PL168266B1 - Sposób wytwarzania grupy substancji czynnych do restytucyjnej chemoterapiiwirusowych chorób zakaznych PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania grupy substancji czynnych do restytucyjnej chem oterapii wiru- sowych chorób zakaznych, ewentualnie w postaci preparatów farmaceutycznych, w którym to sposobie drewno lub substancje drewnopochodne ekstrahuje sie w srodowisku wodnym, znam ienny tym , ze przeprow adza sie omówione nizej etapy postepow ania I-III, przy czym w etapie I drewno i/lub m aterialy drzewne i/lub roslinne hodowle komórkowe ekstrahuje sie w slabo kwasnych lub obojetnym, lub zasadowym srodowisku wodnym i oddziela sie nie- rozpuszczalne skladniki stale, w etapie II prowadzi sie wodno-alkaliczna ekstrakcje (pH = 7- 14) produktów uweglenia drew na lub biokonwertowanych m aterialów drzewnych i oddziela sie nierozpuszczalne w alkaliach skladniki stale, a w etapie III produkt etapu I poddaje sie reakcji w srodowisku wodno-alkalicznym (pH = 8-14) z produktam i etapu II, produkt tej reakcji poddaje sie ultrafiltracji przy nominalnych wartosciach odciecia rozdzielczego od okolo 15 000 do 40 000 z uzyskaniem przesaczu, który traktuje sie kationitem -H + przy p H= 3-7,0, i oddziela sie przereagowany kationit-H+ , otrzym any zas wodny roztwór pore akcyjny z etapu III przetwarza sie ewentualnie na plynny preparat farmaceutyczny. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania grupy substancji biologicznie czynnych do restytucyjnej chemoterapii wirusowych chorób zakaźnych, w którym drewno lub substancje drewnopochodne ekstrahuje się w środowisku wodnym.

Zwalczanie zakażeń wirusowych stanowi problem, który dotychczas nie został jeszcze całkowicie rozwiązany. Jednym z nierozwiązanych zagadnień jest stosunkowo szybkie uleganie wirusów mutacjom, co całkowicie lub częściowo uniemożliwia skuteczne działanie leków przeciwwirusowych lub przeciwciał własnego organizmu. Metoda uodporniania na zakażenia wielowirusowe najrozmaitszych rodzajów polega na stosowaniu koktajlu substancji czynnych, przy czym skuteczna jestjedna z tych substancji. Ta zasada jest stosowana w preparacie gammaglobulinowym wytwarzanym przez firmę Sandoz pod nazwą Sandoglobulin. Preparat ten stanowi mieszaninę przeciwciał pochodzących z krwi przeszło 2000 dawców środkowoeuropejskich, które stanowią dużą część spektrum przeciwciał przeciw schorzeniom występującym na obszarze Europy Środkowej i dlatego przyjmuje się, że produkt ten działa skutecznie przeciwko najrozmaitszym zakażeniom ze względu na dużą ilość zawartych w nim różnych przeciwciał.

Dotychczas prowadzono próby zwalczania zakażeń wirusowych atakując w różnych punktach proces replikacji wirusów. Znane są leki typu azydotymidyny (AZT), które hamują

168 266 transkrypcję zwrotną przez przerwanie łańcucha, lecz również wywierają one pacjentów znaczne, niepożądane działania uboczne.

Wszechstronne badania z użyciem ujemnie naładowanego siarczanu dekstranu (związku o masie cząsteczkowej około 10 000) z hemicelulozy roślinnej wykazały, że także ta grupa substancji nie oznacza praktycznie żadnego postępu w leczeniu pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Leczenie siarczanem dekstranu przez podawanie doustne ma między innymi tę wadę, że drogi dekstranu w krwioobiegu i stężenia w miejscach zetknięcia się go z wirusami nie są zbyt skuteczne oraz że powoduje on uciążliwe skutki uboczne (neuropenię, biegunkę). Także klinicznie nie można było stwierdzić żadnych skutków wywierających głębszy efekt. Także klinicznie nie można było stwierdzić żadnych skutków wywierających głębszy efekt.

Czyniono już próby wytwarzania metodami technologii genowej wyodrębnionych białek receptorowych CD4, które powinny wiązać się mocno z wirusem gp 120, a wskutek tego przez wysycenie zobojętniać i unieczynniać go. W celu stosowania tego sztucznego CD4jako czynnika leczniczego konieczne było jednak wstrzykiwanie dużych dawek tego sztucznego białka. Sztuczne, wysokie stężenie powyżej normy wymagane dla tego czujnika komórkowego, normalnie leżącego na zewnątrz błony zdrowych komórek, oznacza wielowarstwowe podrażnienie dla organizmu, którego reakcje odpornościowe i pozostałe są nie do przewidzenia. Rozpuszczalne białko CD4 może wiązać się także z glikoproteiną MHC-II i przekształcać w pełni jej normalnej funkcji, co np. u chorych na AIDS może powodować dalsze pogorszenie stanu osłabienia odporności. Następnie rozpuszczalne CD4 musi być ponownie podawane pozajelitowo w dużych dawkach. (Spektrum der Wissenschaft - grudzień 88, str. 116).

Jako wyjście z tego problemu zaproponowano wytwarzanie małych odcinków CD4, fragmentów białka, które byłyby tak zbudowane, aby mogły być właśnie jeszcze rozpoznawane przez gp 120. Gdyby to udało się, to zawsze pozostałoby jeszcze pytanie, czy ten fragment białka nie będzie powodował in vivo przeciwnej regulacji odporności i wywoływał dziś jeszcze nie znanych zaburzeń w bardzo chwiejnych organizmach osób chorych na AIDS.

M. Lange wyjaśnił jednoznacznie w 1990 r (USA, patrz także Arztliche Praxis 15, str, 28 ff., Werk-Verlag, D-8032 Grafelfing), że dla pacjentów chorych na AIDS i ARC droga do point of no return (punktu bez odwrotu) bynajmniej nie jest tylko zagadnieniem produkcji wirusa. Przypuszczalność HIV jako antygen uruchamia patomechanizmy odpornościowe, które są podatne na eskalację. Podobieństwo z chorobami autoimmunizacyjnymi (np. Lupus Erythematodes) pokazują, że może nie być wystarczające wykorzystywanie tylko chemoterapii anty-HIV. Wydaje się raczej niemożliwe nie uwzględnienie współwłączenia tych usamodzielnień autoimmunizacyjnych (ciągłości trwania) do terapii, a więc opracowania i rozwijania nowej postaci chemoterapii antyeskalacyjnej.

Według Langego podczas zakażenia wirusem HIV następuje ekstremalna aktywacja komplementu i czynnik anafilaksji C5, a indukuje produkcję nowotworowego czynnika martwiczego i interleukiny 1. HIV może uruchamiać eskalację tej kaskady. Zostało to udowodnione przez wiele grup badawczych. Już z tego można łatwo wyciągnąć wniosek, że obiecująca powodzenie chemoterapia anty-HIV nie może ograniczać się tylko do hamowania wirusa HIV, lecz co najmniej częściowo musi przerywać także takie autoimmunizacyjne mechanizmy circulus vitiosus (czyli diabelskiego kręgu).

Indywidualne, eskalacyjne współdziałanie różnych szkodliwości (HIV, sprawców zakażeń oportunistycznych, kaskad autoimmunizacyjnych itp.) musi być jeszcze lepiej zrozumiane, aby można było dojść do chemoterapii prawdziwie skutecznej pod względem leczniczym. Dopiero w ten sposób mogą wyłonić się nowe dyspozycje lecznicze.

Bilans sukcesów obecnych sposobów leczenia (np. 13-18 miesięcy średniej długości życia po zakażeniu, 3,4% 5 letniego okresu przeżycia (San Francisco 1981-1987), 4000 pacjentów, opublikowano w J. Am. Ass. 263 (1990), 402) dowodzi, że obecnie stosowane metody o czysto chemoterapeutycznej orientacji nie są zadowalające.

Wynalazca, Mach, W. J., udowodnił już w 1961 roku razem z Wittichem i Stuhlfauthem, że opisane przez Macha barwniki naturalne typu neo-penichrominy działają na człowieka w małych ilościach (pozajelitowo) jako endogenne substancje sterujące i np. wzmagają aktyw168 266 ność kory nadnerczy. Jest to prawdopodobnie pierwsza wskazówka informująca o tym, że pigmenty redoksy z jednostkami chinoidowymi są w stanie pobudzać mechanizmy przeciweskalacyjne człowieka, nie będąc same białkami lub hormonami i nie działając na drodze niespecyficznej reakcji bodźcowej.

Przyszła chemoterapia wirusa HIV musi więc równocześnie zawierać (z punktu widzenia odporności) elementy przeciweskalacyjne, aby mogła hamować drogę do point of no return (punktu bez odwrotu).

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania nadającej się też do podawania pozajelitowego grupy produktów postępowania, która powoduje zobojętnianie wirusów bez skutków cytotoksycznych i bez wyzwalania niepożądanych reakcji immunologicznych w organizmie leczonego pacjenta.

Ponadto także celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania grupy substancji czynnych, która jest w maksymalnym stopniu aktywna również przeciwko zmienionym/zmutowanym postaciom wirusa.

Osiąga się ten cel za pomocą sposobu wytwarzania grupy substancji czynnych do restytucyjnej chemoterapii wirusowych chorób zakaźnych, w którym drewno lub substancje drewnopochodne ekstrahuje się w środowisku wodnym, polegającego według wynalazku na tym, że przeprowadza się omówione niżej etapy postępowania I-III, przy czym w etapie I drewno i/lub materiały drzewne i/lub roślinne hodowle komórkowe ekstrahuje się słabo kwaśnym lub obojętnym, lub zasadowym środowisku wodnym i oddziela się nierozpuszczalne składniki stałe, w etapie II prowadzi się wodno-alkaliczną ekstrakcję (pH=7-14) produktów uwęglenia drewna lub biokonwertowanych materiałów drzewnych i oddziela się nierozpuszczalne w alkaliach składniki stałe, a w etapie III produkt etapu I poddaje się reakcji w środowisku wodno-alkalicznym (pH=8-14) z produktami etapu II, produkt tej reakcji poddaje się ultrafiltracji przy nominalnych wartościach odcięcia rozdzielczego od około 15 000 do 40 000 z uzyskaniem przesączu, który traktuje się kationitem-H+ przy pH=3-7,0, i oddziela się przereagowany kationit-H+.

