HUT70473A

HUT70473A - Immunoassays for anti-hcv antibodies using antigens with conformational epitopes

Info

Publication number: HUT70473A
Application number: HU9500008A
Authority: HU
Inventors: David Y Chien
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1992-07-07
Filing date: 1993-07-02
Publication date: 1995-10-30
Also published as: ES2171414T5; US20020150883A1; FI950002A; DE69331845T3; NO950006D0; EP0649537A1; CA2139645A1; NO321185B1; SK284556B6; EP0649537B1; CZ291951B6; DE69331845D1; JP3490085B2; RU2126158C1; AU4662993A; ES2171414T3; JPH07509060A; DK0649537T4; DK0649537T3; PL174686B1

Description

A találmány tárgyát a hepatitisz C vírus (HCV) által okozott fertőzés elterjedésének megakadályozására alkalmas anyagok és módszerek képezik.

Pontosabban, a találmány tárgyát a HCF fertőzések, kimutatásában, megelőzésében • · ·· ··· * .....

- 2 és kezelésében immunológiai reagensként használható polipeptidek, valamint immunesszék és alkalmazási kitek képezik.

A HCV-t először Houghton és munkatársai azonosították és jellemezték, mint a poszt-transzfúziós nem-A, nem-B hepatitisz (NANBH) elsődleges okozóját. Amellett, hogy lényeges információkat szolgáltattak a HCV-röl, Houghton és munkatársai, valamint a velük együttműködők számos általános és specifikus immunológiai reagenst és módszert fedeztek fel [Houghton és munkatársai., EPO Pub. No. 318,216; Houghton és munkatársai., EPO Pub. No. 388,232; Choo és munkatársai., Science, 244, 359-362 (1989); Kuo és munkatársai., Science, 244, 362-364 (1989); Takeuchi és munkatársai., J. Gén. Virol., 71, 3027-3033 (1990); Takeuchi és munkatársai., Gene, 91, 287-291 (1990); Takeuchi és munkatársai., Nucleic Acids Research, 18, 4626 (1990); Miyamura és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 983-987 (1990); Saito és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 65476549 (1990); Choo és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 2451-2455 (1991); Han és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 1711-1715 (1991); Houghton és munkatársai., Hepatology, 14, 381-388 (1991); Weiner és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 89, 3468-3472 (1992)]. A publikációk szolgáltatják a szakmai hátteret, beleértve a HCV-t általánosságban, valamint a HCV polipeptid immunológiai reagensek készítését és alkalmazását. A rövidség érdekében, ezeket a publikációkat a találmány leírásában referenciaként használjuk.

Mások könnyen alkalmazták és kiterjesztették Houghton és munkatársai munkáját [Highfield és munkatársai., UK Pat. App. 2,239,245 (The Welcome

Foundation Ltd.); Wang, EPO Pub. No. 442,394 (United Biomedical Inc.); Leung és munkatársai., EPO Pub. 445,423 (Abbott Laboratories); Habits és munkatársai., • · · · · «

- J EPO Pub. No. 451,891 (Akzo N.V.); Reyes és munkatársai., PCT Pub. No. WO 91/15516 (Genelabs Inc.); Maki és munkatársai., EPO Pub. No. 468,657 (Tonen Corp.); Kamada és munkatársai., EPO Pub. No. 469,348 (Shionogi Seiyaku K.K.); Matsura és munkatársai., J. Virology, 66, 1425 (1992); Kató és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 9524-9528 (1990); Takamizawa és munkatársai., J. Virol., 65, 1105-1113 (1991); Chiba és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 46414645 (1991); Harada és munkatársai., J. Virol., 65, 3015-3021 (1990); Hijikata és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 88, 55475551 (1991); Okamoto és munkatársai., Jpn. J. Exp. Med., 60, 167-177 (1990); Yuasa és munkatársai., J. Gén. Virol., 72, 2021-2024 (1991); Watanabe és munkatársai., Int. J. Cancer, 48, 340-343 (1991)].

A HCV-hordozók és a HCV-vel fertőzött vér vagy vértermékek átvizsgálásának és azonosításának érzékeny, specifikus módszerei nagy előnyt jelentenek a gyógyászatban. A poszt-transzfúziós hepatitisz (PTH) a transzfúziót kapott betegeknek körülbelül 10%-ánál jelentkezik, és a HCV ezen eseteknek majd' 90%-áért felelős. Ebben a betegségben a fő probléma az, hogy más hepatitiszekhez, például a hepatitisz B-hez viszonyítva gyakran (20-55%) krónikus májkárosodásba megy át.

A betegek kezelése, valamint a HCV vérrel, vagy vérkészítményekkel, vagy szoros személyes érintkezéssel való átadásának megelőzése szükségessé teszi megbízható diagnosztikai és prognosztikai eszközök meglétét, mint amilyenek például a HCV polipeptidek, ahhoz, hogy a HCV-hez kapcsolódó ellenanyagokat ki lehessen mutatni. Az ilyen polipeptidek emellett jól használhatók még vakcinaként immunterápiás gyógyászati készítményekként is a betegség megelőzésében és/vagy kezelésében. Mivel a HCV egy viszonylag új ágens, folyamatosan szükség ··· ···

-4van arra, hogy meghatározzunk további immunológiai ágenseket is, amelyek lehetővé teszik a betegség klinikai lefolyásának további vizsgálatát, valamint a HCV járványtanának vizsgálatát a népességben.

A feltalálók további szerológiai vizsgálatokat végeztek a HCV antigénekkel, és felfedezték, hogy azok az immunesszék, amelyekben olyan HCV burokantigéneket használnak, amelyek megtartották a természetes konformációjukat, sokkal hatékonyabban mutatják ki az anti-HCV ellenanyagokat mint azok, amelyek ugyanazokat az antigéneket lineáris epitopokformájában alkalmazzák.

Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás hepatitisz C vírus (HCV) elleni ellenanyagok kimutatására olyan emlős testkomponensben, amelyről feltételezhető, hogy tartalmazza az említett ellenanyagokat, oly módon, hogy az említett testkomponenseket érintkezésbe hozzuk egy olyan HCV antigénnel, amely a HCV E1 vagy E2 doménjének konformációs epitopját tartalmazza, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik, hogy immunológiai reakció jöjjön létre az ellenanyagok (ha vannak egyáltalán) és az antigén között, és kimutatjuk az említett ellenanyagok és az említett antigének közötti immunkomplexek jelenlétét (ha vannak egyáltalán).

Egy másik megvalósítási mód szerint a módszerben az E1 és/vagy E2 doménekben kódolt antigéneket, vagy magukat az E1 és/vagy E2 antigéneket használjuk. Néhány megvalósítási mód szerint az antigéneket Vaccinia vektorokról expresszálhatjuk, illetve CHO sejtekben expresszálhatjuk. Emellett a találmány néhány megvalósítási módja szerint egy másik antigént használunk, amely egy másik konformációs epitopban található.

A találmány tárgya továbbá eljárás vér vagy vérkészítmények HCV-re való átvizsgálására, mielőtt az ilyen vért vagy vérkomponenst vértermék készítésére használjuk, az alábbi lépéseket alkalmazva:

····· ·· « ’ «····· · · ·· .1 ·· · · « ·

a. egy potenciális donorból származó testkomponenst egy HCV antigénnel reagáltatunk, amely a HCV E1 vagy E2 doménjéböl származó konformációs epitopot tartalmaz, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik, hogy immunológiai reakció játszódjon le a testkomponensben levő ellenanyagok (ha vannak egyáltalán) és az antigén között;

b. kimutatjuk az antigén és az ellenanyag között létrejövő komplexeket (ha vannak egyáltalán); és

c. az említett donortól származó összes vért és vérkészítményt eldobjuk, ha az említett komplexeket a b. lépésben ki lehetett mutatni.

A találmány tárgya továbbá egy kit, amellyel HCV ellenanyagokat lehet kimutatni, azzal jellemezve, hogy a kit a HCV E1 vagy E2 doménjéböl származó konformációs epitopot tartalmazó HCV antigént tartalmaz, emellett tartalmaz standardokat, megfelelő tárolóedényekbe csomagolva, valamint a kit komponenseinak alkalmazásához szükséges instrukciókat.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékeit ábrákat.

Az 1. ábrán sematikusan jelezzük a HCV poliprotein feltételezett doménjait.

A 2. ábrán sematikusan jelezzük a pSC59 vektor néhány tulajdonságát.

A 3A., 3B. és 3C. ábrákon az l-es, ll-es és lll-as csoport betegeinek százalékát látjuk, akik az egyes HCV antigénnel szemben ELISA-ban reakcióképességet mutatnak.

