CZ695A3 - Method of detecting antibodies of c hepatitis virus and a set for detection hcv antibodies - Google Patents

Method of detecting antibodies of c hepatitis virus and a set for detection hcv antibodies Download PDF

Info

Publication number
CZ695A3
CZ695A3 CZ956A CZ695A CZ695A3 CZ 695 A3 CZ695 A3 CZ 695A3 CZ 956 A CZ956 A CZ 956A CZ 695 A CZ695 A CZ 695A CZ 695 A3 CZ695 A3 CZ 695A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hcv
antigens
antibodies
antigen
cells
Prior art date
Application number
CZ956A
Other languages
Czech (cs)
Other versions
CZ291951B6 (en
Inventor
David Y Chien
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25429280&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ695(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of CZ695A3 publication Critical patent/CZ695A3/en
Publication of CZ291951B6 publication Critical patent/CZ291951B6/en

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Processing And Handling Of Plastics And Other Materials For Molding In General (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Immunoassay methods utilizing HCV envelope antigens that contain conformational epitopes reactive with antibodies in serum from infected individuals are useful for screening and diagnosis. These antigens detect antibodies that are not detected by denatured HCV envelope antigens. In addition, these HCV envelope antigens comprised of conformational epitopes are more immunologically reactive than a number of other HCV antigens. This is the first evidence that conformational epitopes may be involved in the immunologic response to HCV antigens.

Description

Oblast technikvTechnical field

Vynález, se týká materiálů a metodologie ke zvládání rozšířené^ áká^H/iřěm^ž lout ěňky’” C“( he p*a ťi ťi “C vi r u s' HCV )Y ’Z v las ťě~še vynález týká polypeptidů, použitelých jakožto imunologických činidel, vhodných k detekci, prevenci a ošetřování infekcí HCV a rovněž používání imunologických testů a zařízení.The present invention relates to materials and methodologies for managing the expanded CV (HCV) Y 'Z pupil. used as immunological agents suitable for the detection, prevention and treatment of HCV infections as well as the use of immunological tests and devices.

Dosavadní stav technikyPrior art

Poprvé identifikoval a charakterizoval HCV jako prvotní příčinu posttransfuzní ne-A ane-B hepatitidy (NANBH) Houghton a kol. Vedle toho, Že poskytli podstatné informace týkající se HCV, objevili Houghton a jeho spolupracovníci radu obecných a spe:cifick-ý-c-h-i-m-un-o 1 o-g i ckých-' -r ea-ge nebí—a'-nre tod'.' Vů z' ' napH-k-lad^Hou-ght o n a kol. zveřejněné přihlášky vy nálezu Ε P O číslo 318216 a číslo 388232; publikace Chco a kol. Science (1989) 244,str. 359 až 362; Kuo a kol., Science ( 1989 ) 244, str, 362 až 364; Takeuchi a kol.’' J. G e η. V ,i rol. (1990) 71, str. 3027 áž 3033; Takeuchi a kol. Gene (1990) 91,. str. 287 až 291; Takeuchi a kol. Nucl. Acids.Res.He first identified and characterized HCV as the primary cause of post-transfusion non-A ane-B hepatitis (NANBH) Houghton et al. In addition to providing essential information regarding HCV, Houghton and co-workers found a number of general and:cifick-ý-c-h-i-m-un-o 1 o-g i ckých- '-r ea-ge nebí — a'-nre tod'. ' Vů z '' napH-k-lad ^ Hou-ght o n a coll. published applications of the judgment Ε P O number 318216 and number 388232; Chco et al. Science (1989) 244, p. 359 to 362; Kuo et al., Science (1989) 244, pp. 362-364; Takeuchi et al., J. G e η. V, i rol. (1990) 71, pp. 3027 to 3033; Takeuchi et al. Gene (1990) 91,. pp. 287-291; Takeuchi et al. Nucl. Acids.Res.

(190) 18, str. 4626; Miyamura a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87, str. 983 až 987; Saito a kol. Proč. Nati. Acad.(190) 18, pp. 4626; Miyamura et al. Why. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87, pp. 983-987; Saito et al. Why. Nati. Acad.

Sci. USA (190) '87, str. 6547 až 654 9; Choo a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 88, str. 2451 až 2455; Han a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA {1990} 88, str. 1711 až 1715; Houghton a kol. Hepatology (1991) 14, str. 381 až 338; Weiner a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 89, str. 3468 až 3472. Tyto publikace vytvářejí rozsáhlý základ stavu techniky o HCV obecně, stejně jako informují o výrobě a použití polypept idových imunologických reagencií HCV. Pro ,stručnost se zde na tyto publikace toliko upozorňuje.Sci. USA (190) '87, pp. 6547-654; Choo et al. Why. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 88, pp. 2451-2455; Han et al. Why. Nati. Acad. Sci. USA {1990} 88, pp. 1711-1715; Houghton et al. Hepatology (1991) 14, pp. 381-338; Weiner et al. Why. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 89, pp. 3468-3472. These publications form an extensive basis on the state of the art about HCV in general, as well as informing about the production and use of HCV polypeptide immunological reagents. For the sake of brevity, these publications are only pointed out here.

Práci Houghtonovu a kol. pohotově aplikovali a rozšířiliThe work of Houghton et al. promptly applied and disseminated

další badatelé. Viz například Highfield a kol., britská zveřejněná přihláška vynálezu číslo 2 239245 (The We 1 come Foundation Ltd.); Wang publikovaná přihláška vynálezu EPO číslo 442394 (United Biomedícal lne.); Leung a kol. publikovaná přihláška vynálezu EPO číslo 445423 (Abbott Laboratories); Hábit a kol, publikovaná přihláška vynálezu EPO číslo 451891 (Akzo N.V.); Reyes a kol.,POT pub'l , Číslo WO 91/15516 (Oenelabs ínc.J; Mákl a kol., publikovaná přihláška, vynálezu EPO číslo 468657 (Tonen Corp.); a Karnada a kol., publikovaná přihláška vynálezu EPO číslo 469348 (Shionogi Seiyaku K.K.). Viz též Matsuura a kol. (1992) J.Virology 66, str. 1425; Kato a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990) 87, str. 9524 až 9528; Takamizawa a kol. J. Virol.other researchers. See, e.g., Highfield et al., British Published Application No. 2,239,445 (The We 1 come Foundation Ltd.); Wang Published EPO Application No. 442394 (United Biomedical Inc.); Leung et al. EPO Published Application No. 445423 (Abbott Laboratories); Habit et al., EPO Publication No. 451891 (Akzo N.V.); Reyes et al., POT Pub'l, WO 91/15516 (Oenelabs et al., Mákl et al., EPO Publication No. 468657 (Tonen Corp.); and Karnada et al., EPO Publication No. 469348 (Shionogi Seiyaku KK) See also Matsuura et al (1992) J. Virology 66, 1425, Kato et al Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87, 9524-9528, Takamizawa et al., J. Virol.

1113; Chiba a kol,Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1991) 88, str až 4545; Harada a kol., J. Virol. (1991) 65, str. 3015 až 3021; Hijikata a kol., .Proč. Nat1. Acad..Sci, USA ( 1991 ), 88, str. 5 5 47 až 5551; Okamoto a kol. Jpn. J.Exp.Med. (1990) 60,1113; Chiba et al., Why. Nati. Acad. Sci. USA (1991) 88, pp. 4545; Harada et al., J. Virol. (1991) 65, pp. 3015-3021; Hijikata et al., .Why. Nat1. Acad. Sci, USA (1991), 88, pp. 557-55151; Okamoto et al. Jpn. J.Exp.Med. (1990) 60,

177; Yuasa a kol., J.Gen. Virol. (1991) 72,177; Yuasa et al., J.Gen. Virol. (1991) 72,

Watanabe a kol. Int.J. Cancer (1991) 48, str. 11Ό5 až 464 1 str. 167 až str. 2021 až 2024; str. 340 až 343.Watanabe et al. Int.J. Cancer (1991) 48, pp. 11-5-464 1 pp. 167-2021-2024; pp. 340 to 343.

Citlivé, specifické metody ke s kr ί no v á η í a identifikování nosičů HCV a HCV kontaminované krve nebo krevních derivátů jsou významným pokrokem v lékařství. Posttransfuzní žloutenka (posttransfusion hepatitis PTH) se vyskytuje u 10 % pacientů po transfus i a na HCV z toho připadá 90 X těchto případů. Hlavním problémem u tohoto onemocnění je častý výskyt chronického poškození jater (2 5 až 55 %) oproti .jiným žloutenkám, například typu B.Sensitive, specific methods for the detection and identification of carriers of HCV and HCV contaminated blood or blood derivatives are significant advances in medicine. Posttransfusion hepatitis (PTH) occurs in 10% of patients after transfusion, and HCV accounts for 90% of these cases. The main problem with this disease is the frequent incidence of chronic liver damage (25 to 55%) compared to other jaundice, such as type B.

Péče o pacienty stejně .jako prevence přenosu HCV krví a krevními deriváty nebo těsným Osobním stykem vyžaduje spolehlivou diagnostiku a prognostické nástroje, jako jsou HCV polypeptidy, k detekcí protilátek týkajících se HCV. Takové polypeptidy jsou užitečné také .jako vakciny a imunoterapeutická činidla k prevenci a/nebo k léčení nemoci. Jelikož HCV .je poměrně novým činidlem, existuje trvalá potřeba definovat další imunologická činidla, která umožní studovat dále klinický průběh onemocnění a epidemiologii HCV v populaci.Patient care, such as the prevention of HCV transmission by blood and blood derivatives or close personal contact, requires reliable diagnostics and prognostic tools, such as HCV polypeptides, to detect HCV-related antibodies. Such polypeptides are also useful as vaccines and immunotherapeutic agents for the prevention and / or treatment of disease. As HCV is a relatively new agent, there is a continuing need to define additional immunological agents that will allow further study of the clinical course of the disease and the epidemiology of HCV in the population.

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Způsob detekce protilátek viru hepatitis G (HCV) v tělesné složce savců u níž .je podezření, že obsahuje tyto protilátky spočívá podle vynálezu v· tom, že se kontaktují takové tělesné, složky s -antigenem HCV obsá bují c~í 1η~ίίοτΓΓ^ΊΓηΓί“δ nl^Vpl^oT) “z ďonrén-y—E~l· - ne-boE2 HCV zá' podmínek umožňujících imunologickou reakci mezi případnými protilátkami a antigenem a stanoví se přítomnost případného imunitního- -komplexu těchto protilátek a. těchto antigenů.A method of detecting hepatitis G virus (HCV) antibodies in a mammalian body component suspected of containing such antibodies is to contact such body components with an HCV antigen component containing mammalian antibodies. The HCV under the conditions allowing the immunological reaction between any antibodies and the antigen is determined and the presence of a possible immune complex of these antibodies and these antigens is determined. .

Vynález je založen na tom, že byly provedeny další serologické studie antigenů HCV a že se zjistilo, že imunologické .zkoušky za použití obalových antigenů HCV, které zachovávají konformační epítopy jsou účinnější k detekci anti-HCV. protilátek než zkušky, kde se používá stejných antigenů s lineárními epitopy.The invention is based on the fact that further serological studies of HCV antigens have been performed and that it has been found that immunological assays using envelope HCV antigens that retain conformational epitopes are more effective in detecting anti-HCV. antibodies than assays using the same antigens with linear epitopes.

Vynález se také týká způsobu, kdy antigeny jsou zakódovány v doménách. El a/nebo E2 nebo jsou antigeny El a/nebo E2. V některých provedeních mohou být antigeny vytěsněny, expresí z Vakcinía vektorů nebo. z CHO buněk- Kromě toho podle některých^provedení z jiného :on f or vynálezu, se začleňuje druhý antigen sestávající mačního epitopu.The invention also relates to a method wherein the antigens are encoded in the domains. E1 and / or E2 or are E1 and / or E2 antigens. In some embodiments, the antigens may be displaced, expressed from vaccinia vectors or. In addition, according to some embodiments of another invention, a second antigen consisting of a feline epitope is incorporated.

Vynález se také-týká způsobu skrínování krevních složek nebo krve na HCV před použitím takové krve nebo krevních složek k pří.. -^—pna.yě.. ,k.r e.yn í c‘h _de.r,ív_át_ů_, kt_e_r_ý má tyto stupně:The invention also relates to a method of screening for blood components or blood for HCV prior to the use of such blood or blood components for the preparation of blood components or compositions having the following degrees:

a) ’ nechává se .reagovat tělesná složka od potenciálního dárce s HCV antigenem obsahujícím konformační epitop z domén El neboE2 HCV za podmínek umožňuj íc ích '“imunologickou reakc i mez i'-pr í-~padnými protilátkami v tělesné složce a antigenema) the body component is reacted from a potential donor with an HCV antigen containing a conformational epitope from the E1 or E2 domains of HCV under conditions allowing an immunological reaction between any antibodies in the body component and the antigen;

b) zjišťuje se komplex vytvořený mezi antigenem a případnými protilátkami a cj vyřad í”’še' véškérá'krev nebo'” krevn í s ložky od -dárce ,- u-k-terých se podle stupně b) zjistily takové komplexi'.b) detecting the complex formed between the antigen and any antibodies, and discarding any high blood or blood deposits from the donor which have been detected according to step b).

Vynález se také týká soupravy k detekci protilátek HCV obsahujících antigen HCV tvořený konf ormačním. epitopem z domén El nebo E2 HCV a kontrolní standardy, balené ve vhodných ampulkách a instrukce pro použití součástí soupravy.The invention also relates to a kit for detecting HCV antibodies comprising an HCV antigen formed by a formulation. epitope from HCV E1 or E2 domains and control standards, packaged in suitable vials and instructions for use of the kit components.

Vynález blíže objasňuje následující popis a připrojené obrázky:The invention is further elucidated by the following description and the accompanying drawings:

Va obr. 1 jsou schematicky naznačeny předpokládané domény HCV polyproteinu.Figure 1 schematically indicates putative HCV polyprotein domains.

Va obr. 2 je schéma ukazující některé význaky vektoru pSC39.Fig. 2 is a diagram showing some features of the pSC39 vector.

Obr. 3A, 3B a 3C ukazují procento pacientů skupiny ί,. II a IIT reaktivních ve zkouškách ELISA na individuální antigeny HCV.Giant. 3A, 3B and 3C show the percentage of patients in group ί ,. II and IIT reactive in ELISA assays for individual HCV antigens.

HCV antigen je polypeptid nebo polypeptidový analog (například mimitopy) obsahující aminokyselinovou sekvenci (a/nebo aminokysetinový analog) definující nejméně jeden epitop HCV. Zpravidla odpovídají sekvence definující epitop aminokyselinové sekvenci proteinu HCV (buď identicky nebo substitucí analogů rnativního aminokyselinového zbytku, který nerozrušuje epitop). 'Obecně bude mít sekvence, definující epitop, délku 5 nebo více aminokyselin, zpravidla 8 a s výhodou 10 nebovíce aminokyselin. Vzhlede-m ke kon f o r mač π í m epitopům, může být délka sekvence definujícíAn HCV antigen is a polypeptide or polypeptide analog (e.g., mimitope) comprising an amino acid sequence (and / or amino acid analog) defining at least one HCV epitope. Generally, sequences defining an epitope correspond to the amino acid sequence of the HCV protein (either identically or by substituting analogs of a native amino acid residue that does not disrupt the epitope). In general, the sequence defining the epitope will be 5 or more amino acids in length, usually 8 and preferably 10 or more amino acids. With respect to concomitant epitopes, the length of the sequence may be defining

0* s p i top ...pod§. _r oba naj| i.r o.ký.m... o..b.mě n.,á m.,.. nebo f _rs.e. ...má... zato.ž.e _tyuto.. e.-.0 * spi top ... pod§. _r both naj | ir o.ký.m ... o..b.mě n., á m., .. nebo f _ r se ... má ... zato.ž.e _tyuto .. e.-.

pitopy jsou tvořeny antigenem trojrozměrného tvaru (například zá► hyby folding). Tudíž aminokyselin definujících epitop může být co do' počtu málo, avšak mohou být široce rozptýleny podél délky molekuly (nebo dokonce na různých molekulách v případě dimérů, atd.), uváděné do správné epitopové konformace cestou záhybování (folding). Části antigenů mezi zbytky, definujícími epitop, nemusejí být rozhodující pro konformační strukturu epitopu. Například vypuštění nebo substituce těcht.o intervenujících sekvencí nemusí ovlivnit konformační epitop za předpokladu, že se uchovají sekvence rozhodné pro ep i to povou konformaci (například cysteiny zahrnuté v disulfidové vazběglykosylační místa, atd.),pitopes are formed by a three-dimensional antigen (e.g. folding folds). Thus, the epitope-defining amino acids may be few in number, but may be widely dispersed along the length of the molecule (or even on different molecules in the case of dimers, etc.) brought into the correct epitope conformation by folding. The portions of the antigens between the epitope-defining residues may not be critical to the conformational structure of the epitope. For example, deletions or substitutions of these intervening sequences may not affect the conformational epitope, provided that sequences decisive for both the ep conformation are retained (e.g., cysteines involved in the disulfide bond of the glycosylation site, etc.).