Żeby w etapie I otrzymać obfite w polisacharydy jednostki ligninowe HD(PLP) o mniej niż 100 000 można postępować korzystnie tak, że po ekstrakcji w środowiskach wodnych oraz oddzieleniu nierozpuszczalnych, stałych składników nastawia się wartość pH na odczyn obojętny lub słabo kwaśny, prowadzi się filtrację cząsteczkową, korzystnie ultrafiltrację przy odpowiedniej wartości odcięcia rozdzielczego, mniejszej od 100 000; korzystnie mniejszej od 70 000 i odrzuca pofiltracyjną pozostałość; a tak otrzymany roztwór substancji o niskiej masie cząsteczkowej poddaje się dalszej przeróbce w etapie III.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku w etapie II wytwarza się niskocząsteczkowe, ubogie w polisacharydy jednostki lignoidowe LD-LPL o mniej niż około 40 000 w taki sposób, że po ekstrakcji wodno-alkalicznej i po oddzieleniu nierozpuszczalnych w alkaliach składników stałych prowadzi się obróbkę alkaliczną wobec odczynu o wartości pH powyżej 8, po czym następuje rozdzielanie cząsteczkowe drogą ultrafiltracji przy nominalnych wartościach odcięcia rozdzielczego 15 000-35 000, i tak otrzymany produkt poddaje się dalszej przeróbce, w etapie

III.

Po reakcji obfitych w polisacharydy produktów etapu I (PLP) z ubogimi w polisacharydy produktami etapu II (LPL), korzystnie można postępować tak, że oddziela się substancję stałą, a następnie pozostały roztwór poddaje się dalszej przeróbce.

Dalszą przeróbkę otrzymanego z etapu III kwaśnego roztworu LD(LPL=PLP) można prowadzić przez filtrację cząstek i usunięcie pirogenów drogą sączenia, a następnie przez wyjałowienie oraz ewentualnie konfekcjonowanie.

W etapie I do ekstrakcji stosuje się materiały drzewne wybierane korzystnie ze zbioru obejmującego drewno naturalne, np. drewno twardzielowe z drzew w postaci milled wood, drewno miękkie, drewno twarde, systemy PLP, takie jak np. występujące w łupinach z owoców pestkowych lub orzechów, ogólnie zdrewniałe części roślin, zwłaszcza odżywicowany materiał wyjściowy; trawy, jak ostnica mocna, itp., analogi drewna, takie jak substancje drzewne, otrzymane biotechnologicznie na drodze sporządzenia hodowli komórek roślinnych, syntetyczne analogi drewna wytworzone po otrzymaniu metodą Freudenberga dehydrogenacyjnych polimerów (DHP) mono- i/lub dwulignoli itp. i po szczepieniu tych DHP na polisacharydach, kom6

168 266 pleksy ligninowo-polisacharydowe (otrzymane przez alkaliczną ekstrakcję celulozy drzewnej chlorynowej, a także ich mieszaniny).

W etapie II korzystnie stosuje się roślinne materiały wyjściowe wybrane ze zbioru obejmującego naturalne produkty uwęglania; drewno biokonwertowane przez lignolitycznie aktywne mikroorganizmy, przez grzyby białej zgnilizny, drewno biokonwertowane przez wyodrębnione enzymy lignolityczne (takie jak fenolooksydaza), lub mieszaniny tych materiałów.

Korzystnie w poszczególnych etapach jako zasady stosuje się KOH, NaOH, LiOH oraz amoniak, ale można też stosować inne zasady.

W typowej postaci wykonania wynalazku obfite w polisacharydy jednostki ligninowe (PLP) występują po etapie I w stężeniu 0,05-10% wagowych, korzystnie do około 2% wagowych, a zwłaszcza około 0,1 % wagowego.

Przykładowo w etapie I ekstrakcję prowadzi się wobec odczynu o wartości pH od około 12 do 14-, korzystnie w środowisku KOH w ciągu 1-10 dni w temperaturze pokojowej (20°C), albo prowadzi się ekstrakcję w temperaturze podwyższonej do 120°C, przy czym wtedy w temperaturze powyżej około 100°C postępowanie przeprowadza się w autoklawie.

Może być także korzystne, gdy stosuje się produkty uwęglania drewna wybrane ze zbioru obejmującego lignity, węgle barwnikarskie i węgiel brunatny.

Ekstrakcję alkaliczną w etapie II prowadzi się korzystnie za pomocą 0,1-0,8 M KOH, a w korzystnej postaci wykonania za pomocą 0,4 M KOH, w temperaturze pokojowej. To fragmentowanie alkaliczne można prowadzić np. w ciągu 7-10 dni wobec odczynu o wartości pH=11 (KOH) w temperaturze pokojowej.

Reakcje w etapie III w celu otrzymania grupy substancji biologicznie czynnych można prowadzić np. w temperaturze od temperatury pokojowej do temperatury 120°C wobec odczynu o wiatości pH=8-14, korzystnie pH=10-12.

Szczególnie korzystnie produkt reakcji etapu III poddaje się w temperaturze pokojowej rozdzielaniu cząsteczkowemu z uzyskaniem frakcji LD o niskiej masie cząsteczkowej, korzystnie poddaje się niskociśnieniowej ultrafiltracji na odpornych na zasady membranach ultrafiltracyjnych o nominalnej wartości odcięcia rozdzielczego 18 000-38 000. Dalej produkt reakcji etapu III poddaje się wymianie jonów alkalicznych za pomocą kationitu żywicznego w postaci wodorowej, aż do uzyskania stabilnego odczynu o wartości pH w zakresie 4-6,8, korzystnie w zakresie 5-6, po czym kwaśną frakcję LD(PLP=LPL) uwalnia się od pirogenów przez filtrację i następnie wyjaławia np. drogą obróbki przez filtrację i następnie wyjaławia np. drogą obróbki w autoklawie, korzystnie w temperaturze 121°C w ciągu 14 minut.

Roztwór wodny grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku poddaje się przeróbce znaną metodą, ewentualnie za pomocą substancji pomocniczych, na płynny preparat farmaceutyczny, i tak w zależności od postaci aplikacyjnej, np. za pomocą dodatku podłoża maściowego przetwarza się na maść lub za pomocą dodatku roztworu podstawowego przetwarza się na roztwór do wstrzykiwań lub też do użytku zewnętrznego.

Roztworem wodnym grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku LD(PLP=LPL) można przy tym znaną metodą napełniać ampułki do wstrzykiwań. Grupa substancji może być korzystnie stosowana do zwalczania zakażeń wirusowych, np. jako używalny pozajelitowo lub miejscowo, hamujący wirusy środek leczniczy do zwalczania wirusowych chorób zakaźnych, przy czym wirusami mogą być między innymi retrowirusy, zwłaszcza typu HIV (wirusy AIDS).

Z grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku dogodne może być też otrzymywanie związków chelatowych metali szlachetnych, jak Pt, Au, Pd, na drodze wprowadzenia Pt i/lub Au i/lub Pd.

Długoletnie próby przeprowadzone na osobach będących przedmiotem doświadczeń wykazały, że pozajelitowe dawki dobowe w liczbie 2-7 ampułek po 2 mg czynnika leczniczego/24 godziny są w stanie przerywać ciężkie zakażenia grypowe (także w postaciach zakażeń mieszanych wirusowo-bakteryjnych) w przeciągu 24 do 48 godzin bez działań ubocznych. Można było tak działać nawet na pacjentów z ciężką astmą, którzy cierpieli na ciężkie zakażenia grypowe, przez podawanie im dawek 10 mg na 80 kg ciężaru ciała i na 24 godziny bez potrzeby stosowania kortykosterydów w dawkach powyżej 5 mg, unikając dzięki temu niebezpiecznego status asthmaticus.

168 266

Doświadczalny kurcz oskrzeli u zwierzęcia wykazał pewność działania nietoksycznych dawek (stosowanych pozajelitowo) w sensie hamowania kurczu bradykininowego (hamowania serotoniny i hamowania syntezy prostaglandyny).

Te i inne działania są absolutnie niezwykłe u grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku i wykazują, że ta grupa substancji lepiej spełnia wymagania Langego, M. (patrz wyżej cytat) niż dotychczasowe substancje hamujące wirus HIV. Szczególnie zalety wynalazku są między innymi następujące:

- w hodowli komórkowej (limfocytów ludzkich) (test patrz niżej) zakażonej wirusem HIV zachodzi w obszarze stężeń nietoksycznych wyraźne hamowanie wytwarzania zespólni ( aktywność anty-HIV),

- w systemach hodowli komórkowych z neuronów centralnych (z hipokampu lub kory) ma miejsce w ściśle określonych warunkach doświadczalnych wyraźny przyrost zdolności przeżycia (efekt survival) wstępnie dodatkowo sztucznie uszkodzonych jak i nieuszkodzonych neuronów, co biologicznie jest równoznaczne z hamowaniem eskalacyjnych procesów komórkowych (osłaniające działanie restytucyjne).

- Ponieważ neurony są wyraźnie uprzywilejowanym organem docelowym dla wirusów HIV, jak również dla wirusów konwencjonalnych (in situ w pacjencie), więc ta właściwość ma szczególnie duże znaczenie lecznicze.

- Testy rozpoznawcze z zakresu badań specjalistycznych podstaw choroby Parkinsona wykazały, że między innymi jest bardzo prawdopodobne, iż grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku jest zdolna do przechodzenia przez barierę krew-tkanka mózgowa.

- Nawet podczas długotrwałego leczenia (podskórnie), trwającego latami, nie występuje żadne uczulenie, brakjest wszelkich ogólnych reakcji na leczenie, takich jak gorączka reaktywna itp., obraz krwi nie ulega jakiemukolwiek pogorszeniu spowodowanemu leczeniem.

- W przypadku chorób zakaźnych powodowanych przez konwencjonalne wirusy (grypy, ospy wietrznej itp.) następuje szybkie i całkowite wyzdrowienie z równoczesnym spadkiem temperatury do normy bez niepożądanych działań ubocznych na sprawność krążenia,

- ponieważ jest to substancja czynna niebiałkowa, więc nie działa ona jako antygen Co lub jako substancja drażniąca, wywołująca gorączkę,

- podawanie pozajelitowe jest proste i bezproblemowe (podskórnie).

- Dawki lecznicze dla pacjentów chorych na zespół ARC wynoszą 20-40 mg/tydzień,

- nawet w przypadku skrajnego przedozowania (np. kilkakrotne podanie po 48 mg/24 godziny) nie powoduje ostrych lub chronicznych, szkodliwych następstw o charakterze miejscowym lub ogólnym.