A HCV antigén szakkifejezés egy olyan polipeptidre vagy polipeptid analógra (például mimitopokra) vonatkozik, amely olyan aminosav szekvenciát (és/vagy aminosav analógokat) tartalmaz, amely legalább egy HCV epitopot határoz meg. Az epitopot meghatározó szekvenciák általában egy HCV fehérje aminosav szekvenciájának felelnek meg (akár azonosak, akár olyan természetes aminosavanalógokkal helyettesítve, amelyek nem roncsolják el az epitopot). Az epitopot

-6meghatározó szekvencia általában 5 vagy több aminosavból áll, még általánosabban 8 aminosavból vagy többől, és a legtipikusabb, ha mérete 10 vagy több aminosav. Ami a konformációs epitopokat illeti, az epitopot meghatározó szekvencia igen eltérő lehet, mivel az az általános vélemény, hogy ezeket az epitopokat az antigén háromdimenziós alakja (például a természetes térszerkezet) hozza létre. Tehát az epitopot meghatározó aminosavak száma alacsony lehet, de a molekulán eltérő pozíciókban lehetnek elszórva (sőt dimerek esetében különböző molekulákon is lehetnek), és a helyes epitop konformációba a térszerkezet kialakulásakor kerülnek. Az epitopot meghatározó csoportok közötti antigének aránya nem feltétlenül kritikus az epitop konformációs szerkezete szempontjából. Például ezeknek az elválasztó szekvenciáknak a deléciója vagy szubsztitúciója nem feltétlenül érinti a konformációs epitopokat, feltéve, hogy az epitop konformáció szempontjából kritikus szekvenciák megmaradnak (azaz például a diszulfidhidak kialakításában résztvevő ciszteinek, a glikozilezési helyek, stb.).

A jelen találmány szerinti HCV antigének a HCV E1 és/vagy E2 (burok) doménjeinek konformációs epitopjait tartalmazzák. Az E1 doménröl, amelyről az az általános vélemény, hogy a vírus burokfehérjének felel meg, jelenleg úgy becsülik, hogy a HCV poliprotein 192-383-as aminosavaiból áll (PCT Pub. No. WO 91/15771,

1. ábra). Egy CHO rendszerben expresszálva (glikozilezve) az a vélemény alakult ki, hogy látszólagos molekulasúlya 35 kD, SDS-PAGE alapján meghatározva. Az E2 fehérjéről, amelyet korábban NS 1-nek neveztek, az a vélemény alakult ki, hogy a poliprotein 384-800-as aminosavaira terjed ki, és szintén egy burokfehérje. Egy CHO rendszerben expresszálva (glikozilezve) az a vélemény alakult ki, hogy látszólagos gél-molekulasúlya 72 kD. Az nyilvánvaló, hogy ezek a fehérje végpontok becslések (azaz az E2 C-terminálisa valahol a 750-820-as aminosav régióban lehet). Az is nyilvánvaló, az előzőkben említett PCT bejelentésben szereplő prototípus izolátum • ·

- 7HCV1 szekvenciát csak illusztrálás céljából említjük, és bármely HCV izolátum (lásd a máshol idézett referenciákat) megfelelő forrása lehet az E1 és/vagy az E2 szekvenciának, a jelen találmány gyakorlati végrehajtásához.

A jelen találmány során használt E1 és E2 antigének lehetnek teljes hosszúságú virális fehérjék, azoknak lényegében teljes hosszúságú verziói, vagy azoknak funkcionális fragmensei (azaz például olyan fragmensek, amelyekről nem hiányzik egy konformációs epitop kialakításához vagy megtartásához szükséges szekvencia). Emellett a jelen találmány szerinti HCV antigének tartalmazhatnak más szekvenciákat is, amelyek nem blokkolják vagy akadályozzák meg egy számunkra érdekes konformációs epitop kialakulását. Egy konformációs epitop jelenléte vagy távolléte könnyen meghatározható, ha a számunkra érdekes antigént egy ellenanyaggal átvizsgálunk (poliklonális szérum, vagy a konformációs epitopra nézve monoklonális ellenanyag), és reaktivitását összehasonlítjuk az antigén denaturált verziójának aktivitásával, amely csak a lineáris epitopokat tartja meg (ha egyáltalán megtart valamit). Az ilyen, poliklonális ellenanyagokat alkalmazó vizsgálatok során előnyös lehet, ha a poliklonális szérumot először a denaturált antigénnel adszorbeáltatjuk, és megfigyeljük, hogy visszatartja-e az ellenanyagokat a számunkra érdekes antigénen.

A jelen találmány szerinti HCV antigéneket bármely olyan, szokványos módszerrel előállíthatjuk, amely a számunkra érdekes konformációs epitopot szolgáltatja. Például az emlős sejtekben vagy rovarsejtekben végzett rekombináns expresszió egy előnyben részesített módszer glikozilezett E1 és/vagy E2 antigének előállítására natív konformációban. Az azonban lehetséges, amint az a fehérjékre közismert, hogy az antigéneket más rekombináns gazdaszervezetben expresszáljuk, és a fehérjét a kinyerés után renaturáljuk. Az is nyilvánvaló, hogy kémiai szintézissel • · • · · · · ·

-8is előállíthatok konformációs antigén mimitopok, amelyek keresztreakcióba lépnek a természetes antigén konformációs epitopjával.

Az E1 és/vagy E2 komplexei (amelyeket aggregátumoknak is neveznek), amelyek több mmint egy E1 vagy E2 monomert tartalmaznak, szintén előnyös antigének. Az ET.E1 dimerek, E2:E2 dimerek és az E1:E2 heterodimerek is a jelen találmány oltalmi körébe tartozó antigének. Az aggregátumok közé tartozhatnak nagyobb formák is, molekulasúlyuk meghaladhatja a 800 kD-t.

A fúziós polipeptid szakkifejezés alatt olyan polipeptidet értünk, amelyben a HCV antigén(ek) aminosavak egyetlen összefüggő láncának részét képezi(k), amely lánc nem fordul elő a természetben. A HCV antigéneket közvetlenül egymáshoz kapcsolhatjuk peptidkötésekkel, illetve közbeékelt aminosav szekvenciák révén. A fúziós polipeptidek tartalmazhatnak a HCV szempontjából exogén aminosav szekvenciákat.

Az általános szilárd hordozó egy olyan szilárd testet jelent, amelyhez az egyes HCV antigének, vagy a HCV antigéneket tartalmazó fúziós polipeptid kovalens kötéssel vagy nem-kovalens módon, azaz például hidrofób kölcsönhatások révén hozzá van kötve.

A testkomponens szakkifejezés egy emlős egyednek (például antropoidnak, azaz embernek) egy olyan folyadékát vagy szövetét jelenti, amely általában az egyed által termelt ellenanyagokat tartalmaz. Az ilyen, szakterületen jártas szakember számára ismert részek közé tartozhat, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vér, a plazma, a szérum, a gerincfolyadék, a nyirokfolyadék, a légzési, emésztési vagy genitourinális szervek váladékai, a könny, nyál, tej, fehér vérsejtek és mielómák. A testkomponensek közé tartoznak a biológiai folyadékok. A biológiai folyadék szakkifejezés egy szervezetből nyert folyadékra vonatkozik. Néhány biológiai folyadékot más termékek, mint például a véralvadási faktorok (azaz például

- 9 a Vlll-as, C faktorok), szérumalbumin, növekedési hormon és hasonlók előállítására használunk. Ezekben az esetekben lényeges, hogy a biológiai folyadék forrása mentes legyen a vírusfertőzéstől, azaz például a HCV-től.

Az immunológiailag reaktív szakkifejezés azt jelenti, hogy a kérdéses antigén specifikusan azokkal az anti-HCV ellenanyagokkal reagál, amelyek egy HCV-vel fertőzött egyed testkomponensében találhatók.

Az immunkomplex szakkifejezés jelentése egy olyan kombináció, amely akkor jön létre, amikor egy ellenanyag egy antigénen levő epitophoz kötődik.

Az E1 szakkifejezés a továbbiakban egy olyan fehérjét vagy polipeptidet jelent, amely egy HCV poliprotein első 400 aminosavában expresszálódik, és néha E vagy S fehérje néven említik. Természetes formájában egy 35 kD méretű glikoprotein, amelyet a membránnal kialakított szoros kapcsolatban lehet megtalálni. A legtöbb természetes HCV törzsben az E1 fehérje a virális poliproteinben van kódolval, a magfehérjét (C) követően. Az E1 fehérje a teljes poliproteinnek körülbelül a 192-es aminosavától körülbelül a 383-as aminosaváig terjed. Az E1 szakkifejezés a továbbiakban az analógokra és csonkított formákra is vonatkozik, amelyek a természetes E1-gyel immunológiai keresztreakciót adnak.

Az Έ2 szakkifejezést egy olyan fehérjére vagy polipeptidre vonatkozik, amely egy HCV poliprotein első 900 aminosavában expresszálódik; néha NS1 fehérje néven is említik. A természetes formájában 72 kD méretű glikoprotein, amely a membránnal szoros kapcsolatban található. A legtöbb természetes HCV törzsben az E2 fehérje a virális poliproteinben kódolódik, az E1 fehérjét követően. Az E2 fehérje körülbelül a 384-as aminosavtól körülbelül a 820-as aminosavig terjed. Az Έ2 szakkifejezés a továbbiakban az analógokra és csonkított formákra is vonatkozik, amelyek a természetes E2-vel immunológiai keresztreakciót adnak.