Antigeny HCV podle tohoto vynálezu tvoří konformační epitopy z domén. .{ oba lových ) El a/nebo E2 HCV. Doména El, o které se má zato, že odpovídá virálnímu obalu, proteinu,je běžně považována za spojující aminokyseliny 192-383 polyproteinu HCV (zveřejněná přihláška vynálezu PCT číslo W091/15771, obr. 1). Podle exprese v systému CHO (glykosilovaném) se má zato, že má přibližnou mole- 5 kulovou hmotnost 35 Kd zjišťovanou způsobem SDS-PAGE. 0 proteinu E 2 , dříve nazývaném Jí Ξ1 , se má zato, že spojuje aminokyseliny 384-800 polyproteinu, a že je také obalovým proteinem. Podle exprese v systému CHO (glykosilovaném) se má zato, že má zdánlivou „g.e.l.o_vo.u._mo.le ku lovou hmotnost přibližně 72 Kd . J e jas. né, že tyto proteinové koncové body jsou aproximativní (například karboxy zakončení E2 by mohlo ležet poněkud v oblasti aminokyselinThe HCV antigens of the invention form conformational epitopes from domains. . (both hunted) E1 and / or E2 HCV. The E1 domain, which is thought to correspond to the viral envelope, of the protein, is commonly considered to be the linker amino acids 192-383 of the HCV polyprotein (PCT Publication No. WO91 / 15771, Fig. 1). According to expression in the CHO (glycosylated) system, it is considered to have an approximate molecular weight of 35 Kd as determined by SDS-PAGE. The E 2 protein, formerly called Ji Ξ1, is thought to associate amino acids 384-800 of the polyprotein, and is also a coat protein. According to expression in the CHO (glycosylated) system, it is believed to have an apparent "g.e.l.o_vo.u.mo.le" to a bulk density of approximately 72 Kd. It's bright. not that these protein endpoints are approximate (for example, the carboxy terminus of E2 could lie somewhat in the amino acid region

750-820). Je také zřejmé, že prototypová sekvence izolátu HCV1 ve zmíněné zveřejněné přihlášce vynálezu PCT je citována pouze pro' ilustraci, a že jakýkoli izolát HCV (viz například odkazy citované v dosavadním stavu techniky) je vhodným zdrojem sekvence El a/nebo E2 pro provádění způsobu podle vynálezu.750-820). It is also clear that the prototype sequence of the HCV1 isolate in said PCT published application is cited for illustration only, and that any HCV isolate (see for example references cited in the prior art) is a suitable source of the E1 and / or E2 sequence for carrying out the method of of the invention.

Antigeny El a E2 , použité podle vynálezu, mohou být virální proteiny s plnou délkou, v podstatě jejich verze s plnou délkou, nebo jejich funkční fragmenty (například fragmenty nepostrádající sekvence nutné k formování nebo uchování konformačního epitopu). Nadto mohou antigeny HCV podle vynálezu zahrnovat také jiné sekvence, které neblokují nebo nebrání vytvoření sledovaného konformačního epitopu.. Přítomnost nebo nepřítomnost konfořmačního epi' ťopui Ί z-e'~siiaďno z ji-st-i-t -skrín-ov-áním- sl.e-d.o-ya n-ého ..a.nt.igenu...s..proti.-. látkou (polyklonální sérum nebo monoklonální vůči konformačnímu -epitopu)- a porovnáním . reakt i vi.ty s reaktivitou denaturované_ verze ďhťVgemiT^-iřťě^ry-^žů^dT-žOui-é-ýí-en—^T-í-pa-d-ryé^l-i-n-e^-r-hví^e-pú-t-o-p-y-r— P-r-i^tazk.o-r-.-.rji: vém skrínování za použití po 1ykloná 1 ηích protilátek, může být vy.hodně.absorbovat polyklonální sérum napřed s denáturováným antígenem a zjistit, zda zachycuje protilátky pro sledovaný antigen.The E1 and E2 antigens used in the invention may be full-length viral proteins, essentially full-length versions thereof, or functional fragments thereof (e.g., fragments lacking the sequence necessary to form or preserve a conformational epitope). In addition, the HCV antigens of the invention may also include other sequences that do not block or prevent the formation of the conformational epitope of interest. The presence or absence of a conformational epitope is possible from the same screen. ed.o-ya n-ého ..a.nt.igenu ... s..proti.-. substance (polyclonal serum or monoclonal to conformational -epitope) - and by comparison. reactants with reactivity of the denatured version of dhťVgemiT ^ -iřťě ^ ry- ^ žů ^ dT-žOui-é-ýí-en— ^ T-í-pa-d-ryé ^ line ^ -r-hví ^ e-pú Topical screening using monoclonal antibodies, it may be convenient to absorb the polyclonal serum first with the denatured antigen and determine if it captures antibodies to the antigen of interest.

Antigeny HCV podle vynálezu lze připravit obvyklým způsobem, který poskytne sledovaný konformační epitop. Například výhodným způsobem k_zajištění sekretovaných glykosilovaných antigenů El a/ nebo E2 v '‘nativní kon formaci je rekombinantní exprese savčích nebo hmyzích buněk. Může však být možné, jak je to známo u proteinů, podrobit expresi antigeny v jiném rekombinantηím hostiteli a renaturovat protein po jeho získání. Je také zřejmé, že chemická syntéza může také poskytnout konformační antigenové mimitopy, které próreagují s nativním konformačním epitonem antigenu.The HCV antigens of the invention can be prepared in a conventional manner that provides the conformational epitope of interest. For example, recombinant expression of mammalian or insect cells is a preferred way to provide secreted glycosylated E1 and / or E2 antigens in a native conformation. However, as is known for proteins, it may be possible to express antigens in another recombinant host and renature the protein after recovery. It will also be appreciated that chemical synthesis may also provide conformational antigenic mimitopes that interact with the native conformational epitone of the antigen.

Výhodnými antigeny .jsou také komplexy El a/nebo E2 (nazývané též agregáty) obsahující více než .jeden monomer El nebo E2. Diméry El :E1, diméry E2;E2 a heterodiméry E1:E2 jsou všechny a.ntigeny v rozsahu tohoto vynálezu. Agregáty mohou též zahrnovat větší útvary a mohou mít molekulové hmotnosti přesahující 800 kD.Preferred antigens are also E1 and / or E2 complexes (also called aggregates) containing more than one E1 or E2 monomer. E1: E1 dimers, E2, E2 dimers, and E1: E2 heterodimers are all antigens within the scope of this invention. The aggregates may also include larger formations and may have molecular weights in excess of 800 kD.

Pojem spojený polypetid. (fusion po^ypeptjde) urču.je poly^ peptid, v němž je alespoň jeden antigen HCV součástí jediného souvislého řetězce aminokyselin, přičemž se takový řetězec v přírodě nevyskytuje. Antigeny HCV mohou být navzájem spojeny přímo peptidovými vazbami, nebo mohou být odděleny intervencí sekvencí aminokyselin. Spojené polypetidy mohou obsahovat také sekvence οχ minokyselin exogenní vůči HCV.The term linked polypeptide. (fusion is determined) is a polypeptide in which at least one HCV antigen is part of a single contiguous chain of amino acids, such chain not occurring in nature. HCV antigens may be linked directly to each other by peptide bonds, or may be separated by intervention of amino acid sequences. The fused polypeptides may also contain HCV exogenous amino acid sequences.

Pojem společná pevná matrice (common solid matrix) určuje pevnou látku, ke které jsou vázány individuální antigeny HCV nebo spojené polypeptidy kovalentními nebo nekovalentními vazbami, jako je hydrofobní adsorpce.The term common solid matrix refers to a solid to which individual HCV antigens or linked polypeptides are bound by covalent or non-covalent bonds, such as hydrophobic adsorption.

Po,jem tělesná složka (body component) určuje kapalinu nebo -tkáň savcí-h-o- jedn ince ( např í-klad-antropoidní ho , -l-id-ského) která· obvykle obsahuje protilátky .jedincem vytvořené. Takové tělesné složky jsou v oboru známé a zahrnují příkladně krev, plasmu, sérum, míšní mok, lymfatické štlávy,· sekrety dýchacího traktu nebo urogenitálního traktu, slzy, sliny, mléko, bílé krvinky a kostní dřeň. Tělesné složky zahrnují biologické tekutiny. Pojem biological liquid (biologická tekutina) se týká tekutiny získané z organizmu. Některých biologických tekutin se používá .jako zdroje jiných produktů, .jako jsou například faktory srážlivosti (například' faktor VΐIE:C), sérový albumin a růstový hormon. V takových případech je důležité, aby zdroj biologické tekutiny byl prost znečištění virem, .jako je HCV.The body component determines the fluid or tissue of the mammalian body (e.g., the anthropoid human body) which usually contains the antibodies produced by the individual. Such body components are known in the art and include, for example, blood, plasma, serum, spinal fluid, lymphatics, respiratory or urogenital tract secretions, tears, saliva, milk, white blood cells, and bone marrow. Body components include biological fluids. The term biological liquid refers to a fluid obtained from an organism. Some biological fluids are used as sources of other products, such as clotting factors (e.g., factor VIII: C), serum albumin, and growth hormone. In such cases, it is important that the source of the biological fluid be free of contamination by a virus such as HCV.

Pojem imunologicky reaktivní (immunologica 11y reactive! znamená, že sledovaný antigen bude reagovat specificky s anti-HCV proti látkám ipřítomnými v tělesné složce jedince infikovaného HCV Pojem imunitní komplex (immune complex) určuje kombinaci vytvořenou., když protilátka se váže na epitop na antigenu.The term immunologica 11y reactive means that the antigen of interest will react specifically with anti-HCV against substances present in the body component of an HCV-infected individual. The term immune complex refers to the combination formed when an antibody binds to an epitope on an antigen.

Zde používaný pojem El znamená protein nebo polypeptid podrobený expresi mezi prvními 400 aminokyselinami polyproteinu HOV, o němž se někdy hovoří .jako o E-proteinu nebo S-proteinu.As used herein, the term E1 means a protein or polypeptide that is expressed between the first 400 amino acids of the HOV polyprotein, sometimes referred to as the E-protein or S-protein.

V. .jeho přírodním tvaru .je to 35 ki) glykoprotein, který se nachází v silné souvislosti s membránou. Ve většině kmenů HCV .je protein El zakódován ve virálním polyproteinu následně za C (.jádrovým) proteinem. Protein El zasahuje od přibližně aminokyseliny (aa) 192 do přibližně aa 383 plné délky polyproteinu. Zde používaný pojem El zahrnuje také analogy a zkomolené tvar.y, které jsou imunologicky křížově' reaktivní s přírodním El.’In its natural form, it is a 35 ki) glycoprotein which is strongly associated with the membrane. In most HCV strains, the E1 protein is encoded in a viral polyprotein following the C (core) protein. The E1 protein extends from about amino acid (aa) 192 to about aa 383 of the full length polyprotein. As used herein, the term E1 also includes analogs and distorted forms that are immunologically cross-reactive with natural E1.

Zde používaný pojem E2 znamená protein nebo polypeptid podrobený expresi mezi prvními 900 aminokyselinami polyproteinu HOV, o němž se někdy hovoří .jako o NS1 -proteinu. V jeho přírodním tvaru je to 72 k D glykoprotein, který se nachází v silné souvislosti s membránou. Ve většině kmenů HCV je protein E2 zakódován ve virálním polyproteinu následně za proteinem El. Protein E2 zasahuje od přibližně aminokyseliny aa 384 do přibližně aa 820. Zde používaný pojem E2 zahrnuje· také analogy a zkomolené tvary,· které jsou' imunologicky křížově r e a k tivní s nř i rodním E 2.As used herein, the term E2 means a protein or polypeptide that is expressed between the first 900 amino acids of the HOV polyprotein, sometimes referred to as the NS1 protein. In its natural form, it is a 72 k D glycoprotein that is strongly associated with the membrane. In most HCV strains, the E2 protein is encoded in a viral polyprotein following the E1 protein. The E2 protein extends from about amino acids aa 384 to about aa 820. As used herein, the term E2 also includes analogs and distorted forms that are immunologically cross-reactive with native E 2.

Zde používaný pojem agregát (agregáte) znamená komplex El a/n-eho·· -E5-. -obsahu j-íc-í v íc.e _n.e ž Je.d.en monome r_Ej. ..nebo _E2 , Diméry El:E.l, dimérv E2:E2,a. heterodiméry El:E2 .jsou všechny agregáty v rozsahu této definice. Agregáty mohou také zahrovat vetší 7í<vň~--ř-y--a-'-mo-ho-n--m-í-t·· -m-ad -e:k:i!d:Q V-é^h.m.o:t:no.S:t-i.--V-ě-t š-í—n-e-ž -.8-0-0.-k-D..- ..._.....As used herein, the term aggregate (aggregate) means the complex of E1 a / n-eho ·· -E5-. -content j-íc-í v íc.e _n.e ž Je.d.en monome r_Ej. ..or _E2, Dimers E1: E.1, dimers E2: E2, a. heterodimers E1: E2 are all aggregates within the scope of this definition. The aggregates may also include larger 7'<v ~ - ř-y - and -'- mo-ho-n - m-í-t ·· -m-ad -e: k: i! D: Q V- é ^ hmo: t: no.S: ti .-- V-ě-t š-í — ne-ž -.8-0-0.-kD ..- ..._.....

Pojem vyčištěný (ptirified) v souvislosti s proteiny se týká kompozic, kde žádaný protein tvoří nejméně 35 celkové proteinové složky v kompozici. Žádaný protein činí s výhodou nejméně 40 X, výhodněji nejméně přibližně 50' X, ještě výhodněji nejméně přibližně 60.X, ještě výhodněji nejméně přibližně 70 X,-.ještě vyješ tě výhodněji nejméně přibližně 95X hmotnosti celkové proteinové složky. Kompozice může obsahovat jiné složky, .jako jsou například uhlohydráty, soli, lipidy a rozpouštědla, aniž to ovlivní zde použité stanovení čistoty, Pojem isolovaný protein znamená kompozici HCV, která má čistotu nejméně 35 X.The term ptirified in reference to proteins refers to compositions wherein the desired protein comprises at least 35 total protein components in the composition. The desired protein is preferably at least 40X, more preferably at least about 50X, even more preferably at least about 60X, even more preferably at least about 70X, even more preferably at least about 95X by weight of the total protein component. The composition may contain other ingredients, such as carbohydrates, salts, lipids, and solvents, without affecting the purity determination used herein. The term isolated protein means an HCV composition that is at least 35% pure.

Pojem izolovaný polypeptid znamená polypeptid, který byl hodněji nejméně přibližně 80 X 90 X a néjvýhodně.ji přibližně v podstatě prost .jiných virálních složek HCV, zejména genomického polynukleotidu HCV, Po 1ypeptidová kompozice je v podstatě prostá jiné složky, jestliže hmotnost polypeptidu v kompozici je ne.jméně hmotnostně 70 polypeptidu a .jiných kombinovaných složek, výhodněji nejméně přibližně 89 ještě výhodněji přibližně 90 % a nejvýhodněji 95 % nebo více procent. __The term isolated polypeptide means a polypeptide that has more preferably been at least about 80 X 90 X, and most preferably about substantially free of other HCV viral components, particularly an HCV genomic polynucleotide. A polypeptide composition is substantially free of another component if the weight of the polypeptide in the composition is at least 70% by weight of the polypeptide and other combined components, more preferably at least about 89, even more preferably about 90%, and most preferably 95% or more percent. __

Způsoby imunologických testů podle vynálezu používají antigenů HCV z domén El a E2 a těch, které obsahují konformační epitopy rozeznané protilátkami v seru jedinců infikovaných HCV. Každý z antigenů má nejméně jeden konformační epitop, který existuje v přírodně se vyskytující částici HCV, nebo v jejím infekčním produktu, jak je zře.jmo z i munor eakt i v i t y antigenů s protilátkami v tělesné složce jedince infikovaného HCV a za ztráty imunoreaktivity epitopu po denaturaci antigenů. Délka antigenů je postačující k udržení imunoreaktivního konformacního epitopu spojeného s tím epitopem. V rozsahu vynálezu je mít více než .jeden konformační epitop na antigenů. Často mohou mít nativní obalové antige-ny .p-ouž-i té--v· i-m-u-n-o 1 o-g ických t. es t ech , p 1 nou -dé-1 ku , - mo-hou však-být zkomolené, například ke zvýšení rozpustnosti. nebo ke zlepšení sekrece (například vypuštěním dotném spojujících membrány). Do rozsahu vynález·’, také spadá použití buď jednotlivých antigenů nebo jejich kombinací či agregátů. Imunologické testy mohou tudíž použít epitopů El, epitopu E2, agregátů nebo kombinací nativních El a E2. Podle záměru spadá také do rozsahu vynálezu používání antigenů s lineárními epitopy v kombinaci s obalovými konformační mi epitopy HCV.The immunoassay methods of the invention use HCV antigens from the E1 and E2 domains and those that contain conformational epitopes recognized by antibodies in the serum of HCV-infected individuals. Each of the antigens has at least one conformational epitope that exists in a naturally occurring HCV particle or infectious product thereof, as seen from the munor reactivity of antigens with antibodies in the body component of an HCV-infected individual and the loss of immunoreactivity of the epitope after antigen denaturation. . The length of the antigens is sufficient to maintain the immunoreactive conformational epitope associated with that epitope. It is within the scope of the invention to have more than one conformational epitope on antigens. Often, native envelope antigens may have immunological tests, but may be distorted, for example to increase solubility. or to improve secretion (e.g., by omitting the connective membranes). The invention also encompasses the use of either individual antigens or combinations or aggregates thereof. Thus, immunoassays may use E1 epitopes, E2 epitopes, aggregates, or combinations of native E1 and E2. It is also within the scope of the invention to use antigens with linear epitopes in combination with envelope conformational epitopes of HCV.