Głównymi dziedzinami wskazań dla stosowania nowej grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku, oczywiście nie ograniczającymi tych wskazań, są:

- zakażenia wirusem HIV,

- przypadki zespołu ARC z zakażeniami oportunistycznymi,

- uszkodzenia komórek powodowane ogólnie przez chroniczne zakażenia wirusowe,

- wpływanie lecznicze na przypadki dużej oporności komórek raka przeciwko konwencjonalnym przeciwnowotworowym środkom chemoterapeutycznym,

- choroby ośrodkowego układu nerwowego.

Przed bliższym objaśnieniem wynalazku należy w celu ułatwienia zrozumienia najpierw objaśnić zastosowane oznaczenia skrótowe i skróty:

LD = Low-Dalton (niskocząsteczkowy, tu maksymalnie 3000 D)

HD = High-Dalton (wysokocząsteczkowy, tu: 3000 D)

P = łańcuchy polisacharydowe, w sposób naturalny związane z jednostkami ligninowymi lub z poliozami jako człony pośrednie między ligniną a celulozą

L = (naturalne) jednostki ligninowe we wszystkich naturalnych wariantach

LD-L = (jednostki Low-Dalton-ligninowe, maksymalnie 3000 D)

HD-L = (jednostki High-Dalton-ligninowe) (PLP) = bogate w cukry (polisacharydy/poliozy) jednostki ligninowe, takie jak można wyekstrahować jako ligninę milled-wood np. z mączki drzewnej za pomocą wody przy zasado8

168 266 wym pH i które występują również w postaciach wariantowych powstałych w wyniku biosyntezy drewna (LPL) = ubogie w cukry jednostki liguoidywe, takie jakie między innymi można wyekstrahować z produktów zwęglania drewna, jak z lignitu i z węgli barwnikarskich (z włączeniem węgli kamiennych), za pomocą zasadowych polarnych (wodnych) mediów, ale które przez proces zwęglania zostały silnie zubożone w ascmilywalne nośniki energii typu polisacharydów (rozkład mikrobiologiczuy przed zwęgleniem itp.)

LD(L-PL)=ubogie w cukry jednostki lignyidowe pochodzące z procesów zwęglania, które między innymi można wyekstrahować za pomocą zasadowych mediów wodnych, ale które przez proces zwęglania zostały silnie zubożone w asymilowalue nośniki energii typu polisacharydów, z Low Dalton (rozpuszczalne w wodzie także przy pH poniżej 7,0)

LD(PLP) = frakcja Low Dalton bogatych w cukry jednostek liguinywccy (patrz wyżej)

HD(LDP=PLP) = produkt reakcji z jednostek LD z bogatych w cukry jednostek L i jednostek LD z ubogich w cukry jednostek L

LD(PLP=LPL) = frakcja Low Dalton wyżej wymienionego produktu reakcji, która nadaje się do stosowania biologicznego według wynalazku.

Jak wynika z przeprowadzonych badań produkt reakcji (LPL=PLP) według wynalazku rozwija działanie hamujące wirusy i praktycznie nie wywiera działania ubocznego.

Zaletą grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku, posiadającej łańcuchy cukrowe, jest to, że jest ona nie-białkiem i jako taka nie powoduje podrażnienia na drodze obrony odpornościowej przeciwko obcym dla ustroju substancjom białkowym a więc nadaje się do długotrwałego leczenia.

Przyjmuje się, że grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku nie dopuszcza do przyczepiania lub przyklejania się wirusa, tu zwłaszcza wirusa HTV, do komórki gospodarza. Najprawdopodobniej jest ona atrapą glikypryteiuową, która, nie będąc białkiem, nie wyzwala reakcji odpornościowej w sensie ujemnym - lecz nawet oddziałujejak czynnik przeżycia na najwrażliwszy układ testowy wyodrębnioną komórkę mózgową.

Grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku stosowana długotrwale w dawkach leczniczych (0,1 mg/kg ciała człowieka), nie wywołuje uczulenia, nie jest toksyczna i nie wykazuje działań ubocznych. Posiada ona domeny hydrofi^e, które powodują dobrą rozpuszczalność w wodzie.

Reasumując należy stwierdzić, że grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku ze względu na jej mebiałkową budowę i jej uietokscczuość nadaje się do długotrwałego stosowania.

Ważną zaletę grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku stanowi to, że nadaje się ona do ochrony komórek nerwowych w charakterze czynnika przeżycia.

Szczególnie ważną zaletą grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku jestjej różnorodność, która zapewnia ciągłe działanie na wirusy najrozmaitszymi konformacjami zawartymi w tej grupie substancji i posiadającymi zróżnicowane rozmieszczenie ładunków.

O wielu wirusach wiadomo, zwłaszcza o wirusach HIV, że bardzo szybko ulegają zmianom i przystosowują się, tak że jedna jedyna konformacja nie jest już skuteczna przeciwko zmutowanemu wirusowi.

Stosowane według wynalazku jednostki gliko-ligninowe są skomplikowanymi układami pylisacharcdowo-poliozowy-ligninywcmi, które dzięki ich różnorodności sterycznej i zróżnicowanemu rozmieszczeniu ładunków mogą wysycać najrozmaitsze glikyreceptory. Grupy substancji wytworzone sposobem według wynalazku (nie-białkowe, niskocząstkowe i rozpuszczalne w wodzie) składają się głównie z jednostek feuylypropanowycy zubożonych o łańcuchy cukrowe (łańcuchy polisacharydowe) z domenami chmoidowymi (orto lub para).

Lignoidywe domeny cząsteczkowe, które mają powinowactwo do bocznych łańcuchów cukrowych i częściowo są w swoiście ste^czny sposób zubożone w cząsteczki glikozy, znajdują się w przyrodzie w tak zwanych produktach zwęglania; a więc w węglach barwuikarskicy, w lignitach, jak również śladowo w węglach kamIenuccy. Podczas przebiegającego w ciągu mIliyuów lat procesu zwęglania następowało zubożenie w łańcuchy polisacharydowe lub poliozy, które tworzą połączenia biologiczne między jednostkami liguiuywcmi a celulozą. Dochodziło to do skutku na drodze rozkładu

168 266 mikrobiologicznego, długotrwałych reakcji utleniania itp., które prowadziły do powstania produktu zwęglania ubogiego w węglowodany.

Zaletą wynalazku jest także zdolność systemu cząsteczek do przenikania biologicznego przez błony komórkowe, co zostało potwierdzone doświadczalnie pomiarami wykonanymi in situ na komórkach nerwowych i wątrobowych.

Na drodze badań naukowych stwierdzono, że skuteczność działania grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku na zakażone hodowle komórkowe jest nadspodziewanie wyraźna i że nie występują żadne istotne działania uboczne o charakterze toksycznym.

Dzięki temu grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku nadaje się do długotrwałego leczenia; podczas długotrwałego podawania nie następuje obniżenie skuteczności działania; może ona być także stosowana bez ryzyka w podejrzanych przypadkach chorobowych i używana w połączeniu z odpowiednimi substancjami czynnymi o charakterze niespecyficznym. Ogólnie odznacza się skutecznym działaniem restytucyjnym i może być bezproblemowo podawana w postaci zastrzyków.

Wynalazek objaśniają bliżej poniższe przykłady wykonania i załączone rysunki. Na rysunkach tych fig. 1a przedstawia schemat wytwarzania grupy substancji sposobem według wynalazku, fig. 1b - dalszy schemat wytwarzania grupy substancji sposobem według wynalazku, fig. le - dalszy wariant wytwarzania grupy substancji sposobem według wynalazku, fig. 2a do 2e - widma fluorescencyjne roztworów wodnych grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku oraz ich przedgonów według przykładu I, fig. 3 - widmo C13 grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku, fig. 4 - wykres graficzny aktywności LDH w hodowlach kory szczurów przy braku glikozy, fig. 5 - wykres graficzny testu żywotności neuronów hipokampu po 48 godzinach in vitro oraz fig. 6 - wykres absorbancji w zależności od czasu naświetlania roztworu produktu wytworzonego sposobem według wynalazku.

Przykład I. Postać wykonania sposobu według wynalazku.

Etap I. Wytwarzanie bogatej w cukier frakcji ligninowej.

300 g zmielonego drewna twardzielowego z modrzewia syberyjskiego (Larix sibirica) jako milled wood dysperguje się przez mieszanie w 6000 ml odmineralizowanej wody i dodaje 150 g KOH. Otrzymaną zawiesinę trzyma się przez 3 doby w temperaturze 46 do 66°C (dielektryczne ogrzewanie przerywane). Następnie oddziela się substancje stałe na nuczy, odrzuca pozostałość, klaruje przesącz przez odwirowanie i przez dodanie porcjami silnie kwaśnego wymieniacza jonowego z żywicy sztucznej (Amberlite IR 120) w postaci wodorowej, który był świeżo zreaktywowany oraz przy stałej kontroli pH za pomocą cechowanej elektrody szklanej nastawia powoli pH na 11,5. Wymieniacz jonowy oddziela się i odrzuca. Klarowny, wyraźnie złotożółty roztwór oczyszcza się od substancji pirogenicznych i cząstek przez filtrację cząsteczkową na drodze ultrafiltracji przez odporne na zasady membrany ultrafiltracyjne o nominalnej wartości odcięcia rozdzielczego 100 000. Z tego klarownego, żółtego roztworu macierzystego pobiera się do analizy spektralnej próbkę o wielkości 20 1, rozcieńcza ją w kuwecie kwarcowej (1 cm) za pomocą 3 ml wody, miesza i wykonuje serię widm wzbudzanych fluorescencyjnie, rejestrując je przy długościach fal: 450 nm, 490 nm i 520 nm.

Fluorymetr nastawia się na taką czułość, aby względna emisja fluorescencji przy długości fali 450 nm leżała przy 100 lub w pobliżu. Następnie wykonuje się zdjęcie widma wzbudzonego przy 450 nm (pisak 2 cm/min), szybkość przesuwania długości fali wzbudzającej 100 nm/min, przyrząd: Kontron (Szwajcaria typ SFM-23). Dla kontroli wykonuje się także zdjęcia widm wzbudzonych przy 490 nm i przy 520 nm. Otrzymano żółty roztwór macierzy PLP.

Etap II. Wytwarzanie ubogich w cukry frakcji lignoidowych (LPL).