··· «·«

- 10Αζ aggregátum szakkifejezés egy olyan E1 és/vagy E2 komplexre vonatkozik, amely egynél több E1 vagy E2 monomert tartalmaz. Az E1:E1 dimerek, E2:E2 dimerek és E1:E2 heterodimerek mind ennek a meghatározásnak a körébe tartozó aggregátum-ok. Az agrregátumoknak lehetnek nagyobb formáik is, molekulasúlyuk meghaladhatja a 800 kD-t is.

A tisztított szakkifejezés alatt fehérjékre alkalmazva egy olyan készítményt értünk, amelyben a keresett fehérje a készítményben levő összes fehérjekomponensnek legalább 35%-át képezi. A keresett fehérje előnyösen legalább 40%-át, előnyösebben legalább 50%-át, még előnyösebben legalább 60%át, még előnyösebben legalább 80%-át, ennél is előnyösebben legalább 90%-át, és legelőnyösebben legalább 95%-át képezi a teljes fehérjekomponensnek. A készítmény tartalmazhat egyéb vegyületeket is, mint például szénhidrátokat, lipideket, oldószereket, sókat és hasonlókat, anélkül, hogy ez érintené a százalékos tisztaság meghatározását. Egy izolált HCV fehérje egy olyan HCV fehérjekészítmény, amely legalább 35%-os tisztaságú.

Az izolált polipeptid szakkifejezés egy olyan polipeptidre vonatkozik, amely lényegében mentes az egyéb HCV virális komponensektől, főleg a genomiális HCV polínukleotidtól. Egy polipeptid készítmény lényegében mentes egyéb komponensektől, ha a készítményben a polipeptid súlya a polipeptid és az egyéb komponensek összes súlyának legalább 70%-át képezi, előnyösebben legalább 89%-át, még előnyösebben körülbelül 90%-át, és legelőnyösebben 95%-át, vagy többet.

A találmány szerinti immunesszé módszerek az E1 és E2 doménekből származó HCV antigéneket használják, és ez megtartja azokat a konformációs epitopokat, amelyeket a HCV-vel fertőzött egyedek szérumaiban levő ellenanyagok felismernek. Minden egyes antigénnek van legalább egy olyan konformációs • · · ·

- 11 epitopja, amely a természetben előforduló HCV részecskében vagy fertőző termékében fordul elő, amit az antigénnek az ellenanyaggal szemben mutatott immunreaktivitása mutat egy HCV-vel fertőzött egyed testkomponenseiben, valamint az epitop immunreaktivitásának elvesztése mutat az antigén denaturálása után. Az antigén hossza elegendő ahhoz, hogy fenntartson egy immunreaktív konformációs epitopot, amely az említett epitoppal asszociálódik. A találmány oltalmi körébe tartozik az is, hogy egy antigénen egynél több konformációs epitop legyen. Gyakran az immunesszében használt természetes burokantigének majdnem teljes hosszúságúak, de lehetnek csonkítottak is, például az oldhatóság vagy a szekréció fokozása érdekében (azaz például a membránkötö domének deléciója révén). Az is a találmány oltalmi körébe tartozik, hogy vagy egyedi antigéneket használunk, vagy az antigének kombinációit vagy aggregátumait. Tehát az immunesszék használhatnak E1 epitopokat, E2 epitopokat, a természetes E1 és E2 aggregátumait vagy kombinációit. Az is a találmány oltalmi koréba tartozik, hogy lineáris epitopokkal rendelkező antigéneket használjunk HCV burok konformációs epitopokkal.

A konformációs epitopok jelenlétének kimutatására szolgáló módszerek ismertek a szakirodalomban, és néhányat a szabadalmi példák között is felsorolunk.

A HCV1 nukleotid szekvenciájában kódolt feltételezett aminosavak, valamint más bizonyítékok alapján a kódolt HCV poliprotein feltételezhető fehérjedoménjei és a hozzávetőleges határaik az alábbiak:

Feltételezett dómén

C (nukleokapszid fehérje)

E1 (vírusburok fehérje)

E2/NS1 (burok?)

NS2

NS3 (proteáz?)

NS4

NS5 (polimeráz)

- 12Hozzávetőleqes határ (aminosav sorszám)

1-191

192-383

384-800

800-1050

1050-1650

1651-2100

2100-3011 (vége)

Ezek a domének azonban csak feltételezések. Például az E1-NS2 határ feltételezhetően a 750-810-es régióban található, és az NS3-NS4 határ körülbelül 1640-1650-nél található. Arra is van bizonyíték, hogy a C 191 aminosavas verziója egy prekurzor, amely tovább processzálódik (azaz körülbelül 170 aminosav hosszúságra), és az NS2, NS4 valamint az NS5 fehérjék tovább processzálódnak két érett fehérjére. A domének kapcsolatát az 1. ábrán mutatjuk be.

Az E1 és E2 antigének előállítási eljárásait, beleértve azokat is, amelyeknek természetes a konformációjuk, Spaete és munkatársai írták le [Spaete, R. és munkatársai., Virology, 188, 819-830 (1992); WO92/08734], amely publikációkat referenciaként kezelünk a továbbiakban. Általában olyan gazdasejteket választunk, amelyek lehetővé teszik a természetes konformációs epitopok kialakulását az expresszált burokfehérjékben; ezek a gazdasejtek lehetnek például állati sejtek, rovarsejtek, élesztőseitek és hasonlóak.

Az eukarióta gazdasejtek lehetnek élesztők és emlős sejtek sejttenyészetben.

A Saccharomyces cerevisiae és a Saccharomyces carlsbergiensis a leggyakrabban használt élesztő gazdaszervezetek, és kényelmes gomba gazdaszervezetek. Az élesztő kompatibilis vektorok olyan markereket tartalmaznak, amelyek lehetővé • · · · ······ · · «· teszik a sikeres transzformánsok szelekcióját, azáltal, hogy az auxotróf mutánsokat prototróffá teszik, vagy a vad típusú sejteket nehézfémekre rezisztenssé teszik. Az élesztőkompatibilis vektorok alkalmazhatják a 2 mikronos replikációs origót [Broach és munkatársai., Methods in Enzymology, 101,307 (1983)], a CEN3 és az ARS1 kombinációját, vagy bármely egyéb módszert a replikáció biztosítására, mint például az olyan szekvenciákat, amelyeknek az az eredménye, hogy egy megfelelő fragmens beépül a gazdasejt genomjába. Az élesztővektorokhoz ismertek a kontrollszekvenciák, ide tartoznak a glikolitikus enzimek szintézisének promoterei [Hess és munkatársai., J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 (1968); Holland és munkatársai., Biochemistry, 17, 4900 (1978)], beleértve a 3-foszfoglicerát kináz promoterét [Hitzeman, Journal of Biological Chemistry, 255, 2073 (1980)]. Terminátorok is ide tartozhatnak, mint például az enoláz génből származó terminátorok [Holland, Journal of Biological Chemistry, 256, 1385 (1981)]. Különösen jól használhatók azok a kontroll rendszerek, amelyek a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) promotert vagy az alkohol dehidrogenáz (ADH) szabályozható promotert tartalmazzák, a terminátorok is a GAPDH-ból származnak, és ha szekrécióra van szükség, akkor az élesztő alfa-faktorból származó vezérszekvenciát. Emellett a transzkripciós szabályozó régió és a transzkripciós iniciációs régió, amelyek működés szempontjából össze vannak kötve egymással, olyanok lehetnek, hogy ilyenek a vad típusú szervezetben nem találhatók meg természetes asszociációban. Ezeket a rendszereket részletesen leírják az 1984. október 3-án publikált EPO 120,551-ben, az 1984. augusztus 22-én publikált EPO 116,201-ben és az 1985. december 18-án publikált EPO 164,556-ban, amelyeket a jelen találmány szerzői nyújtottak be, és ezért a továbbiakban referenciaként hivatkozunk rájuk.

- 14Az expresszióhoz gazdaszervezetként hozzáférhető emlős sejtvonalak ismertek a szakirodalomban. Ide tartoznak az American Type Culture Collection-nél (ATCC) hozzáférhető immortalizált sejtvonalak, mint például a HeLa sejtek, aranyhörcsög petefészeksejtek (CHO), bébihörcsög vesesejtek (BHK), és számos egyéb sejtvonal. Az emlős sejtekhez használható promoterek is jól ismertek a szakirodalomban, ide tartoznak a virális promoterek, mint például a Simian Vírus 40 (SV40) [Fiers, Natúré, 273, 113 (1978)], a Rous szarkóma vírus (RSV), adenovírus (ADV) és szarvasmarha papillómavírus (BPV) promoterek. Az emlős sejteknek is szükségük lehet terminátor szekvenciákra és poliA addíciós szekvenciákra; enhanszer szekvenciákra, amelyek fokozzák az expressziót, valamint olyan szekvenciákra, amelyek a gén amplifikálódását okozzák. Ezek a szekvenciák ismertek a szakterületen.

Az emlős sejtekben való replikációra alkalmas vektorok ismertek a szakterületen jártas szakember számára, ide tartozhatnak virális replikonok, vagy olyan szekvenciák, amelyek biztosítják a megfelelő, a NANBV epitopokat kódoló szekvenciák integrálódását a gazdaszervezet genomjába.