Způsoby detekce přítomnosti konformačních epitopů jsou v oboru známé a některé z nich .jsou dále ilustrovány v příkladech.Methods for detecting the presence of conformational epitopes are known in the art, and some of them are further illustrated in the examples.

Na základě předpokládaných aminokyselin, zakódovaných v nukleotídové sekvenci HCV1 a na základě jiných poznatků, jsou možnými proteinovými doménami zakódovaného proteinu HCV, stejně jako přibližná rozhraní tato:Based on the putative amino acids encoded in the HCV1 nucleotide sequence and other knowledge, the possible protein domains of the encoded HCV protein, as well as approximate interfaces, are as follows:

Předpokládaná doménaExpected domain

C (nukleokapsidový protein) El (virový obalový protein)C (nucleocapsid protein) E1 (viral envelope protein)

Přibližné rozhraní (čísla aminokyselin)Approximate interface (amino acid numbers)

1-1911-191

192-383192-383

E2/NS1 (obal?) NS2E2 / NS1 (cover?) NS2

NS3 (proteáza?) MS4NS3 (protease?) MS4

384-800384-800

800-1050800-1050

1050-16501050-1650

1651-21001651-2100

NS5 (polymeráza)NS5 (polymerase)

21Ό0-3Ό11 (zakončení)Tyto domény jsou ovšem pokusné. Například rozhraní E1-NS2 je pravděpodobně v oblasti 750-810 a rozhraní N S 3 - N S 4 je přibližně 1640-1650. Existuje také poznatek, že verze 191 aa C je prekurzor, který je dále veden (například do délky přibližně 170 aa), a že proteiny NS2, NS4 a NS5 jsou každý dále vedeny do dvou dokonalých proteinů. Vzájemná poloha domén je znázorněna na. obr. 1.21Ό-3-311 (termination) However, these domains are experimental. For example, the interface E1-NS2 is probably in the range 750-810 and the interface N S 3 - N S 4 is approximately 1640-1650. It is also noted that versions 191a and C are precursors that are further fused (e.g., to a length of approximately 170 aa), and that the NS2, NS4, and NS5 proteins are each further fused to two perfect proteins. The relative position of the domains is shown in. Fig. 1.

Způsoby přípravy antigenů. El a E2 včetně antigenů s na t i vn i mi konřormacemi, jsou popsány v článku Spaste R a kol., Virology (1 992 ) 1 88,· str. 819-830 a v přihlášce vynálezu WO92/O8734 . Obec-ně -.se - vol-í·—ho-s-t i-t-e-1 ské- ..buňky.jež. .u.m.o.žn í... vy t vá_ř en í .na ti vn í c h ko nformačn.ích. e.p.itopů v expresovaných obálových proteinech; těmito hostitelskými . buňkami mohou být například zvířecí buňky, hmyzíMethods of antigen preparation. E1 and E2, including antigens with internal conformations, are described in Spaste R et al., Virology (1999) 1888, pp. 819-830 and WO92 / O8734. Generally, cells are selected. .u.m.o.žn í ... vy t vá_varení .na t vní í c h k nformačních. e.p.itopes in expressed envelope proteins; these hosts. the cells may be, for example, animal cells, insect cells

Mezi eukaryotické hostitele patří kultury kvasnicových ,a_savčícht buněk. Nejběžněji používanými kvasnicovými hostiteli .jsou Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces carlsbergensis a jsou vhodnými plísňovými hostiteli. S kvasnicemi kompatibilní vektory nesou značky, které umožňují výběr úspěšných transformantů udělujících prototropii auxotropickým mutantům nebo odolnost vůči těžkým kovům u kmenů divokého typu. S kvasnicemi kompatibilní vek tor v mohou· ooužívat 2-mikronového počátku replikace (Broach v , a kol. (1983 ) Meth. Enz. 101, str. 307 ), kombinace CEN3 a ARSl1 nebo jiných prostředků k zajištění replikace, jako jsou sekvence, které vedou k začlenění příslušného fragmentu do genomu hostitelské buňky. Řídicí sekvence pro kvasnicové vektor?/ jsou v oboru známé a zahrnují promotory pro syntézu glykolitických enzymů (Hess a kol. (1968) J.Adv.Enzyme Reg , str. 149; Holland a.kol. (1978) Biochemistry 17, str. 4900), včetně promotoru pro 3 fosfoglycerátovou kinázu (Hitzeman (180) J.Biol.Chem. 2 5 5, str. 2073). Začleněny mohou být i terminátory, jako například terminátory odvozené od enolazového genu (Holland (1981) J. Biol. Chem. 256, str. 1385). Obzvlášť vhodnými řídicími systémy jsou systémy, které obsahují promotor glyceraldehyd-3 fosfátové debydrogenázy (GAPDH) nebo řiditelný promotor alkoholové dehydrogenázy (ADH) , terminátory také odvozené od GAPDH a je-li požadována sekrece, vedoucí sekvence z kvasnicového a-faktoru. Kromě toho oblast řídící transkripci a oblast iniciující transkripci jež jsou funkčně spojeny, mohou být takové, že přirozeně, nesouvisejí s organismem d i voké ho typ u. Tyto systémy jsou podrobně popsán y nřihláškách vynálezů .EPO 120551, z v eř e j n ě né 3 . října 1984, EPÓ 116201, zveřejněné 22. srpna 1984 a EPO 164556, zveřejněné 18. prosince 1985.Eukaryotic hosts include yeast and mammalian T cell cultures. The most commonly used yeast hosts are Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces carlsbergensis and are suitable fungal hosts. Yeast-compatible vectors carry tags that allow the selection of successful transformants conferring prototropy to auxotropic mutants or heavy metal resistance in wild-type strains. The yeast compatible age Tor may · ooužívat 2 micron origin of replication (Broach, in, et al. (1983) Meth. Enz. 101, pp. 307), the combination of CEN3 and ARSl 1 or other means for assuring replication, such as sequences which lead to the incorporation of the relevant fragment into the genome of the host cell. The control sequences for the yeast vector? 4900), including the 3 phosphoglycerate kinase promoter (Hitzeman (180) J. Biol. Chem. 2 5 5, p. 2073). Terminators may also be included, such as terminators derived from the enolase gene (Holland (1981) J. Biol. Chem. 256, p. 1385). Particularly suitable control systems are those which contain a glyceraldehyde-3 phosphate debyrogenase (GAPDH) promoter or a controllable alcohol dehydrogenase (ADH) promoter, terminators also derived from GAPDH and, if secretion is desired, a yeast α-factor leader sequence. In addition, the transcription control region and the transcription initiation region that are operably linked may be such that, naturally, they are not related to a wild-type organism. These systems are described in detail in EPO 120551, published 3. October 1984, EPO 116201, published August 22, 1984, and EPO 164556, published December 18, 1985.

Rady savčích buněk, vhodných jako hostitelé, pro expresi jsou zahrnují mnoho zvěčněných buněčných n ý ch od American Type C u1111 r e Collection (A TC0), včetně Hela b uněk, buněk z vaječníků čínských křečků (CHO), buněk z ledvin mladých křečků (BHK) a mnoho dalších řad savčích buněk. Vhodné nrcv oboru známé a zahrnují virové 40 (SV40) (Flers (1978) Mature motory pro savčí buňky jsou také promotory, jako od Simian Virus 273,str. 113) Rous sarcomas virus (RSV), adenovírus (ADV) a hovězí nádorový virus (bovine papilloma virus -BPV). Savčí.buňky mohou také vyžadovat termínátorové sekvence a sekvence póly A; mohou' též být zahrnuty usnadňující sekvence zvyšující expresi a mohou být též žádoucí sekvence, které způsobují zesílení genu. Tyto sekvence jsou v oboru známé.The range of mammalian cells suitable for expression includes many immortalized cell types from the American Type C u1111 re Collection (A TC0), including Hela cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, young hamster kidney cells ( BHK) and many other mammalian cell lines. Suitable nrcv are known in the art and include viral 40 (SV40) (Flers (1978) Mature mammalian cell motors are also promoters such as from Simian Virus 273, p. 113) Rous sarcomas virus (RSV), adenovirus (ADV) and bovine tumor virus (bovine papilloma virus -BPV). Mammalian cells may also require terminator sequences and pole A sequences; Facilitating expression enhancing sequences may also be included, and sequences that cause gene amplification may also be desirable. These sequences are known in the art.

Vektory vhodné k replikaci savčích buněk jsou v oboru známé a mohou zahrnovat virální repl ikony, nebo sekvencp zaručující integraci příslušných sekvencí kódujících epitopy NANBV do hostitelského genomu,Vectors suitable for mammalian cell replication are known in the art and may include a viral replica of an icon, or a sequence ensuring the integration of appropriate sequences encoding NANBV epitopes into the host genome.

Vektor, kterého se používá k expresi cizích DNA, a kterého může být použito k přípravě v a k c i n y . j e V a c c i n i a virus. V tomto případě je heterologní DNA začleněna do Vaccinia genomu. Technika začleňování cizí DNA do genomu vaccinia viru je v oboru známa a používá například homologové rekombinace. Heterologní DNA se obecně začleňuje do genu, který je svou povahou zbytný, například thymidin kinázový gen (tk), který také zajišťuje selektovatelnou značku. Plasmidové vektory, které značnou měrou usnadňují konstrukci rekombinantních virů, jsou popsány v literatuře (viz například Mackett a kol., (1984) J.Virol. 49, str. 857; Chakrabarti 'a kol. , ( 1985 ) Mol·.' Cell'. Biol. 5, str'. 3403; Moss (1987 v knize Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (nakladatelé Miller a Calos, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harhor, N.Y.), str.10). K expresi HCV polypeptidů pak dochází v buňkách nebo v jedincích, kteří byli imunizováni živým rekombinantním virem vakciny.A vector which is used to express foreign DNA and which can be used to prepare v a k c i n y. j e V a c c i n i a virus. In this case, the heterologous DNA is integrated into the Vaccinia genome. The technique of incorporating foreign DNA into the vaccinia virus genome is known in the art and uses, for example, homologous recombination. Heterologous DNA is generally incorporated into a gene that is by nature redundant, such as the thymidine kinase (tk) gene, which also provides a selectable label. Plasmid vectors that greatly facilitate the construction of recombinant viruses are described in the literature (see, e.g., Mackett et al., (1984) J. Virol. 49, p. 857; Chakrabarti et al., (1985) Mol. Cell). Biol. 5, p. 3403; Moss (1987 in Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harhor, NY), p. 10). occurs in cells or in individuals who have been immunized with live recombinant vaccine virus.

Segment HCV CDNA kódující požadovanou sekvenci se začlení do Vaccinia vektoru. Sekvence, kódující polypeptid, může být pripoak t i je na k vůdčí sekvenci. Vůdci sekvencí muže- být sekvence pro vátor ' tkáňového pLasrn i nogenu (TPA) něho z jiného zdroje, například sekvence pro (3-glohin. Het.erologový po 1 y nuk 1 ec t i d může bytThe HCV CDNA segment encoding the desired sequence is inserted into the Vaccinia vector. The sequence encoding the polypeptide may be attached to the leader sequence. The sequence leader may be a sequence for a tissue plasminogen gene (TPA) from another source, for example a sequence for β-glohin. The heterologous sequence may be

-·,.......zac-le-ně-n,.-d.o...,v..a.c.cú n í.a . v.e.kioru, .k.t.erý.. ..j.e _ver_z_í..p.SCl 1.., _d_íky_ př í sad ě sekvence spojovníku (polylínker), která obsahuje klonovací místo.- ·, ....... zac-le-ň-n, .- d.o ..., v..a.c.cú n í.a. v.e.kioru, .k.t.erý .. ..j.e _ver_z_í..p.SCl 1 .., _d____ad_ad set a linker sequence (polylinker) which contains a cloning site.

Aby ..se zjistilo, zda je provedena exprese HCV polypeptidů — —•-^z^^ďe-i-n-i-a- '.v^:k:t-n~-r-n::--^m.ob..O3!-a:b:ý.t—bjuňkv-BSC-l-—-í-n-f-e-kt-o-v-án-y-.-S—r-e.k.o.mb.i nantním vektorem a pěstovány na sklíčku mikroskopu za podmínek dovolujících expresí. Buňky lze pak 'fixovat acetonem a provedou se zkoušky imunofluorescence pomocí séra, o němž je známo, že obsahuje anti-HCV protilátky vůči polypeptidům zakódovaným v oblasti genomu HCV, z něhož byl segment HCV v rekombinantηím expresním v ektor u odv o z sn.In order to determine whether HCV polypeptides are expressed from the expression of HCV polypeptides: b: ω.t-bjuňkv-BSC-1 -—- i-nfe-kt-ov-in-y -.- S-re.comb.incombinant vector and grown on a microscope slide under conditions allowing expression. The cells can then be fixed with acetone and immunofluorescence assays performed with serum known to contain anti-HCV antibodies to polypeptides encoded in the region of the HCV genome from which the HCV segment was recombinantly expressed in the vector.

Mezi jiné systémy eukaryotických nebo virových genomů patři hmyzí buňky.a vektory vhodné k použití v těchto buňkách. Tyto systémy jsou v oboru známé a zahrnují nanříklad hmyzí expresní transferové vektory, odvozené od baculoviru Autography californica nukleárního polyherového viru (A c Ν Ρ V),.kterým je na pomocníku závislý virový expresní vektor. Expresní vektory, odvozené od t.o 12 hoto .systému, používají obvykle silného genového promotoru vírového po lyhedrinu k řízení exprese heterologových genů. Běžně ne j častěji používaným transferovým vektorem k začleňování cizích genů do AcNPV je p,Ac373. Mnohé jiné, odborníkům známé vektory byly také určeny ke zlepšení exprese. Patří mezi ně například pVL985 (který mění počáteční po lyhedri nový kodon z ATC na ATT, a který zavádí pár bází SamHI klonovacího místa 32 po proudu od ATT; (viz Luckow a Summers (1989) Virology 17, str. 31). Dobrá exprese nespojených cizích proteinů vyžaduje obvykle cizí geny, které mají ideálně krátkou vůdčí sekvenci obsahující vhodné signály k iniciaci translace předcházející počáteční signál ATC. Plasmid obsahuje také polyhedrin pólyaděnylovy signál a ampicilinu res istentní (amp) gen a počátek replikace pro selekci a šíření v E.colv.Other systems of eukaryotic or viral genomes include insect cells and vectors suitable for use in such cells. These systems are known in the art and include, for example, insect expression transfer vectors derived from the baculovirus Autography californica nuclear polyher virus (A c Ν Ρ V), which is a helper-dependent viral expression vector. Expression vectors, derived from the 12th hotosystem, typically use a strong viral post-lyhedrin gene promoter to control the expression of heterologous genes. A commonly not commonly used transfer vector for the incorporation of foreign genes into AcNPV is p, Ac373. Many other vectors known to those skilled in the art have also been designed to improve expression. These include, for example, pVL985 (which changes the initial lyhedron new codon from ATC to ATT, and which introduces the base pair of SamHI cloning site 32 downstream of ATT; see Luckow and Summers (1989) Virology 17, p. 31). unrelated foreign proteins usually requires foreign genes that ideally have a short leader sequence containing appropriate signals to initiate translation preceding the initial ATC signal.The plasmid also contains a polyhedrin polyadenyla signal and an ampicillin resistance (amp) gene and an origin of replication for selection and propagation in E. coli .

Způsoby zavádění heterologního DNA do požadovaného místa v baculoviru jsou v oboru známé. (Viz Summer a Smith, Texas A g r i -Methods for introducing heterologous DNA into a desired site in a baculovirus are known in the art. (See Summer and Smith, Texas A g r i -

c u 1 a r c u 1 a r Experiment Station Experiment Station Bulletin Bulletin číslo number 1 5 5 5 : 1 5 5 5: ; J u ; J u a kol. (1987); et al. (1987); Smith Smith a kol . ( 1 9 83 ) Mo.l . et al. (1 9 83) Mo.l. & Cell & Cell B i o 1 . B and 1. 3, 3, str . p. 2156 až 2165; 2156 to 2165; a. Lucl a. Lucl íow a Sum.m.e.rs (198.9). íow and Sum.m.e.rs (198.9). V i. r o. 1 o.gy V i. R o. 1 o.gy .1.7,.._ .1.7, .._ ,s tr.... , s tr .... 31).. 31) .. Např-íkLad. mů.že. For example. mu.ze.

být začlenění do genu takového, jakým- je polyhedri nový gen, ho filologovou rekombinací; začlenění může být také do restrikčního enzymového místa zaměřeného do požadovaného bacuiovírového genu. Začleněnými sekvencemi mohou být sekvence, které kódují všechny nebo odchylné segmenty polyproteinu nebo jiných orfs, které kódují virové polypeptidy.be incorporated into a gene such as the polyhedrin new gene by philological recombination; the incorporation may also be into a restriction enzyme site directed to the desired baculovirus gene. Incorporated sequences can be sequences that encode all or aberrant segments of a polyprotein or other orfs that encode viral polypeptides.