600 g milled (drobnozmielonego) lignitu dysperguje się przez mieszanie w temperaturze pokojowej (20°C) w 10 000 ml roztworu KOH o stężeniu 1,68% wagowych; rozpuszcza częściowo i po 9 godzinach oddziela w wirówce szybkoobrotowej substancje stałe i odrzuca osad. Po 24 godzinach wykonuje się ponownie oddzielanie substancji stałych w wirówce szybkoobrotowej i odrzuca osad. Po wykonaniu fragmentowania zasadowego w ciągu 5 dni w temperaturze 20°C oddziela się ponownie z otrzymanego dotychczas odcieku z wirówki substancje stałe, a następnie poddaje roztwór filtracji cząsteczkowej w urządzeniu ultrafiltracyjnym z odpornymi na zasady membranami ultrafiltracyjnymi o nominalnej wartości odcięcia rozdziel10

168 266 czego 30 000. Ultrafiltrację przerywa się po otrzymaniu 6,7 1 przesączu. Następnie nastawia się pH ultraprzesączu na 5,5 przez dodanie świeżo aktywowanego silnie kwaśnego wymieniacza jonowego (Amberlite IR 120) pod kontrolą wycechowanej elektrody szklanej.

Ten słabo kwaśny roztwór filtruje się natychmiast na ultrafiltrze w celu oddzielenia pirogenów. Następnie poddaje się roztwór wyjaławianiu cieplnemu w autoklawie w temperaturze 121°C w ciągu 15 minut. W celu oznaczenia stężenia ciała stałego pobiera się próbki i w temperaturze 85°C zatęża do stałego ciężaru (promiennik podczerwieni). Otrzymany w ten sposób ultraprzesącz po nastawieniu na żądane stężenie stosuje się jako składnik LPL lub jako ubogą w cukry frakcję lignoidową (LPL) do reakcji z produktem z etapu I (patrz wyżej).

Następnie zostanie przeprowadzona dyskusja widma 13C zastosowanych frakcji LPL (produktu etapu II).

Widma 13C-NMR.

Z widma 13C-NMR wynika, że próbka ta różni się od naturalnej ligniny przede wszystkim dużą zawartością grup karboksylowych, które wskazuje średni multiplet przy około 168 - 180 ppm. Przy tym atomy C grup karboksylowych ze względu na brak efektów Kema-Overhausera i sprzężenia spinowo-spinowego z bezpośrednio połączonymi jądrami wodorowymi dają szczególnie słabe sygnały, tak że ich stężenie musiało być jeszcze wyższe niż wskazuje na to względna intensywność ich sygnałów. Odnosi się to odpowiednio także do atomów C grup a-karbonylowych, które absorbują w obszarze 190,5 - 198, lecz wykazują znacznie słabsze intensywności. Ostry singlet przy 158,2 ppm można najlepiej przyporządkować atomowi węgla 4 w grupach p-hydroksyfenylowych (odnośnie oznaczeń atomów C porównaj H. D. Ludemann und H. Nimz, Makromol, Chemie, 175, 2409 (1974). Ponieważ jednak pomiary odpowiednich substancji modelowych były wykonane w heksadeuteroacetonie jako rozpuszczalniku i przy użyciu wzorca wewnętrznego (H. D. Ludemann und H. Nimz, Makromol, Chemie, 175, 2393 (1974), należy ewentualnie wziąć także pod uwagę dla tego sygnału bardziej prawdopodobne atomy C 3 i 5 w grupach syryngilowych.

Szeroki multiplet (7) w obszarze 93 - 145 ppm musi być przyporządkowany atom węgla 1, 2, 5 i 6 w grupach gwajacylowych jak również 1, 2, 4 i 6 w grupach syryngilowych. Złe rozwinięcie widma w tym obszarze wskazuje na silne kondensacje w ligninie, które miały miejsce w wyniku wstępnej obróbki.

W obszarze alifatycznych atomów węgla sygnały (8), (9) i (15) jako typowe sygnały ligniny można przyporządkować wiązaniom arylogliceryno-P-aryloeterowym, które stanowią najważniejszy typ wiązania we wszystkich ligninach. Niepewność w zakresie przyporządkowania wynikajednak także tu z rozpuszczalnika i z wzorca zewnętrznego. Stosunkowo słaby sygnał grupy metoksylowej przy 58,6 ppm wskazuje na częściowe odmetoksylowanie podczas wstępnej obróbki próbki. Występuj ące również w tym obszarze sygnały (10), (11)i(12)o dobrej strukturze nie znajdują się w typowych widmach ligniny [H. D. Ludemann und H. Nimz, Makromol, Chemie, 175, 2409 (1974)] i wskazują na skondensowane części węglowodanów.

Trudny do objaśnienia jest także szeroki multiplet (17) w obszarze przy około 0-55 ppm. Powinny tu były absorbować zwłaszcza alifatyczne atomy węgla, które nie są związane bezpośrednio z tlenem. W ligninie występuje jednak bardzo mało atomów tego rodzaju, np. atomy węgla w położeniu β w jednostkach pinorezinolowych i atomy węgla w położeniu a w jednostkach dibenzylotetraihydrofuranowych (literatura: 1. H. -D. Ludemann und H. Nimz, Makromol, Chem. 175, 2393, 1974; H. -D. Ludemann und H. Nimz, Makromol, Chem. 175, 2409, 1974). Takie atomy węgla (np. w CO-CH3, -CHOH-CH3 lub -CH2-C) musiały więc powstać z ligniny podczas utleniającej lub innej wstępnej obróbki ligniny albo zostały przejęte z drewna podczas preparowania ligniny.

Reasumując należy stwierdzić, że niniejsza próbka zawiera silnie zmienioną strukturalnie ligninę, której charakteru ligninowego nie można już jednoznacznie udowodnić. Przyporządkowanie sygnałów jest utrudnione przez użycie D2O jako rozpuszczalnika, gdyż nie jest ona rozpuszczalna w heksadeuteroacetonie, w którym przeprowadzono pomiary ligniny porównawczej (H. D. Ludemann und H. Nimz, Makromol, Chemie, 175, 2409 (1974)). Ponadto użycie wzorca zewnętrznego zamiast wewnętrznego może także nieznacznie wpływać na przesunięcia

168 266 chemiczne, wskutek czego w przesunięciach chemicznych mogą występować nieuniknione różnice o około 2 ppm.

Przesunięcie chemiczne 13C w ppm TMS'u jako wzorca zewnętrznego zarejestrowane w D2O spektometrem Yarian XL-100-15.

Nr	Delta (ppm)	Intensywność	Przyporządkowanie
(1)	190,5-198	słaby multiplet	grupy: α-karbonylowa i aldehydu cynamonowego
(2)	168-180	średni multiplet	grupy karboksylowe
(3)	164,0	słaba
(4)	158,2	silny singlet	C-4 w grupie p-hydroksyfenylowej (C-3/5) w grupie syryngilowej
(5)	150,5	słaba	C-3 w grupie 2-metoksyfenylowej
(6)	148,5	słaba	C-3 w grupie 2-metoksyfenylowej
(7)	93-145	szeroki multiplet	C-1/2/5/6 w grupie 2-metoksyfenylowej oraz C-1/2/4/6 w grupie syryngilowej
(8)	88,4	słaba	C-β w eterach arylogliceryno-P-arylowych
(9)	70,0	średnia	C-α w eterach arylogliceryno-P-arylowych
(10)	67,9	średnia
(11)	67,4	średnia
(12)	66,2	słaba
(13)	64,8	silna	C-γ w fenylokumarenach i C-γ oraz C-P w jednostkach P-l-dilignolowych
(14)	63,8	średnia	C-γ w alkoholach cynamonowych oraz eterach arylogliceryno-P-arylowych z grupą α-karbonylową
(15)	60,7	średnia	C-γ w eterach arylogliceryno-P-arylowych
(16)	58,6	średnia	OCH3
(17)	0-55	szeroki multiplet	alifatyczne, zwłaszcza nie związane z tlenem atomy C

x) porównaj ponadto: H. D. Ludemann und H. Nimz, Makromol. Chem. 175, 2409 (1974).

Dalsze przerabianie w etapie III:

Dodając stopniowo ubogą w cukry frakcję lignoidową (LPL) o stężeniu dokładnie 2 mg/ml w porcjach po 5 |il do 3 ml kuwety kwarcowej (miareczkowanie fluorescencyjne) wykonuje się zdjęcia widma wzbudzonego przy 520 nm aż do chwili, gdy wskutek odpowiedniego zwiększenia ilości dodawania roztworu pojawi się znamienny pik emisyjny przy 465 nm a emisja wzrośnie w całym zakresie długości emitowanych fal i przy emisji 394-396 nm nastąpi wzrost o wielkość rzędu 80% w stosunku do emisji względnej. Ilość frakcji lignoidowej (LPL) niezbędnej do uzyskania tego wzrostu fluorescencji wskutek dodawania ubogiej w cukry frakcji lignoidowej (LPL) zaznacza się (tu było to np. 10 gl 0,2% roztworu) i mnoży ją przez współczynnik 2,5.

Oznaczoną w ten sposób ilościowo wielkość dodatku roztworu ubogiej w cukier frakcji lignoidowej (LPL) do roztworu macierzystego realizuje się następnie dla będącego do dyspozycji roztworu macierzystego: np. do 4000 ml roztworu macierzystego tego zestawu dodaje się więc zgodnie ze wskazówką 5000 ml 0,2% roztworu ubogiej w cukry frakcji lignoidowej (LPL) (120 gl macierzy potrzebuje 10 gl 0,2% roztworu ubogiej w cukry frakcji lignoidowej (LPL), a więc po pomnożeniu przez współczynnik 2,5 wynika na 4000 ml macierzy zapotrzebowanie 2000 razy 2,5). Miesza się intensywnie w temperaturze 45 do 65°C po reakcji trwającej 4 godziny w temperaturze 45 do 65°C poddaje roztwór rozdzielaniu cząsteczkowemu w urządzeniu ultrafiltracyjnym z odporną na zasady membraną ultrafiltracyjną o nominalnej wartości odcięcia rozdzielczego 30 000, odrzuca pozostałość a przesącz przerabia dalej. Za pomocą silnie kwaśnego wymieniacza kationowego w postaci H+ nastawia się pH przesączu na 5,5 i po przefiltrowaniu w celu uwolnienia od pirogenu natychmiast wyjaławia na drodze cieplnej.

Z szarży pobiera się próbki potrzebne do celów biologicznych i analitycznych i po wykonaniu próby na identyczność za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej i wykonaniu

168 266 oznaczenia na brak pirogenów kieruje do ampułkowania. Jako rozpuszczalnik do ampułek przeznaczonych do stosowania pozajelitowego służy jałowy 0,9% NaCl do zastrzyków.