Az idegen DNS expresszálására használt vektor, amely vakcina készítésére is használható, a Vaccinia vírus. Ebben az esetben a heterológ DNS-t a Vaccinia genomjába építjük be. Az idegen DNS-nek a vaccinia vírus genomjába való beépítéséhez szükséges technikák ismertek a szakterületen jártas szakember számára, és például a homológ rekombináción alapulnak. A heterológ DNS-t általában egy olyan génbe illesztik be, amely a természetben nem feltétlenül szükséges, például a timidin kináz génbe(tk), amely szelekciós markerként is szolgál. A rekombináns vírusok készítését nagymértékben megkönnyítő plazmidokat már publikáltak [Mackett és munkatársai., J. Virol., 49, 857 (1984); Chakrabarty és munkatársai., Mól. Cell. Bioi., 5, 3403 (1985); Moss: GENE TRANSFER VECTORS

- 15 FÓR MAMMALIAN CELLS (Miller and Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), 10. old.]. A HCV polipeptid expressziója azután olyan sejtekben vagy egyedekben történik meg, amelyeket az élő rekombináns vakcinia vírussal immunizáltak.

A kívánt szekvenciát kódoló HCV cDNS szegmentet egy Vaccinia vektorba építünk be. A polipeptidet kódoló szekvencia kapcsolható egy leader szekvenciához. A leader szekvencia lehet a szöveti plazminogén aktivátorból (TPA), vagy egyéb forrásból, azaz például béta-globinból származó szekvencia. A heterológ polinukleotidot egy olyan vakcinia vektorba lehet bépíteni, amely a pSC11 módosított változata, egy klónozó helyet tartalmazó polilinker szekvencia hozzáadása révén.

Ahhoz, hogy kimutassuk, hogy a HCV polipeptid a vakcinia vektorról expresszálódik-e, a BSC 1 sejteket a rekombináns vektorral fertőzhetjük, majd mikroszkóp tárgylemezen szaporíthatjuk őket, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik az expressziót. A sejteket azután acetonnal fixálhatjuk és immunfluoreszcencia vizsgálatot végezhetünk, amelyről tudott, hogy anti-HCV ellenanyagokat tartalmaz olyan polipeptiddel szemben amelyet a HCV genomnak az a szegmentje kódol, amely szegmentből a rekombináns vektorban levő HCV vektor származott.

Az eukarióta vagy virális genomok expresszálására használt egyéb rendszerek közé tartoznak a rovarsejtek, és az ilyen sejtekben használható vektorok. Ezek a rendszerek ismertek a szakirodalomban, ide tartoznak például a bakulovirus Autographa califomica nukleáris polihedrózis vírusból (AcNPV) származó rovar expressziós transzfer vektorok, ami egy helperfüggetlen, virális expressziós vektor. Az ebből a rendszerből származó expressziós vektorok általában az erős virális polihedrin gén promoterét használják, hogy meghajtsák a heterológ gének expresszióját. Jelenleg az idegen géneknek az AcNPV-be való bejuttatására

- 16 legáltalánosabban használt transzfer vektor a pAc373. Számos más vektort is terveztek, amelyeket a szakterületen jártas szakember ismer, azzal a céllal, hogy jobb legyen az expresszié. Ezek közé tartozik például a pVL985 (amely a polihedrin startkodont ATG-röl ATT-ra változtatja, és amely egy BamHI klónozási helyet juttat be az ATT utáni 32 bázispárra) [Luckow and Summers, Virology, 17, 31 (1989)]. A nem fúzionáltatott idegen fehérjék jó expressziójához általában olyan idegen génekre van szükség, amelyeknek ideális esetekben egy rövid leader szekvenciájuk van, amely megfelelő transzlációs iniciációs szignált tartalmaz, megelőzve egy ATG startjelet. A plazmid tartalmaz emellett egy polihedrin poliadenilezési szignált és egy ampicillin-rezisztencia (amp) gént is, valamint az Escherichia coli-ban való szelekcióhoz és szaporításhoz szükséges replikációs origót.

A heterológ DNS-nek a bakulovírusban levő kívánt helyre való bejuttatására szolgáló eljárások ismertek a szakirodalomban [Summer and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Bo. 1555, Ju és munkatársai., (1987); Smith és munkatársai., Mól. Cell. Bioi., 3, 2156-2165 (1983); Luckow and Summers, Virology, 17, 31 (1989)]. Az inszerciót megtehetjük egy olyan génbe, mint például a polihedrin gén, homológ rekombinációval; az inszerciót végezhetjük egy olyan restrikciós enzim hasítási helyre, amelyet a kiválasztott bakulovírus génbe juttattunk be. A beépített szekvenciák azok lehetnek, amelyek a poliprotein összes, vagy különböző szegmentjeit kódolják, illetve egyéb nyitott leolvasási keretek, amelyek virális polipeptideket kódolnak.

A poszttranszlációs módosítás jeleit, mint például a szignálpeptid hasítás, proteolitikus hasítás, foszforilezés jeleit láthatóan felismerik a rovarsejtek. A szekrécióhoz és a sejtmagban való felhalmozódáshoz szükséges jelek is láthatóan megőrződtek a gerinctelen és gerinces sejtek között. A gerinctelen sejtekben is aktív, gerinces sejtekből származó szignálszekvenciák ismertek a szakterületen, ilyen lehet

- 17például a humán interleukin-2 szignál (IL-2_S), amely a sejtből való kijuttatás szignálja, ezt a rovarsejtek felismerik és helyesen távolítják el.

Immunesszé formák

A jelen találmány szerinti HCV E1 és E2 antigéneket lényegében bármely olyan esszéformában használhatjuk, amely egy ismert antigént használ antitestek kimutatására. Természetesen el kell kerülni, vagy módosítani kell azokat a formákat, amelyekben a HCV számunkra érdekes konformációs epitopjai denaturálódnak. Az összes ilyen vizsgálatnak egy közös tulajdonsága az, hogy az antigént egy olyan testkomponenssel hozzuk érintkezésbe, amelyről feltételezzük, hogy HCV ellenanyagokat tartalmaz, olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik, hogy az antigén kötődjön bármely ilyen, a komponensben jelenlevő ellenanyaghoz. Az ilyen körülmények általában fiziológiás hőmérséklet, pH és ionerősség, fölöslegben levő antigén használatával. Az antigénnek a mintával való inkubálását az antigént tartalmazó immunkomplexek kimutatása követi.

Az immunesszék tervezése számos eltérést tartalmazhat, és a szakterületen számos forma ismert. A protokollok használhatnak például szilárd hordozókat vagy immunprecipitációt. A legtöbb vizsgálatban jelzett ellenanyagot vagy polipeptidet használnak; a jelzések lehetnek például enzimes, fluoreszcencia, kemilumineszcencia, radioaktív vagy festékmolekula jelzések. Ismertek azok az eljárások is, amelyek felerősítik az immunkomplexekből származó jeleket; ilyenek lehetnek például a biotint és avidint alkalmazó vizsgálatok, az enzimjelzést alkalmazó vizsgálatok, mint például az ELISA vizsgálatok.

Az immunesszé korlátozás nélkül lehet heterogén vagy homogén formában, lehet standard vagy kompetitív típusú. A heterogén formában a polipeptid tipikusan egy szilárd mátrixhoz vagy hordozóhoz kötődik, hogy ezáltal az inkubálás után

- 18megkönnyítsük a mintának a polipeptidtől való elválasztását. A használható szilárd hordozó lehet például nitrocellulóz (lehet membrán vagy mikrotiter luk formában), polivinil klorid (például lemezek vagy mikrotiter lukak formájában), polisztirol latex (például gyöngyök vagy mikrotiter lemezek formájában), polivinilidén fluorid (Immunion néven is ismert), diazotált papír, nylonmembrán, aktivált gyöngyök és Protein A gyöngyök. Például a Dynatech Immunion 1 vagy Immunion 2 mikrotiter lemezeket vagy 0,635 cm-es polisztirol gyöngyöket (Precision Plastic Ball) használhatunk heterogén formában. Az antigén polipeptideket tartalmazó szilárd hordozót általában mossuk a vizsgált mintától való elválasztás után és a megkötött ellenanyagok kimutatása előtt. Mind standard mind kompetitív formák ismertek a szakterületen.

A homogén formában a vizsgált mintát az oldatban levő antigének kombinációjával inkubáljuk. Lehet például olyan körülmények között, amelyek kicsapják a keletkező összes antigén-ellenanyag komplexet. Ezeknek a vizsgálatoknak mind standard mind kompetitív formái ismertek.

A standard formában az ellenanyag-antigén komplexekben levő HCV ellenanyagok mennyiségét közvetlenül követjük. Ezt elvégezhetjük úgy, hogy meghatározzuk, vajon a jelzett anti-xenogén (azaz anti-humán) ellenanyagok, amelyek felismernek egy anti-HCV ellenanyagon levő epitopot, kötődnek-e komplexképződés következtében. A kompetitív formában a mintában levő HCV ellenanyagok mennyiségét úgy következtetjük ki, hogy követjük egy ismert mennyiségű jelzett ellenanyag (vagy más versengő ligandum) megkötésére gyakorolt kompetitív hatást a komplexben.