'Signály pro posttransiačni modifikace jako je signál peptidového Štěpení, proteolytického štěpení a fosforylace, se jeví .jako rozeznatelné hmyzími buňkami. Signály potřebné k sekreci a nukleární akumulaci se .jeví rovněž jako konzervované mezi buňkami bezobratlých a obratlovců. Příklady signálních sekvencí buněk obratlovců, .jež jsou účinné v buňkách bezobratlých, .jsou v oboru známé, například u lidského ‘inter1eukin-2 signálu (IL-2), což je signál pro transport z buňky, je rozeznán a čistě odstraněn ve hmyzích buňkách.Signals for post-translational modifications, such as peptide cleavage, proteolytic cleavage, and phosphorylation, appear to be recognizable by insect cells. The signals required for secretion and nuclear accumulation also appear to be conserved among invertebrate and vertebrate cells. Examples of vertebrate cell signal sequences that are effective in invertebrate cells are known in the art, for example, the human interleukin-2 signal (IL-2), a signal for transport from the cell, is recognized and neatly cleared in insect cells. .

Struktura imunologických testůStructure of immunological tests

HGV ant i geny El a E2 podle tohoto vynálezu mohou být uplatněny v obecně .jakékoli struktuře, která používá- známých antigenů k detekci protilátek. Ovšem struktury, které deformují sledovaný konformační epitop HCV je třeba vyloučit nebo modifikovat. Společným znakem všech těchto testů je, že se uvádí do styku antigen s tělesnou složkou, u níž je podezření, že obsahuje protilátky HCV za podmínek, které umožní vazbu antigenu na kteroukoli takovou protilátku přítomnou've složce.‘Takovými podmínkami jsou typicky fyziologická teplota, hodnota pH a iontová pevnost, používající nadbytku antigenu. Inkubaci antigenu se vzorkem následuje detekce imunitních komplexů daných antigenem.The HGV ant1 and E2 genes of the present invention can be used in generally any structure that uses known antigens to detect antibodies. However, structures that deform the HCV conformational epitope of interest need to be eliminated or modified. A common feature of all of these assays is that the antigen is contacted with a body component suspected of containing HCV antibodies under conditions that allow the antigen to bind to any such antibody present in the component. Such conditions are typically physiological temperature. pH and ionic strength using an excess of antigen. Incubation of the antigen with the sample is followed by detection of the immune complexes given by the antigen.

Plánování imunologických testů podléhá do značné míry změnám a v oboru jsou známé mnohé struktury. Protokoly mohou například zahrnovat pevné nosiče nebo imunoprecipitaci. Většina testů používá značkovaných protilátek nebo polypeptidů; značení může být například pomocí molekul enzymatických,' f Iii orescencnícn. c h e iii i luminiscenčních, radioaktivních nebo barevnýchTesty , které zesilují signály z imunitního komplexu jsou také známy; jejích přík......la:d.em. .j.sou. -tes.t.y... p.o.už.í v.a .j í.c í ,bi.o.t.in____a .ayidin., a... enz_y_my_ značené a enzymy., zprostředkované imunologické testy, jako jsou testy ELISA.The planning of immunoassays is subject to considerable change, and many structures are known in the art. For example, protocols may include solid supports or immunoprecipitation. Most assays use labeled antibodies or polypeptides; the labeling can be, for example, by means of enzymatic molecules, which are fluorescent. che iii i luminescent, radioactive or color Assays that amplify signals from the immune complex are also known; its examples ...... la : d.em. .j.sou. These assays use enzymes, labeled enzymes, and enzyme-labeled enzymes, mediated by immunoassays such as ELISAs.

Imunologické testy mohou mít bez omezení heterogenní nebo :^.-jz:H:G'-m:o:g-’S-n-n-í-· — sLŤ.'-r..irk-.t..n;r-n-zaT-.-..--m:ph:oji-_h:ý:t-:. s-t-a-nda-rd-ní-hQ--n-ej3_0—koňku r-eč-n-íh.Qtvpu. U heterogenních struktur je polypeptid typicky vázán na pevnou matrici nebo nosič k usnadněná separace od polypeptidů po inkubaci. Příklady pevných nosičů, kterých lze použít, je nitroceluloza (například v podobě membránových nebo mikrotitračních důlků), polyvinylchlorid (například u listů nebo mikrotitračních důlků) polystyrénový-latex (například u perlových nebo mikrotitračních destiček, oolyvinylidínflnorid - 2námý jako Imm union™), di azotizovaný papír, nylonové membrány, aktivované perly a perly Proteinu A. V případě heterogenních struktur může být například použito Dynatech Immunlonu™ 1 nebo Immunlonu™ 2, mikrotitračních . destiček nebo polystyrénových perel o průměru 6,35 mm (Precision Plastic 3all).Pevný nosič obsahující antigenová polypep14 tidy se typicky omývá po oddělení od zkušebního vzorku a před detekcí vázaných protilátek. -Jak standardní, tak konkurenční struktury jsou v oboru známé.Immunological assays can be, but are not limited to, heterogeneous or: H-G'-m : o : g-'Snn-í- · - sLŤ .'- r..irk-.t..n; rn-zaT -.-..-- m: ph: oji-_h: ý: t- :. sta-nda-rd-í-hQ - n-ej3_0 — koňku r-eč-n-íh.Qtvpu. In heterogeneous structures, the polypeptide is typically bound to a solid matrix or carrier to facilitate separation from the polypeptides after incubation. Examples of solid supports that can be used are nitrocellulose (e.g. in the form of membrane or microtiter wells), polyvinyl chloride (e.g. in leaves or microtiter wells) polystyrene-latex (e.g. in bead or microtiter plates, oolyvinylidinium fluoride - 2 known as Imm union®), di azotized paper, nylon membranes, activated beads and Protein A beads. In the case of heterogeneous structures, for example, Dynatech Immunlon ™ 1 or Immunlon ™ 2, microtiter, can be used. plates or polystyrene beads with a diameter of 6.35 mm (Precision Plastic 3all). The solid support containing the antigenic polypeptide is typically washed after separation from the test sample and before detection of bound antibodies. Both standard and competitive structures are known in the art.

U homogenních struktur je zkušební vzorek inkubován s kombinací antigenů v roztoku. Může to být například za podmínek, které vyloučí veškeré komplexy antigen-protilátka, které se vytvoří. Jak standardní, tak konkurenční struktury těchto testů jsou v oboru známé.For homogeneous structures, the test sample is incubated with a combination of antigens in solution. This may be, for example, under conditions that exclude any antigen-antibody complexes that form. Both standard and competitive structures of these assays are known in the art.

lidské) protilátky, budou vázat vlivem tvořeníhuman) antibodies will bind by formation

U standardní struktury se přímo zaznamenává množství protilátek HCV v komplexu antigen-protilátka. Může se to provádět tak, že se zjišťuje, zda se značené anti-xenotické (například anti.teré rozeznají epitop na protilátkách HCV komplexu..U konkurenční struktury se na množství protilátek HCV usuzuje ze sledování konkurenčního účinku na vazbu známého množství značené protilátky (nebo jiného konkurujícího ligandů) v komplexu.For the standard structure, the amount of HCV antibodies in the antigen-antibody complex is directly recorded. This can be done by determining whether labeled anti-xenotic agents (e.g., those that recognize an epitope on HCV complex antibodies. In a competitive structure, the amount of HCV antibodies is judged by monitoring the competitive effect on binding a known amount of labeled antibody (or another competing ligand) in the complex.

Vytvářené komplexy obsahující anti-HCV protilátky (nebo y_případě konkurenčních testů,_ množství konkurující protilátky) se zjišťují radou známých technik, závisejících'na struktuře. Například detekci neznačených protilátek HCV v komplexu lze provádět pomocí konjunkce antίxenotických íg v komplexu se značkou (například s enzymovým značením).The complexes formed containing anti-HCV antibodies (or in the case of competing assays, the amount of competing antibody) are determined by a number of known techniques, depending on the structure. For example, detection of unlabeled HCV antibodies in a complex can be accomplished by conjunction of antigenotic γ in a complex with a label (e.g., an enzyme label).

U testu imunoprecipitaČní nebo agglutinační struktury vytváří reakce mezi antigeny HCV a protilátkami síťoví, které precipituje z roztoku nebo suspense a tvoří viditelný povlak nebo film preciptátu. Není-li přítomná žádná protilátka HCV, nevytvoří se žádný viditelný přec i pí tát.In an immunoprecipitation or agglutination assay, reactions between HCV antigens and antibodies form a network that precipitates from solution or suspension to form a visible coating or film of the preciptate. If no HCV antibody is present, no visible overflow is formed.

Běžně existují tři specifické typy testů část i cové agglutinace (ΡΛ). Těchto testů se používá k detekcei protilátek na různých ant, i genech jsou-li povlečeny na nosiči.There are commonly three specific types of partial agglutination tests (ΡΛ). These assays are used to detect antibodies to various antigens, even when coated on a support.

vých hemagg1utinačních testů pnuživajícic'haemagglutination tests

Jedním typem takoČerveních krvinek (RBC), které jsou senz ibi 1 izovány pasivní adscrpcí antigenu (nebo protilátky) na RBC. Přísada specifických popřípadě přítomných antimonových protilátek v tělesné složce, způsobí, že se RBC povlečou vyčištěným antigenem k agglutinátu.One type of such red blood cells (RBCs) that are sensitized by passive adsorption of antigen (or antibody) to the RBCs. The addition of specific antimony antibodies, optionally present in the body component, causes the RBCs to be coated with the purified antigen to agglutinate.

Aby se vyloučily potenciální nespecifické reakce v hemagglutinacním testu, musí se použít dvou umělých nosičů místo RBC v PA. Z r.ich jsou nejběžnější latexové částice. Lze však také použít želatinových částic. Testy používající kteréhokoli z těchto nosičů jsou založeny ňa pasivní agglutinaci částic povlečených vyčištěnými antigeny.To rule out potential non-specific reactions in the haemagglutination test, two artificial carriers must be used instead of RBCs in PA. Of these, latex particles are the most common. However, gelatin particles can also be used. Assays using any of these carriers are based on passive agglutination of particles coated with purified antigens.

Antigeny HCV El a E2 konformačních epitopů se typicky balí do souprav používaných v těchto imunitních,testech. Souprava obsahuje normálně' v oddělených.obalech nativní antigen HCV, kontrolní protilátkové formulace cenou protilátku, vyžaduje-li (například enzymový substrát), (pozitivní a/nebo negativní), znají struktura a signální reagencie jestliže značení nevytváří signál přímo. Nativní antigen HCV může .být vázán už na pevnou matricí nebo odděleně s reagenciemi pro vázání do matrice. Součástí soupravy jsou' obvykle instrukce (například písemně, na pásku a CDROM) k provádění testu. ♦HCV E1 and E2 conformational epitope antigens are typically packaged into kits used in these immune assays. The kit normally contains native HCV antigen in separate packages, control antibody formulations cost the antibody if required (e.g., enzyme substrate), (positive and / or negative), know the structure, and signal reagents if the label does not generate a signal directly. The native HCV antigen can be bound to the solid matrix or separately with the matrix binding reagents. The kit usually includes instructions (e.g., written, tape, and CDROM) for performing the test. ♦

Imunologické testy používající nativního antigenů HCV so hodí ke' skrínování krve k přípravě zásoby, z níž potenciální infekční HCV jsou vyloučeny. Způsob přípravy krevní z-ásoby sestává z. -nás 1 e.d.u ..j..íc.í ch ..kroků,... .Z reagován í.. t §1 ní _ .součás t_i , s výhodou krve nebo krevní složky z idividuální dárcovské krve s nativním antigen. em HCV Ε1 nebo nativním antigenem HCV E2 k umožnění ímunolo--g-řc^k-é:“-p^-3k:c«= -·β.·γ·οt-i--1-á-t-k-am-i- -HC-V- . - -a,._a.ntá.g.e.n.em_H CV_i.. .Immunological assays using native HCV antigens are useful for screening blood to prepare a pool from which potentially infectious HCV is excluded. The process for the preparation of a blood supply consists of a plurality of steps, for reacting a component, preferably blood or a blood component. from individual donor blood with native antigen. HCV Ε1 or native HCV E2 antigen to allow immunoglobulin-g-řc ^ k-é : “-p ^ -3k: c« = - · β. · γ · οt-i - 1-á-tk-am -i- -HC-V-. - -a, ._ a.ntá.genem_H CV_i ...

Zjištění, zda se reakcí vytvořily komplexy anti-HCV protilátky a.HCV antigenů .jsou výsledkem reakce. Krev přidaná do krevní zát . Λ-· k. , » if. II Λ -fc ' ,.ΛΙ *,(-.[·»,. - , T, .* fc- + i soby pochází od dárců, kteří nevykazují protilátky vůči nativním antigenúm HCV El nebo E2.Determination of whether the reaction has formed complexes of anti-HCV antibody and HCV antigens results from the reaction. Blood added to the bloodstream. Λ- · k., »If. II Λ -fc ', .ΛΙ *, (-. [· »,. -, T,. * Fc- + i reindeer are from donors who do not show antibodies to native HCV E1 or E2 antigens.

V případech pozitivní reaktivity vůči antigenů HCV je výhodné opakovat imunologický test k .vyloučení možnosti falešných .pozitiv. Na oři klad .při skrínování krve ve velkém měřítku k výrobě krevních derivátů (například krve transfuzím, plasmy, faktoruIn cases of positive reactivity to HCV antigens, it is advantageous to repeat the immunoassay to rule out the possibility of false positives. In addition, when screening blood on a large scale for the production of blood derivatives (e.g. blood by transfusion, plasma, factor

Vlil a i mmunog 1 obu 1. i nu ) .jsou skříňové testy typicky strukturovány ke zvýšení citlivosti (k zajištění, že neprojde Žádná kontaminová krev) na úkor spec ifici ty ; to je zvýší se míra falešných pozitiv. Typicky je tudíž pouze upustit od dalšího testování těch dárců, kteří nebo ve víceBox tests are typically structured to increase sensitivity (to ensure that no contaminating blood passes) at the expense of specificity; This is an increase in the rate of false positives. Thus, it is typically only to refrain from further testing of those donors who or more

Záměrem .jsou opakovaně reaktivní, to je pozitivní v jednom imunologických testech darovaného vzorku.They are intended to be repeatedly reactive, that is, positive in one of the immunoassays of the donated sample.

následujících příkladů je vynález ilustrovat, bez jeho jakéhokoli omezení.The following examples illustrate the invention without limiting it in any way.

Př í klady proved_e n i__yvn á le z 11Examples of embodiments of 11

Příklad 1Example 1

Konstrukce PSC59 PólyConstruction of PSC59 Poles

Sekvence HCV, použitá ke konstrukcí, se izoluje z plasmidu p C 5 P -1 jako fragment Stul část.ečně/BglII. Tento fragment se prostírá od prvního methi on i nového polyproteinu HCV-1 ke kyselině asparagové v pozici 966.Zahrnutými doménami jsou nukleokapsid, C, obě domnělé obaly glykoproteinů, El a E2 a zkomolený tvar NS2. Kromě toho obsahuje fragment také asi 60 bp odpovídajících části 5'-nepřemístěné oblasti genomu HCV.The HCV sequence used for the construction was isolated from plasmid p C 5 P -1 as a Stul fragment partially / BglII. This fragment extends from the first methionine HCV-1 polyprotein to aspartic acid at position 966. The domains involved are the nucleocapsid, C, both putative glycoprotein envelopes, E1 and E2, and the distorted NS2 form. In addition, the fragment also contains about 60 bp corresponding to portions of the 5'-untranslated region of the HCV genome.

Fragment se zpracuje Klenowovou polymerázou k vytvoření slepých konců a pak se klonu,je do místa Stul vakcinového vektoru, PSC59 (získaného od Dr.B. Mossa z National Institutes of Health, Bethesda , Md), Vektor je znázorněn na obr, 2, V důsledku ligace do polylinkrové sekvence vektoru, obsahuje C'-zakončení oblasti NS2 přídavnou sekvenci Pro-Tyr.The fragment was treated with Klenow polymerase to form blind ends and then cloned into the Stul site of the vaccine vector, PSC59 (obtained from Dr. B. Moss of the National Institutes of Health, Bethesda, MD). The vector is shown in Figure 2, V due to ligation into the polylinker sequence of the vector, the C'-terminus of the NS2 region contains an additional Pro-Tyr sequence.