Na figurze 2a do 2c są najpierw pokazane widma wzbudzone fluorescencyjnie przy długościach fal wzbudzających 450 nm, 490 nm i 520 nm dla roztworu PLP (grupa substancji A); fig. 2d i 2e pokazują według zasady miareczkowania wzbudzającego fluorescencję przy długości fali wzbudzającej 520 nm dający się zmierzyć wpływ określonego dodatku PlP (tu dwustopniowego) w porcjach po 5 μ; decydujące są tu obecność i wysokość piku emisyjnego przy długości fali wzbudzającej 466 nm.

Schemat reakcji pokazano w celu poglądowym na fig. 1a.

Na figurze Tb ile pokazano możliwe odmiany tego sposobu, które ewentualnie można stosować.

Przykład II. Wytwarzanie grupy substancji sposobem według wynalazku.

Wytwarzanie bogatej w cukry frakcji ligninowej (PLP).

180 g zmielonego drewna twardzielowego z modrzewia syberyjskiego (Larix sibirica), rozdrobnionego na cząstki o wielkości od 0,05 do 0,315 mm w młynie udarowym odśrodkowym z bijakiem krzyżowym, które przed ekstrakcją w środowisku wodnym uwolniono od zawartości substancji ekstrakcyjnych przez ekstrakcję mieszaniną etanol/benzen i etanolem (norma TAPP T-12m, 1959) oraz 120 g drewna z buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L.), przygotowanego jak wyżej, zmieszano i poddano przeróbce analogicznie jak w przykładzie I. Podczas gdy Larix sibirica zawiera w drewnie twardzielowym arabogalaktan (4 części galaktozy : 1 część arabinozy), w buku występują łańcuchy ksylanowe obsadzone kwasem oksymetyloglikuronowym i L-arabinozą, wskutek czego właściwości produktu końcowego są zmodyfikowane.

Odmianę milled wood przerabia się tak jak w przykładzie I, przy czym jednak ekstrakcję wykonuje się według Beckmanna i Lische, Angewandte Chemie 34,285 (1921), ekstrahując za pomocą 1 M KOH w autoklawie w temperaturze 121°C w ciągu 3,5 godziny.

Przykład III. Wytwarzanie grupy substancji sposobem według wynalazku.

I) Wytwarzanie bogatej w cukry frakcji ligninowej (PLP). Wytwarzanie PLP odbywało się tak jak w przykładzie II.

II) Wytwarzanie ubogiej w cukry frakcji lignoidowej (LPL). LPL otrzymano ze sproszkowanego eoceńskiego węgla brunatnego, użytego zamiast lignitu, w sposób opisany w przykładzie I. Poza tym wytwarzanie przebiegało w sposób podany w przykładzie I.

Przykład IV. Wytwarzanie grupy substancji sposobem według wynalazku.

I) Wytwarzanie bogatej w cukry frakcji ligninowej (PLP).

210 g drewna twardzielowego z modrzewia, 60 g drewna twardzielowego z buka oraz 30 g zdrewniałych łupin owoców z Prunus avium przerobiono na PLP w sposób podany w przykładzie IL

II) Wytwarzanie ubogiej w cukry frakcji lignoidowej (LPL).

Mioceński węgiel brunatny, który został oczyszczony w zwykły sposób przez ekstrakcję benzenem w aparacie Soxhleta od żywic, tłuszczów i wosków, przerobiono dalej w sposób podany w przykładzie I.

Przykład V. Wytwarzanie grupy substancji sposobem według wynalazku.

I) 'Wytwarzanie bogatej w cukry frakcji llgninowej (PLP)

210 g drewna twardzielowego z modrzewia, 90 g drewna syntetycznego według Freudenberga (Freudenberg K., Markin J. M., 1960, Modelle fur die Bindung des Lignins an die Kohlenhydrate, Chem. Ber. 93,2814-2819) przerobiono na PLP w sposób opisany w przykładzie Π. Dalsza przeróbka odbyła się w sposób podany w przykładzie I.

Przykład VI. Wytwarzanie grupy substancji sposobem według wynalazku.

Zasadowy ekstrakt (A5) z chlorynowej celulozy drzewnej, otrzymanej z mączki drzewnej z drewna buka (Fagus sylvatica L.), zdeligninowanej za pomocą NaClO2 (według Feckla, 1981, Diss. Universitat Manchen) i poddanej ekstrakcji zasadowej 4% roztworem KOH według Fengela (1976, Holzforschung 30, str. 73-78), poddano oddzieleniu substancji stałej, wyjałowiono i na początku trzeciej doby wprowadzono w ilości 900 ml (stężenie substancji stałej 0,12%, ligniny resztkowej 2,3%) do roztworu LPL z lignitu (otrzymanego w sposób opisany w przykładzie I). Objętość 2,1% roztworu (pH 11,4) wynosiła 9100 ml. Czas fragmentowania wynosił 9 dni. Następnie roztwór

168 266 poddano dalszej przeróbce w sposób pokazany na fig. Ib, oddzielając następnie substancje stałe i poddając pozostający roztwór filtracji cząsteczkowej na drodze ultrafiltracji przez odporne na zasady membrany o nominalnej wartości odcięcia rozdzielczego w granicach 18 000-38 000 i przy wartości pH 8-14. Następnie zakwaszono roztwór wymieniaczem jonowym H+ i w warunkach jałowych ynfiltrywauy cząstki. Otrzymany przesącz wcjałowiyuy na drodze cieplnej w autoklawie w temperaturze 121°C, po czym można było poddać go dalszej przeróbce w sposób podany w przykładzie I.

Przykład VII. Wytwarzanie grupy substancji sposobem według wynalazku.

Etap I: 100 g zmielonej (jak milled wood) Cortex Omamom poddano trwającej 6 dni ekstrakcji roztworem KOH w wodzie onmiueralizowauej w temperaturze 60°C (pH nastawiono za pomocą KOH na 8-9). Krążenie materiału w cieczy zapewniono przez wprowadzanie tlenu do roztworu. Następnie oddzielono substancje stałe przez odwirowanie i odrzucono je. Otrzymany w ten sposób roztwór PLP wyjałowiono na drodze cieplnej w autoklawie i natychmiast poddano wraz z produktem LPL z etapu II według przykładu I reakcji w środowisku zasadowym i na gorąco, przy czym dalsza przeróbka odbyła się w sposób podany w przykładzie I.

To wykonanie preparatu jest także przedstawione na fig. le.

Przykład VIII. 600 g zmielonego węgla barwuikarskiegy (eocen), identycznego z surowcem użytym w przykładzie III, poddano roztwarzaniu zasadowemu w temperaturze pokojowej w 101 roztworu 110 g KOH i 60 g NaOH w wodzie ynmiueraliyywauej, mieszając, w ciągu 2 do 5 godzin. Przed rozpuszczeniem wodorotlenków dodano do wync 20 g węgla aktywnego, zmielonego jak najdrobniej na drodze mechanicznej. Ten węgiel aktywny oddzielono następnie razem z osadem przez odwirowanie, które stanowi operację oczyszczania produktu przeznaczonego do fragmentowania zasadowego itp.

Odwirowanie wstępne w wirówce o dużej pojemności, a w razie potrzeby także w wirówce kubełkowej posiadającej 4000 do 5000 obrotów/min, jest niezbędne, gdyż oddzielanie ciała stałego (następna operacja procesu), wykonywane przy maksymalnym wykorzystaniu siły grawitacji w ultrawirówce (również w wirówce szybkoobrotowej z pionowym cylindrem oddzielającym, posiadającej około 40 000 obrotów/mm.), ulega natychmiast przerwaniu wówczas, gdy ilość osadu obniży współczynnik sprawności w cylindrze klarującym, wskutek czego byłaby niemożliwa każda produkcja w skali przemysłowej. Odciek z odwirowania wstępnego zbiera się, zadaje węglem aktywnym w ilości 8 g na 10 1 i tak długo poddaje ultraodwirowywaniu (bliższe dane patrz wyżej), w razie potrzeby w obiegu zamkniętym, aż cylinder klarujący ultrawirówki praktycznie stanie się jasny i dadzą się jeszcze rozpoznać tylko minimalne ślady osadu podobnego do lakieru.

Ten intensywnie oczyszczony wstępnie produkt (zasadowy surowy roztwór grupy substancji czynnych) pozostawia się następnie w temperaturze pokojowej poddając go w ten sposób samyfragmentowamu zasadowemu. Przebieg tego fragmentowania dozoruje się przez bieżące mierzenie pH. Następnie należy próbnie przeprowadzić co najmniej dwukrotnie dalsze ultraydwirywauie jak wyżej, aby móc na bieżąco usuwać tworzące się i zdolne do sedymentacji ale niepożądane z farmakologicznego punktu widzenia produkty kondensacji fragmentów, nie posiadające trwałej rozpuszczalności i reaktywności cząsteczkowej.

Po zakończeniu samyfragmeutowania zasadowego a więc po upływie około 9 dni, jeszcze raz przeprowadza się bardzo dokładne klarowanie przez ultraydwirowauie i poddaje roztwór (który nadal jest silnie zasadowy) oszczędzającemu frakcjonowaniu przez wykonanie ultrafiltracji przy nominalnej wartości odcięcia rozdzielczego 30 000 w taki sposób, że przy wielkości szarży produkcyjnej (opisanej tu przykładowo) wynoszącej 10 litrów ultrafiltrację kończy się wówczas, gdy uzyska się 7400 ml ultrafiltratu a objętość pozostałości wyniesie wówczas około 2000 ml.

Pozostałość odrzuca się, płucze dokładnie zasadowo urządzenie ultrafiltracyjne a przesącz zużywa w następnej operacji przygotowawczej. Następujące teraz zetknięcie się soli zasadowych ultrafiltratu z silnie kwaśnym wymieniaczem kationowym z żywicy sztucznej (w ekstremalnej postaci wodorowej) jest także procesem, który ma znaczenie dla produktu końcowego.

168 266

Zakwaszanie zasadowego ultrafiltratu, np. przez dodawanie kwasu, nawet przy użyciu kolumn z wymieniaczami jonowymi jest całkowicie nieprzydatne, gdyż np. w tym ostatnim przypadku kolumna może się łatwo zatkać a wówczas otrzymuje się całkowicie nieużyteczny przesącz.

Według wynalazku wymiana kationów (wymiana jonów Na+ i K+ na jony H+) musi być wykonywana w naczyniu reakcyjnym jako operacja periodyczna a proces dejonizacji dozorowany elektronicznie na bieżąco za pomocą wycechowanej elektrody szklanej.