Az anti-HCV ellenanyagot tartalmazó komplexeket (vagy a kompetitív vizsgálatok esetében, a versengő ellenanyagokat) bármely ismert technikával kimutathatjuk, a formától függően. Például, a komplexben levő jelzetlen HCV

- 19 ellenanyagok mennyiségét kimutathatjuk, egy jelzéssel (például enzimjelzéssel) komplexet képező antixenogén lg konjugátumot használva.

Egy immunprecipitációs vagy agglutinációs vizsgálati formában. a HCV antigének és az ellenanyag közötti reakció egy hálózatot hoz létre, amely kicsapódik az oldatból vagy szuszpenzióból, és a csapadéknak egy látható rétegét vagy filmjét hozza létre. Ha a vizsgált mintában nincs jelen anti-HCV ellenanyag, akkor nincs látható csapadék sem.

Jelenleg három specifikus típusú részecske-agglutinációs (PA) vizsgálat létezik. Ezeket a vizsgálatokat különböző antigének elleni ellenanyagok kimutatására használják, egy hordozót beborítva velük. Ennek a vizsgálatnak az egyik típusa a hemagglutinációs vizsgálat, vörös vérsejteket (RBC) alkalmazva, amelyeket az RBChez antigént (vagy ellenanyagot) passzívan adszorbeáltatva érzékenyítünk. A testkomponensben jelenlevő specifikus antigén ellenanyagok hozzáadása, ha van ilyen, azt okozza, hogy a tisztított antigénnel borított RBC-k agglutinálódnak.

Ahhoz, hogy elimináljuk a potenciális aspecifikus reakciókat a hemagglutinációs vizsgálatban, a PA-ban az RBC helyett két mesterséges hordozót használhatunk. Ezek közül a legáltalánosabbak a latexrészecskék. Azonban zselatinrészecskék is használhatók. Számos egyéb vizsgálat, amely ezeket a hordozókat használja, a tisztított antigénekkel borított részecskék passzív agglutinációján alapul.

A konformációs epitopokat tartalmazó HCV E1 és E2 antigéneket általában kit formájában csomagolják az ilyen immunesszékben való felhasználás céljából. Normális esetekben a kit külön tartóedényekben tartalmazza a természetes HCV antigént, a kontroll ellenanyag készítményeket (pozitív és/vagy negatív), a jelzett ellenanyagot, ha az esszé kiviteléhez erre van szükség, valamint jelképző reagenseket (például enzimszubsztrátok), ha a jelzés nem kelt közvetlenül jeleket. A

- 20 természetes HCV antigén már lehet közvetlenül hozzákötve egy szilárd hordozóhoz, vagy lehet külön, olyan reagensekkel csomagolva, amelyekkel hozzá lehet kötni a hordozóhoz. A vizsgálat kivitelezéséhez szükséges instrukciók (írott formában, kazettán, CD-ROM-on, stb.) is megtalálhatók általában a kitben.

A természetes HCV antigént alkalmazó immunesszék jól használhatók vér átvizsgálására, olyan készítmények készítésére, amelyekből a potenciálisan fertőző HCV hiányzik. A vér előkészítésében használt módszer az alábbi lépéseket tartalmazza. Egy véradóból származó testkomponenst, előnyösen vért vagy vérkomponenst természetes HCV E1 vagy természetes HCV E2 antigénnel reagáltatunk, és ezzel lehetővé tesszük az immunológiai reakciót a HCV ellenanyagok (ha van ilyen) és a HCV antigén között. Kimutatjuk, hogy a reakció következtében anti-HCV ellenanyag - HCV antigén komplexek keletkeznek-e. A vértartalékot olyan donorok véréből képezzük, akiknek vérében nem található a természetes HCV antigénekkel, azaz az E1-gyel és E2-vel szemben ellenanyag.

Azokban az esetekben, amikor a HCV antigénre pozitív reakciót kapunk, célszerű megismételni az immunesszét, hogy csökkentsük a hamis pozitív eredmények valószínűségét. Például vértermékek (azaz például vértranszfúzió, plazma, Vlll-as faktor, immunglobulin, stb.) készítésénél nagymennyiségű vért kell átvizsgálni, ekkor általában a szűrővizsgálati” teszt érzékenységét növelik (annak biztosítására, hogy fertőzött minta nem marad kimutatlanul) a specifitás rovására; azaz a hamis pozitívok aránya megnő. Tehát az a jellemző, hogy azoknak a donoroknak a további vizsgálatát, akik ismételten reaktívak, azaz az adott vérük két vagy több immunesszében pozitívnak bizonyult, csak elhalasztják.

Az alábbi példákkal csak illusztrálni akarjuk a találmányt, és nem szándékunk, hogy a találmány oltalmi körét bármi módon korlátozzuk.

1. Példa

A PSC59 poli készítése

A konstrukcióhoz használt HCV szekvenciát a pCSP-1 plazmidból izoláljuk egy Stul részleges/BglII fragmens formájában. Ez a fragmens a HCV-1 poliprotein első metioninjától a 966-os pozícióban levő aszparaginsavig terjed. Az ebben levő domének a nukleokapszid, a C, mindkét feltételezett burok glikoprotein, az E1 és E2, és az NS2-nek egy csonkított formája. Emellett a fragmens tartalmaz körülbelül 60 bázispárt, amely megfelel a HCV genom 5'-nem transzlálódó régiójának.

A fragmenst Klenow polimerázzal kezeljük tompa végek előállítása céljából, majd egy vakcinia vektor, a PSC59 Stul hasítási helyére klónozzuk (Dr. B. Moss-tól kaptuk, National Institutes of Health, Bethesda, Md). A vektort a 2. ábrán mutatjuk be. A vektor polilinker szekvenciájába való ligálás eredményeképpen az NS2 régió C-terminálisa egy további Pro-Tyr szekvenviát tartalmaz.

2. Példa

A HCV poliprotein fragmenst, beleértve az E1-et és E2-t is, kódoló Vaccinia vírus törzsállományok készítése

A rekombináns Vaccinia vírus szűrővizsgálatát lényegében Mackett és munkatársai leírása alapján végeztük [Mackett és munkatársai., DNS Cloning, Π, 191-211 (Ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford, Anglia, 1985)]. Pontosabban Afrikai zöldmajom vesesejtek (BSC40) egybefüggő egysejtrétegét (6 cm-es csésze) vad típusú Vaccinia vírussal (WR törzsek) fertőzzük, 0,05-ös fertőzési multiplicitással (MOI). Két óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on, majd a sejteket 25 pg PSC59 poli DNSsel fertőzzük, a kalcium-foszfát módszer alkalmazásával. Négyórás inkubálás után a tápközeget normál tápközegre cseréljük le, és a sejteket további 48 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on. A sejteket oly módon nyerjük ki, hogy lekaparjuk a csészéről • 9 • · ♦ ν ·· . 22 őket, majd a vírus 3 fagyasztási-olvasztási ciklussal szabadítjuk fel, és a sejtlizátumban levő felszabadított vírust -80 °C-on tároljuk.

Ahhoz, hogy rekombináns vírusra végezzünk szűrővizsgálatot, humán 143 TK sejtek egybefüggő egysejtrétegét fertőzzük két óra hosszat a sejtlizátummal, tízszeres sorozathigításban. Az oltóanyag eltávolítása után 25 pg/ml 5brómdezoxiuridin tartalmazó szérumközegben készített 1%-os agarózt adunk a sejtekhez, majd a sejteket 72 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. A tarfoltokat úgy tesszük láthatóvá, hogy a sejtréteget 0,01% neutrálvöröst tartalmazó 1% agarózzal rétegezzük le, majd a sejteket éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A felülrétegzett agarózt úvatosan eltávolítjuk, majd a sejtrlteget egy nitrocellulóz szűrőlap mesterkópiára blottoljuk (Schleicher and Schüll, BA85, 0,45 μιτι). A mesterkópiáról másolatokat készítünk, és ^²P-vel jelzett HCV-próba szekvenciával vizsgáljuk át. A pozitív tarfoltokat izoláljuk a mesterkópiáról, 0,5 ml szérummentes közegbe tesszük őket, majd kétszer 30 másodpercig besugározzuk ultrahanggal. A szűrővizsgálati eljárást kétszer megismételjük, a vírus tarfolt tisztítása céljából.

Ahhoz, hogy a rekombináns Vaccinia vírus szaporítsuk, tíz csészényi (150 cm2) BSC40 sejtet fertőzünk a vírus törzsállománnyal, MOI 0,05 érték mellett. A fertőzést 2 óra hosszat végezzük 37 °C-on, majd a vírus törzsállományt friss tápközeggel helyettesítjük. 72 óra elteltével a sejteket kinyerjük, 10 mmol/l TRIS-HCIben (pH=9,0) szuszpendáljuk, majd egy Wheaton szövetfeltáróban homogenizáljuk. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszót tripszinizáljuk és ultrahanggal besugározzuk, majd a vírusszuszpenzió alikvot részeit -80 °C-on tároljuk.