Příklad 2Example 2

Příprava zásob Vaccinia Virus zakódováním fragmentu polyproteinu HCV zahrnujícího El a E2Preparation of Vaccinia Virus stocks by encoding an HCV polyprotein fragment comprising E1 and E2

Skrínování pro rekombinantní Vaccinia virus se provádí v podstatě .jak .je popsáno Mackettem a kol. v knize DNA Cloning svazek II (vydavatel D.M, Glover, IRL Press, Oxford, England, 1985, str. 191 až 211). Specifičtěji se infikuje divokým typem Vaccinia viru (WR-kmen) konfluentní monovrstva (6 cm miska) ledvinových buněk africké zelené opice, BSC40, při několikanásobné infekci (MOI) 0,05. Po dvouhodinové inkubaci při teplotě 37 *C se buňky trans17' fektu.jí 25 μ* PSAC59 póly DNA metodou fosfátu vápenatého. Po čtyřech hodinách inkubace se medium zamění za normální a buňky se inkubu.jí dalších 48 hodin při 37 ’C. Buňky se získají seškrabáním z misky a virus se uvolní 3 cykly zmrazování-roztávání a uvolněný virus v buněčném 1 vsátu se uskladní při teplotě -80 ’C.Screening for recombinant Vaccinia virus is performed essentially as described by Mackett et al. in DNA Cloning Volume II (published by D.M., Glover, IRL Press, Oxford, England, 1985, pp. 191-211). More specifically, the wild-type Vaccinia virus (WR-strain) is infected with a confluent monolayer (6 cm dish) of African green monkey kidney cells, BSC40, at a multiple infection (MOI) of 0.05. After incubation for two hours at 37 DEG C., the cells were transfected with 25 .mu.l of PSAC59 poles of DNA by the calcium phosphate method. After four hours of incubation, the medium is changed to normal and the cells are incubated for another 48 hours at 37 ° C. Cells are harvested by scraping from the dish and the virus is released for 3 freeze-thaw cycles and the released virus is stored in cell well at -80 ° C.

Ke skrínování. rekombinantního víru se infikuje kontinentní monovrstva lidských buněk 143 TK dvě hodiny buněčným·lysátem v 10-násobných sériových 2ředeních. Po vyjmutí inokula se přidá 1% agarosa v sérovém médiu obsahujícím 25 pg/ml 5-bromdeOxyuTídinu a buňky se inkubu.jí 72 hodin pří teplotě 37 *C. Destičky se' z vidi tel. ní. povlečením buněčné vrstvy 1% aga rosy plus 0,01^ neutrální červeně a inkubováním buněk pres noc při teplotě 37 ’C. Ase pak opatrně sejme a buněčná vrstva se odssa.je g a r o z o vy po v nitrocelulozovým matricovým filtrem (Schleir a Schuell, BA85, 0,4 5 μ-m). Získá se replika matricového filtru a označí se hybridizační sondou sekvence HCV značenou 32P. Pozitivní destičky se izolují od matricového flitru, umístí se 'do 0/5 ml media prostého séra a ρ r o zv uč í se dvakrát po 30 sekundách. Proces skrínování se opakuje dvakrát k vyčištění viru.For screening. of the recombinant virus, the continental monolayer of human TK 143 cells is infected with cell lysate for two hours in 10-fold serial dilutions. After removing the inoculum, 1% agarose in serum medium containing 25 pg / ml 5-bromodeoxyutidine was added and the cells were incubated at 37 ° C for 72 hours. The plates are visible from the phone. by coating the cell layer with 1% aga dew plus 0.01% neutral red and incubating the cells overnight at 37 ° C. The Ase is then carefully removed and the cell layer is aspirated through a nitrocellulose matrix filter (Schleir and Schuell, BA85, 0.45 μ-m). A replica of the matrix filter was obtained and labeled with a 32 P HCV sequence hybridization probe. Positive plates were isolated from the matrix sequin, placed in 0/5 ml of serum-free medium, and plated twice for 30 seconds. The screening process is repeated twice to clear the virus.

.........K . ro.z.š.í ř.e η í ...r..e.k,omb i na.n tn í ho Vaccinia _v iru se infikuje 10 misek (150 cm2) buněk BSC40 zásobním virem při Μ0Ι 0,5. Infekce se · · ' ,· provádí dvě hodiny při teplotě 37 ’C a virová zásoba se nahradí ič:e.r-s-t..v..ý;m·- an;ed:fcejn _P-o.·. .-7-2:. -h od-i-ná-c-h· --se-. b-u ň k-y— s-h-rom ážd.í-,--S-u.s.p.e.n.d.u .j.í. _s.e v 10 Mm Tris/kyse1 i na chlorovodíková, hodnota pH 9,0 a homogeniz u j í se ve Wheatonově jemném tkáňovém drtiči. Úlomky buněk ve i zolu.jí odstředěním, supernatanty se trypsini zuj i a prozvučí a a'1í k v o t y virové suspense se uskladní při teplotě -80 ‘C.......... K. 10 dishes (150 cm 2 ) of BSC40 cells are infected with the stock virus at Μ0Ι 0.5 in Vaccinia _v iru. The infection is carried out for two hours at 37 DEG C. and the viral stock is replaced by the same. .-7-2 :. -h od-i-ná-ch · --se-. cells— sh-rom ážd.í -, - Su.spendu .j.í. 10 .mu.m of Tris / acid to hydrochloric acid, pH 9.0 and homogenized in a Wheaton fine tissue grinder. The cell debris was collected by centrifugation, the supernatants were trypsinized, and the quota of the virus suspension was stored at -80 ° C.

Příklad 3Example 3

Výroba antigenů E1/E2 'Jeden litr buněk Hela S3 (spinr.er cells) se pěstuje v otáčecí baňce (spinner flask) do hustoty 10ů buněk na ml. Buňky se infikují rekombinantním virem Vaccinia kódujícím póly proteinový fragment HCV pomocí MCI 1,0, inkubují se přes noc, shromáždí a u18 skladní v podobě buněčných pelet při teplotě -80 ‘C.Production of antigens E1 / E2 'One liter of Hela S3 (spinr.er) cells grown in a rotating flask (Spinner Flask) to a density of 10 cells per ml. Cells were infected with recombinant Vaccinia virus encoding the polys of the HCV protein fragment using MCI 1.0, incubated overnight, harvested, and stored in cell pellets at -80 ° C.

Expresní' produkt E1/E2 se vyčisti lyzogenováním buněk v hypotonickém pufru, s následnou extrakcí neionického detergentu obsaženého v pufru. Buněčný extrakt se půdrobí chromatografii na sloupci lectin (ONA) agarosa. Žádané proteiny se eluují ze sloupce methyl-a-D-mannopyranosídem (Sigma C o r p'. ) . El nova né frakce se monitorují na El a E2 Western blots pomocí specifického antiséra vůči El nebo E2. Frakce obsahující antigeny se shromáždí a zkončentrují se na sloupci S-Sepharose (Pharmacia). Čistota konečného produktu je přibližně 70%;The E1 / E2 expression product is purified by lysogenizing the cells in hypotonic buffer, followed by extraction of the nonionic detergent contained in the buffer. The cell extract was subjected to lectin (ONA) agarose column chromatography. The desired proteins are eluted from the column with methyl-α-D-mannopyranoside (Sigma C o r p '.). The eluted fractions are monitored for E1 and E2 Western blots with specific antiserum to E1 or E2. Fractions containing antigens were pooled and concentrated on an S-Sepharose column (Pharmacia). The purity of the final product is approximately 70%;

Příklad 4Example 4

Použití imunitních testů EliE2Use of EliE2 immune tests

Pacienti Vzorky séra. shromážděné od nahodile vyhraných placených dárců krvé.' z.východní, západní, středozápadní a jihozápadní části. Spojených států, se získají od lín i globe Research Corporation {Řeše d a, ICA), Sérové vzorky, poskytované H.Tongem (Huntington Memoriál K o s p i t a 1 v Pasademě, California), transfuzních pacientů v souvislosti s skupiny 39 pacientů uživatelů drogy byly získány od skupiny 38 chronickou ΝΛΝΒΗ a od jiné I V s chronickou N A Ν Β H .Patients Serum samples. collected from randomly won paid blood donors. ' z.eastern, western, midwestern and southwestern parts. United States, are obtained from both the Lines and Globe Research Corporation (Resolutions, ICA). Serum samples provided by H. Tong (Huntington Memorial K ospita 1 in Pasadema, California), transfusion patients related to a group of 39 drug users were obtained from group 38 chronic ΝΛΝΒΗ and from another I V with chronic NA Ν Β H.

V těchto 77 pacientů nebyla .jiné onemocnění jater, bylí anti-HAV a anti-Hbsag nereaktivní a protilátky anti-nuklearní protilátky (ANA) byly u'nich normální. Od. H·. Alter ( the National institut es of Health, Bethesda,. Maryland) Ca od Serologicals Incorporation v Clarkston, Georgia se získají. tři ssrokonversní transfusní panely související v HC V. Vzorky akutní rozkladné HC V poskytl ústav Max von Petlenkofer-Institute, University v Mnichově, v Německu. 19 případů akutní rozkladné NANBH bylo diagnostikováno·na základě jaherního drobnohledného vyšetření a na základě dlouhodobého studování (2 až 11 let) úrovní normální amino trans f erá zy {ALT).In these 77 patients, there was no other liver disease, anti-HAV and anti-Hbsag were non-reactive, and anti-nuclear antibodies (ANA) were normal. From. H ·. Alter (the National Institute of Health, Bethesda, Maryland) Ca of Serologicals Incorporation in Clarkston, Georgia are obtained. three seroconversion transfusion panels related to HC V. Samples of acute degradation HC V were provided by the Max von Petlenkofer-Institute, University of Munich, Germany. 19 cases of acute degradation NANBH were diagnosed · on the basis of a lavish examination and on the basis of long-term study (2 to 11 years) of normal amino transfer levels (ALT).

Exprese a čištění rekombi na πtních antigenů HCVExpression and purification of recombination on HCV antigens

V kvasnicích S. cerevisíae se podrobí expresi antigeny C22C22 antigens are expressed in S. cerevisiae yeast

Í119aa), El (130aa),E2 (251aa) ,NS5 (942aa) a chimérický C25 (nazývaný též c200/c22)(858aa), jako C-terminálové fuze s lidskou super ox idcvcu dismutazou (SOD) způsoby popsanými prvně fíuem G. a kol., Science (1989) 244, str. 362 až 364 a Cousensem L. a kol, Gene (1987) 61 , str . 26 5 až 272, Antigen C33'C (266aa) se podrobí expresi jako interní SOD spojený pólypeptid v E.coli způsoby popsanými dříve pro syntézu 5-1-1 antigenu (viz PCT WO89/O46699, EPO Pub. č. 318216 a Hougton a kol. Science 244, str. 359 (1989). Po rozmělnění buněk a odstředění se z' buněčných pelet získají extrakcí nerozpustné SOD spojené nebo 1 % SDS a vyčistí se buď pólypeptidy použitím 5 M močoviny gelovou filtrací 'nebo kombinací iontoměničové chromá to,g rafie (Q a S-sepha'rose) a gelové filtrační chromatografie (Sephacryl).I119aa), E1 (130aa), E2 (251aa), NS5 (942aa) and chimeric C25 (also called c200 / c22) (858aa), as C-terminal fusions with human superoxid dismutase (SOD) by the methods described first by G et al., Science (1989) 244, pp. 362-364 and Cousens L. et al., Gene (1987) 61, p. 26-272, The C33'C antigen (266aa) is expressed as an internal SOD-linked polypeptide in E. coli by methods described previously for 5-1-1 antigen synthesis (see PCT WO89 / O46699, EPO Pub. No. 318216 and Hougton Science 244, 359 (1989) After cell comminution and centrifugation, insoluble SOD coupled or 1% SDS is obtained from the cell pellet by extraction and purified with either polypeptides using 5 M urea by gel filtration or a combination of ion exchange chromatography. graphics (Q and S-sepha'rose) and gel filtration chromatography (Sephacryl).

HCV nativní antigen El a E2 [nazývaný též rVV (el &. e2) ] se retikula infikovaných buněk re(rvv), které obsahují plnou délku Sť vyčistí z endoplastického kombinantního Vaccinia viru genů HCV El a E2. Čištění cróvede afinitu 1 chromátografi v, následovanou i ont oměničovou chromatografíí ze nedenat.ur i zujících podmínek. Tyto metody jsou popsány '· patentovém spise WO92/O8734.HCV native antigen E1 and E2 [also called rVV (el &. E2)], the reticulum of infected re (rvv) cells, which contain the full length of Stt, is purified from the endoplastic combined Vaccinia virus of the HCV E1 and E2 genes. Purification is indicated by affinity chromatography, followed by exchange chromatography from undenaturing conditions. These methods are described in WO92 / O8734.

Na-t-i-vní.-antigen-.H.CV E2.,. .CHO-e 2 . s e. p.ř i p.ray í y pod sta tě podle Spaeta.á .kol., Virology (199 1 ) 188, str 819 až 830. Zvláště se konstruuje savčí řada buněk CHO vytvářející antigen CH0-e2 z ρ-1-Α-ν;·Η-ΰ·'ίζ~ο-Η-η·η-Η·ι.ι.~-ι-í-c -í :s.e.k-V:e,n:C:i---HLGj.lr--l-.- -k-o d-u-i-í-c-í--·A La 3-8-3. n.a,. .G.X.U 6.1.1_»_Na-tivni.-antigen-.H.CV E2.,. .CHO-e 2. In particular, according to Spaeta et al., Virology (199 1) 188, pp. 819-830. ν; · Η-ΰ · ' ίζ ~ ο-Η-η · η-Η · ι . ι . ~ -ι-í-c -í: sek-V: e, n: C: i --- HLGj.lr - l -.- -ko dui-í-c-í-- · A La 3 -8-3. on,. .GXU 6.1.1 _ »_

Plasmid se pak transfektuje do buněk CHO k vytvoření stabilní linie e x p r e s u j í c í antigen e 2 s plnou délkou (nazývaný též e 2/n s1). Klony, vykazující vysokou expresi, se volí a expandují ve válcových lahvích za růstu v DMR./H21 s 10% dialyzovaným zárodečným telecím sérem a obvyklými doplňky plus 1,6 μΜ Methotrexatu. Supernatant kultivačního prostředí se shromáždí a použije se .k čištění antigenu ECH0-e2. Čisticí schéma zahrnuje afinitu a íontoměnlčovou chromatografíí za nedenaturujících .podmínek.The plasmid is then transfected into CHO cells to form a stable line e x transferring the full length e 2 antigen (also called e 2 / n s1). High-expressing clones are selected and expanded in cylinders in growth in DMR./H21 with 10% dialyzed fetal calf serum and the usual supplements plus 1.6 μΜ Methotrexate. The culture medium supernatant is collected and used to purify ECHO-e2 antigen. The purification scheme involves affinity and flash chromatography under non-denaturing conditions.

K rozrušení nativních domnělých konformačních epitopů e2 se připraví denaturovaný CH0-e2 přísadou DL-dithiothreitolu (DTT) na konečnou koncentraci 10 Mm, 0,2% dodecylsulfát sodný (SDS) a vaří se 5 minut při teplotě 100 *C. Všechny rekombinantní antigeny HCV sa považují ζ.ϊ alespoň z 90% čisté analysou polyakrylamidového gelu SDS a obarvením Coomassiovou modří.To disrupt native putative e2 conformational epitopes, denatured CH0-e2 was prepared by the addition of DL-dithiothreitol (DTT) to a final concentration of 10 mM, 0.2% sodium dodecyl sulfate (SDS) and boiled at 100 ° C for 5 minutes. All recombinant HCV antigens are considered to be ζ.ϊ at least 90% pure by SDS polyacrylamide gel analysis and Coomassie blue staining.

Testy .ELISATests .ELISA

Antigeny RVV(el & é?RVV antigens (el & é?

OHO-e 2 a denaturovanv CH0-e2 se zředí na optimální koncentraci ve fosfátem pufrované solance (PBS) (hodnota pH 7,4) a nanesou se na destičky Immunlon™ 1 (Dynatech, Chantily, FA).. Testy ELISA se provádějí takto: Zkušební vzorky na destičce se zředí 40-násobně v ředidle vzorků a inkubují se jednu hodinu při teplotě 37 *C a pak se promyjí promývací-m pufrem. Co každého důlku se přidá polyklonální kozí anti-humánní protilátka IgG (H + L) konjugovaná ke křenové peroxidáze (HRPO). Destičky se inkubují po dobu jedné hodinu při teplotě 37 'C a pak se promyjí 'o-feny1endiaminem 2 HC1 (OPD) a přidá se peroxid vodíku k vyvolání barvy.HRP. Výsledky se čtou pomocí destičkového čtecího zařír zení při 492/630 nm. Závěrečné hodnoty ELISA O.D. proantigen RVV (el & e2). SOD, 02 5, 022, 0330 a ns-3 jsou 0,4 plus O.D. ze·.středu negativních hodnot. Zá vě rč né hodnoty C H 0-e 2 a d e n a t u r gv a n é h o OHO-e2 jsou 0,4 O.D. plus O.D. z odpovídající negativní regulace antigenů. Závěrečná hodnota . anti-0100-3 je 0,45 O.D. plus jeho střed negativní controly O.D.OHO-e 2 and denatured CH0-e2 were diluted to the optimal concentration in phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4) and plated on Immunlon ™ 1 plates (Dynatech, Chantily, FA). ELISAs were performed as follows. : The assay samples on the plate are diluted 40-fold in the sample diluent and incubated for one hour at 37 ° C and then washed with wash buffer. Horseradish peroxidase (HRPO) conjugated goat anti-human IgG polyclonal antibody (H + L) is added to each well. The plates were incubated for one hour at 37 ° C and then washed with o-phenylenediamine 2 HCl (OPD) and hydrogen peroxide was added to induce color. The results are read using a plate reader at 492/630 nm. Final ELISA values O.D. proantigenic RVV (el & e2). SOD, 02 5, 022, 0330 and ns-3 are 0.4 plus O.D. from the center of negative values. The final values of C H 0-e 2 and d e n a t u r gv a n é h o OHO-e2 are 0.4 O.D. plus O.D. from the corresponding negative regulation of antigens. Final value. anti-0100-3 is 0.45 O.D. plus its center of negative control O.D.