Punktem docelowym jest wartość pH 5,1 i po osiągnięciu tej wartości dodawanie wymieniacza jonowego musi być natychmiast przerwane. Według wynalazku dejonizację należy prowadzić przy ciągłej cyrkulacji jeszcze częściowo zasadowego produktu i przez wytwarzanie turbulencji, np. za pomocą regulowanej pompy cyrkulacyjnej, należy troszczyć się o to, aby w naczyniu reakcyjnym nie tworzyły się przestrzenie o dużym stężeniu wymieniacza jonowego.

Ponieważ obecnie nie ma jeszcze możliwości wykonywania zadowalających pomiarów grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku, więc przestrzeganie będących przedmiotem wynalazku, nawet najmniejszych, ustalonych doświadczalnie etapów reakcji jest zawsze najpewniejszą metodą otrzymywania grup substancji absolutnie identycznych pod względem farmaceutycznym.

Poddany wymianie kationowej (definitywnie zdejonizowany) roztwór grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku filtruje się teraz przez jałowy filtr w celu oddzielenia cząstek, które mogły dostać się do niego przy zetknięciu z wymieniaczem jonowym i następnie natychmiast wyjaławia przez autoklawowanie go (np. w temperaturze 121°C w ciągu 20 minut). Ten roztwór grupy substancji może być całkowicie bezpiecznie przechowywany w temperaturze od plus 4 do 20°C w przeciągu 18 miesięcy i stosowany np. do wytwarzania roztworów do ampułek (rozpuszczalnik np. 0,9% roztwór soli kuchennej).

Użycie węgla aktywnego nie ma na celu przeprowadzenia jakiejś niespecyficznej operacji oczyszczania, lecz chodzi tu o wywarcie wpływu na przebieg reakcji w czasie docelowego fragmentowania. Zasadniczo należy stosować węgiel aktywny typu węgiel aktywny w proszku p. a./przykładowe parametry takich węgli aktywnych są następujące: wartość pH 5% roztworu w wodzie, w temperaturze 20°C, przesącz: 4,0-7,0; zdolność adsorpcji 0,15% roztworu błękitu metylenowego większa niż 12 ml (0,1 g).

Ważne są wielorakie funkcje jakie pełni węgiel aktywny, np. dzięki zawartości tlenków na jego powierzchni, które mogą mu nadawać właściwości kwasowe lub zasadowe. Wprawdzie czyste powierzchnie węglowe, jak u grafitu, są hydrofobowe, to jednak tlenki powierzchniowe wytwarzają in situ przestrzenie hydrofilowe, tak że węgiel aktywny staje się zwilżalny przez wodę i w ten sposób wywiera wpływ na przebieg reakcji podczas fragmentowania. Ważny jest także rozkład wielkości ziarna zastosowanego węgla aktywnego: około 50% powinny stanowić cząstki mniejsze od 40 mikrometrów. Przy takim rozkładzie wielkości ziarna można czysto oddzielić na drodze technologicznej dodatki węgla aktywnego bez potrzeby stosowania pomocniczych środków filtracyjnych.

Przykład IX. Przedstawiony w przykładzie VIII produkt, uwolniony już kilkakrotnie według zasady jednego lub kilku jonów przez ultraodwirowanie od zawartości cząstek osadu poddaje się krótko ogrzewaniu mikrofalowemu do temperatury 46°C, a następnie pozostawia do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Zasadową mieszaninę produktu poddaje się po ostatnim bardzo dokładnym oczyszczeniu przez ultraodwirowanie (bliższe dane patrz w przykładzie VIII) dalszej przeróbce, takiej samej jak produkt otrzymany według przykładu VIII.

Za pomocą tych będących przedmiotem wynalazku wielokrotnych wymuszonych na drodze fizycznej zmian procesu fragmentowania modyfikuje się grupę substancji wytworzonych sposobem według wynalazku.

Przykład X. Fotometryczne badania reakcji wykazały, że grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku opisanym np. w przykładzie Vm, można silnie zmodyfikować na drodze aktywacji fotonowej przy 388-378 nm. Podczas reakcji przemiany, przebiegającej wtedy w obszarzejednostek chwytaczy fotonów w grupie substancji, zachodzą w niej procesy fotochromiczne. Należy przez to rozumieć odwracalne reakcje fotochemiczne, w wyniku których substancja A

168 266 przekształca się w inną postać (konformację) lub związek B i ta reakcja przebiegająca w jedną stronę i/lub reakcja odwrotna jest powodowana przez absorpcję światła UV lub światła widzialnego. Według wynalazku tak długo działa się na środki lecznicze falą o długości 388 nm, aż w wyniku kontroli absorbancji stwierdzi się np. po upływie 90 min. wystąpienie maksimum absorbancji. Równocześnie w fotometrze dwustrumieniowym można stosować i rejestrować monochromatyczne promieniowanie 388 nm jako promieniowanie pomiarowe (fig. 6) (szerokość pasma np. 5 nm).

Oprócz wykonywania pomiarów maksimum absorbancji (patrz fig. 6) można dodatkowo badać modulację konformacji przez mierzenie fluorescencji (rejestrację widma wzbudzonego). Przez fotochromiczne działanie na grupę substancji wytworzonych sposobem według wynalazku wywołuje się we wszystkich obszarach spektrofluorymetrii wzbudzanej taki przebieg krzywej;który znacznie różni się od próby zerowej. Te indukowane przez UV systemy wpływają na skuteczność ich działania chemoterapeutycznego in situ jak in vivo. Taki aktywowany za pomocą UV roztwór grupy substancji jest przydatny nie tylko do doświadczeń klinicznych nad AIDS, lecz także w przypadku chłoniaka komórek T może być stosowany do wywierania wpływu na limfocyty T. Jak wiadomo, przez aktywowanie za pomocą UV środka 8-MOP, który składa się z pierścienia furanowego i kumaryny, można wywierać wpływ na CTCL. Koszt jest jednak bardzo duży (leukafereza), podczas gdy w przypadku otrzymanego według wynalazku związku aktywowanego za pomocą UV potrzebne jest tylko przeprowadzenie zwykłego leczenia pozajelitowego.

Ogólnie należy stwierdzić, że warunki prowadzenia ekstrakcji drewna mają duży wpływ na budowę cząsteczkową rozpuszczalnych jednostek polisacharydowo-ligninowych. Budowa cząsteczkowa macierzy zależy przy tym w dużym stopniu od materiału wyjściowego a więc od tego jakie zostanie zastosowane drewno twardzielowe z danego drzewa, czy też słoma lub trawa. W celu uniknięcia śladów ochrony roślin, należy stosować stare drzewa.

Decydujący jest przy tym także rodzaj drewna (drzewo iglaste, drzewo liściaste) jak również rodzaj części rośliny stosowany jako materiał wyjściowy (skorupy orzechów, pestki brzoskwiń, miękkie części drewna); i tak np. wiązanie między P i L w skorupach orzechów jest znacznie mocniejsze niż np. w drewnie miękkim.

Ponadto ważna dla produktu jest metoda ekstrakcji sieci LD-PLP, przy czym nadają się do tego zwłaszcza: ekstrakcja zasadowa, działanie mieszaniną gorącej wody i pary wodnej pod zwiększonym ciśnieniem (autoklawy) jak również elektroliza z użyciem NaCl jako elektrolitu. Grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku zawiera bardzo wiele jednostek strukturalnych z zespołu substancji naturalnych, arenów i węglowodanów.

Poniżej omówiono i przytoczono wyniki badań przeprowadzonych z materiałem z przykładu I na różnych systemach komórek.

Test grupy substancji wytworzonych według przykładu I na zakażonych wirusem HIV limfocytach ludzkich.

Jako system testowy użyto limfocyty z krwi pępowiny noworodka, które były wstępnie aktywowane 2 dni za pomocą 10 gg/ml fitohemoaglutyniny (PHA). Ten system hodowli komórkowej jest systemem limfocytowym bardzo wrażliwym na badania wirusa HIV. OKoło 200 000 limfocytów z krwi pępowiny aktywowanych przez PHA, zmieszanych z dodatkiem substancji testowej i umieszczonych w hodowlach po 1 ml zakażono izolatem HIV-2 z HIV-2ROD (stężenie końcowe około 200 tworzących zespólnie jednostek/ml). Ocenę zakażonych hodowli wykonano za pomocą mikroskopu optycznego na trzeci dzień po zakażeniu (badanie na powstawanie indukowanych przez wirusy fuzji komórek, czyli tak zwanych zespólni).

Produkt wytworzony sposobem według wynalazku rozpuszczono w pożywce nie wykonując następnie filtracji jałowej. Testowano stężenia: 200 μg/ml, 100 gg/ml, 50 gg/ml, 20 gg/ml, 2 gg/ml,oraz 0,2 μg/ml, Badano dwie szarże, a mianowicie A88-1 i A88-4. Wyniki zestawiono w podanych tabelach 1 i 2.

168 266

Tabela 1

Test szarży A88-1 z przykładu I w płytkach z 24 otworami na hamowanie wytwarzania zespólni

Stężenie gg/ml	Ocena za pomocą mikroskopu optycznego na 3-4 dzień po zakażeniu
tworzenie zespólni	tolerancja
200		dobre kolonie
100	-	dobre kolonie
50	-	dobre kolonie
20	+	dobre kolonie
2	++	dobre kolonie
0,2	++	dobre kolonie

dodatnia kontrola +++

- brak tworzenia zespólni + tworzenie pojedynczych zespólni (1-10) ++ wyraźne tworzenie zespólni (10-50) +++ silne tworzenie zespólni (>50)

Ta b e1a2

Test szarży A88-4 w płytkach z 24 otworami na hamowanie wytwarzania zespólni

Stężenie gg/ml	Ocena za pomocą mikroskopu optycznego na 3-4 dzień po zakażeniu
tworzenie zespólni	tolerancja
200		dobre kolonie
100	-	dobre kolonie
50	-	dobre kolonie
20	+	dobre kolonie

dodatnia kontrola +++

T a b e l a 3

Ocena hamowania tworzenia zespólni z szarżą II. Stosowane komórki: limfocyty peryferyjne (PBL). Wirus: HIY-2ROD, 10⁵ SFU/ml, około 1.500.000 cpm/ml/90 min. zastosowane rozcieńczenie końcowe 1:500

Stężenie (^|?//π1)	Tworzenie zespólni na dzień
2	3	4
1	+	+	+
5	+	+	+
10	+/-	+/-	+/-
25	-	-	-
35	-	-	-
50	-	-	-
75	-	-	_X
100	-	-	_x
150		cytotoksyczne

x - nieznaczna cytotoksyczność

Jak wynika z powyższej tabeli 3, ta szarża wywierała skuteczne działanie przy stężeniach powyżej 10 gg/ml.