ι

3. Példa

Az Ε11/E2 antigének előállítása

Egy liter HeLa S3 fonósejteket (spinner cells) szaporítunk egy fonólombikban (spinner flask) 10θ sejt/ml sűrűségig. A sejteket a HCV poliprotein fragmenst tartalmazó rekombináns Vaccinia vírussal fertőzzük, 1,0 MOI értékkel, éjszakán át inkubáljuk, begyűjtjük, majd sejtüledék formájában Ó80 °C-on tároljuk.

Az E1/E2 expressziós terméket úgy tisztítjuk, hogy a sejteket hipotóniás pufferben lizáljuk, majd nemionos detergenst tartalmazó pufferben extraháljuk. A sejtkivonatot lektin (GNA) agaróz oszlopon kromatografáljuk. A keresett fehérjéket metil-a-D-mannopiranoziddal (Sigma Corp.) eluáljuk az oszlopról. Az eluált frakciókat Western blottal vizsgáljuk meg, hogy tartalmaznak-e E1-et és E2-t, E1 és E2 ellen készített specifikus antiszérumokat használva. Az antigéneket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd S-Sepharose oszlopon (Pharmacia) töményítjük. A végtermék tisztasága körülbelül 70%.

4. Példa

Az E1/E2 alkalmazásás immunesszében

Betegek

A szérummintákat véletlenszerűen válogatott, fizetett plazmadonoroktól kaptuk, akik az Amerikai Egyesült Államok keleti, nyugati, középnyugati és déli államaiból származtak, az Uniglobe Research Corporation-tól (Reseda, ICA) vásárolva. A H. Tong (Huntington Memóriái Hospital, Pasadena) által rendelkezésünkre bocsájtott szérumminták 38 olyan betegből származnak, akik transzfúzió következtében krónikus NANBH-ban szenvednek, valamint 39 olyan betegből, akik intravénás kábítószeresek, és ennek következtében krónikus NANBH-

-24ban szenvednek. Ennek a 77 betegnek egyéb májbetegsége nincs, anti-HAV tulajdonságúak, anti-Hbsag nem-reaktívak, és az anti-nukleáris (ANA) ellenanyagok normálisak. Három transzfúzióhoz kapcsolódó HCV szerokonverziós panelt H. Altertől kaptunk (the National Institutes of Health, Bethesda, MAryland) valamint a Serologicals Incorporations-tól (Clarkston, Georgia). Az akut elválasztott HCV mintákat a Max von Petlenkofer-lnstitute-tól kaptuk, Müncheni Egyetem, München. Az akut reszolváló NANBH 19 esetét májbiopszia és normális alanin aminotranszferáz (ALT) szintek alapján diagnosztizáltuk, hosszútávú (2-11 év) követő vizsgálatok alapján.

A rekombináns HCV antigének expressziója és tisztítása

A C22 (119 as), az E1 (130 as), E2 (251 as), NS5 (942 as) és a kiméra C25 (másik neve c200/c22) (858 as) antigéneket belső antigénekként expresszáljuk a Saccharomyces cerevisiae élesztőben, korábban ismertetett módszereket alkalmazva [Kuo, G. és munkatársai., Science, 244, 362-364 (1989); Cousens, L. és munkatársai., Gene, 61, 265-272 (1987)]. A C33C antigént (266 as) belső SÓD fúziós polipeptidként expresszáljuk Escherichia co//-ban, a korábban az 5-1 antigén szintézisére ismertetett módszerek alkalmazásávaé [PCT WO89/046699; EPO Pub. No. 318,216; Houghton és munkatársai., Science, 244, 359 (1989); amely publikációkat referenciának tekintjük], A sejtek feltárását és centrifugálását követően az oldhatatlan SÓD fúziós polipeptideket a sejtüledékből extraháljuk, vagy 5 mol/l karbamid, vagy 1% SDS alkalmazásával, majd vagy gélszüréssel vagy ioncserés kromatográfia (Q- és S-Sepharose) és szüréskromatográfia (Sephacryl S-300 HR) kombinációjával tisztítjuk.

A HCV természetes E1 és E2 antigénjét [más nevük lehet rVV (e1 & e2)] a rekombináns vakcínia vírussal (rvv) fertőzött sejtek endoplazmatikus retikulumából « · •·· ···

- 25 tisztítjuk, amelyek a teljes hosszúságú HCV E1 és E2 géneket tartalmazzák. A tisztítást affinitáskromatográfiával végezzük, amit ioncserélő kromatográfia követ, nem-denaturáló körülmények között. Ezeket a módszereket a WO92/08734-es találmányban ismertetik, amelyet a továbbiakban referenciának tekintünk.

A természetes HCV E2 antigént, a CHO-e2-t lényegében Spaete és munkatársai leírása alapján készítjük [Spaete és munkatársai.,Virology, 188, 819830 (1992)]. Pontosabban, a CHO-e2 antigént termelő emlős CHO sejtvonalat egy olyan plazmidból készítjük, amely az Ala383-tól a Glu661-ig terjedő HCV-1 szekvenciát kódolja. A plazmidot azután CHO sejtekbe transzfektáljuk, hogy stabil, a teljes hosszúságú e2 (más néven e2/ns1) antigént sejtvonalat kapjunk. A nagy expressziót mutató kiónokat kiválasztjuk, majd forgó palackokban elszaporítjuk, DME/H21 táptalajt használva erre a célra, amelyben 10% borjúmagzat szérum található, valamint a szokásos kiegészítések és 1,6 pmol/l metotrexát. A tenyésztő táptalaj felülúszóját kinyerjük, majd a CHO-e2 antigén tisztítására használjuk. A tisztítási sémában van még affinitáskromatográfia és ioncserélő kromatográfia, nemdenaturálö körülmények között.

Ahhoz, hogy a természetes e2 feltételezett konformációs epitopjait magzavarjuk, denaturált CHO-e2-t készítünk, oly módon, hogy 10 mmol/l végkoncentrációjú DL-ditiotreitolt (DTT) és 0,2% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) adunk hozzá, majd 5 percig forraljuk. Mindegyik rekombináns HCV antigén legalább 90%-os tisztaságúnak bizonyult SDS poli-(akrilamid)-gélelektroforézissel ás Coomassie blue-val való festéssel.

ELISA vizsgálatok

Az RVV(e1 & e2), CHO-e2 és a denaturált CHO-e2 antigéneket foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) (pH=7,4) optimális koncentrációra hígítjuk, majd

Immulon 1 lemezeket (Dynatech, Chantilly, FA) borítunk vele. Az ELISA vizsgálatokat az alábbiak szerint hajtjuk végre. A lemezeken levő mintákat negyvenszeresre hígítjuk mintahigító oldatban, majd 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, végül mosópufferrel mossuk. Tormaperoxidázhoz (HRPO) konjugált poliklonális kecske anti-humán IgG-t (H+L) adunk az egyes lukakhoz. A lemezeket 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, majd mossuk. A HRP-hez a szín előhívására ofeniléndiamin-2HCI-t (OPD), majd hidrogénperoxidot adunk. Az eredményeket lemezleolvasóval határozzuk meg, 492/620 nm-en végzett leolvasással. Az ELISA vágási OD érték az RVV(e1 & e2), SÓD, C25, C22, C33 és ns-5 esetében 0,4, plusz a negatív kontroll átlagából száított OD. A CHO-e2 és a denaturált CHO-e2 vágási értéke 0,3 OD, plusz a megfelelő antigén negatív kontroll OD-ja. Az anti-C100-3 vágási értéke 0,45 OD, plusz az átlagos negatív kontroll OD-je.

Immunesszé vizsgálatok

Az Amerikai Egyesült Államok betegcsoportjaiból származó vérkomponensekben levő anti-HCV ellenanyagok kimutatására az előzőkben ismertetett antigének felhasználásával végzett ELISA kísérletek eredményei az 1. táblázatban láthatók.

··· ···

1. Táblázat

A HCV ellenanyagok elterjedése az Amerikai Egyesült Államok betegcsoportjaiban Anti-HCV pozitív

Betegek rVV

Csoport száma C22 Y-e1 Y-e2 CHO-e2 (e1&e2) C33C C100-3 Ns5 C25 Bármely

CM CO

O CM

b- bCM τ-

Ο σ> CO τ-

O O CO T-

o ⁰⁵co

oCT) CM

b- TCM b-

CD O CO O) cb cd m CO O)

in cm co σ>

*o N

Φ

Φ N ω 'O

TO >

-28• · · V · · · • ·*··«· · · ··

Az 1. táblázat eredményei azt sugallják, hogy az élesztőben termelt e1 és e2 HCV burokantigének immunreaktivitása alacsonyabb mint a Vaccinia vírusban (RVV(e1&e2) és a CHO sejtekben (CH0-e2) termelt rekombináns antigéneké. Mindegyik vizsgált csoportban az élesztőben termelt e1 és e2 antigének reakcióképessége csak kétharmada volt, vagy ennél is alacsonyabb volt, mint az állati sejtekben termelt antigéneké. Érdemes megjegyezni, hogy az élesztő e1 és e2 antigéneket élesztősejtekben állítottuk elő, és denaturáló körülmények között tisztítottuk. Úgy tűnik tehát, hogy ezekben az antigénekben csak lineáris epitopok léteznek. Ezzel szemben a természetes HCV antigének, az RVV(e1&e2)-et és a CHO-e2-t nem-denaturáló körülmények között izoláltuk az állati sejtekből, lehetővé téve ezzel natív konformációs epitopok létezését.