Imunologické testyImmunological tests

Výsledky testů ELISA pomocí uvedených antigenů lc detekci anft-HCV protilátek v krevních složkách od skupiny amerických pacientů jsou v tabulce T.The results of ELISA tests using the indicated antigens lc detection of anft-HCV antibodies in blood components from a group of American patients are shown in Table T.

tč \O na ί*ι θ' utč \ O na ί * ι θ 'u

<1><1>

y τ»and τ »

ÍMIMM

Ϊ.Ϊ.

ta ata a

H «· tsH «· ts

OJ O n cm wiOJ O n cm wi

Ol uOl u

W*l «ΛW * l «Λ

ZOF

UΓΊ <*l υUΓΊ <* l υ

tí? oj o <*i ojyou? oj o <* i oj

C 0» oj — tí? n$ ttí? O Cn f*l — \ΰ «λ ct σ'C 0 »oj - tí? n $ ttí? O Cn f * l - \ ΰ «λ ct σ '

ĚŘĚŘ

C o\ o o — es o σ\ o n — tí?C o \ o o - es o σ \ o n - tí?

θ' — \O NO ΓΊ θ' esθ '- \ O NO ΓΊ θ' es

04 m oo es r- o ΓΊ '•ώ o o o· n — <04 m oo es r- o ΓΊ '• ώ o o o · n - <

VIVI

3>3>

s-<s- <

C aC a

'3'3

NN

Tubu1ku iTubu1ku i

OJOJ

4>4>

>>

r ·, vrt *1 wr ·, garden * 1 w

ί *ta \í £ί * ta \ í £

>L> L

CL fe*CL fe *

O CN ΓΊ -* tí?O CN ΓΊ - * tí?

Ό «Ί n c>Ό «Ί n c>

eS o o\ o m —eS o o \ o m -

OlOl

4)4)

O £About £

U oiAnd yes

4) >4)>

OJOJ

U >y oU> y o

XX

UlHive

O Ol pí — ιη ΐ£ — θ' θ' ΓΊ θ' 00 ΓΊ — v>O Ol pí - ιη ΐ £ - θ 'θ' ΓΊ θ '00 ΓΊ - v>

ijl · ‘«ta □ □ 3 y <— *3 yijl · ‘« ta □ □ 3 y <- * 3 y

•H• H

T íR « ΊΊ η θ' — <Λ ΓΊ (ΛT íR «ΊΊ η θ '- <Λ ΓΊ (Λ

ΓΊ 00 ΓΊ ιη .-íl—6?zí:ΓΊ 00 ΓΊ ιη.-Íl — 6? Sep:

«Ί ΓΊ η Οι oo«Oo ΓΊ η Οι oo

Pí iPi i

UlHive

V u>3 yV u> 3 y

m zm z

tí σ> οtí σ> ο

ΡΊ — cn ρί — m esΡΊ - cn ρί - m es

Γ Tř — ττ σ' ο η — θ'Γ Tř - ττ σ 'ο η - θ'

ΡΊ ca τ' tíΡΊ ca τ 'tí

Z ?OF ?

>N σ» o> N σ »o

y cand c

£>£>

cC

Ví £See £

<s<s

ΌΌ

Λ .CΛ .C

OO

X iX i

<<

U βIn β

tí 71 D '3 o3 . \ wtí 71 D '3 o3. \ w

£2£ 2

Z tí zOf those of

íl' τíl 'τ

Ul aUl a

>N> N

3.3.

.3.3

N vs □N vs □

>>

uat

JtlJtl

M M 3 3 y y ta the y y y y T> T> C- C- ta ta the the '[I '[AND C C 7) 7) 11 11 a and a and 0 0 y y 5 5 a and y y £ £ ? ? y y un a «ta "the y y a and y y ►ta ►ta •ta •the . Λ . Λ Ul Hive ta the

Ul '3 o3 ™4Ul '3 o3 ™ 4

r.r.

yy

ta ta the the a and w w Nta Nta y y s with ta ta the the 3 3 -ta -the y y 3 3 Nta Nta c? C? s with L L ta the 3 3 3 3 * ** * ** y y a and a and y y '3 '3 3 3 *ta *the 3. 3. ..N. ..N. _a _and ·· ta ·· ta Ν' Ν ' ':w'' : w' a and J3 J3 σ> σ> 0 0

3' . .y„3 '. .y „

-a'3-a'3

N • JS-l i -jj— ; y i o ! N ?N • JS-1 and -jj—; y i o! N?

vy > v y>

τ o y y iy nvτ o y y iy nv

- w- w

Ul □Ul □

lil·.lil ·.

E-. .,B .E-. ., B.

>>

ΦΦ

L' — jy^>L '- jy ^>

= H‘ >= H ‘>

y n 2í τy n 2í τ

1' p1 'p

>y i!> y i!

c yc y

P Z y o a ui caP Z y o a ui ca

Výsledky v tabulce I ukazují, že kvasnicemi vyprodukované obalové antigeny HCV si a «2 jsou. značně méně imunoreakt i vní naž rekombinantní antigeny vyrobená z Vacci ni a viru R.W(e 1 & e2) a v buňkách CHO, CHO-e2. ϋ každá za zkoušených skupin byla aktivita antigenů el a a?, vytvářených kvasnicemi, pouze 2/3 nabo menši než u antigenů produkovaných zvířecími buňkami. Je pozoruhodné, že kvasnicové antigeny el a e2 produkované v kvasnicových buňkách .byly čištěny za denat uráč η í c h podmínek v těchto a n t i g e n e c h existují pouze li t o ho , t y 1 y n 3 t i v n í a n t i g a n v HCV . R V ’/ { a 1 5··The results in Table I show that the yeast-produced envelope antigens HCV si a «2 are. significantly less immunoreactive than recombinant antigens produced from Vacci ni and R.W virus (e 1 & e2) and in CHO, CHO-e2 cells. ϋ Each of the test groups had only 2/3 or less of the activity of the yeast and α1 antigens produced by the yeast than the antigens produced by the animal cells. It is noteworthy that the yeast antigens e1 and e2 produced in yeast cells have been purified under denaturing conditions under these a n t i g e n e c h. R V ’/ {a 1 5 ··

Má se tudíž zato, že i nearni epitopy. Na roždí g2) a CKO--s2 líci ·; vany p o d r, í nok, ! r '· t ,·» - n 1It is therefore thought that even near epitopes. On the rosette g 2) and CKO - s2 cheeks ·; vany podr, í nok,! r '· t, · »- n 1

S.£komb i na n t ?.5 nativní antigen',S. £ combi on n t? .5 native antigen ',

El a Ξ 2 · v buňkách se· jeví jako stejně i munóreakti v a snad C25 a imunoraakti vnější než kterýkoli ? 1 /. -j · , L L U • r.,, n o o r ; 3 λ Q 1./ ! t o v a n ý c h mtigenů HCV. C'25 je chimérický polyprotein ssstávající zEl and Ξ 2 · in cells · appear to be the same as munoreacti in and perhaps C25 and immunoraacti external than any? 1 /. -j ·, L L U • r. ,, n o o r; 3 λ Q 1. /! HCV genes. C'25 is a chimeric polyprotein consisting of

MS idů spojených· podle obr.MS ids connected according to FIG.

.,·, ...... i . ... ' ' . r., ·, ...... i. ... ''. r

OZV'.OZV '.

i. L ϋ Li Π t/ '·i. L ϋ Li Π t / '·

I «ΐ; ·.· testem 5 s r o k o n v r 3 η í c h panelů HCV. Výsledky v tabulce ' i mu noře aktivit u · n 31 i vn ích oba 1 o vých a n t i g s η ů HCV, R. V V{ e, 1 'i c a ΐ na > j t c kým kczuj í 2; aI «ΐ; ·. · Test 5 s r o k o n v r 3 η í c h HCV panels. The results in the table of activity parameters of both external activities are HCV, R. V V {e. and

CHOva třech 3 e r o k o r. v a r s η í o h panelech. Každý vzorek v panelech představuje následný odbor krve jedince s transfusní HAMSH. Jak vyplývá z výsledků v tabulce TI, nati bálové antigeny HCV, to j -> antigeny pitopy, zjišťuji protilátky. které · hu infekce, zkoušenýmí •n srovnaní n:. irony HCV \ *· » TíCHOva three 3 e r o k o r. V a r s η í o h panels. Each sample in the panels represents a subsequent blood sample of an individual with transfused HAMSH. As can be seen from the results in Table TI, HCV natal antigens, i.e. pitopa antigens, detect antibodies. which · hu infection, tested • n comparison n :. irony HCV \ * · »Tí

·. pr 1 r cd η. ί n s ;<c · o ·' r·'? ϊ jeví pomsr^S časní 7·. pr 1 r cd η. ί n s; <c · o · 'r ·'? ϊ appears pomsr ^ S early 7

·. om i , jež c ? zjišťuji plnými geny mohou být budit velmi vhodná k peužit’ v imunologických tastsch k diagnose irhvkce HCV·. om i which c? I find full genes can be very exciting to be used in immunological tastes to diagnose HCV infection

- 23 Porovnání CHO-e2. rW <e*i či a ; inu 1 tiant i<ienní ELISY na serokonvers ních panelech ll ’ )- 23 Comparison of CHO-e2. rW <e * i or a; inu 1 tiant i <ienní ELISY on seroconversion panels ll ’)

SŠ8SŠ8

O 2j © «2 8 c d <Λ n « < O §2 8 .-sJ w α < o n « □ π 3 ϋ Su »O 2j © «2 8 c d <Λ n« <O §2 8.-SJ w α <on «□ π 3 ϋ Su»

N 50 PC ÍS ON 50 PC IS O

UJ w íM «UJ w íM «

'*'< O r- <2 o uJ w ® 4 o όϋ>8 x 23« >v’ >« i'*' <O r- <2 o uJ w ® 4 o όϋ> 8 x 23 «> v’> «i

ST tvíST yours

Λ' δ;Λ 'δ;

.1Φ ;c <rt.1Φ; c <rt

1’ ©1 ’©

a:and:

oO

ÍHÍH

4!4!

n n 01 01 © © Lf) Lf) 04 04 D D O) O) 1— 1— TO IT TO IT n n © rf © rf 01 01 Cl Cl n n f*) F*) CD CD o O o O CM CM TO IT Γ- Γ- OJ OJ tn tn to it co what TO IT © © ·— · - © TO © TO 9 9 OJ OJ ω ω (O (O CM CM © © OJ OJ TO IT F“ F" H- H- © © TO IT © © CM CM <OI <OI TO IT tn tn o* O* OJ OJ OJ OJ —1 —1 © © 00 00 o r> o r> © © 01 01 r- r- OJ OJ co what «Η «Η © © O O CM CM TO IT O O O O o_ O_ O O n n 7 · ©^ © ^ O O o O As As ¢0 *s. ¢ 0 *with. , ¾ CM CM o O o” O" 1-T 1-T pT pT co what o O o* O* o O O O cmT cmT ' ©* '© * o” O" O O O O o O o O O O o O O O —1 —1 D D

P7 Cl CO CM — o O CM P)© o o o o ©P7 Cl CO CM - o O CM P) © o o o ©

PÍ © TO P) PÍ CM cm —~O-—.PÍ © TO P) PÍ CM cm - ~ O-—.

« «# l o o o o o o cm — p> r> o r* ® rs to s oooooooooo — — «w ta — fc. ta ta, ' ta ta » ta«« # L o o o o o o cm - p> r> o r * ® rs to s oooooooooo - - «w ta - fc. ta ta, 'ta ta »ta

O O O O O 0-0“O-O-Oσ» oO O O O O 0-0 “O-O-Oσ» o

— CM p« © _ Ο ~Ο«· ta ta ta » «- CM p «© _ Ο ~ Ο« · ta ta ta »«

O OO O CMO OO O CM

- CM «-ή CM CO ) O cm iň m ·**>>_?» > o -r pí <- CM «-ή CM CO) O cm iň m · ** >> _?» > o -r pi <

ř- Ν # N (Oř- Ν # N (O

O O PÍ V © ta ta ta · ·»O O PÍ V © ta ta ta · · »

O © O O CM r- -,— . -vni. to ' ©, ί\ pJ tM_ <Dx O* O —T CM CM — 05 PÍ ta — cm . fcO © OO CM r- -, -. -in her. to '©, ί \ pJ tM_ <D x O * O —T CM CM - 05 PÍ ta - cm. fc

0—10—1

p. to 01 CD n CD CO CM Φ ° cm n v ©p. to 01 CD n CD CO CM Φ ° cm nv ©

- O CO li‘l Sú- O CO li‘l Sú

CM ÍM — — — ©CM ÍM - - - ©

9* ta * *s C* ta9 * ta * * s C * ta

O O O O O — oo — oo co © to o - o cm oo h* * A *O O O O O - oo - oo co © to o - o cm oo h * * A *

O O O O O VO O O O O V

TO CO TO © QOtf o ^9;°t. o o o o Ύ TO CO TO © QOtf o ^ 9; ° t. oooo Ύ

CM - pí tm — Vl taCM - pi tm - Vl ta

Λ « AΛ «A

O O O —l fj-íncosaiOrs®'* 00000 0 - 000 o1 o**o“o'o“ o cTo“o“ o“ σίττσιο® — oi — cm r> MT TOOOO —l fj-íncosaiOrs® '* 00000 0 - 000 o 1 o ** o “o'o“ o cTo “o“ o “σίττσιο® - oi - cm r> MT TO

OOO — O — OCM »ta . ta ta. ta » ta 2*. X ooooooooooOOO - O - OCM »ta. ta ta. ta »ta 2 *. X oooooooooo

CMCM

PÍ wPÍ w

©©

CM CM τ, ΆCM CM τ, Ά

CM COCM CO

PÍ © .©._(*· CM © O PII eo CM — O O Ο'-'Ό ^·ρ) Ρν-Ν O O O O O O O —f — cm © CM © CM CM cm π co v ©PÍ ©. © ._ (* · CM © O PII eo CM - O O Ο '-' Ό ^ · ρ) Ρν-Ν O O O O O O O — f - cm © CM © CM CM cm π co v ©

P.COCM©TOPta — CMe-l ° o o o ©o - © -j *» * ·* *\ ** » *·» ·% 4P.COCM © TOPta - CMe-l ° o o o © o - © -j * »* · * * \ **» * · »·% 4

OOOOOOOOa-fOOOOOOOO and -f

TOTOTO^TTOVO^Ol o o o ---- - © H oooooooo—O taTOTOTO ^ TTOVO ^ Ol o o o ---- - © H oooooooo — O ta

CM _CM©TO©«tr«— ®©CM _CM © TO © «tr« - ® ©

Φ b» !CΦ b »! C

CO WHAT 00 00 TO IT TO IT O O tw tw TO IT TO IT ta the TO IT TO IT TO IT © © © © © © © © © © © © © © Φ Φ <0 <0 ω ω QD QD oo oo TO IT CD CD TO IT TO IT TO IT ÚD ·*. LIMB · *. TO IT TO IT TO IT N N Ρ» —w Ρ » —W Pfc Pfc fs fs P> P> P; P; pfc pfc Γ* Γ * 0 · r* r * CO WHAT tn tn © © O O V IN TO IT © © <n <n H · TO IT TO IT Φ Φ ΊΓ ΊΓ © © o O CM CM TO IT Ρ» Ρ » TO IT Π Π o O Γ* Γ * TO IT c C CM CM CM CM OJ OJ O O O O CM CM c C O O fc* fc * CM CM O O O O r- r- O O OJ OJ OJ OJ P> P> co what TO IT TO IT 01 01 w Λ , w Λ, Pfc Pfc TO IT 00 00 O) O) TO IT TO IT (D b. (D b. fcfc p. fcfc p. p · TO IT •«ta. co •"the. what «. TO «. IT TO IT cn cn σ> σ> Ο) Ο) o O O O O O O O O. O. m ai m ai O O O O o O o O O O O O -c -C .o .O O O O O O O o O O O O O O O Ό Ό ο ο

v iív ií

O uO u

— © p. TO TO JI < < 4 < < ř/1- © p. TO TO JI <<4 <<ř / 1

N — (ON - (O

U UU U

TO Ol U UTO Ol U U

OO

CJ oCJ o

« w«W

O >O>

c oc o

o oo o

Φ co Φ co

- 24 < o *£ £2 S C m » »- O O - rs — r> eo O r* *- <r o co oo coi co O- 24 <o * £ £ 2 S C m »» - OO - rs - r> eo O r * * - <ro co oo coi co O

O O O ifiTrn — « r» v © CNfNfNin — o* c? ůo* ofO O O ifiTrn - «r» v © CNfNfNin - o * c? ůo * of

Tabulka II <pokračování>Table II <continued>

< O<O

Š£oŠ £ o

-tíw u < o © w u © 3 =ť o UJ W-tíw u <o © w u © 3 = ť o UJ W

N < O n 52 o υ jí wN <O n 52 o υ ji w

N eNo

«3 < O«3 <O

S ° tí ω >S ° tí ω>

>>

φ < Q ó 52 α i úí« u >□ .W *·► w , . » ' * \i- | íC > I * r *φ <Q ó 52 α i úí «u> □ .W * · ► w,. »'* \ I- | íC> I * r *

1’ u1 ’and

v’in'

N >N>

C3cd O co oo w o — o -- ·~ » s “ * o o o o * r·» tn ©C3cd O co oo w o - o - · ~ »s“ * o o o o * r · »tn ©

O' O* o tn © © © © Ο ,- co ro *« * * aO 'O * o tn © © © © Ο, - co ro * «* * a

O O O eo © tn © © O rt 'ř ©O O O eo © tn © © O rt 'ř ©

- . r. O O O Η ©-. r. O O O Η ©

°N tn* es © © © X — v rc s° N tn * es © © © X - v rc s

ta cta c

<o<o

UiUi

CC

N >1' _c cN> 1 '_c c

ii >u ta ta nii> u ta ta n

\\

CC

VIVI

VIVI

UiUi

Φ ta ta cTa ta ta c

v uv u

1' 'Ji1 '' Ji

co what © © G0 G0 co what co what © © 00 00 co what **. **. CD CD © © o O co what ** ** CN CN n n <N <N -V. -IN. r- r- Φ Φ co what © © o O O O O O o O

©©

U J 24 VI ů!U J 24 VI ů!

