontrolną i obecność tego kompleksu immunologicznego zawierającego tę aminokwasową sekwencję antygenową HCV wskazuje serokonwersję w odpowiedzi na HCV, znamienny tym, że aminokwasowa sekwencja antygenowa HCV wybranajest z aminokwasowej sekwencji antygenowej kodowanej w regionie El genomu HCV, aminokwasowej sekwencji antygenowej kodowanej w regionie E2 genomu HCV lub ich agregatach i która charakteryzuje się tym, że oczyszczana jest w warunkach nie denaturujących.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję aminokwasową kodowaną w obrębie domeny E1 genomu HCV.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję aminokwasową polipeptydu E1.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję aminokwasową kodowaną w obrębie domeny E2 genomu HCV.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję aminokwasową polipeptydu E2.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję agregatu polipeptydu E1/E2.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję aminokwasową agregatu polipeptydu E1/E1.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję agregatu polipeptydu E2/E2.
9. 9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 4, albo 7, albo 8, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję wytwarzaną na drodze ekspresji w rekombinantowym wirusie krowianki.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aminokwasową sekwencję antygenową HCV stosuje się sekwencję wytwarzaną na drodze ekspresji w komórkach CHO.
11. 11. Sposób wykrywania przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) w składniku ciała ssaka, obejmujący (a) otrzymanie składnika ciała ssaka podejrzanego o posiadanie przeciwciał przeciw HCV, (b) kontaktowanie tego składnika ciała ssaka z co najmniej dwiema antygenowymi sekwencjami aminokwasowymi w warunkach umożliwiających zajście reakcji immunologicznej, (c) wykrycie kompleksów immunologicznych tych aminokwasowych sekwencji antygenowych i przeciwciał, znamienny tym, że co najmniej jedna aminokwasową sekwencja antygenowa wybranajest z grupy stanowiącej aminokwasową sekwencję antygenową kodowaną w regionie El genomu HCV, aminokwasową sekwencję antygenową kodowaną w regionie E2 genomu HCV albo ich agregatów i która charakteryzuje się tym, że oczyszczana jest w warunkach nie denaturujących.

    174 686

    Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania wczesnej serokonwersji w gospodarzach ssaczych i sposobu wykrywania przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV).

    Wynalazek dotyczy zwłaszcza polipeptydowych reagentów immunologicznych użytecznych do wykrywania, zapobiegania i do leczenia zakażeń wirusem HCV, jak również zastosowania tych reagentów do prób i zestawów immunologicznych. Wynalazek służy do ograniczania szerzenia się infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV).

    Wirus HCV zidentyfikowali i scharakteryzowali po raz pierwszy Houghton i współpracownicy jako bezpośrednią przyczynę potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A, nie-B (NANBH). Poza znaczną wiedzą, jaką wnieśli o tym wirusie, Houghton i jego współpracownicy opisali wiele ogólnych i -swoistych reagentów i technik immunologicznych.

    Wyniki badań Houghtona i wsp. są opisane między innymi w następujących publikacjach: Houghton i wsp, publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego nr 388.232; Choo i wsp., Science (1989) 244,359-362; Kuo i wsp., Science (1989) 244,362-364; Takeuchi i wsp., J. Gen. Virol. (1990) 71, 3027-3033; Takeuchi i wsp., Gene (1990) 91,287-291; Takeuchi i wsp., Nuci, Acids Res. (1990) 18,4626; Miyamura i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87, 983-987; Saito i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87, 6547-6549; Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88, 2451-2455; Han i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1711-1715; Houghton i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 3468-3472.

    W publikacjach tych jest zawarta wyczerpująca wiedza ogólna o wirusie HCV, a także, o wytwarzaniu i zastosowaniu reagentów immunologicznych opartych na polipeptydzie HCV. Dla zwięzłości opisu wynalazku, ujawnienia zawarte w powyższych publikacjach wprowadzone są do niniejszego opisu jako cytowania.

    Inni badacze wykorzystali i pogłębili pracę -Houghton’a i wsp. Są one opisane w następujących publikacjach: Highfield i wsp., publikacja zgłoszenia patentowego Wielkiej Brytanii nr 2.239.245 (The Wellcome Foundation Ltd.); Wang, publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego nr 442.394 (United Biomedical Inc.); Leung i wsp., publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego nr 445.423 (Abbott Laboratories); Habits i wsp, publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego nr 451.891 (Akzo N.V;); Reyes i wsp., publikacja międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 91/15516 (Genelabs Inc.); Maki i wsp., publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego nr 468.657 (Tonen Corp.) i Kamada i wsp., publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego nr469.348 (Shionogi Seiyaku K.K.). Patrz również: Matsuura i wsp., J. Virology (1992) 66, 1425; Kato i wsp, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87, 9524-9528; Takamizawa i wsp., J. Virol. (1991) 65, 1105-1113; Chiba i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88,4641-4645; Harada i wsp., J. Virol. (1990) 65,3015-3021; Hijikata i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88, 55-47-5551; Okamoto i wsp., Jpn. J. Exp. Med. (1990) 60, 167-177; Yuasa i wsp., J. Gen. Virol. (1991) 72, 2021-2024; Watanabe i wsp., Int. J. Cancer (1991)48,340-343.

    Ważnym osiągnięciem medycyny stały się czułe, swoiste metody skriningu i nośniki identyfikujące wirusa HCV oraz zanieczyszczoną wirusem HCV krew i produkty krwi. Potransfuzyjne zapalenie wątroby (PTH) występuje u około 10% pacjentów poddawanych transfuzji, przy czym do 90% tych przypadków to zakażenia wirusem HCV. Głównym zagrożeniem w tej chorobie jest często występująca w porównaniu z innymi typami zapalenia wątroby, zwłaszcza typu B, progresja zakażenia, aż do chronicznego uszkodzenia wątroby włącznie, sięgająca 25-55% przypadków.

    Opieka nad pacjentem oraz zapobieganie przenoszeniu HCV bądź przez krew i produkty krwi, bądź przez ścisły kontakt osobisty wymagają dysponowania niezawodnymi narzędziami diagnostycznymi i prognozującymi zachorowalność, takimi jak polipeptydy HCV, pozwalającymi na wykrywanie przeciwciał związanych z HCV. Polipeptydy te są również użyteczne jako szczepionki i środki immunoterapeutyczne nadające się do zapobiegania i/lub do leczenia tej choroby. Ponieważ wirus HCV jest względnie nowym czynnikiem zakaźnym, istnieje ciągła

    174 686 potrzeba zdefiniowania dodatkowych reagentów immunologicznych, które pozwolą na dalsze badania klinicznego przebiegu choroby i epidemiologii HCV w populacji ludzkiej.

    Zgłaszający przeprowadzili dodatkowe badania serologiczne nad antygenami HCV i wykryli, że techniki immunologiczne wykorzystujące antygeny płaszczowe HCV, w których utrzymane są epitopy konformacyjne, są bardziej skuteczne przy wykrywaniu przeciwciał anty-HCV niż te, w których stosuje się te same antygeny z epitopami liniowymi.