Aktywność anty-HIV grupy substancji wytworzonych sposobem według wynalazku (testy Labor I i Labor II) zestawiono w podanych niżej tabelach 4 i 5.

168 266

Grupę substancji badano in vitro w dwóch stężeniach: 2 mg/ml oraz 16 mg/ml. W ramach testu Labor I zbadano HIV-core-protein, p24 techniką antigen-capture po zakażeniu pierwotnym komórkami H9.

Jako pozytywną substancję kontrolną zastosowano kwas fosfonomrówkowy i także badano różne stężenia AZT i ddC. W tym doświadczeniu obydwie próbki wykazały aktywność przeciwwirusową.

W ramach testu Labor II zastosowano jako punkt końcowy tworzenie zespólni po zakażeniu pierwotnym komórek MT-2.

Tabela4

Labor I

Stężenie substancji czynnej pg/l	% hamowania p24	Foscarnet
Adaptogen 2 mg/ml	Adaptogen 16 mg/ml
1	<30	30-50
4	<30	50-75
10			50-75
20	50-75	75
50			>75
100	>75	>75	toksyczna
500	toksyczna	>75	toksyczna
oszacowane EC 50	15-20 pg/ml	1-2 pg/ml	10 pg/ml

Dodatnia kontrola: AZT i dideoksycytydyna (ddC) zostały przetestowane każda z 1-10 pg/ml i wykazały 75% hamowanie ekspresji p24 bez cytotoksyczności.

Tabela 5

Labor II

Stężenie substancji czynnej pg/ml	% powstrzymywania tworzenia zespólni
Adaptogen 2 mg/ml	Adaptogen 16 mg/ml
0,1	33
0,16		14,5
1	50
1,6
10	82
16		88
48		100
100	100
160		100
500	trochę toksyczna
EC 50	1 pg/ml	1 pg/ml

Dodatnia kontrola: ddA w ilości 0,25 (90% hamowanie) oraz 2,5 pg/ml (100% hamowanie).

Z powyższych danych wynika, że grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku wyraźnie utrudnia atakowanie komórek przez wirus HIV.

W dawkach leczniczych (około 0,1 mg/kg ciała człowieka) nawet przy długotrwałym podawaniu grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku nie działa uczulająco ani toksycznie

168 266 oraz nie ma żadnych działań ubocznych. Grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku dysponuje domenami hydryfilnymi, które warunkująjej dobrą rozpuszczalność w wodzie.

Oczywiście możliwe są dalsze zmiany i regulacje zasady wynalazku przez fachowców biegłych w tej dziedzinie, jak np. przez stosowanie innych monomerów na powierzchni macierzy.

Dzięki temu grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku nadaje się do długotrwałego leczenia; podczas długotrwałego podawania nie następuje utrata skuteczności działania; może ona być także stosowana bez ryzyka w podejrzanym przypadku chorobowym. Ogólnie odznacza się ona skutecznym działaniem restytucyjnym i może być bezproblemowo stosowana w postaci zastrzyków. Z powyższych doświadczeń wynika, że grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku posiada wyraźne właściwości przeciwwirusowe.

Niżej omówiono szereg testowy I (badanie efektu survival bez dodatkowego obciążenia komórek).

Grupa substancji wytworzonych sposobem według wynalazku posiada także właściwości przeciweskalacyjne (restytucyjne), jak wynika z poniższego. Ostrym uszkodzeniom w obszarze ośrodkowego układu nerwowego, które występują w urazach, uszkodzeniach mózgu, niedykrwieuiacy itp. towarzyszy często degeneracja lub obumieranie komórek neuronów centralnych. Liczne są również schorzenia neurologiczne i ueurozwyronnieuiowe ośrodkowego układu nerwowego (np. syndromy Parkinsona, Alzheimera, Korsakoffa) charakteryzujące się obumieraniem selektywnych populacji neuronów.

Dlatego badania nad obumieraniem komórek lub nad przeżywaniem neuronów centralnych mają duże znaczenie. W ostatnich latach w wyniku badań czynników neurytrypywcch i badań nad wzajemnym oddziaływaniem na siebie neuronu i tkanki glejowej zgromadzono wiele danych dotyczących warunków przeżywania neuronów in vivo i in vitro. Należą do nich także nowe dane dotyczące znaczenia lipidów zawartych w błonach, z włączeniem gaugliozydów i fosfolipidów, dla żywotności komórek nerwowych. Doświadczenia przeprowadzone na hodowlach komórek nerwowych wykazały, że nadtlenki i rodniki tlenowe przez atakowanie lipidów w błonach mogą grać pewną rolę w zdolności przeżywania (survival) jak również obumierania komórek.

Materiał i metody.

I. Preparowanie hodowli neuronów hipokampu.

Hipokampy zarodków szczurzych w wieku 17 dni dysocjuje się przez działanie trypsyną/EDTA i pocięcie mechaniczne i umieszcza na płytkach Cyverslips pokrytych warstwą pylilizcuc. Po fazie przyczepności w 10%o surowicy komórki rosną w określonej, wolnej od surowicy pożywce.

Π. Test fluorescencyjny.

Stosuje się kombinację dwóch barwników fluorescencyjnych, aby można było różnie zabarwić żywe i martwe komórki. Dwuoctan fluoresceiny (PDA) jako związek uiefluyrczujący jest pobierany tylko przez żywe komórki, wewnątrz których zostaje ryzszczepiyuc hcdrylityczuie i przekształcony w związek fluoryzujący (fluoresceinę). Bromek etynioniowy (EtBr=międzcnarydywej nazwie zwyczajowej bromku 3,8-dwuamiuo-5^tclo-6-fenylyfeuantrydyniywego) nie jest wchłaniany przez komórki żywe i wnika tylko w komórki martwe, w których barwi fluorescencyjnie jądra na kolor czerwony.

Pożywki.

DMEM (Dulbeccos Modified Engles Medium), Seromed, Munchen.

FKS (Fetales Kalberserum), Seromed, Mϋucyeu (10% w DMEM) ^aktywowany w temperaturze 56°C w ciągu 1/2 h.

HM (^ι^^^^ΐχ) insulina 8,8 χ 10'⁷ M transferyna l,1xl0’tM trijynotcryniua 3 χ 10’Ίμ yynrokyrtczyu t n 10‘⁸ M w DMEM

Stężenie grupy substancji wytworzonej sposobem według wynalazku. W ampułce znajduje się 2 mg/ml roztworu.

168 266

		Stężenie końcowe w pożywce
Rozcieńczenie w DMEM	(100 pl22m))
1:10	200 pg/ml	10 pg/ml	(1)
1:100	20 pg/ml	1 pg/ml	(2)
1:1000	2 pg/ml	100 ng/ml	(3)
1:10 000	200 ng/ml	10 ng/ml	(4)
1:100 000	20 ng/ml	1 ng/ml	(5)

Roztwór dodaje się do pożywki z przyczepionymi komórkami w stężeniach (1)-(5), po fazie przyczepności. Test żywotności wykonuje się po 48 godzinach. Na jedno oznaczenie wykonuje się obliczenia z 3 hodowli, każda po 15 pól z około 15 neuronami/pole.

Wyniki.

Test żywotności wykazuje dodatni wpływ w obszarze stężeń około 100 ng/ml pożywki na przeżycie neuronu w hodowli w porównaniu z kontrolą. Przy 10 (Ig/ml pojawia się lekki efekt toksyczny.

Oceniając efekt survival należy uwzględnić, że komórki rosną w zoptymalizowanych warunkach to znaczy że nie należy oczekiwać znacznego zwiększenia przeżycia. Dlatego jest zrozumiałe, że doświadczenia należy przeprowadzić w warunkach suboptymalnych (szereg testowy II).

Test żywotności neuronów hipokampu po 48 godzinach in vitro.

Stosunek: komórki żywe/martwe.

Szereg testowy II.

Wpływ na przeżycie neuronów po uszkodzeniu.

Na zdjęciach mikrokinematograficznych zaobserwowano, że komórki, które w polu widzenia były poddane dłuższemu naświetlaniu światłem lampy halogenowej, obumierają wcześniej niż te na zewnątrz.

Poszukując przyczyny tego zjawiska znaleźliśmy w literaturze wskazówki, że w pożywkach hodowli komórkowych naświetlonych światłem z tak zwanych lamp światła dziennego (o dużej zawartości światła krótkofalowego), zostają wytworzone fotoprodukty o śmiertelnym działaniu. Podczas naświetlania pożywek zawierających tryptofan/ryboflawinę bliskim UV (365 nm) powstaje w toksycznych ilościach H2O2 (Mc Cormick, J. P., Fischer, J. R., Pachlatko, J. P. and Eisenstark, Science 191,468-469 (1976); jak również Wang R. J. and Nixon, B. T., In Vitro 14, No. 8, 19-22 (1978))..

Nadtlenki i rodniki tlenowe znalazły się obecnie w polu widzenia w związku z procesami starzenia się komórek i uszkodzeń komórek powodowanymi przez wpływy toksyczne (np. w wyniku niedoboru tlenu).

Poniższe studium bada wpływ produktu wytworzonego sposobem według wynalazku na te skutki uszkodzenia komórek spowodowane naświetlaniem światłem lampy halogenowej.

W próbie wstępnej ustalono najpierw czas naświetlania, który powoduje wyraźne zmniejszenie przeżycia komórek, ale nie jest jeszcze całkowicie śmiertelny.

Metoda.

Neurony z hipokampu szczurzych zarodków (17 dzień) zostały spreparowane - jak opisano. Po rośnięciu w inkubatorze przez 3 do 4 godzin wyjęto szalki z hodowlami i poddano je naświetlaniu. Następnie dodano do hodowli produkt wytworzony sposobem według wynalazku w 3 stężeniach i ze świeżą pożywką oraz dalej prowadzono hodowlę w ciągu 20 godzin. Przeżycie komórek oznaczono za pomocą opisanego testu fluorescencyjnego. Jako kontrola służyły naświetlone jak również nienaświetlone komórki, do których równocześnie dodano świeżą pożywkę bez substancji czynnej.

Naświetlanie.

500 W lampa halogenowa z reflektorem, odległość 40 cm, (wartość świetlna zmierzona na poziomie szalek Petriego: LW 18,5), czas naświetlania 20 min. Szalki hodowlane znajdują

168 266 się podczas naświetlania w termostatowanej łaźni wodnej, przy czym temperatura mierzona bezpośrednio w pożywce, nie przekracza 34°C.