>>

c r i \c r i \

rn £Drn £ D

O — CN © o tn © m ·: tabulce- 5 u kazu jí porovnání nativních antigenů zprasí z genů El a E2 ss srovnatelnými děnaturo va aόe i mu o d o -a c i a n t ů s akutní r o z ! i š s n o u W A ří Β H a j a p o ; ., ,4 i. ..O - CN © o tn © m ·: Table 5 shows a comparison of native antigens from the E1 and E2 genes with comparable denatures and acute genes! i š s n o u W A ří Β H a j a p o; .,, 4 i ...

-ř :j 7-ř: j 7

HCV zí skanýc h a zz nými antigeny. V tabulce byla sledována v závislosti na n o r e a k ί t-3HCV is derived from scanning antigens. The table was monitored depending on n o r e a k ί t-3

r o v η á - a s r o v η á - a s i mu ne and he doesn't r a a k ti v 1 to u r a a k ti v 1 to u p-3 p-3 bulky 3 vy bulky 3 you p 1 ývá p 1 lives , vykazují , show antigeny, antigens, které which obsahují contain jak how P..VV (el & P..VV (el & e2) ξ e2) ξ CHO-e než CHO-e than ant ant t o p y e 1 a t o p y e 1 a e2 ( e2 ( produkované produced v in

bálovéballs

Celkové je zře 6-.3, že imunorsakti g e n ů H C V s a z v4 v i e 8 -* až 9 -· k r á t u jen a; i 2-krát u pacientů 5 chrc s s týká k o n f o r m a é η í c h e p i t o p ů, z a t řThe overall view is that the immunoractivation of H C V s a z v4 v i e 8 - * to 9 - · k r a t u jen a; i 2 times in patients 5 chrc s s concerns k o n f o r m a é η í c h e p i t o pů, z a tr

ná stejnoměrně rozdělena rne z i konf T ;/ i o studia předsta v u jí první topy : ? mohou c ýk·? t imunologické' iů H · ’ -Ouniformly distributed rne z i konf T; / i o studios represented in u her first tops:? can c ýk ·? t immunological 'iů H · ’-O

i t a i t a ne No ti vních obal those outer packaging o vých o vých a n t i - a n t i - pec furnace i a n i a n t ů 'g a k u t .η í t ů 'g a k u t .η í r o z. 1 i 5 e r o z. 1 i 5 e n o u a n o u a ; ρ τ. ; ρ τ. 'J Ví 'J He knows MA^SH. Jeví MA ^ SH. Apparently -j 3 t s d -j 3 t s d y, že y that o n t o n t 0!.! S 0!.! WITH r o z 1 i 5 e n o u r o z 1 i 5 e n o u f -j r m o u f -j r m o u WANBH WANBH rne o rne o u at akutní formy acute forms je při is at bliž closer r ma r ma ch í ch í a lineární and linear ep itopy ep itopy

poznátek, konformační spi dezvy' na HCV α ho-s ťi tel skáhb .Tjbul.-:.: IU ....... ,...... ....... ....... ...... ...........v.. . .knowledge, conformational spi 'on HCV α ho-s ťi tel skáhb .Tjbul .-:.: IU ......., ...... ....... ...... ...... ........... v ... .

Převaha anti-HCV antigenů o bs a ku j í z · ch konformační. 'epitopy oproti antigenům obsahujícím pouze lineární epitopy u rozlišené a chroPcčst (¾) anti-HCV positivních po transfusí D i a gnz z z Ak ut ni ro z ' i šsné Η Λ ΜβH C h r o n ické Ν A Ν Β H p o b j n z.The predominance of anti-HCV antigens by bs and its conformational ones. 'epitopes versus antigens containing only linear epitopes in differentiated and chroPcst (¾) anti-HCV positive after transfusion D i and gnz z z Ak ut ni ro z' i šsné Η Λ ΜβH C h r o n ické Ν A Ν Β H p o b j n z.

transfuzi. C-5 měsíců 6-17 měsíců >12 měsícůtransfusion. C-5 months 6-17 months> 12 months

An.tige?.y HCVAn.tige? .Y HCV

C2 5 C2 5 : 9 / ’ 9 * : 9 / ’9 * 19/19* 19/19 * 13/19’ 13/19 ’ o / o · o / o · i i oct; i i oct; (100¾) (100¾) (95¾) (95¾) (100¾) (100¾) r VV( ' $.· .? 2 ) r VV ('$. ·.? 2) 16/19’ 16/19 ’ 17/13’ 17/13 ’ 16/19’ 16/19 ’ g /g * g / g * (34¾) (34¾) (33¾) (33¾) (3 4¾) (3 4¾) (100¾) (100¾) CHO-e 2 CHO-e 2 ! 1/19’ ! 1/19 ’ 12/19’ 12/19 ’ 13/19’ 13/19 ’ 9/9’ 9/9 ’ ( 53¾) (53¾) (53¾) (53¾) (53¾) (53¾) (100¾) (100¾)

?2? 2

T / ; 9 * T /; 9 * 3/ 1 9 * 3/1 9 * 4/13* 4/13 * / Q / Q / σ ψ a ·, ' ,n j/ σ ψ a ·, ' , n j ( 1 5¾) (1 5¾) f n 1 a* v \ / f n 1 a * v \ / ( c ς =v \ -» «_· (c ς = v \ - »« _ · 1/19* 1/19 * 1/19* 1/19 * 4 /19* 4/19 * 4/9 4/9 ( 5?,) (5 ?,) ( 5¾) (5¾) (21¾) (21¾) ( 4 4 2. (4 4 2. 2/19 * 2/19 * 4/19* 4/19 * 4/19* 4/19 * 4/9 4/9 ( *} (*} (21¾) (21¾) (21¾) (21¾) (44¾ (44¾

* Počet pozitivní ch/počat testovaných ** Diagnosa 'akutní rozlišené NANBH (převládající většina drobnohledně c r e s i s t s n c ·.? l. r a no a m i n í ; .* Number of positive ch / conceived tested ** Diagnosa 'acute differentiated NANBH (predominant majority small-scale cresistsnc ·.? L. Ra no amin í ;.

na základe biopsis .jištěná) a rozliš e- r. i . tč ;muno kompetentních ( Á~. J? ** Ή 1 (2 l*. η - 2 “ * i ;on the basis of biopsy .insured) and the difference e- r. i. tč; muno competent (Á ~. J? ** Ή 1 (2 l *. η - 2 “* i;

k t ?' i i s o u i i ~ a k τ m u n o log; c k ý t ·? 5 t El / E 2 : Pero v n á η i p a c i 3 i mvr.o s op r3 ;,r; í c hk t? ' i i s o u i i ~ a k τ m u n o log; c k ý t ·? 5 t El / E 2: Pero v n a η i p a c i 3 i mvr.o s op r3;, r; í c h

O Γ) TO Γ) T

1ÍT’: -v - - t i 1 i - ky ιΎ - -zi-u HIV. CH:;·;!· “.věří 2C chronickou infekcí H C'' í.íok or.o u fr an 3 f u z. rávi. Všichni p o c ; n t i yr pozitivní n ant i-HCV a HCV PNA. Ska.pt nu II tvoří 15 pacientů na h.? mo d : a · ~J3 ΐ Jedenáct z nich je anti-HCV pozitivních na příjmu, jeden .mě v průběhu trans?'antaci ledviny. Pět pacientů se stalo anti-HC III tvoří i? příjemců 1?dv:novyc je HCV a HCV R NA pozitivních n.1ÍT ’: -v - - t i 1 i - ky ιΎ - -zi-u HIV. CH:; ·;! · “. Believes 2C by chronic infection H C '' í.íok or.o u fr an 3 f u z. Rávi. All p o c; n t i yr positive n ant i-HCV and HCV PNA. Ska.pt nu II consists of 15 patients per h.? mo d: a · ~ J3 ΐ Eleven of them are anti-HCV positive on intake, one .me during trans? 'antation of the kidney. Five patients have become anti-HC III form i? recipients 1? dv: novyc is HCV and HCV R NA positive n.

příjmu. Sedm s? stalo anti-HCV pozitivních v průběhu, z nichž dv. byl; napřed sami HCV HA pozitive;. Dva pne iont i byli HCV R.NA s;income. Seven s? became anti-HCV positive in the course of which dv. was; first themselves HCV HA positive ;. The two pne ion i were HCV R.NA s;

t i v.-, i na η ř (' j mu, o ba z Ct-3 t a 1 i HCV S N.A po z . t 1 v η 1 , a ' pozitivních v průběhu. Skupina transp1 ahtát ů. Sedm pacientů mc ap.fi -HCV n 2 ga t : va i v průběhu HCV RMA nouze v orůbéhn.ti v.-, i na η ř ('j mu, o ba from Ct-3 ta 1 i HCV S NA po z. t 1 v η 1, a' positive during. Group of transp1 ahtátů. .fi -HCV n 2 ga t: va i during HCV RMA emergency in orbit.

Séra' se záměrně shromáždila během července 1C5C a dubn n g 2 .3 b y, .3 ulež e n a v a 1 1 k v o t ec h oři -70 J C - ř 2 cí f 3 c t o 7 -r a · m. · 0 až čtyři vzorky 5hro máždéns v intervalech 5 až 12 měsíců byl; testovány prc- pacienty skupiny I. Dva vzorky shromážděné v intervalu 1,5 až 2 let byly testovány pro všechny pacienty skupiny II a III; dodatečné vzorky v intorvenční periodě a průběžné vzork; byly taká testovány pro pacienty, kteří se změnili ze staví antí-HCV a/nebo HCV .RNA ve druhém vzorku.Sera 'deliberately collected during April and July 1C5C 2 .3 ng would ulež ENAV 1 .3 1 The quotas ec h charger -70 C J - R 2 C 3 F 7 CTO -r · m. · 0 to four samples 5hro máždéns at intervals of 5 to 12 months; tested prc- patients of group I. Two samples collected in the interval of 1.5 to 2 years were tested for all patients of groups II and III; additional samples in the intervention period and a continuous sample; were also tested for patients who changed from anti-HCV and / or HCV RNA in the second sample.

í k ΐ í k ΐ 3du 3du 4 4 U testů N In tests N 2 2 S a S a n á on váz ligament C Pl C Pl í m va cc i n í m va cc i n t t ζ · '7? ζ · '7? t u t u ř- ř- ředidlu thinner • τ 7· • τ 7 · y. z y. of i i) i i) r\ r \ ÍJ í ÍJ í itím vacci itím vacci r. í r. í onh onh r 0 1 r 0 1 Γι í C Íι í C Sr S r v z 0 r k ů . v z 0 r k ů. obr giant 3 3 A d A d r r 3C. Pouze 3C. Only £ c £ c r # r # ago va 1 ago and 1 0 0 na a nt i ge na a nt i ge *» 17 l* ?* »17 l *? ' r- 'r- ·. J rp i ·. J rp i c h n c h n i and “ s ·.? i 2 n ·' 1 r “S ·.? i 2 n · '1 r a C; and C; c 5 c 5 :'V :'IN a and £ ·.{' £ ·. {' 0? ·;·: ·λι né v 0? ·; ·: · Λι né v - -

’’ fS /.·* ' Γ< i kýslsdky jsou znázorněny na’’ FS /.·* 'Γ <i kýslsdky are shown on

Testy ELI SAELI SA tests

Antigeny HCV se připraví jako .podle příkladu 4 a použij t_ s· £< e? s; protein;HCV antigens were prepared as in Example 4 and using t? S · £ <e? with; protein;

' i ) přísadou v 3 c o i n i 3 bv n ě čn éh i •st I Q ij 5 i ! 4 F ·' ki *- ’-ί Γ '-L- ί Γι f č Π t ! 'ÍJ 2 Π η k o n t r o 1 η í c h v z o r k ů.'i) additive in 3 coini 3 bv v e c e éh i • st IQ ij 5 i! 4 F · 'ki * -' -ί Γ '- L - ί Γι f č Π t! 'ÍJ 2 Π η kontrol 1 η í chvzork ů.

5K i mu no k c *τι ρ Ώ tQ n t η í r t- r - i p n t r sknoír^ r a a π n *. r a 1 π π s n ť í π p v o 1 γε s b í e 2 5 x ρ za o o v a η í v kvasnicích; r *· < ;/ r: ' ’ :/ -> -t : I 3 .Ί * r: Λ * ' <7 ./ i r u . Jo ko u i mzno k 5npe te n t η í c h pacientů, by ’ : v č t ό : λ ' b r m z d ; c5K i mu no kc * τι ρ Ώ t Q nt η í r t- r - ipntr sknoír ^ raa π n *. ra 1 π π sn ť í π pvo 1 γε sb í e 2 5 x ρ za oova η í in yeast; r * · <; / r : '': / -> -t: I 3 .Ί * r: Λ * '<7 ./ iru. Jo ko ui mzno k 5npe te nt η ích patient, by ': v č t ό: λ'brmzd; C

-l-yzn í-c-h- •..•pac-i-eďit-ů. skuo-i n,y. ..IX. .. r.sa.k.t.i y.ri.Lch.. ...na.....a.n t i g z ;y L.2 5.,_C.2..' a N e. >S< s2. Významně nižší podíl pacientů reagoval -s.ClOO-3. C332C,. NS-5,. el a e2. Ve srovnání s imunokompetentními pacient.1 -l-yzn í-ch- • .. • pac-i-eďit-ů. skuo-i n, y. ..IX. .. r.sa.kti y.ri.Lch .. ... na ..... an tigz; y L.2 5., _ C.2 .. 'a N e.> S <s2. A significantly lower proportion of patients responded to -s.ClOO-3. C332C,. NS-5,. el and e2. Compared with immunocompetent patient. 1

-('s-a-gO-v-sR-G-^-ý-z^rAaynpjě—md-n-š^p^ízrjzsTm ^rT;!ze^!37.-iJí:oawý.-cáí.=t7r.-a:n-S:piáíii-72di=S=rŽ2kí!JŽJť ny III vůči všem testovaným antigenům HCV.- ('sa-gO-v-sR-G - ^ - ý-z ^ rAaynpjě-md-n-š ^ p ^ ízrjzsTm ^ rT; -a: nS: piáíii-72di = S = rŽ2kí! JŽJť ny III against all tested HCV antigens.

Vši c hn i i muno k cmps t e n t η í pa c i s n t i r e a oc v3 1 i na '225 , 2 2 2 C33C; 90 % reagovalo na HS-5' a 30 / na V100-3. Pouze 5Č t reago válo na z kvasni'c odvozené antigeny sl & e2, avšak všichni reagovali na vaocinia sxpresovaná antigeny N el & e2, což značí, žs o bálové epitopy isct!' konfcrmaČní a g1ykosi 1 o váné . 55 n ..až 90 d i a 1 ya o J ; iny r 3 a g t f; 7 .τ 0. !Lice c hn ii muno k cmps tent η í pa cisntirea oc v3 1 i na '225, 2 2 2 C33C; 90% responded to HS-5 'and 30 / to V100-3. Only 5% reacted with yeast-derived s1 & e2 antigens, but all responded to vaocinia expressed by N1 & e2 antigens, indicating that they are formal epitopes. configuration and glycosis 1. 55 n .. to 90 dia 1 ya o J ; iny r 3 agtf; 7 .τ 0.!