A sejtekben levő E1 és E2 génekről expresszálódó rekombináns natív HCV antigének ugyanolyan immunreaktivitást mutatta! mint a C33C és feltehetőleg a C25, és nagyobb immunreaktivitást mutattak, mint bármely más vizsgált HCV antigének. A C25 egy kiméra poliprotein, amely az NS3, NS4 és C polipeptidek egy részét tartalmazza, az 1. ábrán bemutatott módon fúzionáltatva.

A konformációs epitopok szerepét a gazdaszervezet immunrendszere korai válaszának serkentésében HCV szerokonverziós panelek immunesszéjével értékeljük ki. A 2. táblázatban látható eredmények a természetes HCV burokantigének, az RVV(e1&e2) és a CH0-e2 immunreaktivitását mutatják, a három szerokonverziós panelben levő mintákkal. Mindegyik panelben levő minta szekvenciális mintavételt képvisel egy poszt-transzfúziós NANBH utáni egyedböl. Amint a 2. táblázat eredményeiből látható, a természetes HCV burokantigének, azaz a természetes konformációs epitopokkal rendelkezők, azokat az ellenanyagokat mutatják ki, amelyek a fertőzésnek viszonylag korai szakaszában keletkeznek,

-29összehasonlítva azokkal, amelyeket más vizsgált HCV antigénekkel lehet kimutatni. Tehát ezek az antigének jól használhatók a HCV fertőzés diagnosztizálására végzett immunesszékben.

« · 9 · 9 ·«· ··* · · ·· « · · · ♦ ·

2. Táblázat

A CH0-e2, rVV (e1&e2) és multi-antigén ELISA-k összehasonlítása HCV szerokonverziós paneleken Transzfúzió CHO-e2 rVV(e1&e2) C22 C33C C100-3 ns5 C25 ALT

o CL ro c Έ re 5

re

E •ra

N (Λ

CXJ	X—	co	co	co	τ-	CXJ	CXI	CXJ		in
O_	CXI	CD	00-	o	Ο	o	CD	co	x—	CO_
o	o	“	cxT	co	o	cd	o	o	CXÍ	cd
CO	co	co	CXJ	_	co	in	05	co	co	CXI
O	o	CXI	co	CD	CXI	«τ-	o	x—	x—
cd	o	o	o	o	cd	ο	o	o	o	o
σ>		CM	b-	ID		X—	o	00	in	00
o	o	X^-	o	xt	CXJ	CXI	τ-	x—	x-	CD_
o	cd	cd	cd	cxí	o	o	ο’	cd	o
	CXI		CXI	CO	co		co	00	CD	05
C5_	o	CXJ	ID	xt	cd_	τ-	CD	οχΐ-	co	b~-
o	o		co	xt	o	ο	cd	ο	cd	Xt
	CXI	co	CXI	CD	co	co	00	CD	00	CXI
O	CD	co	Xf	CD	o	X—	o	CXI	co	co
o	o	o	CD	cxí	cd	o	cd	o		in
		LO	CO		CXI		co	05	CXJ	CXI
CD	CXJ	b-	CXI	C0_	X—	co	xf	CXJ	CD_	xf-
o	o		C\í	CXÍ	o	o	o		cxí	co
	σ>	co	b-	CO	r-	Xt	05	in	Xt	CD
CO	X^-	CXI	cd	CO	o	LD	CXI	CX{	X-	CD
o	o	T—	T-	CM	o	cd	T-’	cxí	cd	b-‘

Φ «CD £ -CD >

Φ

C re o.

w •O ’n

Φ > C o Jsí

O i_

Φ

N <n <

Φ
	00 co			c re
O co	CXI	00	Q. O	CO	CXI	in	CM	CXJ
CXJ	Xt	LO	ω ‘O	CM	co	co		CD

00	in	in CXJ	05 CXJ		N k. Φ	co CXJ	in CXJ	05 CXJ	o	co CD	00 CXJ
bJ	co	00	00	05	>	b-’	oo	cd	05	05	05
CD	o	o	O	O	0	o	o	G5	O	O	O
00	C0	oo	00	00		00	00	00	00	00	oó
CO	co	00	00	00	o	00	00	co	00	co	00
05	05	05	05	05	Φ	05	05	05	05	05	05
			r—		N (Λ	v~	T—		t—
	CD	r^-	00	05	o		CD	b-	00	05	o
<	<	<	<	<	cxí	o	O	o	o	O	O

··

2. Táblázat (folytatása)

A CH0-e2, rVV (e1&e2) és multi-antigén ELISA-k összehasonlítása HCV szerokonverziós paneleken Transzfúzió CH0-e2 rVV(e1&e2) C22 C33C C100-3 ns5 C25 ALT

Vérvétel utáni napok ELISA ELISA ELISA ELISA ELISA ELISA ELISA Szint

Ώ

O

O ώ

o o ω

O

O ω

O

O ώ

co	CD	xt	CD	σ>	co	co	co	o	o
	LD	co	t—		CM	CD	CD	CM	CD
								co	CD
00	O	b-	CD	CD	T—	CM	00	co	LD
O-	V—	o	O-	O	'ί-	τ-	CD	oq	CM_
o	o	o	o	d	ο	ο	d	T-’	co

CM	τ-	co	b	co	b-	CD	b	CO	b
O	ο	o	O	o	O	O-	O_	O	o
o	d	o	o	o	o	o	o	d	d

cMT-cooob-ooob-ooTt o o o o O C) v- o_ o_ o_ o o o o o d o o d d

co	Χί-	co	o	co	χ—	σ>	•Τ-	CM
O-	ο	o	τ-	O-		Ο-	ΟΜ-	xt
o	d	o	ο	o	o	o	Ο	o

b	CO	CM	CD	co	b-
O	o	o	o	o	o
o	d	o	o	o	o

o	CD	CO	CD	Xt	CD	τΤ
o	O_	o	O	τ-		τ-
ώ	o	o	o'	ο	o	ο

o o

CM CD d

o

CM~ xF CD d

ld CO cm

co	LD	CD	b-	CM	LD	O
τ-	O	O	O	τ-	O	τ-
ο	o	d	o	ο	o	ο

FCM CM cm

Φ c ra CL (Λ

Ό ’n

Φ > c o o

k_

Φ

N ω

(O Q (ű Μ- K T- CM CO xf (£)

bLD

	CD	ó	CM	CD	b	d	co	d	b
o		CM	Ο	O	v—	o		CM	CM
b	b	b	00	00	00	σι	CD	σι	d
O	o	o	O	O	o	o	O	ο	o
CD	CD	CD	CD	CD	CD	CD	CD	CD	CD
b	b	b	b	b	b	b	b-	b-	b-
σ>	CD	σ>	CD	CD	CD	CD	σ>	CD	CD
X—	T—	V-							T-
									O
χ—	CM	co		LD	CD	b	co	CD	x—
—J	—J	“5	->				“5	“J	—>

2. Táblázat (folytatása)

A CH0-e2, rVV (e1&e2) és multi-antigén ELISA-k összehasonlítása HCV szerokonverziós paneleken Transzfúzió CH0-e2 rVV(e1&e2) C22 C33C C100-3 ns5 C25 ALT < ω

UJ <

ω —I UJ < ω _ι UJ • · ♦ · · ··· ·«· · · ··

o o ω o o ώ

V-	co	o	Τ-	cm:
—	o-	co	Ο	r-
		X^-	xt
ctj	oo	oo	oo	00
o	τ-		co_	h--
o	ο	θ'	ló	cd

t—	00	O-	•xt	CD
CM	CM	CM	in	X—
Ö	o~	o	o	cő

00	o	00	co	in
o	τ-	o	X^-	x—
o	ο	o	ó	xt
ct>		in	σ>	σ>
o	τ-	X~	χ-	σ>
o~	ο	O~	ιό	in
00	CM	co	CO	in
o	X”	co_	co	ct>
o	θ'	o‘	CD	xt

< ω	o	σ>	m	00	00	00
_j		ο	co_	xt	CD	X—_
LU	ω	θ'	θ'	ο	χ^-	cm’
< ω _1	O o	,08	-	CD Ο_	CD CM_	CD χ—
LU	ώ	ο	θ'	ο’	θ'	ο’

φ	ro
φ	C
£	ο
'φ	Q
>	^:Ο ΊΟ
	ro
	C
	is

CT)	co	CM	xt
CO	xt	0-	x—
			χ—
CD	ó	cő	CT)
CM	co	CM	O
CO	co	CT)
O	o	O	x-
co	co	CO	00
00	co	00	00
CT)	CT)	05	CT)
X—	x—	v—	x—
o	X—	CM	co
x—	v“	T“	X—
CD	CD	CD	CD

φ -ο c φ o CL 05 .X.

u.