Wynik.

Wynik jest pokazany na fig. 4, z czego wynika ilość komórek żyjących w hodowli po upływie 24 godzin, podana w procentach (survival).

1) survival bez naświetlania po 24 godzinach

2) po naświetlaniu bez badanego produktu

3) po naświetleniu i po dodaniu badanego produktu w ilości 1 gg/ml

4) po naświetleniu i po dodaniu badanego produktu w ilości 0,1 gg/ml

5) po naświetleniu i po dodaniu badanego produktu w ilości 0,01 gg/ml.

Obserwuje się wyraźny wpływ opisanych warunków na przeżycie neuronów w hodowli, przy czym należy zwrócić uwagę, że jedno stężenie (1 gg/ml) wywiera działanie, w wyniku którego w optymalnych warunkach nie obserwuje się po 48 godzinach żadnego efektu survival (patrz sprawozdanie I). Być może, że w normalnych warunkach lekkie działanie toksyczne przewyższa działanie zabezpieczające, które przeważa po uszkodzeniu przez światło.

Nie badano problemu jaka część widma najskuteczniej wywołuje śmiertelne efekty. Wykluczono jednak, że pożywka jest ogrzewana przez duży długofalowy składnik światła i to ewentualnie powoduje uszkodzenia komórek.

PLP

Fig.2(c)

Fig.2(b)

490

Fig. 2 (a)

Fig.2(e) Fig.2(d)

168 266

Fig.4

ŻYWE KOMÓRKI W PROCENTACH /Przeżycie/ po 24 godzinach w hodowli

U przeżycie bez naświetlania po 24 godzinach

2) po naświetleniu bez substancji czynnej

3) po naświetleniu i po dodaniu substancji czynnej w ilości

4) po naświetleniu i po dodaniu substancji czynnej w ilości 0

5) po naświetleniu i po dodaniu substancji czynnej w ilości

O,Olpg/ml

Test żywotności neuronów hipokampu po 48 godzinach in vitro stosunek: komórki żywe/martwe

168 266

Ε

C co »ο

Ό

Ο **

U ο

©

C η « to Ν ο u

β

C u

Η ι

>

C u

ο

Ν

Ο

C .. ο Ό Ν ΟΌ Ο) ©»

Ν

C4 U

-CJ ©

C .-Ν « • Η £

Ν C Ο ® Ό ϋ Ή Ο © Ή C ΌΝ*· © © >

«Η 't Ο.Ό £ Ν « Ο © «Μ S Ο w ·· κο © □ - «4 β U © »Ν ζ © ή ε ·· ) Ή « Ε 3

Ν ε α \ ΙΌ Ο Ν Ή ©

0.0 -Η -Η c ε © £ Ή Ο © η α ΝΌ

Ο 50 ο © ο ο <>C <Μ □ *3 c Η w Ή © © £ Ή © U Ο 6 34 © 34 Ν *- Ο. ίΜ © © ε ® d 3 ® Ο Ζ (0 ΙΜ

Ο

I

Ο (0 <

Ο ο>

σι ©

©

Ν υ

168 266

Fig .Ία

Dalsza przeróbka

168 266

Fig/1b

Surowce wy-Jżelowe A

Surowce wyjściowe B

Roztwarzanie przy pH 4-14

Oddzielanie .substancji stałych

Roztwarzanie przy PH 8-14

Oddzielanie ~ substancji stałych

Wyjaławianie /autoklawowanie/

zasadowe oraz

Fragmentowanie tworzeni ' ne ’ za worzenię sieci interpene.traeyj. ej ZIPN/ w warunkach reakcji* asaoowej w środowisku wodnym

Oddzielanie substancji stałych

.Kontrolowane.rozrywanie siec: /konwersja IPN/ za'pomocą wyg czś kationowego w postaci woS i^S wy ocenie o row« J

Filtracja częstek w warunkach •jałowych

Wyjaławianie-cieplne w temperaturze 121°Ο przerabianie na produkty farmaceutyczne ltd.

168 266

Fig .1c

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (21)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania grupy substancji czynnych do restytucyjnej chemoterapii wirusowych chorób zakaźnych, ewentualnie w postaci preparatów farmaceutycznych, w którym to sposobie drewno lub substancje drewnopochodne ekstrahuje się w środowisku wodnym, znamienny tym, że przeprowadza się omówione niżej etapy postępowania Ι-ΙΠ, przy czym w etapie I drewno i/lub materiały drzewne i/lub roślinne hodowle komórkowe ekstrahuje się w słabo kwaśnych lub obojętnym, lub zasadowym środowisku wodnym i oddziela się nierozpuszczalne składniki stałe, w etapie Π prowadzi się wodno-alkaliczną ekstrakcję (pH=7-14) produktów uwęglenia drewna lub biokonwertowanych materiałów drzewnych i oddziela się nierozpuszczalne w alkaliach składniki stałe, a w etapie ΙΠ produkt etapu I poddaje się reakcji w środowisku wodno-alkalicznym (pH=8-14) z produktami etapu Π, produkt tej reakcji poddaje się ultrafiltracji przy nominalnych wartościach odcięcia rozdzielczego od około 15 000 do 40 000 z uzyskaniem przesączu, który traktuje się kationitem-H⁺ przy pH=3-7,0, i oddziela się przereagowany kationit-H^4-, otrzymany zaś wodny roztwór poreakcyjny z etapu ΙΠ przetwarza się ewentualnie na płynny preparat farmaceutyczny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie I po oddzieleniu nierozpuszczalnych składników stałych nastawia się wartość pH na odczyn obojętny lub słabo kwaśny, a dalej jako filtrację cząsteczkową prowadzi się ultrafiltrację o wartości odcięcia rozdzielczego mniejszej od 100 000, korzystnie mniejszej od 70 000 i tak otrzymany roztwór substancji o niskiej masie cząsteczkowej poddaje się dalszej przeróbce w etapie ΠΙ.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie Π po ekstrakcji wodno-alkalicznej i oddzieleniu nierozpuszczalnych w alkaliach składników stałych prowadzi się obróbkę alkaliczną wobec odczynu o wartościach pH powyżej 8, po czym następuje rozdzielanie cząsteczkowe drogą ultrafiltracji przy wartości odcięcia rozdzielczego 15 000 - 35 000.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po reakcji obfitych w polisacharydy produktów etapu I z ubogimi w polisacharydy produktami etapu Π oddziela się substancje stałe.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dalszą przeróbkę kwaśnego roztworu grupy substancji czynnych z etapu ΠΙ prowadzi się przez filtrację cząstek i usunięcie pirogenów drogą sączenia oraz przez wyjałowienie i ewentualnie konfekcjonowanie.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako poddawane ekstrakcji w etapie I materiały drzewne stosuje się materiały wybrane ze zbioru obejmującego drewno naturalne, analogi drewna, substancje drzewne wytworzone biotechnologicznie na drodze sporządzenia hodowli komórek roślinnych, syntetyczne analogi drewna wytworzone po otrzymaniu metodą Freudenberga dehydrogenacyjnych polimerów mono i/lub dwulignoli i po szczepieniu tych syntetycznych polimerów dehydrogenacyjnych na polisacharydach, kompleksy ligninowo-polisacharydowe, otrzymane przez alkaliczną ekstrakcję celulozy drzewnej chlorynowej.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie Π stosuje się roślinne materiały wyjściowe wybrane ze zbioru obejmującego naturalne produkty uwęglania, drewno biokonwertowane przez lignolitycznie aktywne mikroorganizmy, przez grzyby białej zgnilizny, drewno biokonwertowane przez wyodrębnione enzymy lignolityczne, korzystnie fenylooksydazę lub mieszaniny tych materiałów.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w poszczególnych etapach'jako zasady stosuje się KOH, NaOH, LiOH i amoniak.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymane w etapie I obfite w polisacharydy jednostki ligninowe stosuje się w roztworze wodnym w stężeniu 0,05-10% wagowych, korzystnie do około 2% wagowych, a zwłaszcza około 0,1 % wagowych.

   168 266
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję w etapie I prowadzi się wobec odczynu o wartości pH od około 12 do 14, korzystnie w środowisku KOH w ciągu 1-10 dni w temperaturze pokojowej (20°C).
11. 11. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że ekstrakcję w etapie I prowadzi się w temperaturze podwyższonej do 120°C, przy czym w temperaturze powyżej około 100°C postępowanie przeprowadza się w autoklawie.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się produkty uwęglania drewna wybrane ze zbioru obejmującego lignity, węgle barwnikarskie i węgiel brunatny.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie II ekstrakcję alkaliczną prowadzi się za pomocą 0,1-0,8 M KOH, korzystnie 0,4 M KOH, w temperaturze pokojowej.
14. 14. Sposób według zastrz. 1 albo 13, znamienny tym, że w etapie II ekstrakcję alkaliczną prowadzi się w ciągu 7-10 dni wobec odczynu o wartości pH=11 (KOH), w temperaturze pokojowej.
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję w etapie III prowadzi się w temperaturze od temperatury pokojowej do temperatury 120°C wobec odczynu o wartości pH=8-14, korzystnie pH=10-12.
16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt etapu III poddaje się w temperaturze pokojowej rozdzielaniu cząsteczkowemu z uzyskaniem frakcji o niskiej masie cząsteczkowej, korzystnie poddaje się niskociśnieniowej ultrafiltracji na odpornych na zasady membranach ultrafiltracyjnych o nominalnej wartości odcięcia rozdzielczego 18 000-38 000.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt z etapu III poddaje się wymianie kationu alkalicznego za pomocą kationitu żywicznego w postaci wodorowej aż do uzyskania stabilnego odczynu o wartości pH w zakresie 4-6,8, korzystnie w zakresie 5-6.
18. 18. Sposób według zastrz. 1. albo 17, znamienny tym, że kwaśny produkt z etapu III po obróbce kationitem uwalnia się od pirogenów przez filtrację i następnie wyjaławia drogą obróbki w autoklawie, korzystnie w temperaturze 121°C w ciągu 14 minut.
19. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór wodny poreakcyjny z etapu III poddaje się obróbce znaną metodą, ewentualnie za pomocą substancji pomocniczych, na płynny preparat farmaceutyczny.
20. 20. Sposób według zastrz. 1 albo 19, znamienny tym, że wodnym roztworem produktu etapu III napełniania się znaną metodą ampułki do wstrzykiwań.
21. 21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprowadza się Pt i/lub Au i/lub Pd z utworzeniem związków chelatowych.