% až 5 0 r ea g c - 1 va 1 o na 725, C?2 a H ?! O ?2, rd.?:·· nouze na 071 100-3, 0370 a >!3 -5 . Cmonšcní nebo ztráto r-ja k t i ·· i t y na ar. t i g s n hepatitis 0 viru b y 1 a pozore v á n a po transplantaci 1 2 d v 1 r. nebo kostní dřené, přičemž C25 a M sl S e2 byly méně ovlivněny.% to 5 0 r ea g c - 1 va 1 o at 725, C? 2 and H?! O? 2, rd.?:·· emergency on 071 100-3, 0370 and>! 3 -5. Cmonšcní or loss r-ja k t i ·· i t y na ar. t i g s n hepatitis 0 virus b y 1 and observed after transplantation 1 2 d in 1 y. or bone marrow, with C25 and M sl S e2 being less affected.

j s o u k o- n f o r ma č η í a r e a k 11 vita vŮč i těmto 3 p i t o pům je minimálně o v1 i vn a na potlačením i muni ty oproti jiným antígeňům HCV.j s o u k o- n f o r ma č η í a r e a k 11 vita vč i even with these 3 p i t o pům is at least o v1 i vn and to suppress i munty compared to other HCV antigens.

P „C.S TV A.. 1..9..7.Á........'<y i ί 1 t..?...!...9.,θ 9 í,P „C.S TV A .. 1..9..7.Á ........ '<y i ί 1 t ..? ...! ... 9., θ 9 í,

Způsoby imunologických testů, používající obalová antigény HCV, které obsahují konformační epitopy reaktivní s protilátkami v séru od infikovaných jedinců, se hodí ke skrínování a diagnosám. Tyto antigeny detekují protilátky, jež nejsou detekovány dsnatuvmi antigeny HCV. Kromě toho tyto obalové antigeny .^t iImmunoassay methods using HCV envelope antigens that contain conformational epitopes reactive with antibodies in the serum of infected individuals are suitable for screening and diagnosis. These antigens detect antibodies that are not detected by HCV antigen antigens. In addition, these envelope antigens

r.o vánými obolev HCV, tvořené k' •3 Z t I 7 li e J f v (,-4/ ty Zfy-fíHCV, formed by k '• 3 Z t I 7 li e J f v (, -4 / ty Zfy-fí

Claims (1)

PATENTOVÉPATENTS N A R. O K VN A R. O K V 2působ detekce protilátek víru hepatitis C (KCV) v tělesné složce s a y c ů u n;z v y z n a č u j í c ť ja podezření, že obsahuje tyto protilátky, s ε t t m, ž o 5 s konta k t u j t a k ové tělesné složky s antigenem HCV obsahujícím konfcrmační epitop z domény El nebo E2 HCV za podmínek umožňujících imunologickou reakci mezi případnými protilátkami a antigenem a stanoví se přítomnost případného i mu n i t ní ho ko mp 1 e xir těchto protilátek a těchto ant i genů .Method for the detection of hepatitis C virus (KCV) antibodies in the body component of said cells, which is suspected to contain these antibodies, with 5 s of the body component containing HCV antigen containing a confirmatory epitope from the E1 or E2 domains of HCV under conditions allowing an immunological reaction between the possible antibodies and the antigen, and the presence of a possible immunocomponent of these antibodies and these antigens is determined. 2ρ ůs ob podle nár ok u 1 , v y že obalový antigen HCV je zakódován to me n;2ρ as ob according to claim 1, wherein the HCV envelope antigen is encoded by me; o enom u H CV.o enom u H CV. i. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í o í : e obalovým antigenem HCV j s El.The method of claim 1, wherein the HCV envelope antigen is E1. m,m, Ί. způsob podle nároku ·, v y z n o č (( j í c ή o obale vý :< n i i z - HO V je v -i n v doméně E 2Ί. · Method according to claim, c h a ((r a c ή casing above the <Niiza - Ho is -inv Domain E 2 5. Způsob podle nároku 1 , v y z η o ó u j í c že obalovým antigenem HCV ja E2.The method of claim 1, wherein the HCV and E2 envelope antigen. gsnomu HCVgsnomu HCV 6. 2působ podle nároku 1, v y z n a č π j í c í že sestává déle z druhého obalového' antigenů HCV t f 0 rma č η í m a ρ i t -o p<? m .6. The method of claim 1, further comprising the second HCV envelope antigens t f 0 rma č η í m a ρ i t -o p <? m. n é hc i m,n é hc i m, Způsob podle nároku $, t í rn ž? obalové nativní antigeny HCV jsou expesovány z rekombinantníhoThe method according to claim 1, three. HCV native packaging antigens are expressed from recombinant - ů.c ó p c d 1 « n á r o k u 5 , v y z · :\ a u E2. je exresován .v buňkách CHO.- ů.c ó p c d 1 «n á r o k u 5, v y z ·: \ a u E2. is expressed in CHO cells. 9. 'Způsob skrínování krevních slož-!·: na HCV před pouzí tím tako309. A method of screening blood components for HCV prior to use / é k r v / é k r v n n η θ b c k η θ b c k 'e v η í 'e v η í složky k cřípra ingredients for sour cream k · o v ηί c h der i k · o v ηί c h der i vá t you t 0 '-i , 0 '-i, t; t; v - v - zna know C C C j í o C j í o s s t í m , ž s s s t í m, ž s a) s e a) s e Π Π •3 c b »2 Γ* “ • 3 c b »2 Γ *“ ;;ov3 t ;; ov3 t tělesná složka body component od from potenciál ηí ho potential ηí ho dár gift p P p P 3 3 “| *1 _ J i 1 “| * 1 _ J i 1 t i g s n 9 t i g s n 9 m m HCV t vc HCV t vc ř e n é m ř e n é m konformačním spi conformational spi - S H - S H am domény El n am domain El n s bo s bo Ξ2 Ξ2 HCV HCV 2 3 pO 2 3 pO dm dm i Γί 3 k , ' i 3ί 3 k, ' - - Ή ,·Α - - Ή, · Α vo 1 ii j ť imunologi vo 1 ii j ť immunologi c k 3 c k 3 T s .·? k c ; m 3 z ί T s. ·? k c; m 3 of ί P P Γ ΐ Ϊ́ ΐ n Q rj n Q rj n o u n o u p r c t i 1 p r c t i 1 í t* í t * L> r· ·, 4~ X } 5. ί.· I u 3 . L> r · ·, 4 ~ X} 5. ί. · I u 3. 3 A Ó 5 3 A Ó 5 ! o ž k ?/ a ? n t: g e n e ! o ž k? / a? n t: g e n e if! , if! , b) se b) se provede d perform d 31 e k c a 31 e k c a komplexů, vyt vc complexes, vyt vc řených mezi ant í g between ant í g sne sne ΙΪΙ ΙΪΙ ¢3 · p ¢ 3 · p ř í ~ ř í ~ pádným strong i and proti 1 á against 1 á t k a m i t k a m i a and c) výc c) training 1 o 1 o ní se v her in = š k e r á = š k e r á krev nebo krevn blood or blood í s in s ložky od dárce beds from the donor t t při z j when z j i 3 and 3 t ě η í t. é t ě η í t. é kovýc h kovýc h komplexů v krok complexes in step u b in b 1 0 _ 1 0 _ Λ r . Λ r . -3 73 R -3 73 R detekci proti 1á detection against 1á tok flow Opu r. - ’ - r S ·. . ·..· r r . v: :Opu r . - '- r S ·. . · .. · r r . in:: 1 1 Λ · Λ · Q Q v y z v y z f. F. 3 Č Q 3 Č Q : c í : c í s s t í m , s s t í m, z of •e o b s 3 h'1; ; a • e o b s 3 h'1; ; and n t i n t i qe qe - [ J 6 V - [J 6 V tvořen formed 7 7 k c n f o m k c n f o m ·? ň n í m ·? ň n í m so i t o o em z domén so i t o o em from domains c C i nabc £2 HCV, i nabc £ 2 HCV, ,2 , 2 ko ko π t r π t r o 1 - o 1 - n i n t a n d n i n t a n d s r d y, c s r d y, c d -dii ď d -dii ď ve vhodných ampu in suitable amp ! ká ! ká C b 2 i n S t *i k C 9 C b 2 i n S t * i k C 9 pr pr £ £ D C 'í D C 'í ž i - ž i -
CZ19956A 1992-07-07 1993-07-02 Method for detecting early seroconversion, method for detecting antibodies to HCV and a kit used in these methods CZ291951B6 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91075992A 1992-07-07 1992-07-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ695A3 true CZ695A3 (en) 1996-03-13
CZ291951B6 CZ291951B6 (en) 2003-06-18

Family

ID=25429280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19956A CZ291951B6 (en) 1992-07-07 1993-07-02 Method for detecting early seroconversion, method for detecting antibodies to HCV and a kit used in these methods

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20020150883A1 (en)
EP (1) EP0649537B2 (en)
JP (2) JP3490085B2 (en)
AT (1) ATE216779T1 (en)
AU (1) AU685059B2 (en)
CA (1) CA2139645C (en)
CZ (1) CZ291951B6 (en)
DE (1) DE69331845T3 (en)
DK (1) DK0649537T4 (en)
ES (1) ES2171414T5 (en)
FI (1) FI110546B (en)
HU (1) HUT70473A (en)
NO (1) NO321185B1 (en)
PL (1) PL174686B1 (en)
PT (1) PT649537E (en)
RU (1) RU2126158C1 (en)
SK (1) SK284556B6 (en)
UA (1) UA39944C2 (en)
WO (1) WO1994001778A1 (en)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6274148B1 (en) * 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
US5882852A (en) * 1993-06-29 1999-03-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates
US7070790B1 (en) 1993-06-29 2006-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
DE69526636D1 (en) 1994-07-29 2002-06-13 Innogenetics Nv CLEANED HEPATITIS-C-VIRUS ENVELOPE PROTEINS FOR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USE
DE4428705A1 (en) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Recombinant antigen from the NS3 region of the hepatitis C virus
US5707385A (en) * 1994-11-16 1998-01-13 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Drug loaded elastic membrane and method for delivery
EP0836708A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-22 Abbott Laboratories Method for antibody to hepatitis c virus second envelope glycoprotein
US6514731B1 (en) 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
WO2000026673A1 (en) * 1998-11-03 2000-05-11 Abbott Laboratories Methods of detecting chronic infection caused by hcv
ATE352785T1 (en) * 1999-07-28 2007-02-15 Novartis Vaccines & Diagnostic METHOD FOR DETECTING HEPATITIS C ANTIGENS
US6815160B1 (en) 1999-07-28 2004-11-09 Chiron Corporation Hepatitis C viral antigen immunoassay detection systems
EP1829891B1 (en) 2000-06-15 2012-12-26 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunoassays for Anti-HCV Antibodies
MXPA02012424A (en) 2000-06-15 2003-04-25 Chiron Corp Hcv antigen/antibody combination assay.
AR045702A1 (en) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp COMPOSITIONS OF ASSISTANTS.
WO2004021871A2 (en) 2002-09-09 2004-03-18 Chiron Corporation Hcv assay
WO2004071414A2 (en) * 2003-02-05 2004-08-26 Genzyme Corporation Therapeutic anti-hcv (al9) compounds
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
JP5070055B2 (en) 2004-08-27 2012-11-07 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス,インコーポレーテッド HCV multi-epitope fusion antigen having modified proteolytic cleavage site and use thereof
US8216590B2 (en) 2006-08-25 2012-07-10 Novartis Ag HCV fusion polypeptides
US8815253B2 (en) 2007-12-07 2014-08-26 Novartis Ag Compositions for inducing immune responses
FR2984328B1 (en) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations METHOD FOR DETECTING HEPATITIS C VIRUS INFECTION
EP2968526A4 (en) 2013-03-14 2016-11-09 Abbott Lab Hcv antigen-antibody combination assay and methods and compositions for use therein
CA2906417C (en) 2013-03-14 2022-06-21 Robert Ziemann Hcv core lipid binding domain monoclonal antibodies
WO2014143342A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Abbott Laboratories Hcv ns3 recombinant antigens and mutants thereof for improved antibody detection
WO2016160046A1 (en) 2015-03-27 2016-10-06 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Hcv ns4a/modified ns3 polypeptides and uses thereof

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4855224A (en) * 1984-03-09 1989-08-08 Genentech, Inc. Molecularly cloned diagnostic product and method of use
HU216017B (en) 1987-11-18 1999-04-28 Chiron Corp. Method for producing hcv-1 polypeptids, hcv-1 polynucleotids, recombinant vectors and host cells, immunoassay kit, vaccines against hepatitis c infections, diagnostics for detecting the infections, and immunoanalitical and virus culturing process
HU225068B1 (en) 1989-03-17 2006-05-29 Chiron Corp Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
US5372928A (en) * 1989-09-15 1994-12-13 Chiron Corporation Hepatitis C virus isolates
NZ236491A (en) * 1989-12-18 1993-10-26 Wellcome Found Post-transfusional non-a non-b hepatitis viral polypeptides, dna, antigenic polypeptides and antibodies to the polypeptides
ZA912040B (en) * 1990-03-30 1991-12-24 Akzo Nv Peptides immunochemically reactive with antibodies directed against hepatitis non-a,non-b virus
HU217025B (en) * 1990-04-04 1999-11-29 Chiron Corp. Preparations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies
DK0527815T3 (en) * 1990-04-06 2000-11-06 Genelabs Tech Inc Hepatitis C virus epitope
FI913068A (en) * 1990-06-25 1991-12-26 Univ Osaka Res Found NON-A-, NON-B-HEPATITISVIRUS PARTICLAR.
EP0468657A3 (en) * 1990-07-09 1992-02-05 Tonen Corporation Non-a non b hepatitis-specific antigen and its use in hepatitus diagnosis
DE69131882T3 (en) * 1990-11-08 2007-05-24 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville ASILOGLYCOPROTEINS OF HEPATITIS C-VIRUS
IT1249684B (en) * 1991-07-19 1995-03-09 Sorin Biomedica Spa HEPATITIS VIRUS PROTEIN ENV EPITOPES
WO1993015193A1 (en) * 1992-01-31 1993-08-05 Abbott Laboratories Mammalian expression systems for hcv proteins
US5587285A (en) * 1992-01-31 1996-12-24 University Of Texas System Generation serological assay for monitoring HIV exposure

Also Published As

Publication number Publication date
EP0649537B2 (en) 2006-02-22
CA2139645A1 (en) 1994-01-20
CZ291951B6 (en) 2003-06-18
DK0649537T4 (en) 2006-04-10
JP2003329687A (en) 2003-11-19
ES2171414T5 (en) 2006-09-01
HUT70473A (en) 1995-10-30
WO1994001778A1 (en) 1994-01-20
FI950002A (en) 1995-02-27
PL307178A1 (en) 1995-05-02
EP0649537B1 (en) 2002-04-24
HU9500008D0 (en) 1995-03-28
RU94046284A (en) 1997-02-27
ES2171414T3 (en) 2002-09-16
PT649537E (en) 2002-09-30
FI950002A0 (en) 1995-01-02
SK284556B6 (en) 2005-06-02
DE69331845D1 (en) 2002-06-06
SK495A3 (en) 1995-07-11
RU2126158C1 (en) 1999-02-10
AU4662993A (en) 1994-01-31
JPH07509060A (en) 1995-10-05
DE69331845T2 (en) 2002-08-14
PL174686B1 (en) 1998-08-31
EP0649537A1 (en) 1995-04-26
DK0649537T3 (en) 2002-06-17
CA2139645C (en) 2003-02-11
JP3490085B2 (en) 2004-01-26
NO950006D0 (en) 1995-01-02
FI110546B (en) 2003-02-14
NO950006L (en) 1995-02-24
AU685059B2 (en) 1998-01-15
US20020150883A1 (en) 2002-10-17
NO321185B1 (en) 2006-04-03
ATE216779T1 (en) 2002-05-15
DE69331845T3 (en) 2006-10-05
UA39944C2 (en) 2001-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ695A3 (en) Method of detecting antibodies of c hepatitis virus and a set for detection hcv antibodies
Scarselli et al. The human scavenger receptor class B type I is a novel candidate receptor for the hepatitis C virus
FI106317B (en) Hepatitis C virus (HCV) antigen combinations for use in immunoassays of anti-HCV antibodies
JP3623162B2 (en) Virus detection or measurement method
JP2011125350A (en) Immunoassay for anti-hcv antibody
JP2778886B2 (en) Hepatitis C virus core antigen protein and diagnostic method and kit using the same
US7108967B2 (en) Hepatitis C viral antigen immunoassay detection systems
Favorov et al. Enzyme immunoassay for the detection of antibody to hepatitis E virus based on synthetic peptides
EP0642666B1 (en) Hepatitis c assay
JP2010048830A (en) Hepatitis c viral antigen immunoassay detection systems
JP2020129001A (en) HCV NS4A/modified NS3 polypeptides and uses thereof
US20060166193A1 (en) Binding protein
JP3176570B2 (en) HCV detection or measurement method
JP2001224371A (en) Method of detecting or measuring hepatitis c virus (hcv)
JPH06153959A (en) Nonstructural protein of hepatitis c virus and diagnostic method and kit using said protein

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20130702