O ZZ

Φ ω

Φ σι zz -ra c E <

*

Φ •Φ Φ

Q O ω ra

CT) •ra >

Φ

I ¹¹

Q

O φ '05 σ> ω N ’>

< ö o ώ

-33• · * V « · ··· ··· · · ··

A 3. táblázat eredményei az E1 és E2 génekről expresszálódó természetes HCV antigének és a megfelelő denaturált antigén közötti összehasonlítást mutatják. A táblázatban az akut reszolváló NANBH-szenvedö betegekből származó szérum immunreaktivitását követjük időben, és a krónikus NANBH-ban szenvedő betegek eredményeivel hasonlítjuk össze. Amint a 3. táblázatból látható, azok a természetes HCV burokantigének, amelyek mind konformációs mind lineáris epitopokat tartalmaznak, azaz az RVV(e1&e2) és a CHO-e2 sokkal nagyobb immunológiai reakcióképességgel rendelkeznek mint a többi, csak lineáris epitopokat tartalmazó antigén, azaz az élesztőben előállított e1 és e2 valamint a denaturált CH0-e2. A megfigyeléseket összegezve azt mondhatjuk, hogy a természetes HCV burokantigén immunreaktivitása 8-9-szeres az akut reszolváló betegeknél, és körülbelül kétszeres a krónikus NANBH betegeknél. Úgy tűnik tehát, hogy a NANBH reszolváló formájában szenvedő betegek immunológiai válasza leginkább a konformációs epitopok ellen alakul ki, míg az akut formában körülbelül egyenletesen oszlik meg a konformációs és lineáris epitopok között.

Ezek a vizsgálatok szolgáltatják az első bizonyítékot arra, hogy a konformációs epitopok részt vehetnek a gazdaszervezetnek a HCV-re adott immunológiai válaszának kialakításában.

• · · · ··· 999 9

I

CC

I

n CD —	o^x	CD		O)
00	LO CD	(5	00	CO

CL
05
C			*
Ό f—	* σ>		CD
	T—	O	T~
CD 1	σ5	O	CD
O

Φ
c
-Φ ü) L—« C	co CM O	C\1 Φ oö
05		Ίϋ
> O T		> > L·.

ro E '05 N CD

Φ

4—>

Φ CD Φ *—¹ '05 σ> CD N > ra E '05

N

CD

Φ •4—·

Φ CD Φ >

4—· ’n o CL

E

N CD

C 05 ro

CD •φ _> Ό5

CD CD N >

> '05 ’N

CD

Q.

O JC

N CD 'Φ n _Q o

CD

C CD Φ

CD ’n O

C CD 05

T3 T CŰ z < z

-_o 05 > o

N CD

Φ =5 •Z5

CL _05

N

CD CL

O

CO fennmaradásának reszolúciója

5. Példa

E1/E2 immunesszé: az immunkompetens és immunszuppresszált betegek összehasonlítása

Betegek

Három betegcsoportot vizsgáltunk. Mindegyik beteg negatívnak bizonyult a humán immundeficiencia vírus (HÍV) ellenanyagokra. Az I csoport 20 olyan immunkompetens beteget tartalmaz, akik transzfúzióhoz kapcsolt krónikus HCV fertőzésben szenvednek, de egyébként egészségesek. Mindegyik beteg pozitívnak bizonyult anti-HCV és HCV RNS-re. A II csoportba 15, fenntartó hemodialízises beteg tartozott. Tizenegy beteg volt anti-HCV pozitív a prezentáció idején, egyik kapott a későbbiekben vesetranszplantációt. Négy beteg lett a későbbiekben antiHCV pozitív. A lll-as csoportba 17 veseátültetést kapott beteg tartozott. Hét beteg volt anti-HCV és HCV pozitív a prezentáció idején. Hét anti-HCV pozitív lett a későbbiekben, ezek közül kettő kezdettől fogva HCV RNS pozitív volt. Két beteg volt csak HCV RNS-re pozitív a prezentáció idején, mindkettő HCV RNS pozitív, de antiHCV negatív maradt a későbbiekben. Egy beteg lett HCV RNS-re pozitív a későbbiekben.

Szérumok

A szérumokat 1989. júliusa és 1992. áprilisa között gyűjtöttük, majd a vizsgálat előtt alikvot részekben -70 °C-on tároltuk őket. Az I. csoportba tartozó betegek esetében a 6-12 hónapos intervallumban vett négy mintából kettőt vizsgáltunk meg. A II. és III. csoportba tartozó összes beteg esetében az 1,5-2 éves intervallumban vett két mintát vizsgáltuk meg; a további mintákat a közbeeső időpontokból, és a későbbi mintákat is megvizsgáltuk azoknál a betegeknél, akiknek a második mintánál megváltozott az anti-HCV és/vagy HCV RNS státusza.

ELISA vizsgálatok

A HCV antigéneket a 4. példában leírtak alapján állítjuk elő, és a 4. példában leírtak alapján használjuk ELISA vizsgálatban. Az N e1 & e2 vizsgálatban a vakolnia fehérjéhez való kötődés következtében beálló hamis pozitivitást a következőképpen csökkentjük: (i) vakcinia sejtlizátumot adunk a mintát hígító oldathoz, hogy kompetitív antigénként működjön, és (ii) negatív kontrollként vakcinia negatív mintákat használtunk.

Az eredmények a 3A-3C ábrán láthatók. Az I. csoportba tartozó immunkompetens betegeknek csak 55%-a reagált az élesztőben expresszált e1 vagy e2 antigénekkel; de mindegyik beteg reagált a természetes, vakcinia vírusban expresszált, glikozilezett e1&e2 antigénekkel. Csakúgy, mint az immunkompetens betegekben, a legtöbb II. csoportba tartozó hemodialízises beteg reagált a C25, C22, valamint N e1&e2 antigénekkel. A betegeknek jelentősen kisebb része reagált C100-3, C33C, NS-5, e1 és e2 antigénekkel. Az immunkompetens betegekhez hasonlítva, lényegesen kevesebb III. csoportba tartozó veseátültetéses beteg reagált az összes vizsgált HCV antigénnel.

Mindegyik immunkompetens beteg reagált a C25, C22 és C33C antigénekkel, 90% reagált az NS-5 antigénnel és 80% reagált a C100-3 antigénnel. Csak 55% reagált az élesztő eredetű e1&e2 antigénekkel, de mindegyik reagált a vakciniában expresszált N e1 & e2 antigénekkel, jelezve, hogy a burokepitopok konformációsak és glikozílezettek. A dialízises és veseátültetéses betegek 65-90%-a reagált a C25, C22 és N e1&e2 antigénekkel, de csak 12-60%-a reagált a C100-3, C33C és NS-5 antigénekkel. A hepatitisz C vírus antigénjeivel szembeni reakcióképesség erős ’ < 9 csökkenését, illetve elvesztését lehetett megfigyelni a vese és csontvelő transzplantáció után, ekkor a C25 és N e1&e2 kevésbé érintett.

Ez arra utal, hogy az e1&e2 epitopok konformációsak, és az ezekkel az epitopokkal szemben mutatott reakcióképességet csak minimálisan érinti az egyéb HCV antigénekkel szemben mutatott immunszuppresszió.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás emlős szervezetnek hepatitisz C vírushoz (HCV) történő korai szerokonverziójának kimutatására, azzal jellemezve, hogy (1) a szervezetből egy, HCV elleni antitestet tartalmazónak vélt testkomponent nyerünk ki, (2) az említett testkomponenst (i) egy HCV genom E1 doménjében, egy HCV genom E2 doménjében, és/vagy azok aggregátumaiban kódolt antigénnel hozzuk érintkezésbe, ahol a HCV antigén nem-denaturáló körülmények között tisztított; vagy (ii) egy standarddal hozzuk érintkezésbe, immunreakció létrejöttéhez alkalmas körülmények között, és (3) meghatározzuk az antitestek és az antigén között létrejövő immunkomplex jelenlétét, melynek során a standard kontrolt tartalmazó immunkomplexek hiánya és a HCV antigént tartalmazó immunkomplexek jelenléte mtatja a HCV-hez történő szerokonverziót.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén a HCV genom E1 doménjén belül kódolódik.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén az E1.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén a HCV genom E2 doménjén belül kódolódik.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén az E2.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén egy E1/E2 aggregátum.

V · ·*
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén egy E1/E1 aggregátum.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén egy E2/E2 aggregátum.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén vagy aggregátum rekombináns vakcinia vírusról expresszálódik.
10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HCV antigén vagy aggregátum CHO sejtekben expresszálódik.
11. Kit az 1-8. igénypontok szerinti bármely eljárásban történő alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy a kit tartalmazza a HCV antigént, valamint kontroll standardokat, megfelelő tartóedényekbe csomagolva, és a kit komponenseinek használatához szükséges instrukciókat.